Elisa upao
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INMUNODIAGNOSTICO
DR. CARLOS ESQUERRE AGUIRRE
MEDICO PATOLOGO CLINICO HVLE
INMUNOANALISIS
SON TECNICAS PARA
DETECTAR Y CUANTIFICAR
AG O AC.
UN IE DEBE SER CONFIABLE,
OPORTUNO Y EFICIENTE.
La gran especificidad de Ac, los hace de gran utilidad como reactivos para detectar, cuantificar y purificar Ag
Debido a que puede producirse Ac prácticamente frente a cualquier molécula, se les puede usar para estudiar cualquier tipo de molécula
Inmunoanálisis
Inmunoanálisis
Basado en la presencia de un Ag o Ac, cuya cantidad puede determinarse por medio de una molécula indicadora
Cuando la molécula indicadora es marcada con un radioisótopo, (Yalow y Berson, 1959) se puede cuantificar ultizando instrumentos que detectan la descomposición radioactiva. RIA
Inmunoanálisis
Cuando la molécula indicadora está unida covalentemente a una enzima, puede cuantificarse determinando la capacidad de la enzima de transformar un sustrato transparente en un producto coloreado
A este se le llama enzimoinmunoanálisis
CLASIFICACION DE IE
POR USO DE MARCADORSIN MARCA: PRECIPITACION,
INMUNOELECTROFORESIS, NEFELOMETRIA, INMUNOTURBIDIMETRIA.
CON MARCA: ISOTOPICOS Y NO ISOTOPICOS (ENZIMATICOS Y NO ENZIMATICOS)
CLASIFICACION DE IE
DE ACUERDO AL METODO
DE DETECCION:
COLORIMETRICO
FLUORESCENTE
QUIMIOLUMINISCENTE
CLASIFICACION DE IE
SEGÚN EL DISEÑO DEL SISTEMA DE REACCION:
HOMOGENEO Y HETEROGENEO
COMPETITIVO O NO COMPETITVO
NOMENCLATURA
SE HA RECOMENDADO LLAMAR:INMUNOENSAYO (RADIO, ENZIMO Y
FLUOROINMUNOENSAYO) A AQUELLOS QUE SON DE DISEÑO COMPETITIVO.
ENSAYO INMUNOMETRICO (INMUNORADIOMETRICO, ETC) PARA AQUELLOS NO COMPETITIVOS
EMPLEO DE MARCADORES Y NOMENCLATURA DE LOS IE
EL ANALISIS TIPO I (EXCESO DE
ANTICUERPO) ESTA BASADO EN
MARCAR EL AC REACTIVO.
EL TIPO II (EXCESO DE ANALIZADO),
SE MARCA LA SUSTANCIA
ANALIZADA.
Marcado Enzima
Radioisótopo
Coloidesmetálicos
Látex
Fluoróforo
Hematíes Partículas decolorante
LIMITES DE DETECCION DE MARCADORES DE INMUNOENSAYOS MARCADORFOSFATASA
ALCALINAEUROPIO QUELATOYODO 125ESTER DE
ACRIDINIORUTENIO
CRITERIOS PARA SELECCIONAR UN MARCADOR ENZIMATICO
PUREZASENSIBILIDADFACILIDAD DE VELOCIDAD DE DETECCIONAUSENCIA DE FACTORES QUE
INTERFIERANGRUPOS REACTIVOS POTENCIALESESTABILIDAD IDONEIDAD PARA UN EIA HOMOGENEO
Ventajas EIA frente a RIA
Se evita la exposición a radiacionesReactivos más establesNo se requiere instalaciones ni autorizaciones
especialesMediciones rápidas y fácilmente automatizablesCosto
ELISA
Elemento de captura en la fase sólida.Anticuerpo en el suero del paciente (+) o (-)Reacción con el conjugado Cambio de aspecto del substrato por acción de la Enzima.El cambio de aspecto del substrato es proporcional a la cantidad del elemento “puente” es decir el anticuerpo presente en el suero del paciente positivo.
