Emulsiones agua-en-crudo pesado: estudio de separación de fases a través de la proteína

OmpA pura e inmovilizada en nanopartículas de magnetita

ERIKA TATIANA ACOSTA POVEDA

RAFAEL FERNANDO CRISTANCHO SAIZ

Proyecto de grado para optar título de Ingeniero Químico

Asesor

DIEGO PRADILLA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

BOGOTÁ, D.C.

JUNIO, 2018

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TABLA DE CONTENIDO

Resumen .............................................................................................................................................. 3

1. Introducción ................................................................................................................................ 3

2. Materiales y Métodos .................................................................................................................. 8

3. Análisis de Resultados .............................................................................................................. 10

4. Conclusiones ............................................................................................................................. 18

5. Bibliografía ............................................................................................................................... 18

6. Anexos ....................................................................................................................................... 21

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Resumen

Durante la producción, extracción, transporte y refinado de petróleo, se forman emulsiones de agua

en crudo (W/O). Debido a los problemas que causan como la corrosión, alta viscosidad, aumento en

costos de bombeo, riesgo de erosión en tuberías y equipos, entre otras razones operativas y

económicas, es necesario separar el agua del crudo. Con el fin de evaluar una alternativa a las técnicas

actuales que se implementan para solucionar este problema y dado que las restricciones ambientales

en los procesos industriales son cada vez mayores, se evaluó tanto la proteína sin inmovilizar como

inmovilizada en nanopartículas de magnetita para determinar su efecto en la separación de agua en

emulsiones agua/crudo pesado (13.6°API). La inmovilización en nanopartículas de magnetita se

llevó a cabo con el fin de poder recuperar y reutilizar la OmpA, sin embargo, se observó que además

de ser el medio de recuperación de la proteína, tienen un efecto en la interfase de la emulsión. Debido

a que la producción de proteína OmpA se realizó por lotes, su concentración difiere, lo que conllevó

a registrar valores de tensión interfacial mínima diferentes. En el primer caso, la tensión interfacial

mínima registrada fue 7 mN/m a 17500 ppm. En el segundo, 7.48 mN/m a 50000 ppm. En el de las

nanopartículas se encuentra cerca a los 8 mNm-1 a 35000 ppm. En todos los casos se debe tener en

cuenta que la solución de proteína no es pura, por lo que estas concentraciones hacen referencia a la

mezcla de proteína obtenida. Por otro lado, las pruebas de botella, realizadas con el primer lote de

proteína, evidenciaron que la máxima recuperación posible está cerca de las 16000 ppm, logrando

una separación del 28% de agua en la emulsión preparada.

Palabras clave

Emulsiones agua en crudo, asfaltenos, proteína OmpA, nanopartículas, surfactante, tensión

interfacial, prueba de botella.

1. Introducción

Las emulsiones son un tipo especial de dispersión coloidal [2]. Se define como un sistema en el que

un líquido se dispersa en forma de gotas, en otro líquido inmiscible, mediante fuerzas mecánicas [3].

Las emulsiones han sido de gran interés desde hace mucho tiempo, debido a su uso en la vida

cotidiana. Se pueden encontrar en áreas importantes como alimentos, cosméticos, fluidos biológicos,

industria farmacéutica, agrícola e ingeniería petrolera [3].

Las emulsiones se pueden clasificar en dos grupos, según la estructura del sistema: macroemulsión y

microemulsión. Las microemulsiones se definen como sistemas monofásicos y dispersiones

termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles que contienen cantidades de surfactantes y

co-surfactantes [4], es decir, no se rompen durante el reposo o la centrifugación. La fase dispersa

consiste en pequeñas gotas con un diámetro entre 0.01µm-0.1 µm [4]. Por otro lado, están las

macroemulsiones, que son mezclas de dos líquidos inmiscibles, donde uno de ellos se dispersa en

forma de gotas finas con un diámetro mayor a 0.1 µm en el otro [4]. Estos sistemas son turbios,

lechosos y termodinámicamente inestables, es decir, con el tiempo se separa en dos líquidos

inmiscibles. Durante el proceso de emulsificación, el área interfacial generada es más grande debido

a la formación de pequeñas gotas. Por lo tanto, el aumento en la energía libre de superficie del sistema

está dado por ϒΔA, donde ϒ es la tensión interfacial [4]. El exceso de energía requerido para producir

emulsiones solo se puede suministrar mediante una agitación o turbiedad intensa. Para reducir la

energía de agitación necesaria, se puede agregar un surfactante al sistema [4]. La adición de

4

surfactante reduce la tensión interfacial, que a su vez disminuye la energía libre de superficie del

sistema. La formación de una película de agente tensoactivo alrededor de las gotas facilita el proceso

de emulsificación, y se puede lograr una reducción en la energía de agitación [4]. Además de

disminuir la tensión interfacial, la película de surfactante también tiende a prevenir la coalescencia

de las gotas [4].

Las emulsiones se pueden caracterizar mediante propiedades físicas como el tamaño de partícula y

reológicas como la viscosidad y elasticidad, las cuales juegan un papel importante en la estabilidad

de la emulsión. La película interfacial define tanto la viscosidad como la elasticidad [5]. De esta

manera, la viscosidad hace referencia a la resistencia a fluir, mientras que la elasticidad caracteriza la

forma en que el sistema reacciona frente a tensiones o estrés de la interfase [6]. Una película se

considera elástica si resiste una deformación en la interfase y si la superficie tiende a recuperar su

forma natural cuando se eliminan las fuerzas de la deformación [5].

