EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA Y REGENERACIÓN DE PLANTAS EN

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA Y REGENERACIÓN DE PLANTAS EN

CUATRO SELECCIONES COLOMBIANAS DE Carica papaya L.

ANDREA PINZÓN REYES

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar a título de

BIÓLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA

Bogotá, D. C. (Mayo 24 de 2002)

2

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946: “La Universidad no se hace responsable

por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”.

3




APROBADO:

_____________________ __________________ Lilian R. Duplat Bermúdez, Susana Carrizosa, MSc. Microbiología MSc. Fisiología.

Directora. Asesora

_____________________ ____________________ Claudia Ramírez S. Andrés Laignelet Sierra. MSc. Fisiología MSc. Fisiología.

Jurado Jurado

4




APROBADO:

_______________________ ______________________ Dra. Ángela Umaña Muñoz. Luz Mercedes Santamaría

M. Phil Bióloga. Decana Académica Directora (E) de Carrera

5

A mi familia por ser el principal apoyo en mi vida. A Pili, Luna y Lucas por estar siempre a mi

lado.

Agradecimientos:

Agradezco a mi familia por acompañarme y apoyarme siempre en el proceso de realización

del trabajo.

A Lilian Duplat, directora del trabajo, por su constante apoyo, dedicación y colaboración en

todo momento durante el desarrollo de la investigación.

Al Doctor Gustavo Ligarreto, profesor del departamento de fisiología vegetal de la

Universidad Nacional, y a Iván Valbuena, investigador del Programa Nacional de Recursos

Genéticos y Biotecnología Vegetal de CORPOICA, por su asesoría y colaboración en el

análisis estadístico del trabajo.

Al Doctor Rafael Gómez Kosky, Subdirector de Investigación del Instituto de Biotecnología

de las Plantas (IBP) de Cuba, por la asesoría en el desarrollo del trabajo.

Al Doctor Víctor Manuel Núñez, director del Programa Nacional de Recursos Genéticos y

Biotecnología Vegetal, por sus consejos para el buen y correcto desarrollo del trabajo.

A Susana Carrizosa, profesora del departamento de Biotecnología vegetal de la Pontificia

Universidad Javeriana, por su asesoría en la redacción del trabajo.

Al señor Ramiro Álvarez, investigador de la regional Nº 3 de Corpoica, y a Laura Arango,

Investigadora de la regional Nº 8 de CORPOICA, por haber proporcionado el material de

trabajo.

A la Agencia Colombiana de Cooperación Internacional (ACCI) por el apoyo financiero para

la recibir capacitación de Cuba.

A todos los compañeros del Programa Nacional de Recursos Genéticos y Biotecnología

Vegetal y a los del laboratorio de la Unidad de Producción de Semillas, por que de una u otra

manera colaboraron en el desarrollo y culminación de este trabajo.

Bogotá D.C. Mayo 24 de 2002.

vii

TABLA DE CONTENIDO

Pág

Resumen. 1

1. Introducción. 2

2. Marco Teórico y Revisión de Literatura. 4

2.1 Carica papaya L. 4

2.1.1 Descripción Taxonómica. 4

2.1.2 Variedades de Carica papaya en Colombia. 5

2.1.3 Importancia Económica. 7

2.1.4 Mercadeo. 8

2.2 Cultivo de Tejidos. 12

2.2.1 Medios de Cultivo. 12

2.2.1.1 Nutrientes Minerales. 12

2.2.1.2 Compuestos Orgánicos. 13

2.2.1.3 Agentes gelificantes o Sistemas de Soporte. 13

2.2.1.4 Reguladores de crecimiento. 14

2.2.2 Embriogénesis Somática. 15

2.3 Cultivo in vitro en Carica. 18

2.4 Métodos Estadísticos Empleados en Cultivo de Tejidos. 21

2.4.1 Diseño Completamente al Azar, Bloques Completamente al Azar. 22

3. Formulación del Problema y Justificación. 24

3.1 Formulación del Problema. 24

3.2 Preguntas de Investigación. 24

3.3 Justificación. 25

4. Objetivos. 26

4.1 Objetivo General. 26

4.2 Objetivos Específicos. 26

5. Materiales y Métodos. 27

5.1 Embriogénesis Somática Directa y Formación de Callo. 27

5.2 Embriogénesis Indirecta. 29

5.3 Fase de Conversión de los Embriones Somáticos en Plantas. 29

5.4 Fase de Formación de Brotes Múltiples. 30

5.5 Fase de Crecimiento. 31

viii

5.6 Fase de Enraizamiento. 32

5.7 Aclimatación de las Plántulas. 34

5.8 Análisis de la Información. 35

6. Resultados y Discusión. 36

6.1 Embriogénesis Somática Directa y Formación de Callo. 36

6.2 Embriogénesis Indirecta. 49

6.3 Fase de Conversión en Plantas. 51

6.4 Fase de Formación de Brotes Múltiples. 55

6.5 Crecimiento. 54

6.6 Fase de Enraizamiento. 60

6.7 Aclimatación de las plántulas. 65

7. Conclusiones. 69

8. Recomendaciones. 71

9. Referencias 72

10. Anexos. 77

ix

INDICE DE FIGURAS.

Pág.

Figura 1. Importación de Papaya en Latinoamérica.

11

Figura 2. Procedimiento para extraer los embriones cigóticos de las semillas.

28

Figura 3. Grupos de embriones somáticos inoculados en medio de germinación.

30

Figura 4. Inoculación de las plantas germinadas en medio de formación de brotes.

31

Figura 5. Plantas inoculadas en medio MS al 100 % provenientes del medio de

formación de brotes.

32

Figura 6. Planta en sustrato vermiculita para inducir enraizamiento.

33

Figura 7. Plantas de C. papaya en proceso de aclimatación.

34

Figura 8. Estadios iniciales del embrión cigótico en el proceso de embriogénesis

somática.

37

Figura 9. Estadios de respuesta con desarrollo embriogénico de los embriones

somáticos.

38

Figura 10. Embriones somáticos obtenidos de forma directa.

38

Figura 11. Estadio de respuesta negativa del embrión cigótico.

39

Figura 12. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron embriones

somáticos de forma directa en las selecciones Maradol y Hawaiana.

41

Figura 13. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron embriones

somáticos de forma directa en las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

42

x

Figura 14. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Mediano en

las selecciones Maradol y Hawaiana.

44

Figura 15. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Pequeño en

las selecciones Maradol y Hawaiana.

44

Figura 16. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Grande en las

selecciones Maradol y Hawaiana.

45

Figura 17. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Mediano en

las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

46

Figura 18. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Grande en las

selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

46

Figura 19. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Pequeño en

las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

47

Figura 20. Embriogénesis indirecta.

49

Figura 21. Regeneración en plantas a partir de embriones somáticos.

51

Figura 22. Planta de C. papaya germinada a partir de embriones somáticos.

52

Figura 23. Plantas de C. papaya regeneradas (a los 30 días) a partir de embriones

somáticos

52

Figura 24. Formación de brotes múltiples.

56

Figura 25. Plantas obtenidas en medio de formación de brotes.

56

Figura 26. Hojas formadas sin tallo.

57

xi

Figura 27. Brotes obtenidos en medio líquido y semisólido.

58

Figura 28. Diferencias en el área foliar y longitud del pecíolo.

59

Figura 29. Planta con amarillamiento leve en las hojas.

59

Figura 30. Raíces formadas en sustrato de vermiculita.

60

Figura 31. Comparación de las raíces formadas con y sin el tratamiento de AIB.

61

Figura 32. Diferencias de las raíces formadas en medios con diferentes agentes

gelificantes.

62

Figura 33. Plantas de C. papaya en medio de enraizamiento con AIB y PhytagelTM.

64

Figura 34. Planta muerta en condiciones de aclimatación.

62

Figura 35. Plantas enraizadas in vitro en vermiculita.

68

Figura 36. Plantas aclimatadas en los frascos donde se cultivaron in vitro.

68

xii

INDICE DE TABLAS.

Pág.

Tabla 1. Producción de Papaya por departamento.

8

Tabla 2. Producción de Papaya en Colombia entre los años 1981 y 2001

10

Tabla 3. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el número

de embriones cigóticos que dieron respuestas de desarrollo embriogénico en las

Selecciones Hawaiana y Maradol.

41

Tabla 4. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el número

de embriones cigóticos que dieron respuestas de desarrollo embriogénico en las

Selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

42

Tabla 5. Comparación de promedios (del número de embriones somáticos

formados), según la prueba de Duncan para la embriogénesis indirecta en las

selecciones Maradol y Hawaiana.

50

Tabla 6. Comparación de promedios (del número de embriones somáticos

formados) según la prueba de Duncan para la embriogénesis indirecta en las


50

Tabla 7. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el porcentaje

de germinación en las selecciones Maradol y Hawaiana.

53

Tabla 8. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el

porcentaje de germinación el las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

53

Tabla 9. Comparación de promedios según la prueba Duncan para crecimiento de

las plantas.

58

Tabla 10. Comparación de promedios para el enraizamiento según la prueba

Duncan.

61

xiii

INDICE DE ANEXOS.

Anexo 1. Tabla de composición del medio Murashige & Skoog (MS).

77

Anexo 2. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo

mediano(CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES) en las Selecciones

Maradol y Hawaiana

78

Anexo 3. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano

(CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), en las Selecciones Caripaz 24

y Catira1.

78


(CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), en la selección Hawaiana.

79


(CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), en las selección Caripaz 24.

79


(CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), en las selección Maradol.

79


(CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), en la selección Catira 1.

80

Anexo 8. Prueba de ANOVA para la embriogénesis somática indirecta de las


80

Anexo 9. Prueba de ANOVA para embriogénesis somática indirecta de la selección

Hawaiana.

80

Anexo 10. Prueba de ANOVA para embriogénesis somática indirecta de la

selección Maradol.

81

xiv


selección Caripaz 24.

81


selección Catira.

81

Anexo 13. Prueba de ANOVA para las Selecciones Maradol y Hawaiana para el

porcentaje de germinación.

82

Anexo 14. Prueba de ANOVA para las Selecciones Catira 1 y Caripaz 24 en el

porcentaje de germinación.

82

Anexo 15. Prueba de ANOVA para el porcentaje de germinación en la selección

Maradol.

82


Catira 1.

83


Hawaiana.

83


Caripaz 24.

83

Anexo 19. Prueba de ANOVA para el crecimiento de las plantas en medio de

cultivo con y sin sacarosa.

84

Anexo 20. Prueba de ANOVA para el enraizamiento según el tratamiento.

84

Anexo 21. Prueba de ANOVA para el enraizamiento según la selección.

84

RESUMEN

Se estandarizó el proceso de embriogénesis somática empleando como explante embriones

cigóticos inmaduros. Se obtuvieron embriones de forma directa a las cuatro semanas,

empleando el medio de cultivo Murashige & Skoog (MS) suplementado con 2,4-D en

concentraciones de 54.28 µM para la selección Catira, 45.24 µM para la selección Maradol y

67.85 µM para la selección Hawaiana (Medio de Inducción I) con porcentajes del 14.6 %,

82.1 % y 17.5 % respectivamente. Hubo embriogénesis somática indirecta (Medio de

Inducción II) suplementando el medio con 9.04 y 18.08 µM de 2,4-D para las selecciones

Hawaiana y Maradol; y en medio libre de auxina para las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

Los embriones formados en medio sin auxina de las selecciones Catira 1, Caripaz 24 y

Maradol y los formados en el medio con 9.04 µM de 2,4-D para la selección Hawaiana fueron

los que presentaron mayor porcentaje de conversión a plantas, los cuales fueron de 14 %

para Catira 1, 7.03 % para Caripaz 24, 12.35 % para Maradol y 5.41 % para Hawaiana.

Cuando se obtuvieron plantas de más de 1 cm de longitud se sembraron en medio MS con y

sin sacarosa (30 g/l), observándose una mayor área foliar y longitud del pecíolo en las

plantas cultivadas en el medio sin sacarosa respecto a las cultivadas en el medio con

sacarosa.

El enraizamiento se realizó in vitro y ex vitro con vermiculita humedecida con sales MS al 50

%, obteniéndose un éxito del 100 % en la formación de raíces en el procedimiento realizado

in vitro. Estas plantas se llevaron a condiciones ambientales, donde se obtuvo el 30 % de

sobrevivencia. También se realizó la aclimatación abriendo, poco a poco, la tapa del frasco

de cultivo donde se obtuvo un 53 % de sobrevivencia.

El trabajo se realizó en el laboratorio del Programa Nacional de Recursos Genéticos y

Biotecnología Vegetal del centro de Investigaciones de la Corporación Colombiana de

Investigación Agropecuaria (CORPOICA).

2

1. INTRODUCCIÓN

La producción de frutas ha llegado a tener un aumento importante en la economía nacional y

global. El incremento en la producción se ha llevado a cabo gracias a los avances en las

prácticas de horticultura, manejo de poscosecha y el control de plagas y enfermedades;

razón por la cual en la actualidad la industria de las frutas se basa en pocos genotipos,

aquellos que cumplen con las características agronómicas de interés comercial para el

hombre (Manshardt 1992).

La papaya (Carica papaya L.) es una de las frutas tropicales más importantes en el

comercio internacional hortofrutícola, dado que sus características de color y sabor resultan

atractivas para consumidores de países no tropicales (Boletín CCI Exótica 1998). Por lo

tanto, es de destacar que la papaya es una de las frutas más cosechadas y con un gran

valor económico en las zonas del trópico y subtrópico; la extensión del cultivo de esta planta

y la aceptación de sus frutos ofrece una gran oportunidad para el mercado local y para su

exportación (Yeh et al. 1998).

Como cualquier otro cultivo, la papaya es atacada por numerosas plagas las cuales

ocasionan daño al actuar como vectores de enfermedades de tipo viral (Manshardt 1992); en

el caso particular de la papaya se destaca el Virus de la Mancha Anular (PRV), que ha sido

el principal obstáculo para la producción de frutos a gran escala; por lo tanto el PRV es

considerado como el limitante para el cultivo de esta fruta en el mundo (Yeh et al. 1998).

La biotecnología vegetal como herramienta de estudio y soluciones de problemas puede

ofrecer muchas alternativas, donde se pueden incluir técnicas como el cultivo de tejidos y

células (Manshardt 1992).

En el cultivo de células y tejidos vegetales las células manifiestan su totipotencia

(regenerando plantas completas) mediante dos rutas distintas: a) La organogénesis, que

conduce a la diferenciación de meristemos (caulinares y/o radicales); b) La embriogénesis

somática que lleva a la formación de embriones asexuales siguiendo en muchas especies las

fases del embrión cigótico (globular, corazón, torpedo, cotiledonar) (Azcon-Bieto & Talon

1993). Para llevar a cabo esto, las células requieren de una variedad de nutrientes

3

(orgánicos e inorgánicos) donde se pueden incluir carbohidratos, vitaminas, aminoácidos;

además puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento. Los requerimientos

de estas sustancias varían considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles

endógenos de estos reguladores, así como la interacción del explante con el medio de

cultivo, por lo que en el presente trabajo se evaluó y estandarizó la regeneración in vitro de

papaya a través de la formación de embriones somáticos, proceso indispensable para la

regeneración de plantas que hayan sido transformadas genéticamente; en el caso de la

papaya se busca la obtención de plantas resistentes al PRV.

El trabajo se llevó a cabo en el laboratorio del Programa Nacional de Recursos Genéticos y

Biotecnología Vegetal del centro de Investigaciones de la Corporación Colombiana de

Investigación Agropecuaria (CORPOICA) sede Tibaitatá, ubicada en el kilómetro 14 vía

Mosquera.

4

2. MARCO TEÓRICO Y REVISION DE LITERATURA

2.1 Carica papaya L.

2.1.1 Descripción taxonómica.

La Carica papaya fue clasificada por el naturalista sueco Linneo; esta planta es muy

conocida mundialmente bajo los nombres comunes de “chamburo”, “fruta bomba”, “lechosa”,

“melón”, “mamona”, “papaya”, “papayo”, “zapote”; entre otras. Su clasificación taxonómica

es la siguiente:

División: Magnoliophyta (Angiospermas).

Clase: Magnoliopsida (Dicotiledónea).

Orden: Violales.

Género: Carica.

Especie: papaya

La especie Carica papaya L. se destaca por presentar plantas cuya altura varia entre los

tres y ocho metros de alto. El tallo usualmente es único, grueso, fistuloso, carnoso, hasta 20

cm de diámetro, a veces marcado con cicatrices foliares grandes y numerosas, indiviso y

rematando en un denso grupo de grandes hojas. Hojas del limbo amplio de ámbito circular o

casi circular, profundamente palmatilobas, siete a trece nerviadas, generalmente más bien

grandes; generalmente siete lobulaciones, también pueden ser de nueve u once, casi todos

pinnatífidos; el envés algo más pálido con nervaduras prominentes (Bernal & Correa 1998).

De flores masculinas y femeninas que aparecen en plantas diferentes (dioica) ó

hermafroditas, dispuestas en inflorescencias racimosas; las flores masculinas son de cáliz

pentalobulado o dentado, pequeñas, con pétalos unidos en un tubo delgado, lóbulos

valvados o contortos, diez estambres insertos sobre la corola, filamentos libres o unidos en

la base, anteras de dos celdillas, dehiscencia longitudinal, ovario rudimentario a veces

presente. Las flores femeninas son de cáliz similar al de las flores masculinas, con pétalos al

principio en la antesis unidos pero, a la postre libre, sin estaminodios; ovario súpero sésil,

unilocular o falsamente cinco-locular, placentas parietales, óvulos numerosos; el pistilo sin

estilo o con un estilo muy corto (Cano & Marroquín 1994).

