Aplicaciones clnicas

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLINICA ELISAAlaniz Salinas Michel AndreaBarrera Velzquez GerardoChvez Betancourt AdrianaCortez Galindo DennisMendoza Romn MaydaELISA(Ensayo de Inmunoadsorcion Ligada a Enzima)Se basa en dos fenmenos biolgicos1.- La elevada afinidad de los Ab

2.- La alta actividad de algunas enzimas usadas, que permiten la amplificacin de la seal generada por la muestraClasificacin de Enzimoinmunoanalisisa. Homogneob. HeterogneosHomogneos Se realizan exclusivamente en fase liquida

HeterogneosSe emplea un soporte solido para inmovilizar a uno de los inmunoreactantesSencillez y aplicabilidad.

Amplificacin:(No competitivo)Se emplea un gran exceso de inmunoreactante con el objetivo de obtener una seal mxima debida a la presencia del compuesto a ser usadoUn exceso de inmunoreactante permite detectar niveles bajos de analito que se requiere determinarModulacin: (competitivo)Se modula la actividad del conjugado enzimtico por competicin con el analitoMenores cantidades del conjugado enzimtico permiten obtener una deTectibilidad mayor, ya que pequeas cantidades del competidor tienen gran impacto sobre la actividad enzimtica determinada en la fase solidaInmunoensayos en fase solidaIndependientemente de la estrategia utilizada se distinguen 3 etapasInmovilizacin del inmunoreactante (Ab o Ag) en fase solida

Incubacin con la muestra de modo que esta reaccione con el inmunoreactante inmovilizado

Amplificacin o modulacin por medio de la utilizacin de un conjugado enzimtico.

FundamentoELISAUna enzima conjugada con un Ab reacciona con un sustrato incoloro para generar un producto con reaccin de colorFosfatasa alcalinaPeroxidaza de rabano picanteGalactosa Cromogeno12Basada en la deteccin de un Ag inmovilizado sobre una fase slida mediante Ac que directa o indirectamente producen una reaccin cuyo producto, puede ser medido espectofotomtricamente.

Enzimas empleadas y criterio de seleccin Enzimas y sustratos cromognicos deben reunir ciertos requisitosTiempo de incubacin con sustratos; 10-30 minutosReacciones enzima-sustrato se detienen por agregado de bases o cidos

Caractersticas que deben reunir enzimasEstables durante su almacenamientoFcil preparacin, elevada pureza y bajo costoActividad enzimtica alta y detectableCompatibles con condiciones del ensayoFcilmente conjugables con anticuerpoPeroxidasa:Hemoproteinas que transfieren desde un donante (DH) al H2O2HRP o horseradish peroxidaseEn etapa de revelado se utilizan donantes de H, para que el cromgeno o producto formado sea soluble y cuantificable por espectrofotometra

2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS)

Producto oxidado, mx. Abs= 414nm.

16Fosfatasa alcalina:- Aislada del intestino bovino o de E. coliHidroliza esteres de fosfatoTienen pH alcalinoRequieren de Mg y Zn como cofactoresSustrato: para-nitrofenilfosfato (p-NPP)

p-nitrofenol ( producto de hidrolisis) absorbe a 450nm

.

Ureasa:Empleada para establecer el punto final en una titulacin por determinacin visualLa reaccin catalizada por la enzima es la hidrolisis de la urea con formacin de CO2 y NH3

Ureasa + purpura de coloracin bromocresol purpura .

PRINCIPIO DE INMUNO ENSAYO ABSORBENTE EN FASE SLIDA DIRECTOPOCILLO DE MICROTITULACIN

PARTICULAS

Medios en fase solida para la tcnica de ELISAPOLIESTIRENOCLORURO DE PILIVINILO (PVC)NYLONPOLIPROPILENONOTROCELULOSACELULOSAGOMA DE SILICONA VIDRIOSPIA

TIPOS DE ELISA.Directo.

Indirecto.

Tipo sandwich o captura de antgenos.

