Electroforesis en Geles deElectroforesis en Geles de Poliacrilamida Unidimensional

MSc (c)Francisco Javier León

AplicacionesAplicaciones

Purificación análisis y caracterización de proteínasPurificación, análisis y caracterización de proteínasDeterminar la masa relativa de una proteínaV ifi l ió d iVerificar la concentración de proteinasDetección de modificaciones en las proteínasExpresión Global de proteinas (E 2 dimensiones)

Isoelectroenfoque (IEF)SDS-PAGE

Mapeo de péptidos (digestión proteolítica)Inmunoblotting

Amino ácidos como electrolitosAmino ácidos como electrolitos

pI: carga neta es igual a cero

pK1 + pK 2

2pI =

Punto isoeléctricoPunto isoeléctrico

Amino ácidos: NomenclaturaAmino ácidos: Nomenclatura

Polipéptidos como polianfolitosPolipéptidos como polianfolitos

Glu Gly Ala LysGlu – Gly – Ala - Lys

Gl 2 2 9 7 4 2Glu:: 2.2, 9.7. 4.2

Gly:2.3, 9.6

Ala:2.3, 9.7

Lys: 2.2, 9.0, 10.0

ElectroforesisElectroforesisEl término electroforesis fueintroducido por primera vez enintroducido por primera vez en1907 por Michaelis, técnica en lacual una partícula cargada( t í ) h d l(proteína) se hace desplazar através de un medio (gel depoliacrilaminida, agarosa, papel)aplicando un campo eléctrico.

Paramentros que influyen:Paramentros que influyen:VoltajeDistancia entre los electrodosTamaño y forma de la moléculaTemperaturaTiempoTiempo

La velocidad de migración depende de dos factoresLa velocidad de migración depende de dos factores

C d i d l i i t tá l f j idConduciendo el movimiento está la fuerza qε ejercida porel campo eléctrico sobre la partícula

q es la carga de la molécula (columbios)q es la carga de la molécula (columbios)ε es la fuerza del campo eléctrico (voltios por metro)

Resistiendo el movimiento esta la fuerza de fricción fv delmedio sobre la partícula

v es la velocidad de la partículaf es el coeficciente de fricción

fv = qεq

Geles de poliacrilamida: Continuos y discontinuosGeles de poliacrilamida: Continuos y discontinuosBuffer continuo o discontinuo

Geles continuos: (Weber and Osborn 1969)[ ] ctte de acrilamida[ ] ctte de acrilamida Buffer constanteExiste un único gel separador que emplea el mismo tampón en lostanques y en el gel.

Geles discontinuos:(Laemmli 1970)Geles discontinuos:(Laemmli 1970)“geles de apilamiento” poro no restrictivo (3-4%T)“Geles de resolución o separador ” (7-25% T) En este sistema cada uno de los geles se prepara con tampones dediferente pH y fuerza iónica, y el tampón de electroforesis es un tercertipo de tampón

Electroforesis discontinua multifasica gel bufferElectroforesis discontinua multifasica gel-buffer

3-4 % T

7-25 % T

Geles de PoliacrilamidaGeles de Poliacrilamida

El tamaño del poro porcentaje de acrilamidaEl tamaño del poro porcentaje de acrilamida

Alto (10-15%T) son óptimos para la separación deproteínas de pequeño tamaño (menores de 50KDa)

Menores (<10%T) son los indicados para la separación deproteínas mayores.

La relación utilizada entre acrilamida y bisacrilamida esLa relación utilizada entre acrilamida y bisacrilamida es37,5:1.

Tamaño del poro del gel es el mejor factor para determinar la resolución de las protínas (Hjertén 1962)para determinar la resolución de las protínas (Hjertén 1962)

T = total de la concentración en porcentaje de los monómeros ( l id l N N’ th l bi l id )( acrylamide pluss N,N’-methylenebisacrylamide)

%T = acrilamida (gr) + bisacrilamida (gr) * 100%T = acrilamida (gr) + bisacrilamida (gr) * 100100 ml

C l t j ( ) d l l d N N’C = es el porcentaje (por peso) de los enlaces cruzados N,N’-methylenebisacrylamide relativos al total de los monomeros

%C = bisacrilamida (gr) * 100acrilamida (gr) + bisacrilamida

El tamaño del poro es inversamente proporcional a %T

Otros factoresOtros factores Composición del buffer: Tripsina (pk 8.15) en vez deglicina (pk 9 6) facilita la resolución de péptidosglicina (pk 9.6) facilita la resolución de péptidospequeños (Schanger and von Jagow 1987)

pH: Las propiedades de tamizado son alteradasIncremento de pH de 8.9 a 9.2 se realiza para incluirp pproteinas de baja masa molecular (10-20 K) sin sacrificarla resolución