5

Flores masculinas blanco-cremosas, verde amarillentas o amarillas. Flores femeninas blanco

cremosas, amarillo-pálidas o evidentemente amarillas. Fruto ovoide, esférico periforme,

pulpa amarilla, anaranjada o a veces rojiza, generalmente hueco, aunque frecuentemente en

plantas silvestres, el interior completamente lleno de semillas y masa placentaria. Semillas

con sarcotesta mucilaginosa, lisa; esclerotesta con numerosas protuberancias irregularmente

dentadas a modo de crestas lameliformes dispuestas longitudinalmente o a veces no

desarrolladas (Bernal & Correa 1998).

2.1.2 Variedades de Carica papaya en Colombia.

En Colombia, en particular, se encuentran aproximadamente trece variedades que se

comercializan tanto en los mercados nacionales como en los internacionales. Se destacan la

variedad Regional o Zapote, planta dioica que es ampliamente cultivada en la Costa

Atlántica, y la que se conoce como Melona o Amarilla, que se encuentra en los

departamentos de Santander, Huila y Tolima, donde tiene un alto consumo tanto en fresco,

como procesada en forma de pulpa congelada. También son cultivadas las variedades

Común y Tocaimera. La primera se caracteriza por tener fruto grande, un color de piel que

va desde el amarillo hasta el amarillo verdoso, según el grado de maduración, y una pulpa

amarilla muy dulce, esta variedad es cultivada en todo el país. La variedad Tocaimera, por

su parte, se encuentra en el departamento de Santander, aunque hace algunos años se

cultivó también en los Llanos Orientales, donde los problemas fitosanitarios acabaron

completamente con los cultivos. Se caracteriza por la producción de frutos grandes, cuya

forma va desde globosos hasta alargados (Boletín CCI Exótica 1998).

Dentro de las variedades mejoradas se destacan la Catira 1 y la variedad U.N. Cotové; esta

última desarrollada por la Universidad Nacional de Medellín en un proceso que buscaba

obtener variedades resistentes al PRV. La producción es de más de 40 frutos por planta

cuyo peso es de 1000 a 2000 gr, pulpa de color amarillo rojizo, sabor ligeramente dulce,

forma ovalada, cáscara lisa y amarilla (Boletín CCI Exótica 1998).

La Catira 1 fue desarrollada para el piedemonte Llanero colombiano por el centro de

investigaciones La Libertad de Corpoica, (Boletín CCI Exótica 1998). Es un material

mejorado, con tolerancia al virus de la mancha anular, de mayor productividad y calidad. El

6

árbol de esta variedad es de porte mediano, vigoroso, con una altura de 160 cm. Presenta

un tallo único de color verde, sin ramificaciones. Las hojas son verdes, alternas, palmeadas.

Las flores son dioicas (Arango 1999). Los frutos de la variedad Catira 1 son elípticos y

relativamente pequeños (con un peso promedio de 1 kg). Cuando la fruta está totalmente

madura, la corteza adquiere un color amarillo anaranjado. La pulpa es amarilla y tiene un

alto contenido de azúcares, característica que la convierte en una variedad ideal tanto para

el consumo fresco como para la agroindustria (Boletín CCI Exótica 1998).

Otra variedad mejorada es la Maradol, que es la principal variedad comercial cubana, ha

alcanzado gran difusión en México y se está extendiendo por muchos países tropicales. Se

destaca por su alta productividad. El tallo es de color verde, con tonalidades moradas y

alcanza hasta 2.5 m de altura a los 18 meses. Los frutos cilíndricos proceden de plantas

hermafroditas elongatas, y los esféricos, de plantas femeninas. Los frutos son de piel lisa,

buena coloración y de pulpa roja al madurar, de excelentes condiciones para el consumo en

fresco y la industria, con una gran consistencia, lo que facilita su transporte y

comercialización. El peso de los frutos oscila entre 1 y 3 kg. La producción es precoz, la

cosecha puede comenzar entre los seis y siete meses, después del transplante (Rodríguez &

Rodríguez 2000).

Entre las variedades de fruto pequeño se encuentra la Hawaiana, planta hermafrodita que se

caracteriza por los frutos periformes, cuyo peso promedio oscila entre los 400 y los 500 gr.

Es una de las frutas de mejor sabor, es resistente al transporte y tiene muy buena aceptación

en los mercados nacionales e internacionales. Dentro de esta misma clase se encuentra la

variedad Solo, que es una de las más conocidas a nivel mundial por su tamaño y calidad

característicos. Los frutos son pequeños (450 gr) y periformes, la pulpa es de color amarillo

o rosado muy intenso, y la piel es dura. También originaria de Hawaii, la variedad Sunrise

fue introducida a Colombia a través de la Costa Caribe. Esta variedad ha sido reconocida

como el mejor cultivar comercial para la exportación. Los frutos se caracterizan por su

forma de pera y/o de globo. La pulpa generalmente es de color rojo zapote y los frutos

tienden a pesar entre 250 y 400 gr. Otra variedad importante es la Cariflora, originaria de

Florida, Estados Unidos; es una variedad muy precoz, los frutos tienen pesos que oscilan

entre 500 y 700 gr (Boletín CCI Exótica 1998).

7

En el presente trabajo se emplearon las variedades Maradol, Hawaiana y Catira 1. Dada la

facilidad de cruzamiento entre diferentes variedades es difícil conservar una variedad, a

menos que esta se mantenga completamente aislada o se realicen polinizaciones

controladas a mano. Si no se toman las precauciones anteriores, bajo condiciones naturales

y de polinización abierta, se puede llegar a perder la identidad de las variedades; por lo que

la producción de una variedad no es fácil, por este motivo se hace necesario que los frutos

comercializados sean producto de una elección basándose en características deseables

para el consumidor. Por último, la Caripaz 24 es un material mejorado de CORPOICA que

aún no ha sido lanzado como variedad, esta selección proviene de la polinización controlada

que se ha estado haciendo en la variedad Zapote, la cual ha venido perdiendo su identidad

debido a la polinización abierta donde no se ha tenido en cuenta la fuente del polen. Con el

fin de conseguir una variedad más pura lograron conseguir 27 líneas, por características

agronómicas de interés seleccionaron 5 líneas, entre las que se encuentra el material

Caripaz 24. Por razones de no haber trabajado con variedades colombianas y con una

selección se estimó conveniente emplear un término que abarcara todos los materiales que

se emplearon, por lo que se designaron con el nombre de selecciones.

2.1.3 Importancia económica.

La importancia económica radica en sus propiedades alimenticias, industriales y medicinales.

El valor alimenticio se valora por cada 100 gr de pulpa de fruta que contienen entre 2000 y

3000 unidades de vitamina A y 33 a 55 mg de vitamina C, también contiene vitamina B.

Completa sus cualidades nutritivas con una buena cantidad de fósforo y hierro (Lucas 1997).

Además entre sus propiedades medicinales se destacan la acción antihelmíntica,

antidiarreico, laxante, elimina lunares, etc. (Bernal & Correa 1998). En el sector industrial se

destaca el uso del látex seco de “papaya” (papaína), por su carácter digestor proteico,

gracias a sus dos enzimas denominadas “papaína” y “quimiopapaína” (Bernal & Correa

1998). Estas enzimas proteolíticas no han podido ser sustituidas directamente en el

mercado; aparentemente la enzima sintética con las mismas cualidades no ha sido

producida. El manejo de este producto es de cuidado, ya que requiere almacenamiento a

bajas temperaturas además de estar correctamente empacado, precauciones que

incrementan su valor económico (UPapaína S.A 1997).

8

2.1.4 Mercadeo.

Mundialmente se producen 4 500 000 toneladas métricas que se distribuyen de la siguiente

manera:

- América de Sur 42 %

- Asia 33 %

- América del Norte y Central 15 %

- África 6 %

- Oceanía 2 %

El cultivo de la papaya se está expandiendo por todo el mundo; el país de mayor producción

mundial de papaya es Brasil, con el 36 % del total mundial. Argentina es el que presenta

menos áreas cultivadas (Lucas 1997). En Colombia, el cultivo de la papaya se encuentra en

el cuarto lugar por áreas sembradas respecto a otras frutas cultivadas en el país.

La producción de papaya en Colombia de los últimos años se presenta en la tabla 1.

Tabla 1. Producción de papaya por departamento, entre los años 1995 y 2000.

DEPARTAMENTO

1995 1996 1997

Area

(Ha)

Producc

(T)

Rend

kg/Ha

Area

(Ha)

Producc

(T)

Rend

kg/Ha

Area

(Ha)

Producc

(T)

Rend

kg/Ha

Antioquia 32 1251 39 094 65 1956 30 092 283 9 542 33 717

Atlántico 76 1580 20 526 5 90 15 000 2 27 13 500

Bolívar 44 630 14 318 25 420 16 900 7 70 10 000

Boyacá 24 480 19 167 27 520 19 259 23 378 16 357

Caldas ND ND ND ND ND ND 1 20 20 000

Cauca 5 35 7000 7 74 10 571 15 126 8400

Cesar 71 2100 29 577 28 840 30 000 132 3003 22 750

Córdoba 1592 75 104 44 388 2922 144 005 49 283 2216 91 995 41 514

Cundinamarca 4 60 15 000 80 370 4625 81 2287 28 235

La Guajira ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Huila 183 2956 16153 190 3054 15 074 192 2986 15593

Magdalena 381 7620 20 000 426 8520 20 000 466 9320 20 000

Meta 1391 52 390 37 664 518 16 305 31 477 497 13 569 27 302

Nariño ND ND ND ND ND ND 20 700 35 000

Norte de

Santander

248 2156 8694 146 2360 16 154 169 2451 14 503

9

Santander

Quindío 59 541 9154 38 452 12 040 15 150 10 000

Risaralda 53 1561 29 453 30 588 16 933 44 530 12 045

Santander ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Tolima 178 5322 29 900 126 3911 31 040 118 3350 28 390

Valle del Cauca 234 7396 31 607 108 2117 19 602 124 2843 21 315

DEPARTAMENTO

1998 1999 2000

Area

(Ha)

Producc

(T)

Rend

Kg/Ha

Area

(Ha)

Producc

(T)

Rend

Kg/Ha

Area

(Ha)

Producc

(T)

Rend

Kg/Ha

Antioquia 540 17 143 31 746 213 7163 31 211 341 6177 18 141

Atlántico 7 117 16 714 8 146 18 250 16 180 12 000

Bolívar ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Boyacá 26 421 16 192 50 685 13 700 35 494 14 114

Caldas 2 30 15 000 2 26 13 000 2 26 13 000

Cauca 23 165 7174 5 30 6000 5 25 5 000

Cesar 159 3909 24 585 110 2650 24 091 85 2000 23 529

Córdoba 2484 88 175 35 497 2338 64 005 27 376 2033 65 310 32 125

Cundinamarca 76 1587 20 882 20 460 23 000 67 1406 20 985

La Guajira 20 520 26 000 ND ND ND ND ND ND

Huila 188 2857 15 194 162 2479 15 302 129 2023 15 682

Magdalena 481 8978 18 665 569 10 106 17 761 548 9806 17 894

Meta 693 16 577 23 921 553 13 888 25 114 406 7887 19 426

Nariño 30 1050 35 000 21 705 33 571 83 2441 29 410

Norte de

Santander

140 2240 16 000 133 2274 17 098 147 2657 18 038

Quindío 56 734 13 216 66 1026 15 561 79 1076 13 655

Risaralda 54 1255 23 241 40 831 20 775 53 1166 22 000

Santander 90 2580 28 667 ND ND ND 25 625 25 000

Tolima 172 4112 23 907 226 4642 20 540 241 5106 21 187

Valle del Cauca 127 2682 21 100 195 4260 21 801 204 4248 20 824

Fuente: Ministerio de Agricultura (2000).

En la mayoría de estos departamentos se cultivan variedades que generalmente abastecen

los mercados locales cuya producción depende de la demanda en el mercado. De estas

regiones productoras, los departamentos de Córdoba y Meta poseen la mayor área de

papaya sembrada, y son los mayores abastecedores del principal centro de consumo del

país que es Bogotá; el departamento de Córdoba produce toda la papaya Hawaiana que se

10

consume principalmente en los almacenes de cadena de Bogotá, y Meta es el mayor

abastecedor de papaya Catira1 y Maradol las que se consumen principalmente en los

mercados mayoristas de Bogotá y el oriente colombiano. Los demás departamentos

producen diferentes tipos de papaya que se comercializan principalmente para autoconsumo

de la región y su participación en el mercado de Bogotá es casi nula (L. Arango, CORPOICA-

Com. Pers.).

En los últimos años la producción de papaya en Colombia se ha visto afectada por la

incidencia del PRV, y por la ausencia de medidas de control y manejo de esta enfermedad,

ocasionando que los volúmenes y rendimientos de producción disminuyan a la mitad (Arango

1999). Tal disminución se empieza a observar desde el año 1990 (tabla 2) donde es

evidente que las áreas cosechadas aumentan mientras que el rendimiento disminuye, siendo

que en el año 1981 se cosecharon 1600 hectáreas de papaya con un rendimiento de 34 375

kg/Ha, en comparación con el año 1995 donde se cosecharon 2300 hectáreas con un

rendimiento de 27 826 kg/Ha y en el año 2001 se cosecharon 4600 hectáreas alcanzando

un rendimiento máximo de 24 673 kg/Ha,

Tabla 2. Producción de Papaya en Colombia entre los años 1981 y 2001.

AÑO

AREA COSECHADA

(Ha)

RENDIMIENTO (kg/Ha)

1981 1600 34 375 1982 1500 40 000 1983 1400 36 285 1984 1100 37 976 1985 1360 38 750 1986 1320 36 834 1987 1500 38 758 1988 1800 39 558 1989 2000 39 958 1990 1452 27 631 1991 2463 28 877 1992 2187 33 753 1993 2200 28 199 1994 2250 28 000 1995 2300 27 826 1996 2300 27 826 1997 2300 27 826 1998 2300 27 826 1999 4728 24 402 2000 4496 25 050 2001 4600 24 673

Fuente: FAO.

11

La disminución en la producción de papaya ha llevado a que Colombia se vuelva uno de los

principales importadores de Latinoamérica (figura 1), haciendo resaltar que este país es una

gran consumidor de esta fruta donde la producción nacional no ha sido suficiente para

abastecer el mercado local lo que hace puntualizar aún más en la importancia que tiene este

cultivo en el país.

Importación de Papaya (Ton)

44173617

10

30

60338 1213 40 7

137

Argentina Bahamas Barbados Colombia El Salvador

Guatemala Honduras Nicaragua Paraguay Uruguay

Figura 1. Importación de Papaya en Latinoamérica para el año 2000 (toneladas).

Fuente: FAO

Como una alternativa para la solución de problemas en la producción de frutas la Ingeniería

Genética ofrece la obtención de variedades resistentes por medio de la transformación

genética, incorporando genes derivados del patógeno que codifiquen para la cubierta

proteica del virus y que actúe como agente de resistencia a la enfermedad. Combinando la

técnica de transformación con el cultivo in vitro de plantas es posible no solo introducir un

gen o grupo de genes en células totipotentes, sino que, más importante aún, lograr la

regeneración de plantas genéticamente transformadas que permitirían estudiar el efecto o

destino del gen o genes introducidos (Azcon-Bieto & Talon 1993).

12

2.2 Cultivo de tejidos.

El cultivo de tejidos in vitro comprende un heterogéneo grupo de técnicas mediante las

cuales un explante se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y

se incuba en condiciones ambientales controladas (Mroginski & Roca 1993).

2.2.1 Medios de Cultivo.

En la actualidad existen varias formulaciones, cada una de las cuales contiene entre 15 y 35

compuestos químicos que suministran (Mroginski & Roca 1993):

a) Carbono.

b) Nutrientes minerales.

c) Vitaminas.

d) Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos).

e) Sustancias reguladoras de crecimiento.

f) Otros compuestos.

2.2.1.1 Nutrientes Minerales.

Los medios de cultivo aportan los elementos que se consideran esenciales para el

crecimiento de plantas (macro y micronutrientes) (Mroginski & Roca 1993).

Entre los macronutrientes se encuentran: a) El Calcio (Ca) el cual es importante en la

síntesis de la pared celular; b) El Magnesio (Mg) muy importante para el funcionamiento de

enzimas, además de ser un componente integral de la molécula de la clorofila; c) El

Nitrógeno (N) necesario para el crecimiento en general; d) El Fósforo (P), parte integral de

los ácidos nucleícos y otros componentes estructurales; e) El Potasio (K) sirve como el

mayor ión positivo que balancea iones negativos; y f) El Azufre (S), importante en la

estructura de las proteínas; por su presencia en varios aminoácidos que contienen azufre

(Sutter 1996).

13

Entre los microelementos que se adicionan al medio de cultivo se cuentan: a) Boro (B)

involucrado en la actividad enzimática relacionada con la biosíntesis de lignina y el

metabolismo de ácidos fenólicos; b) Cobre (Cu) esencial en muchas reacciones enzimáticas,

incluído el sistema oxidasa citocromo; c) Yodo (I) su efecto varía dependiendo de la especie;

no se considera un elemento esencial pero se adiciona al medio de cultivo porque se ha

encontrado que mejora el crecimiento de raíces y callos; d) Hierro (Fe) se necesita para la

síntesis de clorofila al igual que en muchas reacciones de oxido reducción; e) Manganeso

(Mn) se necesita para reacciones enzimáticas, particularmente en el proceso de respiración y

fotosíntesis; f) Molibdeno (Mo), actúa como cofactor con dos enzimas involucradas en la

transformación del nitrato de amonio; y g) Zinc (Zn), también se emplea en muchas

actividades enzimáticas y es muy importante para el desarrollo del cloroplasto (Sutter 1996).

2.2.1.2 Compuestos Orgánicos.

La sacarosa es la fuente de Carbono más empleada ya que muy pocos cultivos in vitro son

autótrofos, por lo tanto no son capaces de fijar el carbono para llevar a cabo la fotosíntesis

debido a las limitaciones de disponibilidad del CO2. La incorporación de myo-inositol en el

medio (100 mg/l) generalmente da como resultado un mejor crecimiento de callos y

suspensiones celulares (Mroginski & Roca 1993).

