Embriogénesis Somática en Onoto

7/24/2019 Embriognesis Somtica en Onoto

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EMBRIOGNESIS SOMTICA EN ONOTO1

Claret C. Michelangeli de Clavijo*, Paola I. Artioli G.**y Ada M. Medina M.**

1Trabajo financiado por el Fondo Nacionalde Ciencia, Tecnologa e Innovacin (FONACIT)

*Directora y **Asistentes de InvestigacinCentro de Investigaciones en Biotecnologa Agrcola (CIBA)

Apdo. 4579. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela

RECIBIDO: Marzo 12, 2002

RESUMEN

Con la finalidad de inducir la formacin de callos, embriones somticos y regeneracinde plntulas a partir de anteras de onoto, Bixa orellana L., se tomaron botones floralesmayores de 0,7 cm, con granos de polen uninucleados de 19 genotipos del campo

experimental del Instituto de Agronoma, Universidad Central de Venezuela. Lasanteras fueron sometidas a cinco regmenes de temperatura (8 C durante 0, 2, 4, 6 y8 das) removidas aspticamente. Se evalu el efecto de tres medios de cultivo:Murashige Skoog (MS) Nitsch y Nitsch y B5, con diferentes combinaciones dereguladores de crecimiento: cido naftalenactico (ANA), Kinetina (Kin), 2,4-dichlorophenoxiactico (2,4-D), Picloram (Pic), cido indolbutrico (AIB), 6-bencilaminopurina (BA) y Thidiazuron (TDZ) solos o en combinacin, probndosecondiciones de iluminacin y oscuridad para cada tratamiento. En los casos donde seutilizaron las sales MS suplementado con 4 mg l -1de ANA y 2 mg l-1de BA, bajooscuridad y a una temperatura de 30 1 C, para los genotipos identificados comoG1, 41 e I, se indujo la formacin de embriones somticos. No se observarondiferencias en la respuesta de los tratamientos a cinco regmenes de temperatura. Porotra parte, la germinacin de embriones hasta el desarrollo de plntulas se logr en elmedio MS, sacarosa (20 g l-1), sin regulador de crecimiento. El protocolo obtenidopermiti la regeneracin eficiente de plntulas mediante la embriognesis somtica apartir de cultivo de anteras.

Palabras Clave:Antera; Bixa orellana; cultivo in vitro; embriognesis somtica;embrin.

INTRODUCCIN

El onoto, Bixa orellana L., es una especie leosa tropical originaria de la cuencaAmaznica con un amplio margen de adaptacin a suelos y climas tropicales (Smith ySchultes, 1990). Presenta una gran variedad de usos como colorante natural y esutilizado por empresas procesadoras de alimentos, cosmticos y ungentos, puesresulta inofensivo para el consumo y aplicaciones en la piel (Arce, 1990).

Por ser una planta algama, surge el inconveniente de una amplia variabilidad en ladescendencia y en consecuencia desuniformidad al tiempo de la cosecha, en losrendimientos y en la calidad del producto comercial. El uso de un programa de


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mejoramiento que incluya la produccin de haploides ha sido utilizado para disminuireste tipo de variabilidad (Roca et al.,1991).

La tcnica del cultivo in vitrocon el uso de anteras representa adems unaherramienta muy til en plantas perennes como el onoto, ya que la produccin de

haploides y posterior generacin de individuos homocigotas en una sola generacin,permite acortar el tiempo en los programas de mejoramiento gentico, comparado conlas tcnicas convencionales (Luna, 1987; Moraes-Fernandes et al.,1999).

Hasta el presente, los estudios de regeneracin in vitropresentados en onoto se hanlimitado a la morfognesis y la micropropagacin usando como explantes hipoctilos ypices (Michelangeli y Atacho, 1996; Tamayo, 1997) as como segmentos nodales yapicales (DSouza y Sharon, 2001) a partir de plntulas obtenidas por semilla.

El trabajo tuvo como objetivo inducir la formacin de callos, embriognesis somtica yregeneracin de plntulas de onoto a partir del cultivo de anteras, examinndosefactores como la composicin del medio, tipo de explante, genotipo, ambiente fsico ypretratamientos con baja temperatura.