El suero que no aporta el elemento puente (anticuerpo) , no mantiene a la enzima en el sistema y por lo tanto no se producen cambios en el aspecto del substrato y es negativo
ELISA
(+) (-)
Antígeno-Anticuerpo y conjugado antiglobulina - EnzimaCambio de color del substrato
Con
cen
trac
ión
rel
ativ
a
Infección
Meses AñosSemanas
IgMIgM
Respuesta InmunológicaRespuesta Inmunológica
IgGIgG
Seroconversión
AgAg
Días
AntígenoAnticuerpo
Ag - Ac
ELISAReacción antígeno-anticuerpo
ELISAReacción antígeno-anticuerpo
Elisa : Reacción muestra - conjugadoElisa : Reacción muestra - conjugado
H2O2
H2O
O2
Tampón sustrato
TMBCromógeno
Elisa: Reacción del sustratoElisa: Reacción del sustrato
ConjugadoAnticuerpo IgG
Antígenorecubriendoel pocillo
Antígeno
Anticuerpo de captura
Anticuerpo IgM
Bioelisa : LeyendasBioelisa : Leyendas
Detección de IgGDetección de IgG
Fase
Solida
Fase
SolidaMuestraMuestra
ConjugadoConjugado
TMB
Detección de AntígenoDetección de Antígeno
TMBFase
Solida
Fase
Solida
MuestraMuestraConjugadoConjugado
Detección de IgM: InmunocapturaDetección de IgM: Inmunocaptura
TMBFase
Solida
Fase
Solida
MuestraMuestraConjugadoConjugado
Lavado
37°C37°C
Protocolo standard bioelisa:1.- Agregar muestra
Protocolo standard bioelisa:1.- Agregar muestra
Lavado
37°C37°C
Protocolo standard bioelisa:2.- Agregar el Conjugado
Protocolo standard bioelisa:2.- Agregar el Conjugado
TMB Temp. Amb.Temp. Amb.
TMBTMB
TMBTMB
H2O2H2O2
H2O2
H2O2
Protocolo standard bioelisa:3.- Agregar del Sustrato
Protocolo standard bioelisa:3.- Agregar del Sustrato
H2SO4
Protocolo estándar bioelisa:4.- Agregar Solución de parada
Protocolo estándar bioelisa:4.- Agregar Solución de parada
Fuente de luz
Filtro de 450 nm
Fotocélula
LECTURADENSIDADES OPTICAS
Cálculo de resultados
Protocolo estándar bioelisa:4.- Lectura de Absorbancias
Protocolo estándar bioelisa:4.- Lectura de Absorbancias
Lectura a 450 nm
Agregar solución de parada
Incubación
Dispensar Sustrato
Lavado
Incubación
Dispensar Conjugado
Lavado
Incubación
Agregar muestras y controles
Sensibilidad Especificidad
EstabilidadReproducibilidad Facilidad de usoAutomatizable
Guía de erroresGuía de errores
Elisa
Causas de error en el ELISACausas de error en el ELISA
MejorprevenirMejorprevenir
Leer y entender el manual de usuario
Preparar con tiempo el material
Programar el trabajo
Causas comunes de error en el ElisaCausas comunes de error en el Elisa
Errores de dilución durante la preparación de controles y reactivos
Rascado de la fase sólida durante la adición de muestras y/o reactivos
Pipeteo
Utilización de un tamaño de punta incorrecto
Comprobar que la pipeta no esté bloqueada y que dispense correctamente
Evitar contaminación cruzada con muestras y/o reactivos
Utilize puntas nuevas cada vez
Uso de instrumentación en mal estado. Asegurese que los instrumentos funcionen correctamente y estén calibrados.
Uso de los kits todavía frios. Permita que los kits y las muestras adquieran la temperatura ambiente antes de ser utilizados
Mezclar componentes de diversos lotes. Los reactivos están optimizados para cada lote de fabricación.
Contaminación:Salpicaduras de muestras o reactivo durante cualquier paso intermedio de la técnicaUso de puntas recicladasUso de viales sucios o mal secados en la preparación de los reactivos
Causas comunes de error en el ElisaCausas comunes de error en el Elisa
Calidad del agua destilada/desionizada. Parámetros como pH, iones, puede afectar la cinética de los Elisas. La pureza del agua es muy importante.
No utilizar los reactivos del kit pasada su fecha de caducidad
Retornar los kits a la nevera, entre 2-8°C inmediatamente después de usarlos.