De todas las vitaminas únicamente la Tiamina (B1) se ha encontrado como esencial para

muchas especies en el cultivo de plantas. La Tiamina se necesita para el metabolismo y

biosíntesis de algunos aminoácidos (Sutter 1996).

2.2.1.3 Agentes gelificantes o Sistemas de soporte.

Es un sistema que se emplea como soporte para la planta al se colocada en el medio de

cultivo. Aunque también se usan medios líquidos, estos deben ser agitados para suministrar

suficiente oxígeno. Entre los sistemas de soporte o agentes gelificantes se encuentran: el

agar, Gellam gum (Gerlita y PhytagelTM) y agarosa; y sistemas de soporte mecánicos tales

como puentes de papel filtro y una variedad de membranas de polipropileno (Sutter 1996).

14

2.2.1.4 Reguladores de Crecimiento.

La mayoría de reguladores de crecimiento empleados en el cultivo de tejidos son del grupo

de las Auxinas, Citoquininas y Giberelinas.

- Auxinas: Influyen sobre muchos procesos en las plantas tales como la elongación

celular, dominancia apical y formación de raíces adventicias. Las auxinas se emplean en

el cultivo de tejidos en su forma natural como el ácido indol 3-acético (AIA) y el ácido

indol 3-butírico (AIB); y sintéticas el ácido 1-naftalenacético (ANA) y el ácido 2,4-

diclorofenoxiacético (2,4-D) (Sutter 1996).

Las auxinas son empleadas para la inducción de callo, enraizamiento y morfogénesis. El

uso del 2,4-D es más limitado que el de otras auxinas, se emplea para embriogénesis

somática e inducción de callo; inhibe la morfogénesis en muchas especies por lo que es

usado únicamente en la inducción y mantenimiento de cultivos embriogénicos (Sutter

1996).

- Citoquininas: Actúan como antagonistas de las auxinas en la dominancia apical, como

antisenescentes y como inductores de división celular; en el cultivo in vitro son usadas

para la inducción de brotes, desarrollo y multiplicación. Se emplean de forma natural

como la Zeatina, el 6-dimetilaminopurina (2-iP) y de forma sintética como la

Benzilaminopurina (BAP), el 6-furfurilaminopurina (Kinetina) (Sutter 1996).

- Giberelinas: Involucradas en la elongación del tallo y floración. En el cultivo de tejidos

las giberelinas inhiben la inducción de la organogénesis, particularmente la formación de

raíces adventicias. Se emplean para la elongación del tallo en casos donde los brotes no

se elongan naturalmente. En muchas plantas pueden producir anormalidades (Sutter

1996).

15

2.2.2 Embriogénesis Somática.

Es la formación de un embrión a partir de una célula sin la fusión de gametos (Gómez 1998).

Los embriones somáticos son estructuras bipolares con un eje radical-apical, y no poseen

conexión vascular con el tejido materno; las estructuras bipolares son capaces de crecer y

formar plantas normales (Litz & Jarret 1993).

Para inducir y estudiar la embriogénesis somática se han empleado diferentes tipos de

explantes tales como hojas jóvenes, hojas inmaduras, inflorescencias, peciolos (Gómez

1998), cotiledones, hipocótilos, ápices caulinares, segmentos de tallos, y raíces. Sin

embargo, relativamente pocos explantes tienen la habilidad para producir células con

capacidad embriogénica (Litz & Jarret 1993).

En el desarrollo de embriones somáticos, en primer lugar se deben desdiferenciar las células

ya diferenciadas, y posteriormente iniciar la división. De esta forma se originan células

parenquimáticas vacuoladas que se transforman en células ricas en citoplasma, que se

hacen embriogénicas por la influencia de la auxina. Las células embriogénicas, a partir de

las cuales se originan los embriones, muestran una serie de características comunes, típicas

de las células en proceso de división rápida. El desarrollo de un embrión, a partir de una

célula embriogénica, se consigue generalmente sin la presencia de auxinas en el medio

(Ayerbe & Sagasta 1990).

Se pueden distinguir dos tipos de embriogénesis somática:

n Directa: Donde un estímulo de la división celular puede ser suficiente para la formación

de un embrión somático a partir del tejido del explante, es decir es la formación de

embriones somáticos en forma directa a partir de una estructura organizada tal como

segmentos de embriones cigóticos o embriones cigóticos completos, tallos, hojas, entre

otros tipos de explantes (Gómez 1998).

n Indirecta: Las células del tejido deben sufrir varias divisiones mitóticas en presencia de

una auxina durante la inducción del estado de célula embriogénica. Estas divisiones

mitóticas dan lugar a un callo (Gómez 1998), a partir del cual se forman después los

embriones. En este tipo de embriogénesis, las células diferenciadas deben ser primero

16

desdiferenciadas, donde demuestran su totipotencialidad al convertirse en células con

capacidad embriogénica que son capaces de regenerar plantas completas. (Ayerbe &

Sagasta 1990). El callo que se forma puede tener diferentes apariencias y color

dependiendo de la especie o genotipo con que se trabaje, así como las condiciones del

cultivo in vitro. El color varía de blanco, blanco-amarillento a pardo. Su apariencia puede

ser acuosa (callos que no regeneran) o compactos, secos y nodulares. En pocas

palabras el mejor callo es aquel que se denomina como un callo friable (de apariencia

seca, compacto y de coloración amarillo blanquecina).(Gómez 1998).

Existen otros factores que afectan la embriogénesis somática, tales como:

- El Genotipo de la Planta: La respuesta embriogénica varía con la especie siendo

que algunos cultivares se pueden regenerar fácilmente en un medio específico, mientras que

otros cultivares no responden en el mismo medio (Litz & Jarret 1993). También depende del

tipo de explante y edad o desarrollo fisiológico del mismo, en este caso se ha encontrado

que entre más diferenciado se encuentre el explante la respuesta embriogénica disminuye ya

que la activación de los genes para el programa de la embriogénesis se hace más difícil. En

este caso se ha estimado que los mejores explantes son los tejidos más jóvenes o

inmaduros, por tal razón el que se usa con frecuencia es el de embriones cigóticos

inmaduros. Este tejido es embriogénico por naturaleza y aparentemente requiere menos

nutrientes que otros tejidos somáticos para inducir respuesta de embriogénesis somática. En

este tipo de explante la respuesta embriogénica también varía con el estado de desarrollo

del embrión inmaduro (Finer 1995); y con la concentración de la auxina empleada (Gómez

1998). En el caso de emplearse embriones cigóticos, se debe evaluar la edad en número de

días después de la polinización para determinar el estado óptimo de inducción, en el caso de

papaya se ha estimado que la edad de los frutos inmaduros debe estar entre los 90 a 120

días después de la antesis (Finer 1995).

- El Medio de Cultivo: Las formulaciones que se han desarrollado para una óptima

morfogénesis en el cultivo de tejidos se han basado generalmente en el medio Murashige &

Skoog (1962) (MS). Las sales MS contienen relativamente más cantidad de macronutrientes

en comparación con el medio White ó B5 (Litz & Gray 1992); el uso del medio de cultivo con

sales concentradas parece ser muy benéfico para el crecimiento de embriones somáticos

17

(Litz & Jarret 1993). Por otro lado se ha estimado que la concentración de sacarosa entre el

30 – 60 % es un componente importante del medio de cultivo, ya que ayuda a aumentar el

potencial osmótico el cual afecta el crecimiento y la morfogénesis en el cultivo de embriones,

embriogénesis somática, cultivo de anteras y morfogénesis del cultivo de callos (Sutter

1996).

- Reguladores de Crecimiento: La embriogénesis somática se ha obtenido cuando se

emplea un medio que contiene auxinas, principalmente el 2,4-D en concentraciones que van

de los 22 a los 67 µM; también se emplean otras auxinas sintéticas como el Dicamba, Ácido

Naftalenacético (ANA en 0.5 µM) o Picloram (Litz & Gray 1992). Aunque son usadas para la

inducción de embriones somáticos, usualmente son inhibitorias para el desarrollo de los

mismos en estados avanzados; razón por la cual se usa con frecuencia un medio libre de la

hormona o que contenga bajas concentraciones de estas para el desarrollo del estado

globular de los embriones; esto dependiendo del genotipo de la especie (Phillips et al. 1995).

Los embriones no solo se pueden desarrollar, sino que también pueden madurar; o en otros

casos pueden producir embriones múltiples o embriones con anormalidades tales como la

fasciación y la fusión de cotiledones (Litz & Gray 1992, Litz & Jarret 1993).

Si las condiciones del cultivo son inadecuadas para llevar a cabo el desarrollo normal de los

embriones somáticos puede ocurrir la germinación precoz, dando como resultado una baja

viabilidad de regenerantes. Si los embriones no son fisiológicamente maduros, ellos no

pueden germinar normalmente y usualmente no sobreviven; la germinación precoz puede ser

estimulada en los embriones somáticos inmaduros por la presencia en el medio de una

auxina para el desarrollo de raíces y de una citoquinina para el desarrollo de brotes (Litz &

Gray 1992).

Por otro lado, el control de secuencias de los eventos de desarrollo durante la ontogenia de

embriones somáticos no está bien definida para ninguna especie, ni siquiera para el modelo

clásico de la zanahoria. Se ha manifestado por muchos años que los embriones somáticos

no son anatómicamente ni bioquímicamente idénticos a los embriones cigóticos, a pesar de

sus similaridades morfológicas (Litz & Gray 1992) sobre todo en su desarrollo evolutivo

desde proembrión, fase globular, corazón, torpedo y fase cotiledonar o embrión maduro, esto

18

para el caso de las especies dicotiledóneas (Gómez 1998); por lo que las interpretaciones de

los eventos que ocurren tempranamente en las células y que traen consigo la diferenciación

de plantas a partir de callos siguen siendo hipotéticas (Litz & Jarret 1993).

2.3 Cultivo in vitro en Carica.

Litz & Conover (1978) son los principales investigadores en el cultivo de tejidos de papaya

desde que empezaron a propagar plantas vía cultivo in vitro que habían sido resistentes al

virus de la mancha anular. En este caso se empleó el cultivo de ápices sobre un medio

sólido (medio basal MS); donde concluyeron tener excelentes perspectivas ya que

consiguieron una rápida propagación. Por otro lado, también demostraron la facilidad del

establecimiento, proliferación y diferenciación del cultivo in vitro de la papaya usando ápices

de plantas maduras sin la inducción primaria de un callo; por lo que empezaron a pensar en

la producción de plantas in vitro como un método más económico que la producción

convencional por semilla.

Al año siguiente Litz & Conover (1979) obtuvieron cultivos de callos friables de Carica

stipulata en medio MS que contenía ANA en la concentración de 0.5 µM.

Así mismo Litz & Conover (1980a) lograron una óptima embriogénesis somática en cultivos

celulares de C. stipulata cuando el medio de cultivo contenía los reguladores de crecimiento

ANA (1 µM) y BA (2 µM), y Carbón activado (1 % p/v); pero no fue así cuando se

encontraban dos o uno solo de estos compuestos. Estos autores determinaron que su

trabajo estaría encaminado a la recuperación de híbridos siguiendo la fusión de protoplastos,

células que obtenían de hojas jóvenes colectadas de plantas cultivadas in vitro.

Litz & Conover (1980b) determinaron que el 2,4-D a una concentración de 22 µM daba un

callo más friable; y a su vez seguían confirmando el papel inhibitorio de las citoquininas para

el crecimiento del callo y su uso indispensable para la regeneración de la planta.

Concluyeron que la inducción de callo y su crecimiento es claramente dependiente del 2,4-D.

La profundización del cultivo in vitro de la papaya continuó con la producción de embriones

somáticos desarrollados a partir de un callo ovular (producto de la hibridación específica

19

entre C. papaya y C. cauliflora). En ese trabajo obtuvieron un 20 % en la germinación de

los embriones somáticos demostrando ciertas anormalidades morfológicas tales como la

fasciación, fusión de cotiledones, pérdida de dominancia apical. Finalmente se comenta que

la respuesta embriogénica es altamente dependiente del genotipo del material y no puede

ser inducida en algunos tipos de papaya (Moore & Litz 1984).

El autor Drew (1988) desarrolló un interesante trabajo al conseguir una rápida propagación

clonal de C. papaya. Su trabajo estuvo encaminado a solucionar los tres problemas que,

según él, limitan la aplicación de la técnica de cultivo in vitro a la producción comercial: a) el

cultivo de genotipos élites conlleva a trabajar árboles establecidos en el campo donde es

necesario escoger adecuadamente el explante apropiado el cual debe ser joven ya que el

cultivo de tejidos maduros es más difícil, b) la inhabilidad para subcultivar indefinidamente, c)

el alto nivel de contaminación (> 80 %) bacterial en los explantes colectados en campo. Por

otro lado, su trabajo no solo estuvo encaminado a la regeneración y propagación de C.

papaya, sino que también lo estuvo a la fase de aclimatación, por lo que llevó a cabo el

enraizamiento de las plantas con 10 µM de AIB, y luego estableció el material en una mezcla

de turba : perlita : piedras (1:1:1 en volumen) diferentes sustratos, no informa cual fue el

porcentaje de sobrevivencia de las plantas sembradas.

Miller & Drew (1990) continuaron en la búsqueda del mejor método para la formación de

brotes, basándose en la respuesta de tres tipos de explantes; esta investigación estaba

encaminada a una mejor propagación in vitro de papaya y consecuentemente a incrementar

los volúmenes de proliferación.

En cuanto a trabajos específicos sobre embriogénesis somática y su regeneración en

plantas, Fitch & Manshardt (1990) trabajaron con embriones cigóticos inmaduros de C.

papaya en cuatro cultivares comerciales. En su investigación dicen haber demostrando la

capacidad de producir una alta frecuencia de embriones somáticos de forma directa (2-20

embriones somáticos) a partir de embriones cigóticos inmaduros. Para llevar a cabo su

trabajo emplearon diferentes concentraciones de 2,4-D (de 0-25 mg/l), TDZ (0.02 mg/l), BA

(0.4 mg/l) y Picloram (0.5 mg/l); en sus resultados encontraron que estos tres últimos

reguladores inhibían la embriogénesis somática en papaya.

20

En 1991, nuevamente se induce embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos

inmaduros, con el fin de rescatar embriones producto de la hibridación de dos especies: C.

papaya x C. cauliflora; el interés en este estudio se origina en la resistencia que C.

cauliflora le puede aportar a C. papaya al transferirle el gen de resistencia al PRV, gen que

no ha sido posible transferir por métodos convencionales debido a la incompatibilidad que

existe entre estas dos especies; todo esto con el fin de obtener híbridos interespecíficos que

puedan ser usados con propósitos comerciales y continuar el desarrollo del cultivo de

embriones para obtener plantas híbridas maduras (Chen et al. 1991).

Luego de conocer el proceso de regeneración de C. papaya las investigaciones en

biotecnología continuaron, en esta ocasión hacia la ingeniería genética donde se evidencia la

importancia de la regeneración in vitro de embriones somáticos que fueron transformados

genéticamente. Tal es el caso del estudio realizado por Fitch et al.(1993), quienes se

dedicaron en su trabajo a aumentar la frecuencia de embriogénesis somática a partir de callo

de papaya; trabajo que estuvo conducido a la regeneración de plantas que habían sido

modificadas genéticamente. Sus resultados han sido muy importantes ya que confirman las

diferencias en la respuesta que presentan tres diferentes cultivares de papaya.

Luego, las investigaciones sobre papaya estuvieron evaluando el potencial de embriogénesis

somática para su producción a gran escala. En esta ocasión emplearon un sistema de

medio de cultivo líquido (Castillo et al. 1998a). De acuerdo con estos resultados, Castillo et

al. (1998b) utilizaron la técnica de embriogénesis somática con fines comerciales, esto es,

hacia la producción de semilla sintética o artificial; presentando un método para la

encapsulación de los embriones somáticos de alta calidad, que habían sido producidos por el

sistema líquido que ya habían desarrollado y evaluado.

Continuando en la búsqueda de incrementar la producción de brotes, Lai et al. (1998)

encontraron que el airear el frasco de cultivo una semana después de iniciado el cultivo

incrementa la producción y calidad de los brotes hasta en un 41 %.

Como se ha de notar, la propagación y regeneración en el cultivo de tejidos de papaya ha

sido muy bien estudiada, sin embargo, en la fase final del proceso de producción in vitro de

plantas se ha encontrado un obstáculo, es decir, que hay inconvenientes en la fase de

enraizamiento y en consecuencia en la de aclimatación. Se ha considerado una dificultad

21

debido al bajo porcentaje de sobrevivencia y a su pobre crecimiento después del transplante

a campo.

Por otro lado, se ha estimado que el enraizamiento in vitro resulta muy costoso, además las

raíces que se obtienen no siempre son funcionales y en consecuencia las plantas degeneran

después de su transplante. Por tales motivos se han realizado diversas investigaciones en el

proceso de enraizamiento de papaya. En estos estudios siempre se evaluó el efecto del

sustrato en la morfología y formación de las raíces tanto in vitro como ex vitro; para lo cual se

han ensayado diferentes sustratos tales como agar, gellam gum, vermiculita, almidón y

rockwool; encontrando generalmente que la vermiculita permite un mejor desarrollo de

raíces, es decir, que no se presentan anormalidades estructurales en comparación con las

raíces desarrolladas en el medio con agar; y en consecuencia las plantas presentan un

crecimiento más vigoroso (Kataoka & Inoue 1991, Kataoka 1994, Suksa-Ard et al. 1998a,

1998b).

2.4 Métodos Estadísticos Empleados en Cultivo de Tejidos.

La estadística es una herramienta importante para investigaciones biológicas porque ofrece

una vía objetiva y no sesgada para evaluar tratamientos experimentales. En estadística se

usan probabilidades matemáticas para determinar si un evento ocurre o no por efecto de un

tratamiento, seguido de la selección del mejor tratamiento (Compton 1996).