Aditivos a los geles: Los detergentes (tritonx100, SDS) ypolímeros como dextran ficoll entre otros inhiben lapolímeros como dextran, ficoll entre otros inhiben lapolimeración de la acrilamida generando poros detamaño grande

Movilidad de las partículas en la electroforesis en gelMovilidad de las partículas en la electroforesis en gel

Determinación de la masa molecular (Mr) de una proteínaElectroforesis en gel con SDSElectroforesis en gel con SDS

Determinar el peso molecular nativo

Las estructuras 2 3 y 4 de las proteínas seLas estructuras 2, 3 y 4 de las proteínas se descomponen

La cadena se rodea del SDS

Carga es insignificanteCarga es insignificante

Carga y longitud son proporcionales al tamaño de la cadena

Colorantes VideoColorantes VideoLas proteínas separadas mediante SDS-PAGE pueden

i li d l l di di é d dser visualizadas en el gel mediante diversos métodos de tinción: A l coomassie (sensibilidad hasta 50 ng)Azul coomassie (sensibilidad hasta 50 ng)Fluorescencia SYPRO RUBY (280 nm y 450/610 nm) (sensibilidad hasta 50 ng)(sensibilidad hasta 50 ng)Coloración de Plata compatible con espectrofotometría de masas (Sensibilidad 1 a 2 ng)de masas (Sensibilidad 1 a 2 ng)

2D- PAGE2D PAGESeparación de mezclas de proteínas altamente complejasL t í d i l t d it iLas proteínas son separadas secuencialmente por dos criteriosfísicos:

En primer lugar son separadas en un gel con gradiente de pH encondiciones desnaturalizantes de acuerdo con su puntoisoeléctrico (isoelectroenfoque)isoeléctrico (isoelectroenfoque).

Segundo lugar tras esta separación por carga son separadas deSegundo lugar tras esta separación por carga son separadas deacuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua engel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE).

La tinción del gel permite que las proteínas aparezcan formandomanchas circulares (spots).( p )

2D-PAGE O’f ll d J Kl 19752D PAGE O’farrell and J. Klose 1975

Preparación de las muestrasPreparación de las muestrasLisis de las células o destrucción de los tejidos j

Baja TInhibidores de proteasasSustancias interferentes (removidas con ácido tricloroacetico)Reactivos de calidadPreparar la muestras y realizar inmediatamente el IEF

d l í l f óSeparar todas las partículas por centrifugación

Solubilización de las proteínasSolubilización de las proteínasCompletamente solubilizada, disgregada, denaturada y

d id t d li l IEF l l ireducida antes de aplicar el IEF para lo cual se requiere:

Un agente denat ante UREA o tio eaUn agente denaturante UREA o tiourea[] 2 a 8M

Un detergente neutro o zwitterionico (Triton X SDS)Un detergente neutro o zwitterionico (Triton X, SDS)[] final 0,25% (w/v) o inferior

Un agente reductor (puentes disulfuro y sulfidricos)Un agente reductor (puentes disulfuro y sulfidricos) 2-mercaptoetanol

[]20 a 100 mM

Buffers o anfolitos transportadores [] 40 mM o 2% (v/v)

Interferencias: I t i l ió i li ióInterferencias: Intervienen en la separación y visualización

Moléculas iónicas pequeñas Moléculas iónicas pequeñas Endógenas (metabólicos en tejidos y sales en suero)Exógenas (Buffer residual y sales)Interfieren en la separación de la 1D incrementan conductividad reducen la efectividad del IEF

ÁAcumulación el Ánodo o Cátodo en la tiraSoluciones:

l ( ) d l lPrecipitar las proteinas (TCA) y resuspenderlas en soluciones libres de salesDiálisis retirar salesDiálisis retirar sales

Interferencias: I t i l ió i li ióInterferencias: Intervienen en la separación y visualización

Ácidos NucleídosÁcidos NucleídosADN o ARNPobre enfoque en la región de ácida del gel IEFGeneran background en geles 2D coloreados con plata

Soluciones:óRemoverlos por ultracentrifugación

Adicionar nucleasas ( 1 mg/ml Dnasa I, o,25 mg/ml RNasa)Adicionar ureaAdicionar urea Emplear Benzonasa endonucleasa bacteriana

Interferencias: I t i l ió i li ióInterferencias: Intervienen en la separación y visualización

LípidosLípidosForman complejos con:Las proteínas: reducen la solubilidad Los detergentes: reducen su efectividad Solución:

áPrecipitarlos con solventes orgánicosUsando un exceso de detergente

Interferencias: I t i l ió i li ióInterferencias: Intervienen en la separación y visualización

Compuestos fenolicosCompuestos fenolicosModifican las proteínas reacciones de oxido reducciónSoluciones:

Emplear diotreitol (DTT) durante la extracción Técnicas de precipitación Enzima fenol oxidasa es inhibida por la tioureaEnzima fenol oxidasa es inhibida por la tioureaSecuestrados por polivinilpirrolidona

ColorantesColorantesAzul Azul coomassiecoomassie ((aminotriarilmetanoaminotriarilmetano) ) Robert Robert WebsterWebster y Stephen y Stephen FazekasFazekas 19631963No forma complejos covalentes con las proteínasFuerzas de van der Waals einteracciones con grupos aminosFuertemente protonado(a.a. básicos) Arginina, lisina, tirosina y histidina Ley de Beer -LambertSensibilidad hasta 50 ng

ColorantesColorantesAzul Azul coomassiecoomassie ((aminotriarilmetanoaminotriarilmetano) )

ColorantesColorantesColoración de Plata amoniacal. Coloración de Plata amoniacal. SwitzerSwitzer et al 1979et al 1979Alta sensibilidadAlta sensibilidad Problemas background alto Rabilloud et al 1994 en 100 protocolos: cinco pasos

FijaciónSensibilicaciónImpregnación con platap g pRevelar la imagen Estabilización de la imagen

Sensibilidad 2 a 4 ng de proteína en spotSensibilidad 2 a 4 ng de proteína en spotCalidad del agua: Agua desionizada con una resistividad de más 15 moh/cm para la soluciones y lavadosAgua destilada no puede ser usadaAgua destilada no puede ser usadaEspectrometría de masas compatible con coloración de plataEspectrometría de masas compatible con coloración de plata

Coloración de Plata amoniacalColoración de Plata amoniacalColoración de Plata amoniacal. Coloración de Plata amoniacal.

Las proteínas se separan con4.20% de SDS-gel degpoliacrilamida y se visualizaronmediante tinción de plata.Punta de flecha indica co-Punta de flecha indica co-inmunoprecipitadas proteínas.

Fuente: Purificación de un complejo de proteínasque se asocia con la cromatina. Masahiro Okada,maokada@lab.nig.ac.jp, Departamento de GenéticaMolecular del Instituto Nacional de Genética y de laUniversidad de Graduados de Estudios AvanzadosUniversidad de Graduados de Estudios Avanzados,Mishima, Shizuoka 411-8540, Japón

ColorantesColorantesFluorescencia SYPRO RUBYFluorescencia SYPRO RUBYEstructura del colorante no es de dominio publicoForma un complejo orgánico con metales que se une

ádirectamente por mecanismos electrostáticos (280 nm y 450/610 nm) (sensibilidad hasta 50 ng)Interacciona con los a.a. básicos Arginina, lisina y histidina Muy costoso

ColorantesColorantes

Fuente: http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Stains/BioRadSyproRubinProtStains.pdf

Transferencia de proteínas VideoTransferencia de proteínas VideoWesternWestern blottingblotting ((TowbinTowbin etet alal 19791979)):: es una técnicausada para identificar y localizar proteínas en función desu capacidad para unirse a los anticuerpos específicos.

VisualizaciónVisualización DensitómetrosDensitómetros

Escáner de fluorescenciaEscáner de fluorescencia

Funcionan con softwares de análisis diseñados parapdetectar y cuantificar “spots” en las imágenes digitalesasí como para comparar y analizar estadísticamente los

l d i égeles de interésEl software de análisis usado en el Servicio es elPDQuest de Bio Rad Se ofrece la opción de usar elPDQuest de Bio-Rad. Se ofrece la opción de usar elsoftware Decyder de GE para análisis de imágenesDIGE.DIGE.

Visulaización y análisis de los geles 2DVisulaización y análisis de los geles 2D

Análisis de los geles 2DAnálisis de los geles 2DDetectar y cuantificar proteínasIdentificar cambios en la expresión de proteínasSoftware:Software:

Z3 (Compugen)Melanie III (Genebio and Bio-Rad)Melanie III (Genebio and Bio Rad)PDQuest (Bio-Rad)Phoretix 2D advance (PerkinElmer Wallac)( )

Análisis de los geles 2DAnálisis de los geles 2D

Parámetros: Sensibilidad, tamaño del pozo, reducción del background y número de smoothsnúmero de smooths

Análisis de los geles 2DAnálisis de los geles 2D