MATERIALES Y MTODOS

El trabajo se llev a cabo en el laboratorio de cultivo de tejidos del Centro deInvestigaciones en Biotecnologa Agrcola (CIBA) en el Instituto de Gentica, situado enla Facultad de Agronoma de la Universidad Central de Venezuela, Maracay.

Se utilizaron botones florales procedentes de 19 plantas adultas (segundo ao defloracin) del jardn de onoto existente en el campo experimental del Instituto deAgronoma, provenientes de semillas colectadas en las regiones andinas, centrales yorientales del pas (Cuadro1).

Se seleccionaron botones con longitudes mayores a 0,7 cm para cada uno de losgenotipos evaluados por presentar microsporas en estado uninucleado (Michelangeli etal., 2002). Estos fueron sometidos a cinco regmenes de temperatura: 8 C durante 0,2, 4, 6 y 8 das, lavados con agua jabonosa (jabn azul) para eliminar restos de tierray polvo, colocndose luego en etanol 70% durante 3 min. Posteriormente, fueronsumergidos en cloro comercial (ingrediente activo: hipoclorito de sodio) al 5,25%durante 5 min., seguido de tres lavados con agua destilada. Se eliminaron los ptalosexternos y sumergieron de nuevo en una solucin de hipoclorito de sodio al 2,5%durante 5 min. Bajo cmara de flujo laminar se realizaron tres lavados ms de aguadestilada previamente esterilizada. Finalizado el proceso de desinfeccin, fue eliminadoel resto de los ptalos quedando las anteras al descubierto.

Cuadro 1. Procedencia geogrfica de los 19genotipos de onoto utilizados en la induccin deembriognesis somtica.

Genotipo Origen

25,37 Gurico26 Mrida

G1, G6, G8, 21, 29, I Aragua7, 8, 9, 10, 18

Sucre

30, 40 Cojedes


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35 Carabobo41

Portuguesa

44 Nueva Esparta

Medios de cultivo

Para inducir la formacin de callo embriognico (medio I) se evalu el efecto de tresmedios de cultivo, a saber: MS (Murashige y Skoog, 1962), Nitsch y Nitsch (1969) yB5 (Gamborg et al.,1968), suplementado con myo-inositol (100 mg l-1), tiamina-HCl(0,1 mg l-1), cido nicotnico (0,5 mg l-1), piridoxina (0,5 mg l-1), casena hidrolizada(250 mg l-1), sacarosa (20 a 160 g l-1), pH ajustado a 5,8 2 y solidificado conPhytagel (2,5 g l-1). Asimismo, diferentes combinaciones de reguladores decrecimiento: cido naftalenactico (ANA), Kinetina (Kin), 2,4-dichlorophenoxiactico(2,4-D), Picloram (Pic), cido indolbutrico (AIB), 6-bencilaminopurina (BA) yThidiazuron (TDZ), observados en el Cuadro 2. Adicionalmente, se probaron trestiempos de cultivo en el medio I (21, 28 y 42 d), para determinar el tiempo ptimo deinduccin de callo embriognico.

Posteriormente, los callos embriognicos formados fueron transferidos a un medio deinduccin de embriones (medio II). El medio estuvo compuesto por las sales MS,suplementado con myo-inositol (100 mg l-1), tiamina-HCl (0,1 mg l-1), cido nicotnico(0,5 mg l-1), piridoxina (0,5 mg l-1), casena hidrolizada (250 mg l-1), sacarosa (60 g l-1), pH ajustado a 5,8 2 y solidificado con Phytagel (2,5 g l -1). Se probaron lossiguientes reguladores de crecimiento: BA (0,1 y 4,0 mg l-1), 2-ip (0,1 y 4,0 mg l-1),Kin (0,1 y 4,0 mg l-1) y medio bsico.