Competitivo.ELISA DIRECTO.ENSAYO ELISA SIMPLE DE DOS CAPAS:

Las placas se recubren los pocillos con las soluciones problema de Ag.Incubar con Ac marcados. Es necesario incluir controles negativos (muestras con ausencia del Ag).Se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el Ag buscado, o bien aadido).

ELISA INDIRECTO.Las placas se preparan de forma idntica a la anterior. Los controles positivos y negativos.El sistema de deteccin emplea dos Ac:

primario contra el antgeno.secundario marcado contra el primario.

Mayor sensibilidad por amplificacin de seal (por unin de 2 ms Ac secundarios por cada primario).

(1) El antgeno se pega a la placa.

(2) Aadir el suero problema.

(3) posteriormente, el conjugado.

(4) por ltimo, el sustrato.

ELISA SANDWICH.ENSAYO DE CAPTURA DE ANTGENO Y DETECCIN MEDIANTE INMUNOCOMPLEJOS:Se recubre el pocillo con un primer Ac anti-Ag o Ag anti-Ac

Aplicar la muestra problema en la que se encuentra elAg (ser retenido al ser reconocido por el 1er Ac.

Se aplica una solucin con un 2 Ac anti-Ag marcado.

As pues un Ag + un Ac + un2 Ac al menos, que lo marca.

(1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-Ag unido a la placa.

(2) se incubar con la muestra problema.

(3) se aadir el conjugado.

(4) por aadir el sustrato.

Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

ELISA COMPETITIVO.En este sistema se parte de un Ac (monoclonal o policlonal), frente a un Ag conocido, previamente ha sido inmovilizado en la placa.

Se denomina de competicin ya que el suero problema es incubado previamente con el Ag, antes de incubarlo con el anti-suero fijado en la placa, y por tanto compite con l.

(1) Se incuba el suero problema con el antgeno.

(2) Depositar la mezcla anterior sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un suero anti-antgeno.

(3) se aade el conjugado.

(4) despus, el sustrato.

En este caso la ausencia de color sera positivo Aplicaciones clnicas

Aplicaciones clnicas

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TECNICA DE ELISAMTODO VENTAJAS Se utilizan pequeas cantidades de reactivos.Incrementa la tasa de reaccin dependiendo del medio utilizado.Estable cuando se almacena y manipula adecuadamente.Puede almacenarse a 4C por ms de 6 meses. Hay variedad de sustratos a utilizar amplia variedad de substratos comerciales disponiblesDesventajasEs costoso.En algunos casos hay impedimento estrico( fosfatasa alcalina) a diferencia de la peroxidasa.Se inactivan por agentes quelantes.Es un proceso largo.

MtodoDeteccin de ELISA se divide en dos sesiones.1. preparacin del antgeno 2.titulacin de conjugado de peroxidasa unido a un Ac de chivo anti cadenas y humanas.

a A B C D E F G

Mtodo

Tubo A 3mL-solucion de IgG DE 128g/mL-realizar diluciones de 1.5 mL-disuelta en amortiguador de recubrimiento B-G(3.0 mL) Eliminar sobrenadante, bloquear con albumina srica bovina 1%desechar y lavar 4 veces con PBS-tweenTubo A 3ml de sol. AgG a una () 128 mg/mL disuelta en amortiguador de recubrimiento, realizar diluciones al doble con vol. De 1.5 mL del amortiguador de recubrimiento en los tubos de la B-G, de tal manera que al final todos tubos tengan 1.5 mL de volumen, excepto el t. G.34Mtodo

Enumerar del 1-11-realizar diluciones al doble PBS del conjugado de peroxidasa anti IgG humana-comenzar dilucin 1.500, usar vol. 1 mLLeer 490 nmColocar en cada pozo 100L35REFERENCIASDaz J. Fernndez M. Paredes F. aspectos bsicos de bioqumica clnica. Ed Daz de Santos. Espaa. 1996.Ochoa R. tcnicas inmunoenzimaticas para ensayos clnicos de vacunas y estudios inmunoepidemiolgicos. Ed. Serie monogrfica. Cuba. 2012.Fuentes X. Castieiras M. Queralto J. Bioqumica clnica y patologa molecular. Vol. 1. 2da. Edicin. Ed. Revert, S.A. Espaa. 1998.