Dentro de los sistemas de emulsiones, los tipos de emulsión comúnmente encontrados se pueden

clasificar en tres grupos: agua en aceite (W/O), aceite en agua (O/W) y emulsiones múltiples o

complejas [2]. Las emulsiones estudiadas son W/O, que consisten en una dispersión de pequeñas

gotas de agua en crudo. En la industria petrolera, regularmente se forman emulsiones, en las cuales

se encuentra presencia de agua: libre, si se separa en un tiempo menor a cinco minutos o remanente

si permanece emulsionada. En los crudos medianos y livianos (>20 °API) las emulsiones contienen

entre 5 y 20 % volumen de agua, mientras que, en los crudos pesados y extra pesados (<20 °API)

poseen del 10 al 35 % de agua [7]. Se ha estudiado el proceso de formación de emulsiones,

encontrando una relación principalmente con la presencia de asfáltenos y resinas. Los asfáltenos y

resinas, son agentes surfactantes naturales del crudo, los cuales forman una fuerte película interfacial

evitando que las gotas de agua dispersa se fusionen. Dado que estos agentes se unen a la superficie

de las gotas de agua, resisten la ruptura de las mismas [8].

En la industria del petróleo, el tipo de emulsión predominante entre los pozos de inyección y

extracción es la emulsión de agua en crudo. Lo anterior, es debido a que se requiere la inyección de

agua para desplazar crudos con las altas viscosidades [9]. Asimismo, estas emulsiones promueven la

corrosión (debido a la inclusión de sal y salmuera en el petróleo), reduciendo el rendimiento y

deteriorando los equipos o tuberías [10]. Por otra parte, durante el transporte de crudo en yacimientos

petrolíferos, se ha demostrado que una concentración de agua superior al 2% puede provocar

corrosiones graves en la red de oleoductos [11]. América Latina cuenta con el 48% de las reservas

recuperables de crudo pesado en el mundo. Se estima que, en Colombia, el 45% de la producción

corresponde a este tipo de crudo y para este año, alcance el 60% de la producción total [12]. Por su

alta viscosidad, este petróleo necesita de estimulación térmica y química para ser extraído de los

pozos [12]. Luego de la cual, el crudo se convierte en una emulsión de crudo y agua que debe

deshidratarse [13].

La desemulsificación es empleada como una solución a este problema ya que consiste en una serie

procesos fisicoquímicos que afectan la estabilidad del sistema coloidal. En general, el proceso de

desemulsificación consta de 3 mecanismos (floculación, coalescencia y sedimentación) [14].

Inicialmente, las gotas de la fase dispersa (agua) de mayor tamaño se sedimentan por efectos

gravitacionales. Así, en la fase continua (crudo) solo permanecen las gotas más pequeñas, para las

cuales los efectos de la gravedad pueden ser compensados por el movimiento browniano [15]. En la

emulsión remanente se puede presentar un acercamiento entre gotas, hasta que comienzan a

5

acumularse en estructuras más grandes llamadas floccs. Por lo anterior, a mayores concentraciones

de la fase dispersa en la emulsión, mayor será la tasa de floculación. Por otra parte, a mayores

temperaturas, mayor es el movimiento de la fase dispersa y menor es la viscosidad del medio

continuo, por lo que hay una mayor probabilidad de floculación. Posteriormente, los floccs formados

se fusionan entre sí para formar gotas más grandes en un proceso irreversible que reduce el número

de gotas y eventualmente lleva a una separación de fases. Finalmente, las gotas formadas se

sedimentan debido a la diferencia entre las densidades de la fase continua y dispersa.

El proceso de desemulsificación mencionado es ideal, pero en la práctica se ve afectado por diferentes

factores, como lo son:

• Calidad del crudo: En la industria de refinería, la densidad de un aceite se expresa en términos de

grados API. De esta manera, el crudo se puede clasificar en tres categorías: ligero, mediano o

pesado. Si la gravedad API es menor a 10, se considera betún natural. Entre 10° y 22.3 ° se define

petróleo pesado, de 22.3° a 31.1° se considera como aceite medio, y superiores a 31.1° son aceites

livianos [16]. Esta propiedad, varía inversamente con la densidad, cuánto más ligero sea el fluido,

mayores serán sus grados API. Cuanto menor sea la gravedad específica y mayor grado API, el

crudo es de alta calidad y viceversa [17].

• Surfactantes: Generalmente, los sistemas coloidales presentan compuestos estabilizantes conocidos

como surfactantes. En la industria petroquímica, los surfactantes pueden ser encontrados en todas

las etapas del proceso, desde la recuperación hasta los procesos industriales. Así mismo, sus grupos

químicos también pueden ser muy variados, sin embargo, se pueden clasificar como aniónicos,

catiónicos o no iónicos [18]. Los surfactantes se encuentran en la interfase del medio continuo y

disperso, evitando el contacto entre las gotas suspendidas, y, por lo tanto, disminuyen la tasa de

floculación. Los surfactantes más importantes en la industria petroquímica son los asfáltenos,que se

definen como la fracción soluble en tolueno e insoluble en un exceso de n-alcano,heptano o pentano)

[10]. En general, se considera que la estructura de los asfáltenos consiste en un núcleo aromático

con cadenas alquílicas y heteroátomos que poseen nitrógeno, azufre y oxígeno [19]; Los diferentes

tipos de heteroátomos están organizados en grupos funcionales como: carboxilo, cetonas y

aldehídos, entre otros. La superficie de las partículas asfalténicas dispersas en la fase continua

(crudo) están rodeadas de resinas en forma micelar, lo que genera la formación de emulsiones

estables [20]. Similar al caso de los asfáltenos, muchas de las moléculas en el crudo son ácidas y

pueden ionizarse en la interfase aceite-agua para formar el anión del ácido y reducir la tensión

interfacial (IFT), lo que conduce a la estabilidad de la emulsión. Algunas de estas moléculas son:

ácidos alquilcarboxílicos simples, ácidos alquilbenceno carboxílicos y ácidos nafténicos [10].

• pH: La adición de ácidos o bases inorgánicos cambia radicalmente la formación de películas de

asfáltenos y resinas que estabilizan las emulsiones agua-aceite. Ajustando el pH se puede minimizar

la rigidez de la película que estabiliza la emulsión y aumentar la tensión interfacial. De igual manera,

el pH afecta el equilibrio acido base del sistema, promoviendo la formación de cargas superficiales.