Una vez que ocurri la formacin de embriones en el medio II (a los dos meses decultivo aproximadamente), se seleccionaron aquellos que estuvieran en estado globulartransfirindose individualmente a un medio sin reguladores (medio III). El mismoestuvo conformado por las sales MS y vitaminas, suplementado con sacarosa (20 g l -1),

ajustando el pH a 5,8 2. La transferencia a medio fresco se mantuvo durante ochomeses con subcultivos en el mismo medio cada 60 d, para un total de cuatrosubcultivos.

Los embriones en estado de torpedo y cotiledonar obtenidos en el medio III fueroncolocados en un medio de germinacin de embriones (medio IV) que contena las salesMS y vitaminas (a la mitad de su concentracin), sacarosa (20 g l-1) y pH ajustado a5,8 2; probndose tres reguladores de crecimiento, combinados de la siguienteforma: AIB (0,1 y 1,0 mg l-1) + BA (0,1y 1,0 mg l-1); AIA (0,1 y 1,0 mg l-1) + BA (0,1y 1,0 mg l-1) y AIB (0,1 mg l-1) solo y medio bsico sin regulador de crecimiento.

Cuadro 2. Composicin del medio de cultivo utilizado para lainduccin de callo embriognico a partir de anteras de onoto.

Medio

Reguladores de crecimiento (mg l-1)

ANA

BA

AIB

AIA

TDZ

Kim

2,4-d

Pic

.

4

2

.

.

.

.

.

.

..

..

..

..

..

..

..

..

0,1

. . . 3 . . . . .

. 1 2 . . . . . .


4/14

. 1 6 . . . . . .

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5

2

.

.

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. 5 6 . . . . . .Murashige . 2 4 . . . . .y Skoog . 3 . 1,5 . . . .(1962)

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0

.

0,5

.

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.

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0,5.

.

0,5

.

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. . . 1,5 . 0,5 . . .

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.

3

.

0,5

.

.

.. . . 0 . 1,5 . . .

.

.

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0,5

.

1,5

.

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.

. . . 1,5 . 1,5 . . .

. . . 3 . 1,5 . . .

. 4 . . . . 1 . .

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.

.

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.

0,5

1

.

Gamborg

.

2

3

.

.

.

.

.

et. al. . 6 3 . . . . .(1968) . 2 4 . . . . .

. . 6 4 . . . . .

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1,5

.

0,5

.

.

.

.

. . 3 . 0,5 . . . .

. . 1,5 . 1 . . . .

. . 3 . 1 . . . .

.

.

1,5

.

1,5

.

.

.

.

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3

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1,5

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.

2

.

3

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. . 4 . 3 . . . .

. . 2 . 4 . . . .

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4

.

4

.

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.

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ANA: cido naftalenactico; BA: 6-bencilaminopurina; AIB: cidoindolbutrico; AIA: cido indolactico; TDZ: Thidiazuron; Kin:Kinetina; 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxiactico y Pic: Picloram

Siembra

Con la ayuda de un bistur y agujas de diseccin se eliminaron los filamentos delandroceo sembrando las anteras, bien sea completas o separadas (tecas), en cpsulas

de Petri que contenan 30 ml de medio. Cada cpsula contaba con 10 explantes e igualcantidad de repeticiones. Ambos tipos de explantes fueron incubados en los medios decultivo (medio I), colocados en diferentes cmaras de crecimiento bajo iluminacin (32mol m2s-1 con un fotoperodo de 12 horas y 23 3 C) y de oscuridad a 30 1 C.

La induccin de los embriones somticos, transferencia y germinacin (medios II, III yIV) se llev a cabo bajo condiciones de iluminacin de 32,5 mol m-2s-1con unfotoperodo de 12 h, temperaturas en un rango entre 20 y 27 C y una humedadrelativa de 60 a 70%.

Fueron evaluados aspectos cualitativos y cuantitativos: dentro de las variablescualitativas se consider la textura, color y forma de los callos, tambin la descripcinmorfolgica de los embriones y plntulas tanto normales como anormales. Dentro delas variables cuantitativas se evalu el nmero de anteras que produjeron callos(porcentaje de eficiencia), el nmero de embriones en estado globular, torpedo ycotiledonar, tambin el nmero de embriones normales y anormales y el nmero deplntulas obtenidas a partir de los embriones somticos.

