Electroforesis en Gel de Agarosa
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TECNOLOGICO NACIONAL DE TUXTLA GUTIERREZ ING. BIOQUIMICA BIOQUIMICA DEL NITROGENO Y REGULACION GENETICA ALUMNO: Edwar Kennedi Ramírez Méndez. FECHA: 18/nov./2014 CATEDRATICO: Reiner Rincón Rosales. TRABAJO: Reporte de practica (ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA) RESUMEN: Se utilizó un método (electroforesis en gel de agarosa) que permitió verificar y cuantificar la cantidad de ADN cromosómico extraído de una célula bacteriana. El gel se colocó en la cubeta de electroforesis, posteriormente las muestra y de esta forma las moléculas de DNA sometidas a electroforesis se desplazaron al polo positivo .La distancia recorrida por cada fragmento de DNA fue inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Tras la electroforesis, se visualizó el gel con una lámpara de luz UV, y se logró apreciar las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular. 1.-INTRODUCCION: El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico (Nelson & Cox, 2001). Muchas moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los electrodos. La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Después de la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV. OBJETIVO: Conocer y aplicar la técnica de electroforesis horizontal en agarosa para verificar y cuantificar la cantidad de ADN cromosómico extraído de células bacterianas. 2.- PROCEDIMIENTO: Preparación de agarosa: En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, se colocó 100 ml de solución TAE 1X y se disolvió 0.8 gr de agarosa tipo I, después se licuo en el microondas con el tiempo requerido (hasta que la solución quedo totalmente diluida, cero impurezas). Se Colocó la agarosa en el molde de la cámara de electroforesis cuidadosamente y luego se colocó el peine: se cuidó que los niveles de los peines de los pozos queden a ¾ del volumen, y eliminamos las burbujas que se formaron. Se dejó enfriar a 8°C durante 20 minutos. Llenado del gel de agarosa: Se colocó las muestras en cada pozo correspondiente en el gel de agarosa. En el pozo No. 1 se colocó 2 μl del marcador DNA, previamente mezclado con 3 ul de colorante Buffer azul. De la misma manera se colocó las muestras problemas en los pozos en su respectivo orden consecutivo. En este caso se colocó 6 μl ADN y mezclar con 3 μl de colorante azul. Posteriormente se Colocó el molde de agarosa en la cámara de electroforesis y se dejó correr a 110 Volts durante 35 minutos. Pero antes el recipiente de la cámara se llenó con solución TAE 1X. Revelado del gel de agarosa: Cuidadosamente se colocó el gel en un recipiente con bromuro de etilio al 5% y se revelo la muestra durante 10 minutos en la oscuridad. Después, lavar el gel con agua corriente para poder verificar el ADN se analizó en un transiluminador a una longitud de 302 nm. 3.- RESULTADOS Y DISCUSION: 4.- CONCLUCION: Se logró verificar exitosamente y cuantificar la cantidad de ADN cromosómico extraído de una célula bacteriana mediante esta técnica de electroforesis en gel de agarosa. Cabe mencionar que resulto ser una técnica efectiva, por lo que es recomendable para su uso a nivel laboratorio de investigación siempre y cuando teniendo los cuidados de quien lo realiza, recordando que se hace usos de reactivos altamente peligrosos como el caso de bromuro de etilio para la tinción del ADN por lo cual puede mencionarse que genera una desventaja para este método. 5.- BIBLIOGRAFIA: --Bio-Rad: Protocolo que acompaña al “Quantum Prep Miniprep Kit”. --Nelson DL, Cox MM (2001): “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Editorial Omega (Barcelona, España), pp 1119-1128. Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté (Barcelona, España), pp 152-154. . T.L.Q Araceli Morales Fonseca (Jefa de lab. Microbiología) Fig.1 Electroforesis en gel de agarosa al 1% de DNA bacteriano teñido con bromuro de etilio. A partir de los 25 de DNA extraídos con la técnica Roche se procedió a realizar electroforesis para cuantificar el DNA. En la fig. 1 se puede apreciar que la primera banda del marcador indica 10000 pb es decir 18 ng de la molécula en 4 pozos cuyas bandas correspondiente a la cepa 11B y en 3 pozos donde se colocó la cepa 140 se calcula la misma cantidad de un aprox. de 90 ng en 25ml de cada una de las cepas. DISCUSIÓN: La preparación inadecuada del gel de agarosa la resolución de las bandas que se forman tienden a ser difusas y la composición y la fuerza eléctrica del tampón pueden afectar la movilidad del ADN, ya que en ausencia de iones se desplaza lentamente o no se mueve y con demasiado iones se sobrecaliente o se funde.
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TECNOLOGICO NACIONAL DE TUXTLA GUTIERREZ ING. BIOQUIMICA
BIOQUIMICA DEL NITROGENO Y REGULACION GENETICA
ALUMNO: Edwar Kennedi Ramírez Méndez. FECHA: 18/nov./2014
CATEDRATICO: Reiner Rincón Rosales.