Cuando en una investigación se han elegido los tratamientos, como por ejemplo diferentes

niveles de reguladores de crecimiento, es frecuente seleccionar un amplio rango de

concentraciones que envuelvan respuestas que sean subóptimos, óptimos y supraóptimos.

Así mismo, cuando el objetivo es identificar genotipos que sufren embriogénesis somática es

mejor evaluar tantos genotipos como sea posible (Compton 1994).

Una limitada variedad de diseños de experimentos se usan para estudios de cultivo in vitro.

Esto es en parte por la uniformidad ambiental en la cual las células cultivadas crecen. Como

consecuencia la mayoría de estudios en cultivo de tejidos emplean un diseño

completamente al azar o bloques completamente aleatorizados (Compton 1994).

22

A menudo los explantes son seleccionados como la unidad observacional en el cultivo de

tejidos. En muchos experimentos la unidad experimental o réplica es el frasco donde se

cultiva; esto es porque un frasco contiene un explante, el cual es la unidad de observación.

Cuando hay un explante por frasco, ambos, el frasco y el explante son considerados como

réplica. Cuando hay varios explantes por frasco, el frasco es considerado la unidad de

replicación (Compton 1996).

Cuando los investigadores desean comparar los verdaderos efectos de sus tratamientos,

comúnmente recurren a un análisis de varianza con su correspondiente prueba F. Sin

embargo, por sí misma tal prueba no proporciona inferencias sobre comparaciones

específicas entre los grupos (Martínez 1997); por lo que es necesario un análisis post-

ANOVA; y aún más cuando hay más de dos tratamientos. Existen muchos procedimientos

de separación de medias que infieren variación entre tratamientos; estos son, el error

estándar del promedio (SE), comparaciones múltiples y el test múltiple y análisis de regresión

(Compton 1996). Las comparaciones múltiples se deben usar únicamente cuando los

tratamientos no están relacionados, por ejemplo diferentes reguladores de crecimiento,

genotipos, etc., ejemplos de comparaciones múltiples son: Bonferoni, Diferencia Mínima

Significativa de Fisher (DMS), Scheffé, Tukey ó Método de la diferencia Mínima Significativa

honesta de Tukey (Tukey’s HSD) y Waller-Duncan (Compton 1996).

Carner & Swanson (1973) (citado por Montgomery 1991) han realizado estudios de

simulación de Montecarlo en diferentes procedimientos de comparación múltiple.

Concluyeron que el método de la mínima diferencia significativa es una prueba muy eficiente

para detectar diferencias verdaderas en las medias si se aplica hasta después de que la

prueba F del análisis de varianza ha sido significativa en un 5 %. También informan de un

buen desempeño para detectar diferencias reales usando la prueba de intervalos múltiples

de Duncan. Esto no debe sorprender, ya que estos dos métodos son los mejores de los que

se han analizado.

2.4.1 Diseño Completamente al Azar, Bloques Completamente al Azar.

El diseño Completamente al Azar supone que todas las unidades experimentales son

homogéneas y que los tratamientos se asignan a las unidades experimentales en forma

23

completamente al azar. Por lo general, los tratamientos se asignan a igual número de

unidades experimentales. Sin embargo, no es necesario (Martínez 1997).

Este diseño tiene las siguientes ventajas:

- Flexibilidad: se puede usar cualquier número de tratamientos y repeticiones. No es

necesario que todos los tratamientos tengan igual número de repeticiones.

- Sencillez en el análisis estadístico: el análisis es simple a pesar de que se tenga

diferente número de repeticiones, y no se complica por la pérdida de unidades

experimentales. El diseño proporciona el mayor número de grados de libertad para el

error, comparado con otros diseños de estructura más compleja.

La principal desventaja que tiene es su baja precisión y eficiencia cuando las unidades

experimentales son heterogéneas hecho que lleva a una sobre estimación de la varianza del

error experimental (Martínez 1997).

El diseño de bloques completamente al azar se emplea cuando existe heterogeneidad entre

las unidades experimentales, o bloques. El agrupamiento de las unidades experimentales en

bloques uniformes da un mejor estimativo del efecto que tienen los tratamientos sobre las

unidades observacionales, además da una mayor precisión estadística. En este diseño los

tratamientos son agrupados en bloques que contienen al menos una réplica de cada

tratamiento, esto minimiza la variabilidad dentro de los bloques mientras la variabilidad entre

bloques se maximiza; por esta razón, las unidades experimentales dentro de cada bloque

deben ser lo más uniformes posible, además el número de tratamientos debe ser limitado por

que la variabilidad dentro de cada bloque incrementa al aumentarse el número de

tratamientos (Compton 1994).

24

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN.

3.1 Formulación del Problema.

La papaya es un cultivo de fruta muy importante en áreas tropicales y subtropicales. Desde

hace años la enfermedad causada por el virus de la mancha anular de la papaya (PRV) ha

afectado desfavorablemente la producción en muchas partes del mundo (Moore & Litz 1984).

En el caso específico de Colombia, donde el cultivo tiene gran relevancia, también se ha

visto afectado por la incidencia del PRV, el cual ha sido el causante de los mayores daños en

las plantaciones, donde las pérdidas han llegado a ser del 100 % (Mosqueda et al. 1998).

Para dar una solución eficiente la biotecnología ofrece una alternativa excelente para la

obtención de variedades comerciales de papaya mediante la técnica de transformación

genética la cual depende de la regeneración de plantas vía cultivo in vitro; esto se puede

lograr empleando la técnica de embriogénesis somática. Para llevar a cabo esto es

necesario el desarrollo de protocolos in vitro para conocer, no solo la combinación adecuada

de los nutrientes que debe contener el medio de cultivo, sino que también la adición de

algunos reguladores de crecimiento como el 2,4-D; sin embargo estos suplementos varían

con la especie, e incluso pueden llegar a ser específicos de acuerdo con la parte de la planta

que se este cultivando y a la respuesta que se desee obtener, por eso es necesario evaluar

varios genotipos. Por otro lado, la regeneración de estos embriones somáticos es un paso

que en varias ocasiones ha dado resultados poco satisfactorios (Moore & Litz 1984) y en la

obtención de plantas bajo condiciones ambientales los resultados no han sido mejores

(Kataoka 1994).

3.2 Preguntas de Investigación.

¿Cuál es la óptima concentración del 2,4-D para la formación de embriones somáticos en

Carica papaya L?.

¿Las cuatro selecciones colombianas de papaya responden de diferente forma al 2,4-D

empleado para inducir la embriogénesis?

25

¿Es posible la regeneración de plantas, a partir de embriones somáticos en cuatro

selecciones colombianas de papaya?.

¿Los procedimientos del cultivo in vitro permiten obtener plantas vigorosas y que sobrevivan

en la fase de aclimatación en cuatro selecciones colombianas de Carica papaya?.

3.3 Justificación.

En el cultivo de frutas en Colombia, la papaya, ocupa junto con el de la guayaba, el cuarto

lugar de importancia por área sembrada. Después de los cítricos, la papaya se considera el

cultivo de frutas más importante, su producción se ha visto disminuida en un 50 – 100 % por

la incidencia del virus de la Mancha Anular y por la ausencia de medidas de manejo de la

enfermedad (Arango 1999).

Para solucionar estos problemas se utilizan herramientas biotecnológicas como la

producción masiva de plantas vía cultivo in vitro al hacer propagación la clonal de aquellas

que se han seleccionado en campo por presentar características de interés comercial como

el rendimiento y tolerancia al PRSV; por otro lado también se puede emplear la ingeniería

genética empleando en primer lugar la técnica de producción de embriones y su manejo in

vitro. La metodología de embriogénesis somática es la más empleada porque ofrece una

mayor eficiencia, facilidad de manejo y rapidez. Por otro lado este método es considerado

como el primer paso para el inicio de un trabajo de ingeniería genética, ya que los embriones

producidos son la herramienta básica empleada para llevar a cabo el proceso de la

introducción de genes para la obtención de plantas resistentes; razones por las cuales el

cultivo in vitro se hace necesario ya que un sistema efectivo de transferencia de tecnología

depende y requiere en toda su extensión de un procedimiento eficiente y seguro de la

regeneración de plantas a partir de células transformadas.

26

4. OBJETIVOS.

4.1 Objetivo General.

Estandarizar un sistema de regeneración in vitro para la obtención de plantas a partir de

embriones somáticos derivados de cuatro selecciones colombianas de Carica papaya.

4.2 Objetivos Específicos.

- Establecer la concentración más adecuada del ácido 2,4 diclorofenoxiacético para la

inducción de embriones somáticos a partir de embriones cigóticos.

- Regenerar plantas a partir de embriones somáticos en las selecciones Catira 1,

Caripaz 24, Hawaiana y Maradol.

- Determinar las mejores condiciones para la fase de aclimatación de plantas obtenidas

in vitro.

- Producir plantas viables al transplante a condiciones ex vitro.

27

5 MATERIALES Y MÉTODOS.

5.1 Embriogénesis Somática Directa y Formación de Callo.

Para llevar a cabo este proceso se empleó como explante embriones cigóticos provenientes

de frutos inmaduros cuya edad era de 90 – 120 días después de la apertura floral. La

población inicial de estudio fueron los frutos de las cuatro selecciones colombianas: la

selección Catira 1, selección Maradol, selección Caripaz 24, y selección Hawaiana. Las dos

primeras fueron proporcionadas por la regional Nº 8 de CORPOICA (C.I La Libertad, km 17

vía Puerto López). Las selecciones Hawaiana y Caripaz 24 fueron proporcionadas por la

regional Nº 3 de CORPOICA (C.I Caribia, Santa Marta).

El medio basal que se utilizó fue el Murashige & Skoog (MS) (anexo 1) suplementado con

diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento y compuestos orgánicos de

acuerdo con la etapa en que se encontrara el cultivo. La unidad experimental o réplica fue

cada una de las cajas de petri y/o frasco empleado para hacer los correspondientes cultivos.

El procedimiento para extraer los embriones cigóticos fue el siguiente:

- Se tomó el fruto, se limpió muy bien y se abrió en dos partes dentro de una cabina de

flujo laminar horizontal (figura 2A).

- Con unas pinzas debidamente esterilizadas se removieron las semillas de papaya de los

frutos inmaduros. Se realizó un corte en uno de los extremos y otro en la parte superior

de las semillas (figuras 2 B y C); finalmente, presionando suavemente la semilla se

extrajo el embrión (figuras 2 D y E). Los embriones se encuentran dentro de un ambiente

estéril en el saco embrionario; de allí se pueden aislar con facilidad, aunque esta

operación se debe hacer con cuidado con el fin de evitar daños al mismo embrión o al

suspensor.

- Se sembraron los embriones en el medio de cultivo estéril (medio MS), y se incubaron en

oscuridad con una temperatura de 25 ± 2 °C durante 40 días. Al cabo de este tiempo se

obtuvieron embriones somáticos y/o callos.

28

Figura 2. Procedimiento para extraer los embriones cigóticos de las semillas. A) Fruto con semillas inmaduras. B) Corte en uno de los extremos de la semilla. C) Embrión localizado en el centro de la

semilla. D) Extracción del embrión mediante presión. E) Embriones cigóticos (EC) extraídos de semillas.

Fuente: Autor.

El medio de cultivo para esta fase fue semisólido (denominado Medio de Inducción I)

compuesto por sales MS al 100 %, Vitaminas MS al 100 %; Myo-inositol 100 mg/l; L-

glutamina 400 mg/l; sacarosa 60 gr/l; Phytagel 1.8 g/l (R. Gómez, Instituto de Biotecnología

de las plantas, Cuba- Com. Pers.) y 2,4-D evaluando las concentraciones de 13.5, 27.1,

40.7, 54.2, 67.8 y 81.4 µµM para las selecciones Catira 1 y Caripaz 24; y 22.6, 45.2, 67.8 y

90.4 µM para las selecciones Maradol y Hawaiana. La cantidad de medio en cada caja de

petri fue de 30 ml. Se trabajó con un mínimo de siete unidades experimentales y máximo de

25. Se sembraron cuatro embriones cigóticos en cada caja de petri.

Se emplearon dos grupos de concentraciones de 2,4-D teniendo en cuenta trabajos

anteriores, donde ya se han empleado algunas de estas en las selecciones Maradol y

Hawaiana llevando a trabajar rangos de concentraciones más amplios, caso contrario en las

selecciones Catira 1 y Caripaz 24 las cuales son trabajadas por primera vez en este tipo de

ensayos, donde es necesario emplear concentraciones de la auxina cuyos rangos sean más

estrechos.

A B

C D E EC

29

En esta fase se hizo un seguimiento cada diez días el cual permitió determinar las fases por

las que el embrión cigótico pasa para la formación de embriones somáticos y/o callo. Para el

análisis de la información solo se empleó la última lectura realizada que fue a los 40 días de

iniciado el cultivo. También se determinó el porcentaje de embriones cigóticos que tuvieron

desarrollo embriogénico (un embrión cigótico embriogénico se define como aquel que

produce embriones somáticos o callo en su domo apical).

5.2 Embriogénesis Indirecta.

El callo formado en el medio de Inducción I (que se denominó callo mediano) se cambió de

medio a los 40 días, se escogió este callo porque presentaba la apariencia de ser un callo

friable (de apariencia seca, compacto y de coloración blanco – amarillo). La formulación del

medio empleado para la embriogénesis indirecta era la misma del medio de inducción I; pero

se disminuyeron las concentraciones del regulador de crecimiento (llamado medio de

Inducción II), estas eran:

Concentraciones de 0, 5.4 y 16.2 µM para las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

Concentraciones de 0, 9, 18 y 27.1 µM para las selecciones Maradol y Hawaiana.

La cantidad de medio en cada caja de petri fue de 30 ml. Se emplearon de 5 a 25 unidades

experimentales, donde cada caja de petri contenía cuatro callos en su interior. En este

medio permanecieron 40 días a oscuridad con una temperatura de 25 ± 2 °C.

La información colectada en esta fase fue el número de grupos de embriones somáticos

obtenidos por cada tratamiento empleado. Dichos grupos eran de un tamaño aproximado de

10 x 10 mm cada uno con un número aproximado de 20 embriones somáticos.

5.3 Fase de Conversión de los Embriones Somáticos en Plantas.

Los embriones somáticos, obtenidos después de 40 días en el medio de inducción II, se

transfirieron a un nuevo medio de cultivo para su germinación, en este permanecieron 30

días. Para esta fase se empleó medio semisólido compuesto por sales MS al 100 %;

Vitaminas MS al 100 %; Myo-inositol 100 mg/l; 6-BAP 1.1 µM; sacarosa 30 gr/l y Phytagel

1.8 g/l (R. Gómez, Instituto de Biotecnología de las plantas, Cuba- Com. Pers.). La cantidad

30

de medio en cada contenedor fue de 50 ml. Se trabajaron de cinco a catorce unidades

experimentales, cada frasco contenía diez grupos de embriones somáticos en su interior.

Para este proceso, los embriones se agruparon en agregados de aproximadamente 10 x 10

mm y se inocularon en el medio (figura 3). En esta fase los embriones somáticos se

incubaron con un fotoperíodo de 16 horas luz y ocho de oscuridad con una temperatura de

25 ± 2 °C.

Figura 3. Grupos de embriones somáticos inoculados en medio de germinación incubados con una

temperatura de 25 ± 2 °C, fotoperiodo de 16 horas luz y ocho de oscuridad. Fuente: Autor.

Para evaluar este proceso se estimó el porcentaje de conversión de los embriones somáticos

en plantas, dependiendo del tratamiento en el cual los embriones se habían formado de

forma indirecta. La información de colectó a los 30 días de iniciado el cultivo.

5.4 Fase de Formación de Brotes Múltiples.

Las plantas obtenidas en el medio de germinación se inocularon en el medio de formación de

brotes múltiples, en el que permanecieron de 10 a 15 días. El medio de cultivo para esta

fase fue líquido compuesto por sales MS al 100 %; Vitaminas MS al 100 %; Tiamina 1 mg/l;

6-BAP 0.976 µM; Kinetina 0.1 mg/l; Sacarosa 30 gr/l (R. Gómez, Instituto de Biotecnología

31

de las plantas, Cuba- Com. Pers.). La cantidad de medio en cada contenedor fue de 20 ml.

Aunque el medio en esta fase era líquido, no se mantuvo en agitación constante.

Antes de hacer esta inoculación se eliminó el callo formado en la parte basal de las plantas

(figuras 4 A y B). Los cultivos se mantuvieron con un fotoperiodo de 16 horas luz y ocho de

oscuridad y con una temperatura de 25 ± 2 °C.

Figura 4. Inoculación de las plantas germinadas en medio de formación de brotes. A) Eliminación

del callo de la zona basal. B) Plantas inoculadas en medio liquido para la formación de brotes múltiples.

Fuente: Autor.

5.5 Fase de Crecimiento.

Los brotes obtenidos en el medio anterior, se separaron y se inocularon en un nuevo medio

de cultivo (crecimiento) en el que estuvieron 30 días (figura 5) con un fotoperíodo de 16

horas luz y ocho de oscuridad, y con una temperatura de 25 ± 2 °C.

A B

32

Figura 5. Plantas inoculadas en medio MS al 100 % provenientes del medio de formación de brotes.

Fuente : autor

Para el crecimiento de las plantas se empleó medio semisólido compuesto por sales MS al

100 %; Vitaminas MS al 100 % y Phytagel 1.8 g/l; donde se evaluó el efecto de la sacarosa

en concentraciones de 0 y 30 g/l para todas las selecciones. La cantidad de medio en cada

contenedor fue de 50 ml. El número de unidades experimentales fue de doce, cada frasco

contenía dos plantas en su interior.