RESULTADOS Y DISCUSIN


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Bajo las condiciones de estos ensayos no hubo diferencias en la respuesta de lostratamientos al aplicar shock trmico. Slo se obtuvo la formacin de embrionessomticos cuando las anteras se separaron en tecas. De todos los reguladores decrecimiento utilizados en el medio I, ya sea solos o combinados, el callo embriognicoapareci en aquellos tratamientos donde se utilizaron las sales MS suplementado con40 g l-1de sacarosa, 4 mg l-1de ANA y 2 mg l-1 de BA, as como 4 mg l-1AIB y 2 mg l-1BA, bajo oscuridad y a una temperatura de 30 1 C. De estos dos tratamientos,slo se indujo la formacin de embriones cuando se utiliz un tiempo de induccin de21 y 28 das en el medio suplementado con 4 mg l-1ANA y 2 mg l-1BA.

Los callos formados fueron friables, de color crema amarillento y superficie irregular(Figura 1a). A los 42 d de cultivo aunque tambin hubo formacin de calloembriognico no se observ el desarrollo de embriones.

Bajo las condiciones experimentales de esta investigacin, slo se formaron embrionessomticos a partir de los genotipos identificados como G1, 41 e I, colectados en losestados Aragua y Portuguesa, siendo la respuesta morfognica genotipo dependiente.

El porcentaje de eficiencia de formacin de callos en el medio I fue del 65% ya que de100 tecas sembradas se formaron 65 callos embriognicos. De todos los medios deinduccin de embriones (medio II) empleados, aquel suplementado con BA (0,1 mg l -1)fue el nico donde se detect la presencia de embriones (Figura 1b). La representacinesquemtica de las etapas sucesivas de la embriognesis somtica en onoto obtenidasen la investigacin se resumen en la Figura 2.

Cuando los embriones obtenidos fueron subcultivados en medio bsico se presentaronembriones normales en diferentes estados de desarrollo (globulares, corazn, torpedoy cotiledonares, Figura 1 c-f), as como embriones anormales (Figuras 3 y 4). Unacaracterstica comn en los sistemas de embriognesis somtica in vitro es suasincrona, por lo tanto es usual que en un cultivo embriognico se observen

embriones en todas las etapas de su desarrollo (Ammirato, 1987).

Generalmente, esta presencia de embriones se ha atribuido a que la embriognesis enclulas cultivadas es altamente repetitiva y los embriones somticos pueden producirembriones adicionales ms pequeos a lo largo de su eje. Tambin sucede que,adems de los embriones individuales, pueden encontrarse gemelos, tripletes yagregados mltiples de embriones, lo cual genera vstagos mltiples cuando se formanlas plantas (Menndez, 1993). En el trabajo, todos los embriones en estado cotiledonardesarrollaron hipocotilos y cotiledones bien definidos con un dimetro promedio entre0,5 y 1,0 cm con una coloracin crema y verde claro, respectivamente. Por otra parte,los embriones en estado de torpedo formaron un eje cotiledonar bien desarrollado decolor crema.

Dentro de los embriones anormales, unos presentaron formacin de embrionessecundarios que posteriormente se desarrollaron en plntulas normales (Figura 3a-d),otros con formaciones cotiledonares extras que afectaron el cultivo de anteras(separadas en tecas) desarrollo posterior de la plntula. Dentro de las anormalidadesms comunes, se encuentran ejes caulinares ramificados, embrin con mltiplescotiledones, dos ejes radiculares, embriones fusionados, agrupaciones en forma deracimo, entre otros (George, 1993; Chiet al.,1994).


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FIGURA 1. Embriognesis somtica y regeneracin de plantas deonoto utilizando anteras como explante, (a) callo embriognicoformado entre 21 y 28 das de cultivo en medio I; (b) masa deembriones en diferentes estados de desarrollo formados en medioMS suplementado con 0,1 mg l-1BA (medio II) despus de 120 dasde subcultivo; (c) embrin en estado globular; (d) embrin enestado de corazn; (e) embrin en estado de torpedo; (f) embrinen estado cotiledonar.

