ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE

Presencia de Sodio Dodecil Sulfato bajo condiciones reductoras (SDSPAGE)

Mtodo rpido, reproducible y de bajo costo

Utilizado para cuantificar, comparar y caracterizar protenas

Tcnica analtica semipreparativa : se separan biomolculas segn su tamao molecular bajo la accin de un campo elctrico. (Laemmli 1.970).

Permite separar protenas hacindolas pasar por un gel o resina: bisAcrilamida, la cual es un agente entrecruzador que genera un polmero sobre el cual se adherirn las protenas.

La separacin electrofortica se realiza en condiciones desnaturalizantes, al aadircompuestos que alteren las condiciones nativas de las protenas y que se agrupan en una solucin denominada: tampn de carga.

GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

Electroforesis vertical

Soporte: Gel de Poliacrilamida

* Polimerizacin de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida

* Variacin de la concentracin variacin del tamao de poro

[poliacrilamida] tamao poro

1. Preparacin del gel2. Montaje de la cubeta3. Aplicacin de la muestra4. Electroforesis5. Deteccin por tincin:

Azul de CoomassieSales de plata

Condiciones de la PAGE:

* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAO PAGE

S-S

S-SS-S

-----

--- -

- -----

- -

+ SDS+ DTT

25 kDa

S-S S-S

+ SDS - --

-

----

--

--

--

--

S-S

- -

-

----

--

--

- -

--

-

- -44 kDa

S-S

S-SS-S

50 kDa

* Desnaturalizantes: separamos slo por TAMAO SDS-PAGE

Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sdico), urea, reductores: DTT, -mercaptoetanol

SDS: detergente aninico (-), dota a todas las protenas de carga (-) todas migrarn hacia el nodo (+), separndose slo por tamao

Tampn de carga contiene:

Mercaptoetanol, un agente reductor, que se encarga de eliminar los puentes disulfuro que se forman en la estructura terciaria de las proteinas entre los restos Cistena

El SDS (lauril sulfato) es el detergente que se une a las protenas, las desnaturaliza y le aporta sus cargas negativas

Azul de bromofenol, colorante con carga negativa y con una movilidad electrofortica que equivaldra a pequeos polipptidos. Su funcin es la de marcar el frente de electroforesis.

Al aplicar un campo elctrico a la muestra inmersa en el tampn de carga, el complejo protena-SDS migrar hacia el polo positivo y se separar segn su tamao.

Los polipptidos de menor peso molecular migrarn ms rpido.Los de alto peso lo harn ms lentamente.

Las aplicaciones ms comunes de esta tcnica son:

Anlisis del grado de pureza de una protena

Determinacin de su peso molecular

Verificacin de la concentracin de protenas

Deteccin de protelisis

Identificacin de protenas inmunoprecipitadas

Separacin de protenas marcadas con istopos radioactivos

Ventajas:

Gran poder de separacin por TAMAO

Qumicamente inertes

Transparentes (permite densitometra)

Estables (pH, fuerza inica, temperatura)

Versatilidad en cuanto al tamao de poro y entramado uniforme

SDS-PAGE: determinacin del peso molecular

Marcadores de peso molecular :

Mezcla de diferentes protenas pre-teidas de las que conocemos el peso molecular.

Por comparacin podemos averiguar el PM aparente de nuestra protena.

Cuatro componentes lquidos:

Acrilamida

Agente entrecruzante Bisacrilamida

APS (Persulfato de amonio) radicales sulfato inician la polimerizacin

TEMED (Tetrametilen, etilendiamina) propaga la poli merizacin

Geles de Corrida y Apilamiento

Tcnica de electroforesis discontinua. Se preparan 2 geles:

el gel de corrida donde se separan las protenasel gel de apilamiento o gel concentrador (stacking) que concentra la mezcla

El gel de Corrida que separar las muestras posee mayor concentracin de Acrilamida (10%) y pH ms bsico ( 8,3). Ofrece mayor resistencia en la corrida

El gel de apilamiento posee baja concentracin de acrilamida (4%) en tampnligeramente cido (Tris/HCl 1M pH 6,8). Ofrece poca resistencia a la mezcla de protenas sometidas a electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa rapidez.

Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida, se prepara, en la partesuperior de ste el gel de apilamiento.

Bajo la accin del campo elctrico, la mezcla proteica, colocada sobre el gel de apilamiento, comienza a migrar hacia el polo positivo.

Cuando las protenas atraviesan el gel de apilamiento, se encuentran con laresistencia ejercida por el gel de corrida de manera que aquellas protenasretardadas puedan alcanzar al resto y todas inicien la separacin desde elmismo punto, mejorando as la calidad de la corrida.

El gel de apilamiento se prepara siempre a una concentracin de acrilamidadel 4%, mientras que el gel de separacin o gel de corrida se prepara segn el rango ptimo de resolucin:

Preparacin y colocacin de las muestras

Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, colocar el cassette en el tanque de electroforesis con aproximadamente 500 ml tampn de corrida en el cual estn sumergidos los electrodos.

Quitar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos del gel.

Preparar las muestras. Se tomarn 20 l de la muestra y se diluirn con 20 l de tampn muestra 5X por pocillo. Calentar 3 min. a 90C para desnaturalizar.

Incluir un estndar de peso molecular.

Sembrar 20l de muestra por pocillo mediante el uso de una pipeta hamilton

Corrida Electrofortica aplicando corriente (100 mA) de 40 a 80 volts 2 h aprox

Finalizada la corrida, extraer los vidrios cuidadosamente del cassette y separarlos de manera que el gel quede posado sobre uno de los vidrios.

Sumergir el gel en solucin colorante azul de Coomassie durante 40 minutos.

Sumergir el gel en solucin decolorante metanol, cido actico glacial, agua dest. para eliminar las asociaciones inespecficas del gel al colorante.

Observar las bandas proteicas.