Muy importante: Conserve las tiras no utilizadas junto con la bolsita desecante, en la bolsa de plástico con cierre que se incluye en cada kit
Causas comunes de error en el ElisaCausas comunes de error en el Elisa
Errores en el ELISAEsquema de investigaciónErrores en el ELISAEsquema de investigación
Nº Acción OK?
1 Revisar el procedimiento y determinar si ha habidoalgún error u omisión
2 Comprobar fecha de caducidad de los componentes
3Parámetros físicos: Tiempo
Temperatura incubaciónTemperatura ambiente
4 Equipo de laboratorio: Pipetas, lavador, lector5 Calidad del agua desionizada / destilada6 Preparación y conservación de los reactivos7 Los controles han funcionado según lo esperado ?8 Estaban los reactivos a temperatura ambiente?
Espacios libres cubiertos por la Albúmina bovina
¿Por qué falsos positivos?¿Por qué falsos positivos?
Antígeno HIV soluble fijado en la placa
IgG específica contra HIV
HIV Positivo verdadero
IgG contra Albúmina bovina
Falso positivo
¿Por qué falsos positivos?¿Por qué falsos positivos?
HIV Positivo verdadero HIV Falso positivo
RADIOINMUNOANALISIS
Así como en el sistema ELISA usamos una enzima y valoramos los cambios en el aspecto del substrato , en el RIA nos valemos de un ISOTOPO RADIOACTIVO unido a sistemas de anticuerpos .
Las lecturas se hacen por una valoración de la cantidad de radiación emitida , la que es proporcional a la concentración del analito estudiado .
RADIOINMUNOANALISIS
VALIDACION: CONSISTE EN COMPARAR SU RENDIMIENTO CON OTRO DE REFERENCIA
TRANSFERIBILIDAD:TIEMPO DE REALIZACION:SUSTANCIA PROBLEMA MARCADA.
RADIOINMUNOANALISIS
LOS METODOS RIA OFRECEN UN CONSIDERABLE ATRACTIVO POR SU EXTREMA SENSIBILIDAD, SU RELATIVA FACILIDAD DE CREACION Y SU COSTO RELATIVAMENTE BAJO.
COMPONENTES DEL SISTEMA RIA
SUSTANCIA: AG NO MARCADO.AG MARCADO.AC.MEDIO DONDE OCURRE LA
REACCION. ISOTOPOS COMO TRAZADORES: 3H Y
125I .
QUIMIOLUMINISCENCIA
El principio de la prueba es similar al de ELISA es decir una reacción de antígeno y anticuerpo .
Esta reacción se objetiva por la producción de luz a partir de una molécula de alta energía que es descompuesta por actividad enzimática.
La cantidad de luz producida es proporcional al analito investigado.
VENTAJAS DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA
PRESENTAN UN GRAN INTERVALO LINEAL. BAJO LIMITE DE DETECCION. ELEVADA ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ. LA MAYORIA SON PROCEDIMIENTOS DE UN
PASO. NO ES NECESARIO LARGAS INCUBACIONES. ESTABILIDAD DE COMPUESTOS
LUMINISCENTES
FACTORES QUE AFECTAN LAS MEDICIONES QLC
EL PH ES UNA VARIABLE IMPORTANTE.LAS REACCIONES SON DEPENDIENTES
DE LA TEMPERATURA.LOS COMPONENTES SERICOS COMO
ADENINA Y NUCLEOTIDOS DE PIRIDINA. (LAVADOS).
LA LUZ AMBIENTAL
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
UTILIZACION DE MARCADORES NO ISOTOPICOS MUY ESTABLES.
LA ELEVADA DETECTABILIDAD.
EL AMPLIO INTERVALO DE MEDIDA
LA FACIL SEPARACION DE LA FASE LIGADA DE LA LIBRE.
NECESIDADES EMERGENTES EN LOS ANALISIS
MENORES LIMITES DE DETECCION.DETECCION DE ANALITOS DE BAJO
PM.MAYOR ESPECIFICIDAD.VELOCIDAD DE PROCESAMIENTO DE
GRAN NUMERO DE MUESTRAS.DIAGNOSTICOS RAPIDOS.