• Potencial Z: es una medida del potencial eléctrico en la superficie interfacial de las gotas

suspendidas, con unidades en milivoltios. Puede tomar valores positivos y negativos, de manera que

al estar más alejado del 0 aumentan las fuerzas de repulsión entre las gotas de la fase dispersa,

haciendo emulsiones más estables. En general a partir de valores entre -30 y 30 mV se presenta un

efecto de inestabilidad en el sistema [21].

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• Viscosidad: la viscosidad del medio continuo de la emulsión es un factor determinante en el

movimiento de las gotas de la fase dispersa. De tal manera que, a mayores viscosidades las fuerzas

opuestas al movimiento de las gotas son mayores, produciendo menores velocidades de las gotas de

agua, reduciendo la floculación y haciendo más estable la emulsión. [13]

Debido a estos factores, se han propuesto diferentes alternativas para mejorar el proceso de

desemulsificación entre los que se incluyen tratamientos térmicos, mecánicos, eléctricos y químicos.

Los procesos térmicos aprovechan la variación de la viscosidad con la temperatura, de tal manera que

al aumentar la temperatura se reduce la viscosidad de la fase continua, facilitando el movimiento de

las gotas suspendidas. Así mismo, se desestabiliza la interfase de las gotas con la reducción de la

viscosidad interfacial y aumenta la coalescencia por un mayor movimiento de las gotas. Aun así, el

tratamiento térmico puede resultar muy costoso, puede reducir los grados API del crudo y puede

incrementar la corrosión en los equipos con los que se trabaje por un aumento en la deposición de

partículas [14].

Por otra parte, hay una gran variedad de procesos mecánicos que utilizan la salinidad, sedimentación,

presiones o vapor [14]. Por lo general la salinidad, el vapor y la sedimentación se utilizan como

procesos auxiliares, debido a bajas eficiencias o por presentar rendimientos variables al ser muy

dependientes de las condiciones con las que se operan [22]. Adicionalmente, pueden llegar a ser muy

costosos al incluir secciones adicionales para mejorar su rendimiento [23]. Por el contrario, los

procesos eléctricos constan principalmente por redes electrostáticas las cuales pueden polarizar las

gotas de agua atrayendo las que tengan cargas opuestas entre sí y haciendo que se floculen. La

velocidad a la que ocurre la floculación y coalescencia depende de la velocidad de movimiento de las

gotas, la cual es una función del gradiente de voltaje del sistema. Aunque a altos voltajes el proceso

es más rápido, también se pueden separar las gotas suspendidas en gotas más pequeñas, haciendo más

compleja la separación de la emulsión [24]. Finalmente, los procesos químicos consisten en agregar

compuestos que desestabilicen la emulsión por medio de procesos físicos y químicos. Comúnmente

los desemulsificantes químicos tienen 3 componentes, solventes, floculantes y tensoactivos. Los

solventes más usados son tolueno, benceno, xileno, cadenas cortas de alcoholes o aromáticos pesados.

Los tensoactivos son compuestos con un alto valor de HLB, es decir, compuestos con cadenas

hidrofílicas y lipofílicas que tienen a la interfase [14].

Ahora bien, en la industria se emplea la desemulsificación electroquímica, la coalescencia

electrostática de las gotas de agua y en un mayor grado de demulsificación a base de surfactantes

químicos [11]. Sin embargo, a pesar de los avances en diferentes técnicas de inyección de vapor o

tecnología in situ para la producción del crudo pesado, en la mayoría de los casos, el factor de

recuperación no es mayor al 20% [12].

Teniendo en cuenta lo anterior y sumado al creciente interés por la protección ambiental de los últimos

años, se han realizado investigaciones con el fin de desarrollar procesos costo efectivos para la

producción de surfactantes biodegradables y con características menos tóxicas que los agentes

químicos actuales. De esta manera, los biodesemulsificantes se convierten en productos de alto valor

al caracterizarse por su baja toxicidad, biodegradabilidad, y estabilidad ante variaciones de pH,

temperatura y salinidad [25]. Asimismo, gracias a avances técnicos han permitido evaluar el potencial

de metabolitos bacterianos específicos, proteínas, enzimas, nutrientes y bioproductos ex situ en la

desemulsificación [26]. En la industria petrolera, los biodesemulsificantes pueden contribuir a

7

mejorar los procesos de recuperación y deshidratación del crudo, como es el caso de los ramnolipidos,

que han sido evaluados en pruebas de laboratorio y plantas piloto en años recientes [27].

Otro de los productos más estudiados es la proteína de membrana externa A (OmpA), la cual es la

proteína que conforma la mayor parte de la membrana externa de bacterias gran negativas,

especialmente de cepas de E. coli [28]. La proteína OmpA se compone de dos estructuras principales:

la terminal N, de carácter hidrofóbico, compuesta por aminoácidos del 1 al 171 en 8 cadenas beta y 6

sitios de enlace para unirse a compuestos orgánicos [29]. Por otra parte, la terminal C, de carácter

hidrofílico, se compone de los aminoácidos 180 al 325 en dominio periplásmico.

(a) (b) (c)

Figura 1. Estructura de la OMPA (a) Proteína completa. (b) Terminal N. (c) Terminal C [30]

Debido a que tiene regiones hidrofóbicas e hidrofílicas, la OmpA puede actuar como un

desemulsificante anfipático. Por lo cual, dada una emulsión de gotas de agua en crudo, la terminal C

tiende a ir a la fase dispersa. Una vez allí, se llevan a cabo reacciones entre los residuos (parte del

aminoácido que no contiene al grupo amino ni al grupo carboxilo) con las moléculas de la fase

dispersa. Ahora bien, los residuos son específicos para cada aminoácido y pueden contener grupos

ácidos, básicos, polares, no polares o aromáticos [31]; de tal manera que las reacciones tienden

preferencialmente a neutralizar las cargas del sistema. Cunado las cargas se neutralizan, las fuerzas

de repulsión entre las gotas disminuyen lo suficiente para permitir su acercamiento. En este punto se

presenta un segundo efecto estructural de la proteína OmpA. Para poder mantener la presión osmótica

en las bacterias, la terminal N de la OmpA puede actuar como un poro que varía en tamaño de acuerdo

con la temperatura [32]. Por medio del cual, se pueden movilizar moléculas de agua.