Cultivo de anteras (separadas en tecas)

Medio I - Induccin de calloMS, sacarosa (40 g l-1), ANA (4 mg l-1) + BA (2 mg l-1)

21 y 28 das

Medio II - Induccin de embrionesMS, sacarosa (60 g l-1), BA (0,1 mg l-1)

120 das

Medio III - Transferencia de embriones

MS, saracosa (30 g l-1), sin regulador de crecimiento60 das

Medio IV - Germinacin de embriones

en el medio MS, saracosa (20 g l-1), sin regulador decrecimiento


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FIGURA 2. Representacin esquemtica de las etapassucesivas de la embriognesis somtica en onoto.

En el caso de onoto, se observaron embriones de forma arrepollada con numerososcotiledones unidos en roseta (Figura 4a), embriones en forma de paraguas concotiledones unidos en la base (Figura 4b), formacin de embriones fusionados endiferentes estados de desarrollo (Figura 4c-d), formacin de hojas cotiledonaresadicionales (Figura 3e) y embrin con ausencia de eje caulinar (Figura 4f).

Por otra parte, las fases iniciales de la embriognesis somtica (globular y corazn)aunque presentes, no fueron fcilmente diferenciables debido a la textura del callo quepor su friabilidad las enmascar, por tanto se cuantificaron en un mismo grupo. Elnmero de embriones normales (en sus diferentes estados de desarrollo) y anormalespor subcultivo se muestran en el Cuadro 3.

FIGURA 3. Secuencia del desarrollo de dos embrionesfusionados de onoto dando origen a una plntula normal, (a)dos embriones en estado de torpedo temprano fusionados,

presentando un solo eje radicular, (b) embriones fusionados enestado cotiledonar a los 30 das de cultivo en medio bsico deMS; (c) embriones fusionados en estado cotiledonar a los 40 a50 das de cultivo en medio MS y (d) plntula a los 60 das decultivo en medio bsico MS.


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FIGURA 4. Anormalidades observadas en embrionessomticos obtenidos a partir de cultivo de anteras deonoto, (a) embrin de forma arrepollada con numerososcotiledones unidos en roseta, (b) embrin aparaguado con3 o 4 cotiledones unidos en la base y separados en elpice, (c - d) formacin de embriones fusionados endiferentes estados de desarrollo, (e) embrin con ms dedos hojas cotiledonares, (f) embrin torpedo con una razsin desarrollo del eje caulinar.

c: embrin cotiledonar, g: embrin globular, t: torpedo

Cuadro 3. Cantidad de embriones formados en cada subcultivo en medio bsicousando ANA (4 mg l-1) y BA (2 mg l-1) como medio de induccin de callo, BA (0,1mg l-1), como medio de induccin de embriones en onoto.


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Tiempo enmedio de

induccin decallo

(das)

Subcultivo

Embriones normales

Embrionesanormales

Globular(g)

Torpedo(t)

Cotiledonar(c)

Total

21(183 normales24 anormales)

1 40 16 16 72 20

2

31

16

2

49

-

3

-

1

4

5

-

4 8 37 12 57 4.

28(239 normales54 anormales)

1 42 8 5 55 412

45

21

39

105

13

3

-

35

8

43

-

4 9 10 17 36 -

Total (t + c) = 247

La cantidad total de embriones contabilizados en los subcultivos fue de 183 normales y24 anormales para 21 d en el medio de induccin y 239 normales con 54 anormales

para 28 d en el medio de induccin. Esto representa en ambos casos un altoporcentaje de embriones normales (88,4% y 81,5%, respectivamente) en relacin conlos anormales (11,6% y 18,4%, respectivamente).

Asimismo, pudo observarse que a medida que se realizaba un mayor nmero desubcultivos a medio bsico, el nmero de embriones anormales disminuy,asocindose con la disminucin del contenido endgeno de reguladores de crecimientoal que fueron expuestos los explantes.