TRABAJO: Reporte de practica (ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA)
RESUMEN: Se utilizó un método (electroforesis en gel de
agarosa) que permitió verificar y cuantificar la cantidad de ADN
cromosómico extraído de una célula bacteriana. El gel se
colocó en la cubeta de electroforesis, posteriormente las
muestra y de esta forma las moléculas de DNA sometidas a
electroforesis se desplazaron al polo positivo .La distancia
recorrida por cada fragmento de DNA fue inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Tras la
electroforesis, se visualizó el gel con una lámpara de luz UV, y
se logró apreciar las bandas correspondientes a las muestras
de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.
1.-INTRODUCCION: El término electroforesis se usa para
describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico (Nelson & Cox, 2001). Muchas
moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos,
proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien
como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas
se van a separar en función de su carga cuando se aplica un
voltaje a través de los electrodos. La electroforesis en gel es
una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos
de moléculas de ácidos nucleicos. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma. Es importante la
utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos
permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de
DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le
añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las
bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta. Después de la electroforesis, se visualiza el gel con
una lámpara de luz UV.
OBJETIVO: Conocer y aplicar la técnica de electroforesis
horizontal en agarosa para verificar y cuantificar la cantidad de
ADN cromosómico extraído de células bacterianas.
2.- PROCEDIMIENTO: Preparación de agarosa: En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, se colocó 100 ml de solución TAE 1X y se disolvió 0.8 gr de agarosa tipo I, después se licuo en el microondas con el tiempo requerido (hasta que la solución quedo totalmente diluida, cero impurezas). Se Colocó la agarosa en el molde de la cámara de electroforesis cuidadosamente y luego se colocó el peine: se cuidó que los niveles de los peines de los pozos queden a ¾ del volumen, y eliminamos las burbujas que se formaron. Se dejó enfriar a 8°C durante 20 minutos. Llenado del gel de agarosa: Se colocó las muestras en cada pozo correspondiente en el gel de agarosa. En el pozo No. 1 se colocó 2 μl del marcador DNA, previamente mezclado con 3 ul de colorante Buffer azul. De la misma manera se colocó las muestras problemas en los pozos en su respectivo orden consecutivo. En este caso se colocó 6 μl ADN y mezclar con 3 μl de colorante azul. Posteriormente se Colocó el molde de agarosa en la cámara de electroforesis y se dejó correr a 110 Volts durante 35 minutos. Pero antes el recipiente de la cámara se llenó con solución TAE 1X.
Revelado del gel de agarosa: Cuidadosamente se colocó el gel en un recipiente con bromuro de etilio al 5% y se revelo la muestra durante 10 minutos en la oscuridad. Después, lavar el gel con agua corriente para poder verificar el ADN se analizó en un transiluminador a una longitud de 302 nm.
3.- RESULTADOS Y DISCUSION:
4.- CONCLUCION:
Se logró verificar exitosamente y cuantificar la cantidad de ADN
cromosómico extraído de una célula bacteriana mediante esta técnica
de electroforesis en gel de agarosa. Cabe mencionar que resulto ser
una técnica efectiva, por lo que es recomendable para su uso a nivel
laboratorio de investigación siempre y cuando teniendo los cuidados
de quien lo realiza, recordando que se hace usos de reactivos
altamente peligrosos como el caso de bromuro de etilio para la tinción
del ADN por lo cual puede mencionarse que genera una desventaja
para este método.
5.- BIBLIOGRAFIA:
--Bio-Rad: Protocolo que acompaña al “Quantum Prep Miniprep Kit”. --Nelson DL, Cox MM (2001): “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Editorial Omega (Barcelona, España), pp 1119-1128.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté (Barcelona, España), pp 152-154.
.
Vo.Bo Jefe del laboratorio
T.L.Q Araceli Morales Fonseca (Jefa de lab. Microbiología)
Fig.1 Electroforesis en gel de
agarosa al 1% de DNA bacteriano
teñido con bromuro de etilio.
A partir de los 25𝜇𝑙 de DNA extraídos con la técnica Roche se procedió a realizar electroforesis para cuantificar el DNA. En la fig. 1 se puede apreciar que la primera banda
del marcador indica 10000 pb es decir 18 ng de la molécula en 4 pozos cuyas bandas correspondiente a la cepa 11B y en 3 pozos donde se colocó la cepa 140 se calcula la misma cantidad de un aprox. de 90 ng en 25ml de cada una de las cepas. DISCUSIÓN: La preparación inadecuada del gel de agarosa la resolución de las bandas que se forman tienden a ser difusas y la composición y la fuerza eléctrica del tampón pueden afectar la movilidad del ADN, ya que en ausencia de iones se desplaza lentamente o no se mueve y con demasiado iones se sobrecaliente o se funde.