Esta prueba se planteó porque en ensayos anteriores donde se empleó el medio con

sacarosa se notó amarillamiento en las hojas, además de no observarse crecimiento en las

plantas, por lo que se consideró emplear este medio para lograr un mejor estado de las

plantas además de conseguir el incremento en la longitud para que se pudiera hacer la fase

de enraizamiento en plantas que se encontraran de un mayor tamaño.

Se evaluó el crecimiento de las plantas comparando la longitud (cm) total de las plantas, al

inicio y al final del cultivo (0 y 30 días), en el medio con y sin sacarosa.

5.6 Fase de Enraizamiento.

Las plantas de más de 1 cm de longitud se transfirieron a la fase de enraizamiento in vitro y

ex vitro; para esto la parte basal de las plantas se sumergió por diez segundos en una

33

solución de 12.3 mM de AIB disuelto en etanol al 50 %, y luego se sembraron en vermiculita

que contenía sales MS al 50 % y vitaminas MS al 50% en condiciones estériles (in vitro)

(figura 6) y no estériles (ex vitro) (Kataoka & Inoue 1991), ésta última se llevó a cabo

paralelamente a la fase de aclimatación. También se estableció un testigo al cual no se le

aplicó la solución de AIB. El tiempo de permanencia fue de 30 días, incubados con una

temperatura de 25 ± 2 °C. En condiciones in vitro se mantuvieron bajo fotoperiodo de 16

horas luz y ocho de oscuridad.

Figura 6. Planta en medio vermiculita para el enraizamiento.

Fuente : autor

Se emplearon 50 ml de vermiculita con 20 ml de medio. El número de unidades

experimentales fue de diez frascos, cada uno con una planta en su interior. Al finalizar el

ciclo de enraizamiento (30 días) se contó el número de raíces y su longitud para cada planta.

Todos los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 15 lb de presión (121 ºC) durante

20 minutos. El pH de todos los medios fue ajustado a 5.8 con NaOH antes de la

esterilización

34

5.7 Aclimatación de las Plántulas.

Para esta última fase las plantas se lavaron para eliminar el exceso de medio y se

sumergieron en una solución funguicida por 4 minutos (Benlate 1 gr/l). Posteriormente, se

sembraron en vermiculita, como sustrato, que había sido previamente esterilizada, y se

humedeció con sales MS al 50 % que también se habían esterilizado. Cada plántula

sembrada se cubrió con una bolsa plástica transparente y se llevó al invernadero (figura 7 A

y B). Se realizó un riego semanal con agua destilada. La bolsa plástica se fue abriendo

gradualmente hasta que la planta estuvo bien establecida, tiempo en el cual se le retiró la

bolsa completamente .

Figura 7. A) Planta transplantada a vermiculita humedecida con sales MS al 50%. B) Con cubierta

plástica transparente para evitar su deshidratación. Fuente: Autor.

Se estimó la sobrevivencia de las plántulas provenientes del enraizamiento in vitro y ex vitro

a los 25 días de haberse iniciado la fase de endurecimiento.

Por otro lado, también se llevó a cabo la aclimatación abriendo gradualmente la tapa del

frasco de cultivo, es decir que las plantas no se sacaron del frasco en el que se encontraban.

Para este procedimiento se evaluó el porcentaje de sobrevivencia a los 50 días, tiempo en el

que la tapa del frasco se encontraba totalmente abierta.

A B

35

5.8 Análisis de la información.

Los tratamientos se aplicaron bajo la estructura de un diseño completamente al azar con

arreglo factorial; se utilizaron análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de rangos múltiples

de Duncan para detectar diferencias entre los tratamientos, en donde se obtuvieron

comparaciones entre los promedios de cada variable evaluada en las diferentes fases

analizadas. Todos los datos fueron procesados en el programa PC-SAS.

36

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Embriogénesis Somática Directa y Formación de Callo.

La evaluación se realizó semanalmente en todas las selecciones donde se pudieron detectar

nueve estadíos por los que el embrión cigótico pasa para formar callo o embriones

somáticos; estos fueron:

- Estadío IA (inicio de apertura de los cotiledones): El embrión empieza a abrir sus

cotiledones, pero no están en toda su extensión (figura 8 A); este estadío se inicia al

segundo día de cultivo.

- Estadío A (abierto): A los diez días los cotiledones se encuentran totalmente abiertos

(figura 8 B).

- Estadío IE (inicio de embriones): Se empieza a observar formación de protuberancias en

el domo apical, empieza a formarse callo o embriones somáticos.(figura 8 C y D). Esta

respuesta se presenta a los 20 días.

- Estadío CP: A los 30 días se inicia la formación de callo, se denomina callo pequeño y se

encuentra de un tamaño de 3 a 5 mm de longitud (figura 9 A).

- Estadío CM: Se denomina callo mediano, su tamaño era de 6 a 8 mm de longitud (figura

9 B). Tamaño encontrado a los 40 días

- Estadío CG: Se denomina callo grande, su tamaño era de 9 a 11 mm (figura 9 C).

Respuesta encontrada a los 40 días.

- Estadío ES: Cuando ya se distinguen embriones somáticos formados sobre el domo

apical de los embriones cigóticos (figura 10 A y B). Se empiezan a distinguir a los 30

días.

- Estadío N: El embrión cigótico no obtuvo ninguna de las respuestas antes descritas, es

decir, que el embrión permaneció igual que cuando se aisló de la semilla (figura 11 A).

- Otro: Respuestas diferentes a las descritas anteriormente, ej. Formación de

protuberancias de consistencia dura, además de tornarse de color café (figura 11 B).

37

Figura 8. A) Estadío IA, inicio de apertura de los cotiledones. B) Estadío A, apertura total de los

cotiledones. C) Estadío IE, inicio de formación de callo. D) Estadío IE, inicio de formación de embriones. (26X) Fuente: Autor.

Cotiledones.

C D

ES Callo

Cotiledones

Cotiledón

Cotiledones

A B

38

Figura 9. A) Estadío CP, Callo pequeño. B) Estadío CM, callo mediano. C) Estadío CG, callo grande.

Fuente: Autor

Figura 10. A) Estadío ES, embriones somáticos sobre el domo apical del EC (embriogénesis directa)

(26X). B) Embriones somáticos obtenidos después de 40 días de iniciado el cultivo (26X) Fuente: Autor.

A B

Cotiledones del EC

ES ES

ES

A B

C

H

39

Figura 11. A) Estadío N, embrión cigótico (16X). B) OTRO, embrión cigótico que formó protuberancia

y se endureció (16X). Fuente: Autor.

Solo se procesaron los datos obtenidos para las variables CP, CM, CG y ES a los 40 días de

inoculados los embriones cigóticos, ya que estas fueron las respuestas que se consideraron

de interés para el presente estudio.

Después de 40 días de inoculados los embriones cigóticos en el medio de inducción I, se

obtuvieron todos los estadíos para la selección Catira 1; estadíos de A, IE, CP, CM, CG, ES

y N para las selecciones Hawaiana y Maradol; estadíos CA, A, IE, CP, CM, CG, y N para la

selección Caripaz 24. Esta asincronía en el proceso puede estar señalando que la evolución

en la respuesta se detiene en algunos embriones cigóticos, tal estancamiento puede ser

ocasionado por sensibilidad del material a algunos de los tratamientos de 2,4-D que se

emplearon.

Como se notó la selección Caripaz 24 no indujo a la formación de embriones somáticos de

forma directa en ningún tratamiento; la misma respuesta se obtuvo en los tratamientos de

90.4 y 27.1 µM para las selecciones Hawaiana y Catira, respectivamente.

Para la formación de callo, todas las concentraciones del regulador empleado cumplieron

con este propósito, la diferencia radicó en el tamaño del callo y en el número de embriones

cigóticos que dieron tal respuesta.

A B

40

El análisis de varianza (ANOVA) para las selecciones Hawaiana y Maradol (anexo 2)

muestra diferencias altamente significativas entre las selecciones para las variables ES y CP;

diferencias altamente significativas y significativas entre los tratamientos para las variables

ES y CP, respectivamente. La variable CM presentó diferencias altamente significativas en

la interacción Selección x Tratamiento; finalmente la respuesta CG no tuvo ningún tipo de

diferencia.

Por otro lado el ANOVA (anexo 3) para las selecciones Catira y Caripaz muestra diferencias

altamente significativas entre selecciones para las variables ES y CP; y significativas para

CG. Entre los tratamientos de 2,4-D se evidenciaron diferencias altamente significativas para

CP y CM y significativas para ES. En cuanto a la interacción Selección x Tratamiento existen

diferencias altamente significativas para las variables CP y CM y significativas para ES.

Debido a que se encontraron diferencias entre las selecciones se consideró conveniente

hacer el análisis estadístico por selección y no en conjunto, ya que no es posible generalizar

la concentración del 2,4-D, pues cada cultivar responde completamente diferente a cada

tratamiento. Dicha decisión también está apoyada al evidenciar diferencias significativas en

la comparación de promedios de Duncan donde se muestra que la selección Maradol obtiene

promedios más altos con respecto a la Hawaiana; y los promedios de la selección Catira son

mayores a los de Caripaz; por lo que cualquier decisión siempre estaría sesgada hacia la

selección con el promedio mayor.

Ahora, en el análisis por variedad, las tablas ANOVA de las selecciones Hawaiana (anexo 4)

y Caripaz (anexo 5) no muestran diferencia alguna entre tratamientos para ninguna variable;

por el contrario, en la ANOVA de la selección Maradol (anexo 6) se muestran diferencias

altamente significativas entre tratamientos para las variables ES y CM; en la selección Catira

(anexo 7) se presentan diferencias altamente significativas para CM y significativas para CG

y ES.

Con dichos resultados se tiene que las concentraciones de 45.2 y 67.8 µM de 2,4-D son las

mejores para la embriogénesis somática directa en las selecciones Maradol y Hawaiana, con

un porcentaje de embriogénesis del 82.1 y 17.5 % respectivamente (figura 12).

41

82.1

17.5

0102030405060708090

Por

cent

aje

de E

C e

mbr

iogé

nico

s.

22.6 45.2 67.8 90.4

Concentración de 2,4-D (uM).

Variable ES

Maradol

Hawaiana

Figura 12. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron embriones somáticos de forma

directa en las selecciones Maradol y Hawaiana. Fuente: Autor.

Cabe anotar que el promedio de embriones cigóticos que dieron respuesta ES para el

tratamiento de 45.2 µM de 2,4-D en la selección Maradol no solo es el más alto (1.097) sino

que difiere significativamente del resto de los tratamientos, tal diferencia en los promedios no

ocurre en la selección Hawaiana, sin embargo con la concentración de 67.8 µM se obtuvo el

promedio más alto (0.998) (tabla 3).

Tabla 3. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el número de embriones cigóticos que dieron las respuestas de: callo pequeño (CP), callo mediano (CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES) evaluadas a los 40 días en las Selecciones Hawaiana y Maradol

PROMEDIOS

Hawaiana Maradol

TRATAMIENTO µM

CP CM CG ES CP CM CG ES

22.6 0.746a 1.070ba 0.746a 0.854a 1.028a 1.308ba 0b 1.162b

45.2 0a 1.365a 0a 0.987a 0.832a 0.807c 0.744ba 1.907a 67.8 0.846a 1.050ba 0a 0.998a 1.065a 1.028cb 0.764ba 1.238b

90.4 0a 0.846b 0a 0a 0.813a 1.410a 0.880a 1.291b Nivel de significancia 5%. Promedios con la misma letra no difieren significativamente. Datos transformados √ x + 0.5.

42

Para el cultivar Catira la concentración ideal de 2,4-D para la embriogénesis somática directa

es la de 54.2 µM con un porcentaje del 14.6 % (figura 13); el promedio de embriones

cigóticos que indujeron tal respuesta en este tratamiento (0.960) difiere significativamente de

los otros (tabla 4).

0 0 0 0

14.6

0 0

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Por

cent

aje

de E

C

embr

iogé

nico

s.

13.5 27.1 40.7 54.2 67.8 81.4


Variable ES

Caripaz

Catira

Figura 13. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron embriones somáticos de forma

directa en las selecciones Catira 1 y Caripaz 24. Fuente: Autor.

Tabla 4. . Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el número de embriones cigóticos que dieron las respuestas de: callo pequeño (CP), callo mediano (CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES) según el tratamiento. Variables evaluadas a los 40 días en las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

PROMEDIOS

Catira 1 Caripaz 24

TRATAMIENTO µM

CP CM CG ES CP CM CG ES

13.5 1.034a 0.957ab 0.833a 0.841abc 0.845a 0.748a 0a 0a

27.1 0.835a 0.985a 0.840a 0c 0.904a 0.814a 0.734a 0a

40.7 0.888a 0.777c 0b 0.793abc 0.888a 0.758a 0a 0a

54.2 1.040a 0.808bc 0.75ab 0.960a 0.788a 0.843a 0a 0a

67.8 0.928a 0.83abc 0b 0.888ab 0.793a 0.777a 0.730a 0a

81.4 0.847a 0c 0b 0.781bc 0.777a 0.833a 0a 0a Nivel de significancia 5%. Promedios con la misma letra no difieren significativamente. Datos transformados √ + 0.5.

43

El haber obtenido diferencias en las respuestas de los materiales trabajados es consistente

con lo que reporta Fitch (1993) en donde los porcentajes de embriones cigóticos

embriogénicos fueron diferentes en los cultivares empleados, los cuales respondieron en

forma específica a una determinada concentración de la auxina, en lo que obtuvo un máximo

de 8.5 % de embriones cigóticos embriogénicos con 2.26 µM de 2,4-D en el cultivar

Waimanalo, un máximo de 45 % de embriones cigóticos embriogénicos con 4.52 µM en

Sunrise, y un máximo de 76 % con 45.2 µM en Sunset.

En cuanto a la formación de callo, requerido para llevar a cabo el proceso de embriogénesis

somática indirecta, se obtuvo para la selección Maradol diferencias entre tratamientos para la

variable CM, siendo la concentración de 90.4 µM la mejor para tal respuesta con un

porcentaje del 41 % (figura 14); aunque para las variables CP y CG no se presentan

diferencias significativas entre tratamientos. Sin embargo, se puede decir, que las

concentraciones de 67.8 y 90.4 µM son las mejores ya que presentan los mayores

promedios de embriones cigóticos embriogénicos (1.065 y 0.880) (tabla 3), y cada una

corresponde a un porcentaje del 22.9 y 9.09 % respectivamente (figuras 15 y 16).

En la selección Hawaiana, a pesar de no existir diferencias en los promedios de los

tratamientos para inducir a la formación de callo embriogénico (tabla 3), el más alto se

presentó para 67.8 µM (0.846) en la formación de CP con un porcentaje bajo, 7.5 % (figura

15). La concentración de 22.6 µM fue la única que formó CG y su porcentaje fue del 1.92 %

(figura 16). Finalmente la concentración de 45.2 µM con un 38 % para CM (figura 14), cuyo

promedio presenta diferencias según la prueba de Duncan.

44

3841

05

1015202530354045

Por

cent

aje

de E

C e

mbr

iogé

nico

s.

22.6 45.2 67.8 90.4


Variable CM

Maradol

Hawaiana

Figura 14. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Mediano en las selecciones

Maradol y Hawaiana. Fuente: Autor.

22.9

7.5

0

5

10

15

20

25

Por

cent

aje

de E

C e

mbr

iogé

nico

s.

22.6 45.2 67.8 90.4


Variable CP

Maradol

Hawaiana

Figura 15. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Pequeño en las selecciones


45

1.92

0 0

9.09

00

2

4

6

8

10

Por

cent

aje

de E

C e

mbr

iogé

nico

s.

22.6 45.2 67.8 90.4


Variable CG

Maradol

Hawaiana

Figura 16. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Grande en las selecciones


En la selección Catira la concentración de 27.1 µM de 2,4-D es la mejor para formar CM (14

%) (figura 17) y CG (7.6 %) (figura 18); para CP la concentración es la de 54.2 µM de 2,4-D,

la misma para la formación de embriones directa, pero con un porcentaje de 17.7 % (figura

19).

Para la formación de callo en la selección Caripaz 24 el tratamiento con 27.1 µM de 2,4-D es

adecuado para formar callo CG (1.32 %) (Figura 18) y CP (10.5 %) (figura 19); 54.2 µM para

CM (6.6 %) (figura 17), aunque para CM y CP no existen diferencias en los promedios de los

tratamientos que formaron embriones cigóticos embriogénicos (tabla 4) también se emplea la

concentración de 27.1 µM para CM, tratamiento que presenta el mismo porcentaje que la de

54.2 µM (figura 17).

46

14

6.6

0

2

4

6

8

10

12

14

Por

cent

aje

de E

C

embr

iogé

nico

s.

13.5 27.1 40.7 54.2 67.8 81.4


Variable CM

Caripaz

Catira

Figura 17. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Mediano en las selecciones

Catira 1 y Caripaz 24. Fuente: Autor.

1.32

7.61

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Por

cent

aje

de E

C

embr

iogé

nico

s.

13.5 27.1 40.7 54.2 67.8 81.4


Variable CG

Caripaz

Catira

Figura 18. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Grande en las selecciones


47

10.5

17.7

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Por

cent

aje

de E

C

embr

iogé

nico

s.

13.5 27.1 40.7 54.2 67.8 81.4


Variable CP

Caripaz

Catira

Figura 19. Porcentaje de Embriones cigóticos que desarrollaron Callo Pequeño en las selecciones


Se considera que se han trabajado todos los posibles tratamientos para estas selecciones ya

que se obtuvieron diferentes rangos de respuesta entre las selecciones, buenos, regulares y

malos; por lo que se puede decir que las altas concentraciones de la auxina empleada, que

estaban entre 67.8 y 81.4 µM `para las selecciones Catira y Caripaz, y la de 90.4 para

Maradol y Hawaiana, inhibieron o disminuyeron la respuesta embriogénica, respuesta que

pudo ser causada por una posible toxicidad de la concentración utilizada del regulador de

crecimiento, esto es posible ya que el 2,4-D no sólo es considerado un regulador de

crecimiento, también es empleado como agente herbicida, además en la mayoría de trabajos

similares han considerado que las concentraciones superiores a los 45 µM no producen

respuesta embriogénica en el explante utilizado.