En el primer subcultivo con 21 d en el medio de induccin de callo se logr un total de72 embriones normales, mientras que en los subcultivos siguientes (segundo al cuarto)este valor alcanz un total de 111 embriones. Considerando que cada subcultivo tieneuna duracin aproximada de 60 d, puede notarse que la cantidad total de embrionesproducidos en el primer subcultivo es relativamente alta con relacin al tiempo (72embriones en 60 d vs.111 en 180 d). Tomando en cuenta este aspecto en programasde mejoramiento de onoto, sera innecesario el uso de subcultivos para la formacin deembriones secundarios ya que con un solo subcultivo se obtiene un nmerorelativamente alto, logrando as reducir tiempo y costos.

Todos los embriones somticos maduros obtenidos en el medio IV donde slo se usmedio bsico, mostraron tanto expansin cotiledonar como elongacin de races. Lasprimeras hojas verdaderas (nomfilos) se desarrollaron a los dos meses siguientes desu cultivo en el medio IV.

De los embriones normales en fase de torpedo y cotiledonar, que sumaron 247, se

obtuvieron 73 plntulas normales, de las cuales 31 alcanzaron un desarrollo completo(con la presencia de ambos ejes: caulinar y radicular) y 42 incompleto (con ausenciade uno de los ejes). Las completas presentaron buen desarrollo del pice caulinar, connomfilos totalmente expandidos y desarrollo radicular bien definido con una razprincipal y formacin de races secundarias simultneamente (Figura 5a, b). Enpromedio, la longitud de la parte area alcanz un valor de 2,27 cm, la longitud de laraz principal 5,77 cm y el nmero de hojas por plntula fue de 5,55.


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Por otra parte, las incompletas, fueron de dos tipos, 14 con presencia del eje caulinarsin formacin de races, con una longitud promedio de 2,25 cm y 3 hojas (Figura 5c) y28 con formacin de raz principal sin el eje caulinar promedio de 3,75 cm de largo(Figura 5d, e). La falta de un meristema apical y un polo radicular es comn en losembriones somticos, tanto en dicotiledneas como en monocotiledneas (Barwale etal.,1986) y ello est asociado con una supresin del desarrollo (Goebel-Tourand etal.,1993).

FIGURA 5. Plntulas normales obtenidas a partir de embriones somticos deonoto, (a, b) plntula completa con formacin de ambos ejes, (c) plntula coneje caulinar sin formacin de races, (d, e) plntula con desarrollo de raz sineje caulinar.

Aunque la morfognesis de plantas va embriognesis somtica presenta en su etapainicial de desarrollo una estructura bipolar con raz y vstago en polos opuestos en unmismo eje (Gmez, 1998; Menndez, 1993), los protocolos para la embriognesis

somtica pueden presentar limitaciones en programas de propagacin clonal ymejoramiento de plantas debido a la baja frecuencia de conversin en plantasnormales (Chengalrayan et al.,1997). Esta limitante generalmente ha sido atribuida aanormalidades morfolgicas o inmadurez de los embriones somticos (Ammirato,1987).

Para incrementar la frecuencia de recuperacin de plantas se han probado diferentesmedios de germinacin de embriones. En man,Arachis hipogeaL., se logr que


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embriones somticos morfolgicamente anormales germinaran y produjeran races enun medio libre de reguladores; asimismo, se observ la emergencia de brotescaulinares a partir de embriones enraizados con plumulas no desarrolladas, en unmedio que presentaba la combinacin de BA y Kin, as como TDZ slo(Chengalrayan et al.,1997). En el caso de onoto, se debern probar nuevascombinaciones de reguladores de crecimiento en el medio de germinacin deembriones para incrementar la frecuencia de conversin en plantas normalescompletas.

Tambin se observaron 30 plntulas anormales, las cuales presentaron pices dobles,hojas alargadas gruesas y arrepolladas, races bifurcadas, sin la presencia de unaestructura bipolar claramente definida. En otros cultivos tambin se han presentadoanormalidades morfolgicas en las plntulas obtenidas tales como fasciacin decotiledones, fasciacin de embriones en el extremo radicular y/o fasciacin a lo largodel eje embrional (Chengalrayan et al., 1997).