(A) (B)

Figura 2. Poro de OMPA. (A) Cerrado, (B) Abierto [32]

Desde el 2014 se han adelantado estudios para evaluar la eficiencia de la OmpA como biosurfactante

en procesos de deshidratación de crudo. Por medio de estos estudios se obtuvo como resultado un

proceso estandarizado para la síntesis de la proteína que incluye el cultivo de E. coli, la sobrexpresión

de la proteína, procesos de purificación y concentración [33]. Por otra parte, por medio de pruebas en

el reómetro se obtuvieron curvas de cambio en la viscosidad de la emulsión con respecto a esfuerzos

cortantes [1]. Además del efecto de la OmpA libre, se han desarrollado nanopartículas de magnetita

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(óxidos de hierro) sobre las cuales se puede generar una “corona” de proteínas por su afinidad con la

OmpA [34], lo que permite procesos posteriores de recuperación.

A partir de lo anterior, este proyecto busca evaluar por primera vez la eficiencia del proceso de

desemulsificación para un sistema crudo agua con la proteína OmpA en un estado libre y fijada a

partículas de magnetita. A partir de los resultados de pruebas de botella y tensión interfacial se podrá

establecer una dosis óptima para ambos procesos, así como comparar el porcentaje de agua

recuperada. En consecuencia, se plantea un posible producto cuya composición es netamente

biológica, lo que permite mitigar los daños ambientales que producen las intervenciones en pozos o

los tratamientos hechos para mejorar el transporte de crudo. Y al mismo tiempo, constituya una

alternativa efectiva para la deshidratación del crudo en campo.

2. Materiales y Métodos

Síntesis de la proteína

En primer lugar, se prepararon 25ml de medio LB (Tabla 2 de la sección de anexos) y se llevaron a

autoclavar, se adicionó cloranfenicol para asegurar una concentración de 50 μg/mL. Luego se sirvió

el medio en una caja de Petri autoclavada y se descongeló el clon de E. coli K12 W3110/pCA24N

OmpA. Una vez descongelado el clon y se gelificó el agar, se tomaron 10 μL del clon, se esparció en

el agar como un cultivo aislado (figura 8) y se dejó el cultivo en una incubadora a 37°C por 24 horas.

Se prepararon 40ml de medio LB sin agar en un Erlenmeyer de 100ml, se autoclavó y se pasó una

colonia del medio solido al medio de 40ml. El cultivo líquido se llevó a un shaker a 250 rpm y 37°C

overnight. Posteriormente, se prepararon 400ml medio LB sin agar y se adicionaron 10 ml del cultivo

líquido.

Se evaluó la absorbancia del cultivo de 400ml a una longitud de onda de 600 nanómetros en el

espectrofotómetro cada hora hasta obtener un valor entre 0,6 y 0,8. En este momento se adicionaron

3 gramos de lactosa y se dejó en crecimiento en el shaker a 250 rpm y 37°C por 4 horas. Después de

este tiempo, se recogió el medio en tubos falcon de 50 ml, se centrifugó a 4500 rpm con 4°C por 30

minutos, se recogió el pellet y se congeló. Finalmente, se descongeló el pellet y se adicionaron 4ml

de buffer de sonicación (tabla 3 de la sección de anexos) por cada gramo de pellet. Se llevó al

sonicador por 40 ciclos 20 on/40 off con una amplitud de 37% para lisar el pellet y acceder a la

proteína. El pellet obtenido de la sonicación se centrifugó en eppendorff a 13000 rpm con 4°C por 15

minutos; después se descartó el pellet y se recogió el sobrenadante.

Purificación

Para la purificación se dispusieron 16 tubos de eppendorff en el magneto, se adicionaron 700 uL de

una solución de dynabeads ya usados, se esperó la migración y se descartó el líquido. Después, se

adicionaron 100 μL de buffer de purificación (tabla 4 de la sección de anexos) y 600 μL de la muestra

a purificar; se resuspendieron los dynabeads agitándolos en multi-vortex a 1000 rpm por 10 minutos

en baño de hielo. Luego de esto, se Llevaron los eppendorffs al magneto, se esperó la migración, se

retiró el líquido y se almacenó la muestra. Este proceso se repitió para 4 lavados sucesivos con 300

μL de buffer de purificación. Todo el líquido fue rotulado y almacenarlo. Finalmente, se repite el

procedimiento con 100 μL de buffer de elusión.

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Espectrofotometría Nanodrop

Inicialmente, se inició el programa del espectrofotómetro nanodrop y se seleccionó el método de

medición de proteína. Posteriormente se adicionaron 5 μL de agua destilada sobre el punto de

medición del equipo, luego se adicionó 5 μL de blanco (buffer de elusión para evaluar el resultado

final o buffer de purificación para los lavados). Finalmente se adicionaron 5 μL de la muestra y se

registró el valor obtenido por el programa.