Este efecto también puede explicar porque el mayor porcentaje de callo se produce al utilizar

las concentraciones bajas (entre los 13.5 y 54.2 µM para Catira y Caripaz; y entre 45.2 y 67.8

para Hawaiana), e incluso más bajas que las óptimas encontradas para la embriogénesis

somática directa en tres de las selecciones, con excepción de la selección Maradol, donde la

máxima concentración trabajada de la auxina resultó ser la mejor para la obtención de callo

embriogénico de tipo CM y CG. La toxicidad es un factor también identificado por Fitch

(1993) en su trabajo, el cual afirma que las variedades Sunrise y Sunset son sensibles a

48

concentraciones superiores a los 45.2 µM de 2,4-D. Este efecto no solo ocurre en papaya,

también se ha reportado en soya (Finer 1995).

El encontrar una concentración adecuada para cada selección y en los diferentes tipos de

respuesta (27.1 µM para CG y CP, 54.2 µM para CM en la selección Caripaz; 27.1 µM para

CM y CG, 54.2 µM para CP y 54.2 µM para ES en la selección Catira; 90.4, 67.8, 90.4 y

45.2 µM para CM, CP, CG y ES respectivamente en la selección Maradol; 67.8 µM para CP,

22.6 µM para CG, 45.2 µM para CM y 67.8 µM para ES en la selección Hawaiana), indica

que las respuestas a la concentración del regulador utilizado varía de acuerdo con el

genotipo del material que se esta trabajando.

Para la selección Caripaz 24, que no formó embriones somáticos de forma directa, se cree

conveniente hacer nuevos intentos con concentraciones inferiores a los 13.5 µM de 2,4-D,

pues puede que este cultivar sea más sensible al 2,4-D y por ende el efecto de toxicidad sea

mayor. La idea de esto radica en disminuir el riesgo de variabilidad genética que se pueda

producir en los embriones somáticos causada por el 2,4-D al pasar por la fase de callo.

La formación de CG, para la posterior embriogénesis somática indirecta; no se puede

considerar un resultado o una respuesta a la que los estudios deban apuntar, ya que el

porcentaje de embriones cigóticos que dan tal respuesta es bajo (9 %) comparado con el 41

% que se reportó para CM (en la selección Maradol); adicional a esto, únicamente se obtuvo

CG en un tratamiento, por lo anterior se puede concluir que la obtención de CG no es muy

común, y es más recomendable tener como objetivo la formación de CM, que no solo se

puede considerar de un buen tamaño porque no es muy pequeño, sino que es más factible

lograrlo; además, aunque se haya reportado una concentración para formar un determinado

tamaño de callo, tal concentración también es capaz de inducir los otros tamaños, respuesta

que indica que no habrá limitación en su formación, por lo tanto siempre existirá seguridad

en cuanto a la obtención de callo.

Por otro lado, en cuanto a las diferencias en la respuesta del porcentaje de embriones

cigóticos que dieron respuesta embriogénica en cada cultivar y en cada tratamiento es

consistente con lo que ya había sido reportado por Fitch (1993), Moore (1984) y Fitch &

Manshardt (1990), los cuales atribuyen esto a una respuesta dependiente del genotipo del

material, además comentan que en algunos materiales no es posible de lograr.

49

Los resultados dependiendo del genotipo permiten plantear que cualquier trabajo que se

pretenda hacer, por lo menos, en C. papaya debe tener muy bien especificado para que

cultivar se aplica y no se debe generalizar.

Para finalizar se manifiesta que las concentraciones de 45.2, 54.2, 67.8 µM que se informan

en este trabajo para la embriogénesis somática directa se encuentran dentro de los rangos

reportado en otros trabajos, por lo que queda claro que a pesar de haber una concentración

para cada genotipo, siempre existirán unas concentraciones mínimas y máximas que van a

facilitar y limitar trabajos posteriores.

6.2 Embriogénesis Indirecta.

Los embriones somáticos formados indirectamente se obtuvieron en todas las selecciones a

los 40 días de inoculados los callos de tamaño medio en el medio de inducción II; y la

cantidad de embriones formados a partir de callo fue mayor a los obtenidos por medio de la

embriogénesis directa (figura 20 A y B).

Figura 20. Embriones somáticos (ES) obtenidos de forma indirecta A) Las flechas señalan

embriones, se puede notar que son numerosos (16X). B) Embriones formados sobre callo (26X).

Fuente: Autor.

En el análisis de varianza de las respuestas en las selecciones Maradol y Hawaiana se

muestra que hay diferencias altamente significativas entre selecciones pero no entre los

tratamientos ni en la interacción Selección x Tratamiento. Para la selecciones Catira y

Caripaz, el ANOVA (anexo 8) muestra diferencias altamente significativas entre selecciones,

y significativas entre tratamientos, pero no en la interacción.

ES

Callo

A B

50

Al hacer el análisis de varianza para cada selección los resultados muestran que la

Hawaiana, Maradol y Caripaz (anexos 9, 10 y 11) no presentan diferencias entre

tratamientos; sin embargo, los promedios más altos del número de embriones somáticos

formados, corresponden a los tratamientos con 9, 18 y 0 µM de 2,4-D respectivamente

(tablas 5 y 6).

En la selección Catira si existen diferencias entre tratamientos (anexo 12) siendo la

concentración de 0 µM de 2,4-D la mejor con el mayor promedio de embriones somáticos

formados (1.71) (tabla 6). El empleo de este medio sin auxina también ha dado los mejores

resultados en el trabajo realizado por Fitch (1993), Fitch & Manshardt (1990), estos autores

reportan que el medio sin auxina induce a la maduración de los embriones y su desarrollo,

ocurriendo lo contrario cuando se emplean altas concentraciones del 2,4-D.

Tabla 5. Comparación de promedios (del número de embriones somáticos formados), según la prueba de Duncan para la embriogénesis indirecta en las selecciones Maradol y Hawaiana.

PROMEDIOS Tratamiento µM Hawaiana Maradol 0 1.590a 4.617a 9 2.515a 3.966a 18 2.290a 4.660a

27.1 1.785a 3.736a Nivel de significancia 5%.

Promedios con la misma letra no difieren significativamente. Datos transformados √ x + 0.5.

Tabla 6. Comparación de promedios (del número de embriones somáticos formados) según la prueba de Duncan para la embriogénesis indirecta en las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

PROMEDIOS Tratamiento µMl Catira 1 Caripaz 24

0 1.71a 1.238a 5.4 1.513ab 1.020a

16.2 1.155b 1.157a Nivel de significancia 5%.

Promedios con la misma letra no difieren significativamente. Datos transformados √ x + 0.5.

El empleo de la fase de callo antes de la embriogénesis somática puede incrementar la

variabilidad genética en los embriones y en las plantas regeneradas (Chen et al. 1991), por

lo que se considera que el uso del medio desprovisto de reguladores supone un aspecto muy

positivo, puesto que el citado efecto colateral puede aminorarse si se disminuye el período

51

de exposición de los cultivos al 2,4-D; este caso puede estar favoreciendo las selecciones

Catira y Caripaz.

Cuando los embriones obtenidos se separaron y se agruparon de forma que el tamaño del

grupo quedara aproximadamente de 10 x 10 mm, se obtuvo un promedio de 20 embriones

por grupo; tal cantidad de embriones es igual a la que Fitch (1993) obtuvo sobre callo.

6.3 Fase de Conversión en Plantas.

A los seis días de transferidos los embriones somáticos (obtenidos de la embriogénesis

somática indirecta) al medio de germinación empezaron a mostrar una coloración verde, y a

los 10-12 días se presentó emergencia de las primeras plantas (figura 21). Todas las plantas

que se regeneraron presentaron formación de callo en la parte basal, el cual se eliminó al

transferirlos al medio de formación de brotes múltiples (figura 22).

Figura 21. Regeneración en plantas a partir de embriones somáticos. A) La flecha señala un grupo de embriones adquiriendo una coloración verde. B) Plantas regeneradas a los 20 días de iniciado el

cultivo. Fuente: Autor.

A B

52

Figura 22. Planta de C. papaya germinada con formación de callo en la parte basal.

Fuente: Autor.

La germinación se presentó en los embriones somáticos formados en todos los tratamientos

evaluados para la embriogénesis indirecta (figura 23), la diferencia en el porcentaje de

regeneración de los embriones estuvo asociada con el tratamiento en el que se habían

formado; en lo que se obtuvo una ANOVA (anexo 13) para las selecciones Maradol y

Hawaiana con diferencias significativas entre las selecciones y altamente significativas en la

interacción Selección x Tratamiento. La prueba de ANOVA (anexo 14) de las selecciones

Catira y Caripaz muestra diferencias altamente significativas entre las selecciones y

significativas entre tratamientos.

Figura 23. Plantas de C. papaya regeneradas (a los 30 días) a partir de embriones somáticos

Fuente: Autor.

Callo

53

En el análisis realizado a cada selección, el ANOVA para las selecciones Maradol y Catira

(anexos 15 y 16) presenta diferencias significativas entre los tratamientos; la Hawaiana y

Caripaz no evidencian tales diferencias (anexos 17 y 18).

En las selecciones Maradol y Catira los embriones formados en la concentración de 0 µM de

2,4-D presentaron el mayor promedio de conversión en plantas (0.341 y 0.347) (tablas 7 y 8),

el cual difiere significativamente de los otros tratamientos empleados. El tratamiento que

resultó ser el mejor para la germinación de embriones de la selección Maradol no es igual al

obtenido en la fase de embriogénesis indirecta cuyo tratamiento fue de 18 µM de 2,4-D, esto

puede indicar que el medio aconsejado para el desarrollo y maduración de los embriones

somáticos, no es recomendable emplearlo, pues al momento de regenerarse en plantas

dichos embriones no son fisiológicamente maduros y no germinan, por lo que se obtiene una

baja sobrevivencia (Litz & Gray 1992).

Para las selecciones Hawaiana y Caripaz el promedio más alto de germinación (tablas 7 y 8)

lo obtuvieron las concentraciones de 9 y 0 µM de 2,4-D respectivamente (0.342 y 0.168),

aunque no se evidencian diferencias significativas entre los tratamientos.

Tabla 7. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el porcentaje de germinación en las selecciones Maradol y Hawaiana.

PROMEDIOS Tratamiento µM Maradol Hawaiana 0 0.341a 0.147a 9 0.201b 0.342a

18 0.130b 0.237a 27.1 0.096b 0.332a

Nivel de significancia 5%. Promedios con la misma letra no difieren significativamente.

Datos transformados arco seno √(x/100).

Tabla 8. Comparación de promedios según la prueba de Duncan para el porcentaje de germinación el las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

PROMEDIOS Tratamiento µM Catira 1 Caripaz 24 0 0.347a 0.168a

5.4 0.345a 0.135a 16.2 0.058b 0.118a


Datos transformados arco seno √(x/100).

54

El haber registrado el porcentaje de germinación teniendo en cuenta el tratamiento en el cual

los embriones se habían formado tuvo como objeto averiguar si dicho tratamiento podría

estar influenciando el proceso de regeneración en plantas; este planteamiento es bastante

interesante ya que en diversos reportes sobre embriogénesis somática tan solo asignan una

concentración adecuada para llevar a cabo este proceso y no incluyen información sobre la

conversión de estos embriones en plantas. En otros casos, con los embriones somáticos

formados en el medio que consideraron que contenía la mejor concentración de auxina para

este proceso, informan el porcentaje de regeneración, sin tener en cuenta que los embriones

formados bajo otras concentraciones, aunque no sean las mejores para producir una buena

cantidad de embriones somáticos, pueden producir o inducir a un mejor desarrollo y en

consecuencia presentar una mayor frecuencia de regeneración. Una interacción

relacionando el proceso de germinación y el desarrollo de los embriones somáticos fue

reportada en el trabajo de Castillo et al. (1998a) donde se asegura que la germinación se ve

favorecida por los componentes del medio de cultivo donde se forma el callo, en ese caso la

relación existente era con una alta concentración de sacarosa.

El hecho de que los embriones somáticos formados en presencia de 2,4-D no hayan

presentado el mejor porcentaje de conversión en plantas puede deberse a que la auxina

conlleva a un aumento de actividades metabólicas lo que necesita de una gran gasto de

energía (mitosis, desdiferenciación) y en consecuencia puede estar evitando la acumulación

de carbohidratos, lípidos y proteínas, sustancias que según Gray (1996) son importantes

para la fase de germinación; y en consecuencia no permite una óptima maduración.

Además, las condiciones que favorecen la maduración del embrión también favorecen la

conversión en plantas (Gray 1996). Por otro lado, la auxina usualmente es inhibitoria para el

desarrollo de los embriones somáticos en estados avanzados; por lo tanto el medio sin

hormona frecuentemente se emplea para el desarrollo del estado globular de los embriones

y conversión de estos en plantas (Phillips et al. 1995). Esta idea sugiere que es necesario

poner gran atención a las condiciones y nutrición del cultivo para intensificar la producción de

plantas a partir de embriones somáticos y los resultados lleguen a ser equivalentes a la

producción que se obtiene por medio de embriones cigóticos (semilla).

55

A pesar de haber logrado la regeneración de los embriones somáticos, no se sobrepasó del

14 % en la selección Catira, 7.03 % en la selección Caripaz, 12.35 % en la selección Maradol

y 5.41 % en la selección Hawaiana; estos bajos porcentajes no son extraños, otros trabajos

informan resultados similares como en el de Chen et al. (1991), Fitch (1993) y Moore (1984)

en donde lograron un 20 % de conversión, o tan solo comunican haber obtenido un bajo

porcentaje de germinación, y en otras ocasiones informan haber fracasado en el intento de

regeneración (Fitch 1993).

El obtener plantas a partir de embriones somáticos frecuentemente es más difícil de lo que

se puede esperar, y cuando se logra, el porcentaje es demasiado bajo o simplemente no se

informa, para lo cual sugieren que la mayoría de los embriones somáticos presentan

anormalidades para la germinación. Los rangos usuales de la conversión de embriones

somáticos en plantas están entre 0 – 50 % (Gray 1996).

6.4 Fase de Formación de Brotes Múltiples.

Al final de esta etapa (15 días) hubo formación de brotes múltiples en las plantas (figura 24 A

y B). En esta fase también se hizo evidente la respuesta dependiente del genotipo de las

selecciones, ya que se evidenció que en la selección Caripaz la respuesta al estímulo de

formación de brotes múltiples no fue igual al de las demás selecciones, pues en su respuesta

el número de brotes formados fue menor al de las otras selecciones; además, fueron de

mayor longitud (figura 25).

56

Figura 24. Proliferación de brotes en las plantas obtenidas a partir de embriones somáticos. A)

Plantas germinadas, cada una de ellas se inoculó en el medio de formación de brotes y a los 10-15 días se presentó formación de brotes múltiples en cada una de ellas (B).

Fuente: Autor.

Figura 25. Plantas obtenidas después de 15 días en medio de formación de brotes. A la izquierda

planta de la selección Caripaz 24, a la derecha planta de la selección Maradol. Se evidencia diferencia en el tamaño de los brotes de cada selección.

Fuente: Autor.

En esta misma etapa se encontró que en algunas plantas no se desarrollaron brotes sino

que formaron estructuras amorfas como hojas sin tallo o una especie de tallo sin hojas (figura

26 A, B y C).

A B

57

Figura 26. Hojas formadas en el medio de formación de brotes, no se distingue tallo (A y B).

C) Tallo sin hojas. Fuente: Autor.

El medio líquido utilizado para la formación de brotes múltiples se puede considerar como el

adecuado para llevar a cabo el proceso de multiplicación en plantas de papaya ya que se

notó un incremento en el número de brotes múltiples formados en las selecciones. Como

desventaja de este medio de cultivo fue el efecto de vitrificación cuando la permanencia de

las plantas era de más de 10-15 días, por lo que es mejor no sobrepasar este tiempo en esta

fase y así evitar esta respuesta negativa. Por otro lado, es importante destacar que se hizo

un ensayo evaluando este mismo medio pero semisólido, donde se encontró que los brotes

múltiples formados no sobrepasaban los 5 mm de longitud en comparación con las plantas

obtenidas en el medio líquido (figura 27 A y B). Esta respuesta pudo deberse a la capacidad

de absorción de nutrientes que ofrece el medio líquido ya que la planta está totalmente en

contacto con el medio de cultivo (sumergida) por lo tanto las yemas múltiples que se forman

A B

C

58

tienen la oportunidad de abastecerse de nutrientes individualmente, lo que no ocurre en el

medio semisólido, donde tan solo una parte de la planta está en contacto con el medio.

Figura 27. A) Brotes obtenidos en el medio de crecimiento líquido. B) Brotes obtenidos en el medio de

crecimiento semisólido. Fuente: Autor.

6.5 Fase de Crecimiento.

Para el aumento en la longitud de las plantas el análisis de varianza (anexo 19) no mostró

diferencias al final del tratamiento, con respecto al inicio, entre los medios con y sin

sacarosa. Igualmente, en la comparación de promedios de la longitud tampoco se muestran

diferencias significativas (tabla 9). Sin embargo, si se observaron cambios en cuanto a la

longitud del pecíolo y del área foliar en el medio sin sacarosa (figura 28), mientras que en el

medio con sacarosa se observó pérdida del color de las hojas (figura 29).

Tabla 9. Comparación de promedios según la prueba Duncan para crecimiento (longitud) de las plantas a los 0 (inicio) y 30 (final) días.

PROMEDIOS Tratamiento g/l inicio Final 0 3.06a 3.14a 30 3.0a 3.0a

Nivel de significancia 5 % Promedios con la misma letra no difieren significativamente.

Datos transformados ln x.