Al comparar el nmero de plntulas obtenidas a partir de los embriones torpedo ycotiledonar, de 247 embriones de plantas de onoto, se desarrollaron 73 plntulas

normales y 30 anormales, lo que representa un 30% de eficiencia de formacin deplntulas normales. En cultivos Vitis latifoliaL., se han presentado valores de 13,7%de conversin de embriones somticos a plntulas completas (Salunke et al.,1999).Aunque esto podra considerarse un valor relativamente bajo, se debe tomar en cuentaque bajo condiciones in vitro se optimiza el espacio.

En el trabajo se pudo comprobar que la embriognesis somtica en onoto a partir decultivo de anteras estuvo afectada por diversos factores. El tipo de explante yambiente fsico usado fue determinante en la respuesta observada, evidencindose unarespuesta embriognica exclusivamente cuando las anteras fueron separadas en tecasy bajo condiciones de oscuridad a una temperatura de 30 1 C, respectivamente.Asimismo, se demostr que es genotipo-dependiente porque de 19 genotipos

evaluados en slo tres se evidenci la presencia de embriones somticos.

Es importante destacar el papel de los medios de cultivo y los reguladores decrecimiento, ya que su efecto sobre la formacin de callo e induccin de embrionesnicamente estuvo presente cuando se utilizaron las sales MS suplementadas con 4 mgl-1de ANA y 2 mg l-1de BA. En otros trabajos tambin se ha demostrado el efecto dediversos factores sobre la respuesta andrognica. En tomate, LycopersiconesculentumMill., por ejemplo, se probaron ms de 20 medios de cultivo que incluyeronla combinacin de nueve reguladores de crecimiento, de los cuales slo dos fueron msfavorables para la induccin de callo, organognesis y regeneracin de plntulas.

Igualmente se consideraron otros factores como condiciones de crecimiento de laplanta madre, tamao de antera, estado de desarrollo de la microspora ypretratamientos a los botones florales con diferentes temperaturas (Shtereva etal.,1998). En onoto, el protocolo obtenido permiti la regeneracin eficiente deplntulas mediante la embriognesis somtica a partir de cultivo de anteras.

AGRADECIMIENTO


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Los autores desean expresar su agradecimiento al Centro de Investigaciones enBiotecnologa Agrcola (CIBA) de la Facultad de Agronoma, UCV, donde se llev a caboel trabajo.

SUMMARY

Floral buds 0.7 cm in length with uninucleate pollen grains, were removed from 19annatto, Bixa orellana L., genotypes from the Agronomy Institutes experimental field,Faculty of Agronomy, Universidad Central de Venezuela, in order to induce callus,somsatic embryos and plantlet regeneration. Anthers were aseptically removed andsubjected to five temperature regimes: 8 C during 0, 2, 4, 6 and 8 days. The effect ofthree medium cultures Murashige and Skoog (MS), Nitsch and Nitsch and B5 anddifferent growth regulators alone or in combination (naftalenacetic acid (ANA), Kinetine(Kin), 2,4-dichlorophenoxiacetic (2,4-D), Picloram (Pic), indolbutyric acid (AIB), 6-bencilaminopurine (BA) y Thidiazuron (TDZ)) were tested both under ilumination anddark conditions. Somatic embryos were formed on MS medium supplemented with ANA(4 mg l-1) and BA (2 mg l-1), under dark conditions at 30 1 C from the genotypesidentified as G1, 41 and I. There were no differences among thermal shock

treatments. On the other hand, the development of somatic embryos to plantlets wasachieved on half MS medium, sugar (20 g l -1), without growth regulators. Therefore,the efficient regeneration to plantlets through somatic embryogenesis from annattoanthers was achieved with the protocol obtained.

Key Words:Anther; Bixa orellanaL.; in vitro culture; embryo; somaticembryogenesis.

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Embriogénesis Somática en Onoto

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