Electroforesis en Acrilamida (SDS page)

Se seleccionaron, lavaron y limpiaron los vidrios con etanol. Los vidrios se pusieron en el soporte y

se realizaron pruebas de fugas con agua por 20 minutos. Se retiró el agua de los vidrios con papel

adsorbente. Cuando los vidrios se secaron, se preparó el gel de corrido (tabla 15 de la sección de

anexos) y se adicionó al tiempo 60 μL de la solución peroxidisulfato y 20 uL de Temed. Se dejó

gelificar el polímero por 15 minutos en los vidrios. Paralelamente se preparó el gel de almacenamiento

(tabla 16 de la sección de anexos), se adicionó al tiempo 50 uL de la solución peroxidisulfato y 10 μL

de Temed, se dispuso en los vidrios y se insertó el peine. Posteriormente, se dejó polimerizar el gel

por 40 minutos. Durante este tiempo, se preparó buffer de muestra (tabla 12 de la sección de anexos)

para desnaturar a 90 C por 5 minutos. Después de la gelificación, retiró el peine, se retiraron los

vidrios del soporte y se ubicaron en la cámara con el vidrio de menor altura hacia el centro de la

cámara. Luego, se llenó la cámara de buffer de corrido 1x (Tabla 11 de la sección de anexos). Con

una jeringa de 10 μL se sembraron las muestras y el indicador de peso molecular en cada canal. Se

conectaron los electrodos a la cámara y configurar la fuente de voltaje a 110 V y corrió por 1 hora y

25 minutos aproximadamente. Una vez terminó el tiempo de corrido, se retiró el gel de la cámara y

los vidrios, se removió el gel de almacenamiento y se llevó el gel de corrido a la solución de Azul de

Comassie en Shaker por 30 min. Finalmente, se removió la solución de tinción y se realizaron lavados

por inmersión con solución de lavado hasta observar claramente las bandas.

Pruebas de botella

Las pruebas de botella son un método ampliamente utilizado para evaluar la efectividad

demulsificante del producto de interés. En general, consiste en mezclar la emulsión con el surfactante

a evaluar. Luego, se deja separar durante un período de tiempo definido [2]. A lo largo de este tiempo

y con observaciones, se observa el grado de separación de fases junto a la claridad de la interfase y la

turbidez de la fase acuosa. Dependiendo de la viscosidad de la emulsión original, la prueba puede

realizarse a temperaturas elevadas o con cantidades variables de diluyente. La separación también

puede mejorarse mediante centrifugación, aunque usualmente se realiza antes de agregar el diluyente

[18]. Para este caso, se preparó desemulsificante (diluciones) y se tomó una muestra de 42 ml de

crudo a evaluar (según disponibilidad). La relación de volumen aplicado para todos los experimentos

fue de 70% crudo y 30% agua, variando las concentraciones de desemulsificante. Inicialmente, el

crudo se calentó en una plancha hasta 115°C y se dejó enfriar hasta que una temperatura de 70°C.

Paralelamente se preparó la bomba peristáltica a v=19, con 18ml de agua DD. Después, se pasó el

crudo al Dispermat con 5000 rpm, se encendió la bomba y se adicionó el agua lo más cerca posible

al aspa. Cuando se terminó de adicionar el agua, se esperaron 15 minutos manteniendo temperatura

con una plancha de calentamiento. Luego se pasó la emulsión al rotor estator con una velocidad (A)-

8800 rpm por 15 minutos manteniendo la temperatura con una plancha de calentamiento. Al cabo de

ese tiempo, la emulsión se pasó al Dispermat con 5000 rpm y se adicionó el desemulsificante con una

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micropipeta. A partir de la adición, se esperaron 10 min manteniendo temperatura con una plancha

de calentamiento, se pasó la emulsión a tubos zanahoria de 40 mL y se llevó a un baño termostatado

a 60°C por 24 horas, haciendo observaciones en intervalos de tiempo, para evaluar el porcentaje de

desemulsificación [35].

Pruebas de tensión interfacial

Al colocar en contacto dos líquidos inmiscibles, en el sistema se formarán dos fases líquidas y la

interfase de contacto entre ellas. Las moléculas de la interfase estarán sometidas a fuerzas de

magnitudes diferentes a las moléculas en el interior de cada líquido. Además de estas fuerzas, se

generan interacciones de tipo Van der Waals con las moléculas del otro líquido en la interfase [36].

Por lo tanto, la tensión interfacial se define como la fuerza de atracción ejercida sobre las moléculas

de la superficie de un líquido hacia adentro, causando la deformación de la superficie [37]. Aunque

reducir la tensión tiende a estabilizar la emulsión, este efecto no es suficiente, dado que se ha

encontrado que los sistemas de tensión ultra-baja producen emulsiones inestables. Adicionalmente,

diversos estudios han demostrado que la tensión entre crudo y agua disminuye con el tiempo,

requiriendo de varias horas de contacto para obtener un valor estable. A esta variación se le conoce

como tensión interfacial dinámica [38].

El método de la gota pendiente/colgante, usado en este proyecto, consiste en dejar suspendida una

gota de líquido en el extremo de un tubo capilar. Se determina la tensión a partir de la elongación

vertical (deformación) que provoca la fuerza de gravedad. En este método se presentan problemas

experimentales principalmente por la estabilidad de la gota [37] y se aplica comúnmente para

tensiones intermedias, ya que es poco preciso para tensiones muy altas (la gota es esencialmente

esférica) [39]. Para solucionar el problema de la tensión baja y el desprendimiento de la gota, se usa

una aguja curva que permite abrir la gota hacia arriba y disminuye la interferencia de la fuerza

gravedad.

Para el desarrollo de las pruebas de tensión, en primer lugar, se calibro el equipo con una esfera

metálica en una celda con agua, ajustando la resolución de las imágenes tomadas por el equipo.

Luego, se preparó una solución de la proteína en agua destilada a una concentración deseada, en el

caso de la proteína libre, la solución se colocó en la celda el tratamiento y el n-Decano en la jeringa.

Como el n-decano es menos denso que la solución de la proteína, se utilizó una aguja tipo hook, donde

la gota se genera hacia arriba. Por el contrario, cuando se trabajó con nanopartículas, como la solución

es opaca, se colocó en la jeringa y el n-decano se adicionó en la celda. Así mismo, se trabajó con una

aguja recta. Posteriormente, se ubicó la celda con la aguja dentro de la misma, de tal forma que la

cámara pudiera tomar las fotografías en una posición correcta. Finalmente, se generó una gota bien

definida de un tamaño aproximado de 5μl en la celda, se verificó que el programa estuviera haciendo

las mediciones de tensión y se grabaron los resultados para un periodo de tiempo definido hasta la

estabilización de la tensión.