A B

0 cm

1 cm

2 cm

3 cm

59

Figura 28. Diferencias en el área foliar y longitud del pecíolo después de 30 días en la fase de

crecimiento en el medio MS; sin sacarosa a la derecha y con sacarosa a la izquierda, las plantas presentaban de la misma longitud.

Fuente: Autor.

Figura 29. Planta proveniente del medio MS con sacarosa. Se nota un amarillamiento leve en las

hojas. Fuente: Autor.

El aumento en la longitud del pecíolo y del área foliar podría ser el resultado de la búsqueda

de mayor energía lumínica para aumentar la tasa de fotosíntesis ya que la planta de

encontraba en un medio sin fuente de carbono. Estos resultados son consistentes con los

descritos por Nguyen & Kozai (2001) los cuales evaluaron el crecimiento in vitro de Musa

spp bajo condiciones que ellos denominaron fotomixotróficas (30 gr/l de sacarosa y bajo

intercambio de aire en los frascos) y fotoautotróficas (0 gr/l de sacarosa y alto intercambio de

60

aire en los frascos), en las cuales encontraron un incremento en el área foliar de las plantas

cultivadas bajo condiciones fotoautotróficas. También tuvieron un mayor valor de flujo de

fotones fotosintéticos, reflejado en un aumento de la fotosíntesis.

Esta respuesta puede estar asociada con la ausencia en el medio de cultivo de la sacarosa

como fuente de carbono, ya que según Nguyen & Kozai (2001) la sacarosa en el medio de

cultivo puede limitar la eficiencia de la ribulosa 1,5-bifosfato (rubisco) en la fijación de CO2 y

en consecuencia disminuir la tasa fotosintética en las plantas in vitro.

Esta es una respuesta bastante benéfica para la planta, pues la sobrevivencia ante la

ausencia de una fuente de carbono indica que la planta ya está siendo autótrofa, cualidad

fisiológica bastante favorable para la fase de aclimatación ya que haría este paso menos

estresante para la planta, pues el cambio de un medio en el que lo tiene todo y en

condiciones estériles a un medio ambiente en el cual tiene que empezar a ser totalmente

independiente de un momento a otro no es fácil de lograr.

6.6 Fase de Enraizamiento.

A partir de los 10 días de iniciado el cultivo se encontró que ya habían brotes de raíces

(figura 30 A y B).

Figura 30. Raíces formadas en medio que contenía vermiculita A) A los 10 días. B) A los 15 días de

iniciada la fase de enraizamiento. Fuente: Autor.

A B

61

A los 30 días de evaluado el proceso de enraizamiento la formación de raíces se presentó en

todas las plantas cultivadas bajo el tratamiento con AIB (figura 31 A y B).

Figura 31. A) Planta con raíces formadas en el medio vermiculita al finalizar los 30 días de la fase de

enraizamiento. B) Planta cultivada en medio vermiculita sin haber estado expuesta al AIB, no hay enraizamiento. Fuente: Autor.

La prueba de ANOVA (anexo 20) mostró diferencias significativas y altamente significativas

entre los tratamientos para la longitud (cm) y el número de raíces respectivamente; pero no

se encontraron diferencias entre las selecciones (anexo 21), por lo que se puede decir que

esta respuesta no es genotipo dependiente. En los promedios de los tratamientos, donde

hay diferencias significativas, el tratamiento de 2.5 g/l de AIB presenta los valores más altos

(tabla 10).

Tabla 10. Comparación de promedios para el enraizamiento según la prueba Duncan para los tratamientos evaluando la longitud y el número de raíces a los 30 días de iniciados los tratamientos con AIB.

PROMEDIOS Tratamiento mM Longitud Nº raíces

0 0.5b 0.250b 12.3 1.338a 10.128a


Datos transformados ln x.

A B

62

Por otro lado, aunque el objetivo no fue comparar el enraizamiento con un medio que tuviera

PhytagelTM, se presentó la oportunidad de hacerlo de forma visual, ya que algunas plantas

que se encontraban en el medio de crecimiento desarrollaron algunas raíces donde se pudo

comparar que la calidad (vigor, diámetro y número) de las raíces en el medio vermiculita era

muy superior a las que se llegaron a formar en al medio con PhytagelTM (figura 32 A y B).

Figura 32. Diferencias de las raíces formadas en el medio con phytagelTM (A) y en el medio

vermiculita (B). Se nota claramente la calidad de las raíces. Fuente: Autor.

Esta comparación cualitativa es similar a la de trabajos de Kataoka (1994) y Suksa-Ard et al.

(1998) cuyos resultados informan de la calidad de las raíces en el medio con vermiculita, las

cuales no presentaron desarrollo anormal de las estructuras internas. Tales anormalidades

se pueden atribuir a la deficiencia de oxigeno en el medio de cultivo (agar) en el cual se

desarrolla el sistema radical, esta condición estaría cambiando la ruta de la respiración

aerobia a anaerobia, trayendo como consecuencia una baja producción de ATP,

acumulación de productos tóxicos y una rápida reducción de compuestos orgánicos, además

de una absorción y traslocación de agua y nutrientes más lentas por parte de las raíces. La

principal consecuencia de la falta de oxigenación en el sistema radical es el desarrollo de

aerénquima (espacios llenos de aire), la cual se puede presentar por dos formas diferentes,

la primera por una completa disolución de la células; y la segunda, por que las paredes

celulares se separan unas de otras (Kawase 1981).

A B

63

Por otro lado, en trabajos anteriores, Teo & Chang (1994), afirmaron conseguir un buen

enraizamiento en medio con agar, el cual tuvo un aumento en el porcentaje de enraizamiento

cuando se incrementaba la concentración de agar, resultado que también se pudo deber

también a la anoxia del medio de cultivo ya que esta condición conlleva a la formación de

raíces adventicias (Kawase 1981).

El haber obtenido éxito en el enraizamiento empleando vermiculita como sistema de soporte

puede sustentarse en cinco puntos:

1) Primero que todo a un buen sistema de intercambio gaseoso en el sistema radical y a

las condiciones de permeabilidad del sustrato; condiciones especialmente críticas en la

plántulas de papaya (Kataoka & Inoue 1992).

2) La baja concentración de los nutrientes minerales, requisito que según Teo & Chang

(1994) afirman que no es necesario en el medio de enraizamiento y que el uso de agua

destilada y agar dan un buen enraizamiento. Igualmente, Drew & Miller (1989) encontraron

que algunos reguladores de crecimiento son esenciales para el crecimiento de la raíz, pero el

inicio del enraizamiento se reduce cuando se encuentran en el medio, esto fue asociado con

el efecto oxidasa que tiene la riboflavina sobre las auxinas, llevando como consecuencia la

reducción en el inicio del enraizamiento.

3) El hecho de que la parte basal de la planta estuviera sobre un soporte el cual no

permitía el paso de la luz, es un factor de oscuridad que puede intensificar el enraizamiento.

El empleo de la oscuridad es para evitar la degradación de AIB en el medio de cultivo, lo

cual conllevaría a la producción de raíces finas con ramificaciones laterales (Drew & Miller

1989).

4) Otro factor que favoreció el enraizamiento fue la ausencia de sacarosa en el medio, ya

que el azúcar afecta la captación o asimilación del AIB (Drew 1987).

5) El haber expuesto la plantas por diez segundos al AIB y no haberla dejado en un medio

que tuviese la auxina de forma constante. Esto por que el AIB solo promueve la iniciación de

la formación de raíces, pero el crecimiento y desarrollo es mucho mejor en ausencia del AIB

(Drew & Miller 1989). Además, anterior a estos resultados se evaluó el enraizamiento en el

64

medio con PhytagelTM que contenía AIB para inducirlo. Este método fue reportado por Drew

(1998) y Fitch (1993) para papaya, pero no fue adecuado en este estudio, pues la respuesta

fue desfavorable con relación al número de raíces formadas, en muchos casos nula y

asociada con una clorosis (figura 33) que se podría atribuir a una posible senescencia

prematura causada por la auxina y como consecuencia la muerte de las plantas.

Figura 33. Plantas de C. papaya a los 15 días en medio de enraizamiento con AIB y PhytagelTM. Es

evidente la clorosis presentada en las plantas de la selección Maradol (A) y Hawaiana (B). Fuente: Autor.

El enraizamiento llevado a cabo en condiciones ex vitro no tuvo buenos resultados ya que

ninguna planta formó raíces. Los resultados obtenidos en este trabajo no son consistentes

con el 100 % de enraizamiento que informan Kataoka & Inoue (1991). Esta respuesta tan

desfavorable puede deberse a que la planta está buscando sobrevivir bajo las nuevas

condiciones como la baja humedad, pocos nutrientes y condiciones asépticas mínimas que

tiene en condiciones ex vitro, y en consecuencia no se dedica a llevar el proceso de

enraizamiento el cual implica gasto de energía, energía que no se había podido acumular por

un bajo nivel nutricional en el que se encontraban los brotes, esto porque provenían de un

medio que carecía de fuente de carbono y con nutrientes minerales al 50 % (medio de

crecimiento). El enraizamiento es un proceso en el que se necesita que las plantas con

anterioridad hayan sido nutricionalmente muy bien abastecidas in vitro para que tengan

suficiente energía, clave para llevar a cabo este proceso (Kataoka & Inoue 1992).

A B

65

Otra razón de la falla del enraizamiento ex vitro es el aumento en la frecuencia de respiración

de las plántulas durante el proceso, lo cual disminuye las reservas de carbohidratos (Drew &

Miller 1989) y como se mencionó las plantas no tenían una buena reserva de nutrientes.

Por otro lado, la exposición de las plantas a un funguicida antes de su transplante pudo

producirles toxicidad, esta idea surge porque las raíces que se formaron en condiciones in

vitro degeneraron al cabo de un tiempo de transplantadas las plantas.

6.7 Aclimatación de las Plántulas.

Esta fase del proceso fue la que limitó la obtención de plantas en este trabajo, puesto que las

plantas degeneraron después del transplante a condiciones ambientales. La contaminación

por hongos fue el factor que conllevó a la declinación de las plántulas durante su

aclimatación (figura 34 A, B y C), donde se hizo un primer descarte de plantas a los ocho

días de iniciada la aclimatación de las plantas enraizadas in vitro y ex vitro, procedimiento

que se continúo realizando semanalmente. Por tales razones la sobrevivencia de las plantas

enraizadas in vitro en medio vermiculita no cumplió las expectativas esperadas, tan solo se

logró un 30 % a los 25 días de transplantadas. De igual manera las plantas enraizadas ex

vitro solo tuvieron sobrevivencia del 40%; estos resultados no son consecuente con el 90 %

que Kataoka & Inoue (1991) dicen haber logrado al emplear estos mismos procedimientos.

La presencia de este tipo de microorganismo puede deberse a medio de cultivo que se

hubiera infiltrado en las cavidades de la corteza, puesto que es muy difícil llegar a remover

completamente el medio, aunque se puede llegar a retirar bastante de las células

parenquimatosas del cortex estas pueden ser fácilmente atacadas por hongos o bacterias.

Adicional a esto se puede suponer que la muerte de las plantas también pudo ser

consecuencia de una toxicidad producida por el funguicida que les fue aplicado antes de su

transplante; esto se sugiere por que las raíces que se lograron in vitro degeneraron al cabo

de un tiempo de haberse realizado el transplante.

66

Figura 34. A) Planta muerta a los ocho días de transplantadas a invernadero. B) y C). Planta infectada por hongos. Las flechas señalan el hongo .

Fuente: Autor.

Adicionalmente, las condiciones estresantes a las que son sometidas las plantas en el

momento del transplante puede ser el otro factor intrínseco que contribuyó al declinamiento

de las plantas. Esto porque cuando las plantas crecen in vitro están bajo un ambiente con

alta humedad relativa, baja intensidad lumínica, temperatura constante y escaso intercambio

gaseoso, estas condiciones provocan cambios en la morfología y la fisiología de las plantas,

tales como el desarrollo de tallos más delgados, menor cantidad de ceras cuticulares y

epicuticulares, reducción de los tejidos mecánicos de soporte, incremento del contenido de

agua en las células, escasa capacidad fotosintética y estomas con baja funcionalidad; todas

A B

Hongo

C

67

estas condiciones se dan en respuesta a la ausencia de condiciones estresantes que se

presentan en condiciones de invernadero y de campo. Todos estos cambios provocan que

una gran parte de las plantas producidas in vitro no sobrevivan al transplante a condiciones

ambientales (Agramonte et al. 1998).

Aunque se haya realizado el procedimiento de aclimatación con técnicas que se hayan

considerado eficaces para que la aclimatación fuera encaminada a lograr gradualmente

menos humedad relativa, más luz, crecimiento autótrofo y un medio séptico, puede ser que

las plantas de papaya obtenidas in vitro sean demasiado susceptibles y en consecuencia la

aclimatación deba hacerse bajo otros parámetros, los cuales incluyan técnicas que deban

ser bastante específicas y controladas.

Para llevar a cabo esto se empezó a realizar la aclimatación de las plantas enraizadas in

vitro en los mismos recipientes donde se han cultivado, es decir que no se sacaron y se

sembraron, sino que, en primer lugar, se colocaron bajo condiciones de invernadero para

que empezaran a recibir la luz natural, seguido a esto la tapa del frasco se fue abriendo

semanalmente (figura 35) para que las plantas logren un adecuado desarrollo de los

estomas y la cutícula y empiecen a tener regulación de la transpiración. Así, gradualmente

las plantas van teniendo concordancia entre las características morfológicas y fisiológicas

con las características físicas y biológicas del medio. Esta última prueba está buscando que

la aclimatación de las plantas sea más eficiente, ya que no tienen que someterse a cambios

bruscos al ser transplantadas a condiciones no estériles, sino que se están adaptado bajo las

mismas condiciones en las que se encontraban in vitro.

68

Figura 35. Plantas enraizadas in vitro en vermiculita. Semanalmente se les abre la tapa del

recipiente donde se encuentran. Fuente: Autor

Para este procedimiento el sustrato se estuvo humedeciendo semanalmente con 1 ml de

agua destilada y estéril. A los 50 días de evaluado el proceso y cuando la tapa estuvo

totalmente abierta se obtuvo un 53 % de sobrevivencia, además las plantas se observaron

con un buen desarrollo radical además de buen porte (figura 36).

Figura 36. Plantas a los 50 días de adaptadas a invernadero en los frascos donde se cultivaron in

vitro, la tapa de los frascos está totalmente abierta. Fuente: Autor.

Apertura de la tapa

69

7. CONCLUSIONES.

El efecto de la concentración del 2,4-D para la inducción de embriones somáticos en Carica

papaya es dependiente del genotipo.

Es más factible obtener embriones somáticos de forma indirecta ya que la cantidad de

embriones fue mayor que los obtenidos por la vía directa, además se pudo obtener en todos

los materiales trabajados.

Las mejores concentraciones de 2,4-D para la embriogénesis indirecta son las de 45.2, 67.8

y 54.2 µM de 2,4-D para las selecciones Maradol, Hawaiana y Catira 1.

La selección Maradol es el genotipo que presenta los mejores resultados para la formación

de embriones somáticos, ya que se obtuvieron frecuencias del 82.1 % en comparación con la

Hawaiana (17.5 %), Catira (14.6 %) y Caripaz (0 %) para la embriogénesis directa, y en la

indirecta se presentó una mayor cantidad de embriones, cuyo promedio fue de 410

embriones en comparación con los de Catira (42 embriones), Caripaz 24 (24.6 embriones) y

Hawaiana (79.4).

Es necesario emplear un medio libre de reguladores de crecimiento antes de la fase de

germinación, ya que los embriones formados en el Medio de Inducción II en ausencia de 2,4-

D presentaron los mayores porcentajes de conversión a plantas. siendo de un 14 % en

Catira, 12.35 % en Maradol, 7.03 % en Caripaz 24 y 5.41 % en la selección Hawaiana,

mientras que las frecuencias de regeneración de los embriones formados en medio con la

auxina estuvo entre el 1 al 4 % para Maradol, del 5 al 11 % para Hawaiana, del 2 al 11 %

para Catira 1 y del 3 al 5 % para Caripaz 24.

El enraizamiento de las plantas en medio de cultivo con vermiculita es el método más

eficiente y seguro para lograr esta respuesta, pues el empleo de este medio tuvo la

frecuencia del 100 % de formación de raíces.

El empleo de la vermiculita como agente se soporte permite la formación y desarrollo de un

sistema radicular.

70

Para la inducción de raíces, únicamente es necesario una exposición corta al AIB, ya que la

permanencia de este regulador en el medio de cultivo ocasiona degeneración de las plantas,

las cuales llegan a tener una pérdida del 100 %..

La fase más crítica para la obtención de plantas de papaya es la de aclimatación,

obteniéndose un máximo del 53 % de sobrevivencia en las plantas enraizadas in vitro.

71

8. RECOMENDACIONES

Hacer otros ensayos para inducir embriogénesis somática de forma directa en la selección

Caripaz 24 empleando concentraciones inferiores a los 13.5 µM, que fue la dosis mínima

empleada en este trabajo ya que esta selección puede ser más sensible al 2,4-D y en

consecuencia el efecto de toxicidad puede ser mayor; también se puede sugerir que se

empleen otra auxinas que también sean utilizadas para este propósito o en último instancia

evaluar combinación de auxinas.

Evaluar las plantas obtenidas in vitro en condiciones de campo para detectar posible

variabilidad morfológica al compararlas con las plantas obtenidas por semilla.

Continuar la búsqueda referente a la aclimatación de las plántulas para lograr un mayor

porcentaje de sobrevivencia. Para esto se pueden emplear otros sustratos como el humus

de lombriz, ya que este ha sido empleando en trabajos anteriores en los que han informando

de buenos resultados.

Ensayar diferentes productos con acción antifúngica y antimicrobianos que se puedan aplicar

cuando las plantas estén en la fase de aclimatación y así contrarrestar la principal causa de

mortalidad de las plantas en esta etapa.