3. Análisis de Resultados

Pruebas de tensión interfacial

Para una prueba de tensión inicial se utilizó únicamente agua destilada y n-Decano, lo que permitió

identificar el valor de tensión esperado del sistema sin los efectos de la proteína. El sistema inicia con

valores superiores a 65 mN/m y se estabilizó rápidamente en valores entre 50 y 55 mN/m. Para

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suavizar la curva y obtener un comportamiento más detallado, se aplicó una regresión polinómica de

tercer orden, siendo la que mejor se ajusta al comportamiento de los datos con un R cuadrado de 0.47.

A partir de la regresión encontrada se encontró que la tensión del sistema es aproximadamente de 52

mN/m. La tensión interfacial del sistema agua-n-decano (sin proteína) es similar a la obtenida por

Zeppieri y Rodríguez para las tensiones de alcanos en agua, de manera que a una temperatura de 20°C

sus resultaros mostraron una tensión de 52.33 ±0.04 mN/m [40]. Dado que los resultados de la

regresión dan un valor de 52 mN/m se demuestra que el ajuste realizado, si bien presenta un R

cuadrado bajo por el ruido de la medición, es muy similar al comportamiento teórico. Por otra parte,

en el mismo estudio se encontró una reducción de la tensión interfacial de aproximadamente 4 mN/m

para el mismo sistema entre los 20 y los 60°C [40]. Lo anterior indica que las tensiones que se pueden

alcanzar en las pruebas de botella son menores a las que se podrían observar en las pruebas de tensión

correspondientes.

Figura 3. Tensión Interfacial Decano/Agua.

Para pruebas posteriores se asignaron concentraciones de proteína para obtener diferentes curvas de

tensión. Sin embargo, debido a la sensibilidad del proceso de síntesis de la OmpA, la pureza de la

proteína obtenida es variable, por lo cual se dividieron las curvas resultantes en dos gráficas, cada

una para una producción de proteína.

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Figura 4. Tensión interfacial proteína inicial

En el caso de la proteína inicial se evaluó un intervalo más pequeño de concentración, partiendo de

concentraciones pequeñas de 100 y 200 partes por millón, correspondiendo a la décima parte de la

concentración de los desemulsificantes químicos comerciales. Las mediciones llegaron hasta

concentraciones de 17500 ppm, punto donde se consumió toda la proteína disponible (Figura 4).

Figura 5. Tensión interfacial segunda producción de proteína. Las líneas sólidas indican el ajuste

realizado y los valores puntuales son los resultados experimentales

Para la segunda producción de proteína se evaluó un rango más amplio de concentraciones con el

objetivo de llegar a la tensión mínima posible que puede alcanzar el sistema, es decir asegurar la

saturación de la proteína en la interface. Teniendo esto en cuenta, se partió de una concentración de

100000 ppm para la medición inicial y se comenzó a diluir la solución hasta llegar a una concentración

de 4300 ppm para la última prueba (Figura 5). Adicionalmente, se amplió el tiempo de medición de

la tensión para poder generar mejores regresiones y llegar a los valores de tensión en estado estable.

13

En general, las pruebas de tensión se realizaron con una solución homogénea de proteína en el sistema

antes de la generación de la gota, por lo que las tensiones iniciales son menores a la tensión del blanco.

Por lo tanto, aunque los resultados formen parte de la curva de tensión, realmente no corresponden a

los valores iniciales. Debido a esto, para obtener la curva de tensión completa, se debió ajustar el

tiempo de medición de los datos; de manera que, para cada curva de tensión con proteína se generó

una regresión logarítmica donde a tiempos muy pequeños la tensión correspondiera al blanco

obtenido. Posteriormente, se ajustó el tiempo de manera que correspondiera con la tendencia de la

regresión logarítmica, es decir, que el valor del R cuadrado fuera el mayor posible.

En el caso de la primera proteína, las tensiones fueron evaluadas durante períodos de tiempo muy

cortos, por lo que los valores experimentales corresponden únicamente a una fracción de la curva de

tensión. En consecuencia, los ajustes generados no son tan confiables como los de la segunda

producción de proteína. Aun así, en ambos casos se observa como la proteína libre reduce la tensión

interfacial del sistema, causando cambios significativos a altas concentraciones. En general, el efecto

de la proteína se relaciona con su estructura y composición. Como se mencionó anteriormente, la

proteína presenta una terminal N hidrofóbica, y una terminal C hidrofílica, donde la terminal C hace

que la proteína tienda a desplazarse hasta la interfase entre el crudo y el agua. Al mismo tiempo en el

que la proteína se acumula en la interfase, desplaza a los asfaltenos y otros surfactantes naturales del

crudo. Como las terminales N y C están compuestas por 171 y 145 aminoácidos respectivamente, la

proteína se puede concentrar en la interfase, orientado la terminal C en la fase acuosa y la terminal N

en la fase oleosa. En este punto, los aminoácidos polares como la Arginina, Lisina, Acido glutámico,

ácido aspártico e histidina atraen a las moléculas de agua, generando fuerzas contrarias a las fuerzas

de cohesión, lo que reduce la tensión interfacial.

Por otra parte, al comparar el comportamiento de ambas producciones de proteína a concentraciones

similares, 17500 ppm para la primera producción y 20000 ppm para la segunda, se observa como aun

cuando tienden al mismo valor (8mN/m), la primera proteína llega a estabilizarse más rápido. Así

mismo, el comportamiento de las curvas a altas concentraciones de proteína es similar para ambas

producciones, donde las curvas de tensión convergen a los mismos valores, lo que indica que se llega

a una tensión interfacial mínima en el sistema. Como en la primera proteína se presenta en

concentraciones entre 10000 - 17500 ppm (llegando a 7 mN/m) y en la segunda entre 20000-50000

ppm (llegando a 7.48 mN/m), se deduce que la primera proteína es más pura que la segunda haciendo

que la única diferencia entre las curvas de tensión obtenidas sea debido a la pureza de la proteína.