72

9. REFERENCIAS

Agramante, D., F. Jiménez, M. A. Dita. Aclimatización. Págs. 193 – 206. En J.N. Ponce (ed.).

Propagación y mejora Genética de Plantas por biotecnología. Instituto de Biotecnología de

las Plantas. Cuba. 390p.

Arango, L. 1999. Catira de los Llanos Orientales variedad mejorada de papaya. Innovación &

Cambio Tecnológico 1: 10-17.

Ayerbe, L. & M. Sagasta. 1990. Cultivo in vitro de las Plantas Superiores. Primera edición.

Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. España.

Azcon-Bieto, J. & M., Talon. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Primera edición.

Interamericana McGraw-Hill. Madrid. España. 581p.

Bernal, H.Y & J.E Correa. 1998. Especies vegetales promisorias de los países del Convenio

Andrés Bello. Coedición con la Junta de Acuerdo de Cartagena. Santa fe de Bogotá. Tomo

X.

Boletín CCI Exótica. 1998. Variedades de papaya, cultivo alternativo para la diversificación

frutícola. Boletín CCI Exótica 8: 18-19.

Cano, G. & J. Marroquín. 1994. Taxonomía de plantas superiores. Primera edición. Editorial

Trillas. México.

Castillo, B., M. A. Smith & U. L. Yadava. 1998a. Liquid System Scale Up of Carica papaya L.

Somatic Embryogenesis. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 73: 307-311.

Castillo, B., M. A. Smith & U. L. Yadava. 1998b. Plant Regeneration from Encasulated

Somatic Embryos of Carica papaya L. Plant Cell Reports 17: 172-176.

73

Chen, M. H., C. C. Chen, D. N. Wang & F. C. Chen. 1991. Somatic Embryogenesis and Plant

Regeneration from Inmature Embryos of Carica papaya x Carica cauliflora cultured in vitro.

Canadian Journal Botany 69: 1913-1918.

Compton, M. E. 1994. Statistical Methods Suitable for the Analysis of Plant Tissue Culture

Data. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 37: 217-242.

Compton, M. E. 1996. Statistical Analysis of Plant Tissue Culture Data. En: R. N. Trigiano &

D. J. Gray (eds). Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises. Estados Unidos.

Drew, R. A. 1987. The Effects of Medium Composition and Cultural Conditions on in vitro

Root Initiation and Growth of Papaya (Carica papaya L.). Journal of Horticultural Science

62: 551-556.

Drew, R. A. 1988. Rapid Clonal Propagation of Papaya in vitro from Mature Field-Grow

Trees. HortScience 23: 609-611.

Drew, R. A. & R. M. Miller. 1989. Nutritional and Cultural Factors Affecting Rooting of Papaya

(Carica papaya L.) in vitro. Journal of Horticultural Science 64: 767-773.

Finer, J. J. 1995. Direct Somatic Embriogénesis. Págs. 91-101. En: O. L. Gamborg & G. C.

Phillips (eds). Plant cell, Tissue and Organ Culture. Springer Lab. Manual. Germany.

Fitch, M. M. 1993. Hig Frequency Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from

Papaya Hypocotyl callus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 32: 205-212.

Fitch, M. M. & R. M. Manshardt. 1990. Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from

Inmature Zygotic Embryos of Papaya (Carica papaya L.). Plant Cell Reports 9: 320-324.

Fitch, M. M., R. M. Manshardt, D. Gonsalves & J. L. Slightom. 1993. Transgenic Papaya

Plants from Agrobacterium-mediated transformation of Somatic Embryos. Plant Cell Reports

12: 245-249.

74

Gómez, R. 1998 Embriogénesis Somática. Págs. 57-79. En: J.N. Ponce (ed.). Propagación y

Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas.

Cuba. 390p.

Gray, D. J. 1996. Nonzygotic Embryogenesis. Págs. 133-147. En: R. N. Trigiano & D. J.

Gray (eds). Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises. Estados Unidos.

Kataoka, I. 1994. Influence of Rooting Substrates on the Morphology of Papaya Root Formed

in vitro. Japan Journal Tropical Agronomy 38: 251-257.

Kataoka, I., & H. Inoue. 1991. Rooting of Tissue Cultured Papaya Shoots Under ex vitro

Conditions. Japan Journal Tropical Agronomy 35: 127-129.

Kataoka, I., & H. Inoue. 1992. Factors Influencing ex vitro Rooting of Tissue Cultured Papaya

shoots. Acta Horticulturae 321: 589-597.

Kawase, M. 1981. Anatomical and Morphological Adaptation of Plants to Waterlogging.

HortScience 16: 8-12.

Lai, C. C, T. A. Yu, S. D. Yeh & J. S. Yang. 1998. Enhancement of in vitro growth of Papaya

multishoots by Aeration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 221-225.

Litz, R. E. & D. J. Gray. 1992. Organogénesis and Somatic Embriogénesis. Págs. 3-34. En:

Hammerschlang F.A & R.E. Litz (eds). Biotechnology of Perennial Fruit Crops.Cambridge.

Litz, R. E & R. A. Conover. 1978. In vitro Propagation of Papaya. HortScience 13:241-242.

Litz, R. E & R. A. Conover. 1979. Development of Systems for Obtaining Parasexual Carica

Hybrids. Proc. Fla. State Hort. Society 92: 281-283.

Litz, R.E & R.A. Conover. 1980a. Somatic Embriogénesis in cell Cultures of Carica stipulata.

HortScience 15: 733-734.

Litz, R.E & R.A. Conover. 1980b. Partial Organogénesis in Tissue Cultures of Averrhoa

carambola. HortScience 15: 735.

75

Litz, R.E. & R.L. Jarret. 1993. Regeneración de Plantas en el Cultivo de Tejidos:

Embriogénesis Somática y Organogénesis. Págs. 144-171. En: W. M. Roca & L. A. Mroginski

(eds). Cultivo de tejidos en la Agricultura. Centro Internacional de Agricultura Tropical.

Colombia. 969p.

Lucas, M. Papayas [en línea]. Info-LuKasNet. Argentina: Mario Lucas Kiektik, 20 de

noviembre de 1997, 13 julio de 2000. http://www.lukasnet.com/pyme/papaya.htm [Consulta: 3

sept. 2000].

Manshardt, R. 1992. Papaya. Págs. 489-511. En: Hammerschlang F.A & R.E. Litz (eds).

Biotechnology of Perennial Fruit Crops. Cambridge.

Martínez, R & N. Martínez. 1997. Diseño de Experimentos, Análisis de Datos Estándar y no

Estándar. Primera edición. Fondo Nacional Universitario. Bogotá D.C. Colombia.

Miller, R. M. & R. A. Drew. 1990. Effect of Explant Type on Proliferation of Carica papaya L.

in vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture 21: 39-44.

Montgomery, D. C. 1991. Diseño y Análisis de Experimentos. Primera edición. Grupo

Editorial Iberoamérica. México.

Moore, G. A. & R. E. Litz. 1984. Biochemical Markers for Carica papaya, C. cauliflora, and

Plants from Somatic Embryos of their Hybrid. Journal American Society Horticultura Science

109: 213-218.

Mosqueda, R., E. Becerra., G. Arellano., F de los Santos., X. Rosas & A. Villegas. Selección

de plantas tolerantes al virus de la mancha anular del Papayo (VMAP) y su clonación in vitro

[en línea]. Sigolfo. México: Instituto de Ecología, A.C, 1998, 7 de septiembre de 2000.

http://www.ecologia.edu.mx/sigolfo/pagina_n.htm [Consulta: 22 oct. 2000].

Mroginski, L. A. & W. M. Roca. 1993. Establecimiento de cultivos de cultivos de tejidos

vegetales in vitro. Págs. 19-40. En: W. M. Roca & L. A. Mroginski (eds). Cultivo de tejidos en

la Agricultura. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Colombia. 969p.

76

Nguyen, Q. T. & T. Kozai. 2001. Growth of in vitro Banana (Musa spp) Shoots Under

Photomixotrophic and Photoautotrophic Conditions. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 37: 824-

829.

Phillips, G. C., J. F. Hubstenberger & E. E. Hanse. 1995. Plant Regeneration from Callus and

Cell Suspension Cultures by Somatic Embryogenesis. En: O.L. Gamborg & G.C. Phillips

(eds). Plant cell, Tissue and Organ Culture. Springer Lab. Manual. Germany.

Rodríguez, A. & A. Rodríguez. 2000. El Papayo “Maradol”: un Aporte Cubano a la

Fruticultura Tropical. Revista Cubana de Agricultura 1: 73-77.

Suksa-Ard, P., I. Kataoka, Y. Fujime, K. Beppu & S. Subhadrabandhu. 1998a. Development

of Rooting System for Tissue Cultured Papaya Shoots Using Rockwoll Blocks. Japan Journal

Tropical Agronomy 42: 119-121.

Suksa-Ard, P., I. Kataoka, Y. Fujime, K. Beppu & S. Subhadrabandhu. 1998b. Root

Development of Tissue-Cultured Papaya Shoots in Several Rooting Substrates.

Environmental Control in Biology 36: 115-120.

Sutter, E. 1996. General Laboratory Requirements, Media and Sterilization Methods. Págs.

11-25. En: R. N. Trigiano & D. J. Gray (eds). Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory

Exercises. Estados Unidos.

Teo, C. K. H. & L. K. Chang. 1994. The Effects of Agar Content, Nutrient Concentration,

Genotype and Light Intensity on the in vitro Rooting of Papaya Microcuttings. Journal of

Horticultural Science 69: 267-273.

UPapaina S.A de C.V. Uses [en línea]. Universidad de Málaga. UPapaina S.A de C.V.

México: UPapaina, 1997, 6 octubre de 1998.

http://www.podernet.com.mx/ultrapapaina/usos_e.htm [Consulta: 28 oct. 2000].

Yeh, S. D, D. Gonsalves, H. L. Wang, R. Namba, R.J. Chiu. 1988. Control of Papaya

Ringspot Virus by Cross Protection. Plant Disease 72: 375-380.

77

10. ANEXOS.

ANEXO 1. Tabla de composición del medio Murashige & Skoog (MS) empleado para

preparar los medios de cultivo para el presente trabajo.

STOCK COMPONENTE CONCENTRACIÓN USO

(100 %)

Macro I NH4NO3 82.5 g/l 20 ml/l

KNO3 95 g/l

Ca Cl2 2H2O 22 g/l

Macro II Mg SO4 7H2O 18.5 g/l 20 ml / l

Macro III KH2 PO4 20 g/l 20 ml / l

Solución de hierro Fe SO4 7H2O 1.39 g/l 20 ml / l

Na2 EDTA 2H2O 1.86 g/l

Micronutrientes H3 BO3 6.18 g/l 1 ml / l

Mn SO4 H2O 16.9 g/l

KI 0.83 g/l

Na2 MoO4 2H2O 0.24 g/l

ZnSO4 7H2O 8.60 g/l

CoCl2 6H2O 0.024 g/l

CuSo4 5H2O 0.025 g/l

Vitaminas Glicina 0.2 g / 100 ml 2 ml / l

Tiamina-HCl 0.01 g / 100 ml

Acido Nicotínico 0.05 g / 100 ml

Piridoxina-HCl 0.05 g / 100 ml

78

Anexo 2. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano(CM),

callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), evaluadas a los 40 días en las Selecciones

Maradol y Hawaiana

Cuadrados medios Fuente de

variación Grados

de libertad

CP CM CG ES

Selección 1 0.776** 0.141 0.043 6.660** Tratamiento 3 0.243* 0.242 0.027 1.301** Sel*trat 3 0.042 1.041** 0.045 0.425 Error exp. 82 0.233 0.570 0.037 1.691 C.V% 34.94 35.51 19.36 37.04 Promedio 0.862 1.098 0.745 1.184

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05) Datos transformados √√x + 0.5. Anexo 3. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano (CM),

callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), evaluadas a los 40 días en las Selecciones

Caripaz 24 y Catira1.

Cuadrados medios Fuente de

variación Grados

de libertad

CP CM CG ES

Selección 1 3.264** 0.016 0.025* 0.293** Tratamiento 5 0.286** 0.137** 0.012 0.030* Sel*trat 5 0.255** 0.130** 0.012 0.026* Error exp. 1029 0.543 0.123 0.013 0.052 C.V% 30.07 23.56 10.53 14.82 Promedio 0.823 0.762 0.715 0.724

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados √√x + 0.5.

79

Anexo 4. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano (CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), evaluadas a los 40 días en la selección Hawaiana.

Cuadrados medios Fuente de variación

Grados de

libertad CP CM CG ES

Tratamiento 3 0.040 0.338 0.004 0.171 Error exp. 35 0.040 0.338 0.004 0.171

C.V% 23.29 40.15 11.66 39.66 Promedio 0.756 1.052 0.720 0.873

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados √√x + 0.5. Anexo 5. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano (CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), evaluadas a los 40 días en las selección Caripaz 24.


Grados de


Tratamiento 5 0.060 0.034 0.035 0 Error exp. 121 0.060 0.034 0.035 0

C.V% 29.52 28.66 9.07 0 Promedio 0.831 0.793 0.715 0


Anexo 6. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano (CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), evaluadas a los 40 días en las selección Maradol.


Grados de


Tratamiento 3 0.217 0.968** 0.068 1.620** Error exp. 48 0.217 0.968 0.068 1.620 C.V% 39.18 32.28 22.87 35.33 Promedio 0.938 1.124 0.763 1.409


80

Anexo 7. Prueba de ANOVA para las variables callo pequeño (CP), callo mediano (CM), callo grande (CG) y embriones somáticos (ES), evaluadas a los 40 días en las Catira 1.


Grados de


Tratamiento 5 0.183 0.253** 0.090* 0.182* Error exp. 127 0.183 0.253 0.090 0.182 C.V% 36.27 29.73 24.65 32.14 Promedio 0.930 0.846 0.758 0.829

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados √√x + 0.5. Anexo 8. Prueba de ANOVA para la embriogénesis somática indirecta de las selecciones Catira 1 y Caripaz 24.

Cuadrados medios

Fuente de variación

Grados de

libertad ES Selección 1 5.629**

Tratamiento 2 0.991* Sel*trat 2 0.455

Error exp. 195 1.704 C.V% 41.31

Promedio 1.343 ** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados √√x + 0.5.

Anexo 9. Prueba de ANOVA para embriogénesis somática indirecta de la selección Hawaiana.

Fuente de Variación

Grados de Libertad

Cuadrados medios

Tratamiento 3 1.291 Error exp. 1.291 C.V% 66.87 Promedio 1.76


81

Anexo 10. Prueba de ANOVA para embriogénesis somática indirecta de la selección Maradol.


Grados de Libertad

Cuadrados medios


** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados √√x + 0.5. Anexo 11. Tabla ANOVA para embriogénesis somática indirecta de la selección Caripaz 24.


Grados de Libertad

Cuadrados medios


** Diferencias altamente s ignificativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados √√x + 0.5. Anexo 12. Prueba de ANOVA para embriogénesis somática indirecta de la selección Catira 1.


Grados de Libertad

Cuadrados medios

Tratamiento 2 1.344* Error exp. 1.344 C.V% 33.97 Promedio 1.546


82

Anexo 13. Prueba de ANOVA para las Selecciones Maradol y Hawaiana para el porcentaje de germinación.


Grados de libertad

Cuadrados medios

Selección 1 0.105* Tratamiento 3 0.023

Sel*trat 3 0.165** Error exp. 66 0.096

C.V% 61.82 Promedio 0.229

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados arco seno √√ (x/100).

Anexo 14. Prueba de ANOVA para las Selecciones Catira 1 y Caripaz 24 en el porcentaje de germinación.


Grados de libertad

Cuadrados medios

Selección 1 0.469** Tratamiento 4 0.155*

Sel*trat 2 0.098 Error exp. 201 0.195

C.V% 104.61 Promedio 0.199

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados arco seno √√ (x/100). Anexo 15. Prueba de ANOVA para el porcentaje de germinación en la selección Maradol.


Grados de Libertad

Cuadrados medios

Tratamiento 3 0.128** Error exp. 0.128 C.V% 39.94 Promedio 0.264


83

Anexo 16. Prueba de ANOVA para el porcentaje de germinación en la selección Catira 1.


Grados de Libertad

Cuadrados medios

Tratamiento 2 0.297** Error exp. 0.297 C.V% 72.87 Promedio 0.287

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados arco seno √√ (x/100). Anexo 17. Prueba de ANOVA para el porcentaje de germinación en la selección Hawaiana.


Grados de Libertad

Cuadrados medios


** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados arco seno √√ (x/100). Anexo 18. Prueba de ANOVA para el porcentaje de germinación en la selección Caripaz 24.


Grados de Libertad

Cuadrados medios



84

Anexo 19. Prueba de ANOVA para el crecimiento (longitud) de las plantas en medio de cultivo con y sin sacarosa.


Grados de

libertad Sin

sacarosa Con

sacarosa

Tratamiento 1 0.087 0.068 Error exp. 0.087 0.068 C.V% 10.93 14.07 Promedio 3.1 3.03

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados ln x Anexo 20. Prueba de ANOVA para los Tratamientos evaluando la longitud y el número de raíces a los 30 días de iniciado el cultivo.


Grados de

libertad longitud Nº raíces

Tratamiento 1 5.476* 1251.49** Error exp. 5.476 1251.49 C.V% 93.85 72.94 Promedio 1.167 8.118

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados ln x

Anexo 21. Prueba de ANOVA para las Selecciones evaluando la longitud y el número de raíces a los 30 días de iniciado el cultivo.


Grados de

libertad Longitud Nº raíces

Selección 3 0.766 0.405 Error exp. 0.766 0.405 C.V% 45.13 36.57 Promedio 1.67 1.08

** Diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01). * Diferencias significativas (P ≤ 0.05). Datos transformados ln x

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