Para determinar si la pureza de la proteína constituye la principal diferencia entre las dos gráficas de

tensión, se utilizaron los resultados de la prueba de espectroscopía de infrarrojo con transformada de

Fourier (FTIR). A partir de esta prueba se obtuvo la figura 10 de la sección de anexos, donde se

muestran las absorbancias de diferentes grupos funcionales en un rango de longitudes de onda entre

1000 y 4000 cm−1. Para comprobar la presencia de proteína, se debe seguir el comportamiento ideal

donde se incluyen las absorbancias para cada grupo funcional presente en la OmpA, siendo los

determinantes los picos de la Amida I y Amida II. De tal manera que, entre más marcados sean los

picos de absorbancia, mayor será la concentración de OmpA. Como la curva de la OmpA es más baja

que la ideal, la pureza de la proteína liofilizada es menor. En el caso de la segunda producción de

proteína, los picos son significativamente menores a los de la primera producción, lo cual respalda

los resultados obtenidos en las pruebas de tensión. Esto implica que, a pesar de contar con un proceso

definido para la síntesis y purificación de la proteína, pequeñas variaciones en las condiciones del

proceso generan diferencias significativas en las concentraciones de la proteína obtenida, lo que

ocasiona diferencias en las pruebas de tensión realizadas. Adicionalmente, dado que los métodos para

14

estimar la concentración tanto por espectrofotometría nanodrop como la prueba FTIR no permiten

definir cuantitativamente la concentración de OmpA en la muestra de proteína, no se puede establecer

una relación real entre esta, la caída de la tensión y la recuperación de agua. Por lo que la única

relación posible es respecto a la concentración de la muestra total de proteína.

Continuando con lo anterior, en la segunda proteína, la curva de tensión de 100000 ppm se estabiliza

en valores mayores a la de 50000 ppm y 20000 ppm, siendo estos 10mN/m, 9.6 mN/m y 7.8mN/m

respectivamente, confirmando que la saturación de la interface ocurre a concentraciones cercanas a

50000ppm y la acumulación de desemulsificante alrededor de la interface, aumentando la tensión

interfacial. En esta misma proteína se puede observar fácilmente como el método de medición es

menos preciso a tensiones más altas. Por ejemplo, los valores experimentales de la curva de 4300

ppm llegan a tener valores de hasta 2 unidades de diferencia respecto a la regresión, mientras que los

de 50000 ppm presentan una diferencia decimal. De esta forma se encuentra como el ruido de los

datos presenta una disminución continua a medida que aumenta la concentración de proteína y

disminuye la tensión interfacial.

Por otra parte, las pruebas realizadas a la proteína fijada a las partículas de magnetita se realizaron

para las mismas condiciones de la segunda proteína, ya que, la OmpA fijada se obtuvo de la misma

producción, por lo que los resultados pueden ser comparables. Aun así, dado que no se logró

suspender la totalidad de las partículas, la concentración máxima de proteína posible fue de 35000

ppm. Sin embargo, dado que la proteína base fijada a las nanopartículas no es OmpA pura, la

concentración real es menor.

Figura 6. Tensión interfacial para nanopartículas

Figura 7. Prueba de tensión con nanopartículas

15

Las curvas de tensión de las nanopartículas muestran como la tensión a la que llega el sistema en

estado estable aumenta aproximadamente 3 mN/m cada vez que la concentración de partículas se

reduce a la mitad. La diferencia del comportamiento de las curvas de tensión respecto al de la proteína

libre demuestra que las nanopartículas además de ser aplicables para una posible recuperación de

proteína presentan efectos sobre las propiedades interfaciales de la emulsión. De igual manera, las

tensiones finales a las que llega son significativamente más bajas que las de la proteína libre a bajas

concentraciones. Este cambio en la eficiencia corresponde con los estudios realizados para el efecto

de nanopartículas con tensoactivos, donde las tensiones finales del sistema agua hexano fueron

menores cuando se tuvo nanopartículas presentes en el sistema [46]. Lo anterior ocurre debido a que

las nanopartículas, compuestas por óxidos de hierro, actúan como neutralizador de las cargas del

desemulsificante, reduciendo las fuerzas de repulsión entre las moléculas del mismo. Así, una mayor

cantidad de moléculas pueden interactuar con la interfase y consecuentemente reducir la tensión.

Por otra parte, a concentraciones altas las tensiones finales son mayores, debido a que la cantidad

máxima de proteína en la interface no está determinada por la saturación de la proteína, en su lugar,

depende de la cantidad de nanopartículas que se pueden depositar en la interfase. Dado que no toda

la superficie de las nanopartículas está recubierta por la OmpA exclusivamente, la presencia de otras

proteínas sin actividad interfacial hace que la tensión final no sea tan baja como la misma

concentración en la proteína libre. Así mismo, ya que las concentraciones hacen referencia a la masa

de proteína o nanopartículas usadas en el volumen de dilución; la concentración de las nanopartículas

presentara una fracción significativa de magnetita, por lo que la cantidad real de OmpA es menor.

Finalmente, errores en la producción de las partículas, ya sea en el proceso de fijación o en la síntesis,

pueden hacer que las nanopartículas se aglomeren fácilmente por sus propiedades magnéticas. Dicha

aglomeración hace que no todas las nanopartículas lleguen a la interfase y produzcan una reducción

en la tensión.

Pruebas de Botella

Para las pruebas de botella se realizaron los experimentos de la tabla 1, que incluyen 2 pruebas de

nanopartículas a bajas concentraciones, 8 pruebas de proteína libre en agua, en el mismo rango de las

tensiones para la primera proteína. Adicionalmente se realizaron 2 pruebas usando xileno como

solvente para la proteína. Dada la dificultad en la producción de la proteína y las nanopartículas solo

se logró generar la curva de recuperación de agua para la proteína libre hasta una concentración

máxima de 17500 ppm.

Tabla 1. Resultados Pruebas de tensión

Prueba Concentración [ppm] en emulsión total % Recuperación de Agua

Proteína OmpA

inmovilizada

100 2%

500 4%

Proteína OmpaA sin

inmovilizar

100 2%

200 2%

250 2%

500 3%

2000 8%

5000 14%

10000 25%

17500 28%

Proteína OmpaA sin

inmovilizar Xileno

500 2%

2000 9%

16

Figura 8. Resultados de pruebas de botella para 2000 ppm, 5000 ppm y 10000 ppm.

Figura 9. Recuperación de agua en función de la concentración de OmpA

Para las pruebas de botella se tuvo especial cuidado con las condiciones en las cuales se llevaron a

cabo los experimentos dado que la proteína puede denaturarse, lo cual ocasiona una pérdida de

propiedades estructurales y una disminución en su eficiencia como desemulsificante. Particularmente,

se tuvo en cuenta el control de la temperatura y el solvente empleado. Así, se aseguró que la

temperatura de la emulsión en presencia de la proteína no superara los 70°C y se determinó el mejor

solvente comparando los resultados de pruebas a 500 y 2000 ppm entre el xileno y el agua destilada.

Para las pruebas de botella, la tabla 1 se muestra como la prueba con xileno a 2000 ppm obtuvo

mejores resultados que la de agua destilada, aun así, la proteína no se solubiliza fácilmente en un

medio orgánico, por lo cual, al momento de realizar la prueba, parte de la proteína seguía en fase

sólida. En este caso, como el cambio en los efectos de la proteína no es significativo con el cambio

de solvente, se continuó utilizando agua destilada para asegurar una disolución completa. En cuanto

al comportamiento de la curva de recuperación de agua, a partir de los datos experimentales se logra

comprobar el efecto de la proteína OmpA como desemulsificante al presentarse una fracción de

recuperación significativa. Sin embargo, los resultados no permiten identificar una concentración para

obtener la máxima remoción. Por lo tanto, se analizó el máximo valor experimental, donde se

encuentra un máximo posible de 28% de remoción a una concentración de 17500 ppm. Aun así, es

necesario realizar pruebas a concentraciones superiores para confirmar el comportamiento posterior

de la curva.

17

Al comparar los resultados de las pruebas de botella con las pruebas de tensión de la primera

producción de OmpA se encuentra que la máxima recuperación posible ocurre a la misma

concentración donde se obtiene la mínima tensión interfacial. Mientras que, a bajas concentraciones

donde el efecto de la proteína en la caída de la tensión es menor, la cantidad de agua recuperada es

igualmente menor. Adicionalmente, en el caso de la tensión interfacial a una concentración de 2000

ppm se presenta una caída significativamente mayor a las concentraciones anteriores, lo que se ve

reflejado en las pruebas de botella con un aumento en la recuperación de agua. Por lo tanto, a medida

que la tensión interfacial de estado estable del sistema es menor, se produce más fácilmente la

recuperación de agua, donde ambas características son función de la concentración de la proteína. El

proceso por el cual se relaciona la tensión interfacial con la recuperación de agua se presenta durante

la coalescencia, cuando se acercan 2 gotas de agua, ya sea por efectos de gravedad, movimiento

browniano o efectos térmicos. En este punto se presenta un gradiente de tensión interfacial, haciendo

que las moléculas de proteína, que reducen la tensión interfacial mucho más que los tensoactivos

naturales, se adsorban en la interfase y se desplazan los surfactantes naturales. Lo anterior, a su vez,

hace que se reduzca la película entre ambas gotas, en lo que se conoce como el drenaje de la película.

Finalmente, cuando la película se vuelve muy delgada, se rompe debido a la proximidad de la fase

dispersa adyacente, formando una sola gota de mayor tamaño. Si este proceso se repite hasta el punto

en el cual las nuevas gotas generadas son lo suficientemente grandes para caer por gradientes de

densidad, se obtiene el agua recuperada.

El uso de la proteína OmpA libre y/o inmovilizada en nanopartículas conforma una alternativa

efectiva para solucionar problemas en la industria petrolera, como la formación de emulsiones W/O,

derrames fortuitos, alta viscosidad del crudo, entre otros. Este tipo de biosurfactante tiene un alto

valor respecto a los surfactantes clásicos debido a su acción específica, baja toxicidad, mayor

biodegrabilidad, pH, salinidad y amplio campo de aplicación [41]. Al ser una molécula anfipática y

poderse ubicar en la interfase de los compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos le otorga características

importantes como: disminuir la tensión interfacial y/o mejora la solubilidad. Lo cual, tiene un papel

importante en la industria del petróleo para le recuperación del crudo, biorremediación o mejorar las

propiedades del crudo pesado, como su alta viscosidad [41].

La biotecnología y los bioprocesos en esta industria se han expandido debido a que los biosurfactantes

es uno de los avances más prometedores debido a que su aplicación está presente en casi todas las

etapas de la producción de petróleo [42]. En este caso, el uso de la proteína OmpA libre y/o

inmovilizada llama la atención dada la necesidad de encontrar compuestos naturales, ecológicos y

biodegradables. Al provenir de un microorganismo, Escherichia Coli, cumple con las anteriores

especificaciones, además de requerir menor concentración que los surfactantes sintéticos, para lograr

remoción de agua en emulsiones W/O. Aunque la investigación alrededor de esta proteína es reciente,

se logró evaluar el efecto en la separación de fases para emulsiones W/O, a través de mediciones de

tensión interfacial, en lo que se evidenció una reducción significativa en el sistema n-decano y

proteína disuelta en agua. Adicionalmente, con las pruebas de botella, se pudo comprobar la

interacción que tiene en la emulsión agua y crudo pesado, evidenciando una remoción superior al

20%. Ahora bien, aparte de tener la proteína OmpA libre, su inmovilización en nanopartículas de

magnetita presenta una alternativa de reutilización para la proteína y adicionalmente, tienen un efecto

mayor, en la reducción de la tensión interfacial. Sin embargo, se debe evaluar a futuro el mecanismo

de recuperación, para evaluar su eficiencia como demulsificante.

18

4. Conclusiones

• Se logró construir una curva de demulsificación para el sistema crudo/agua con proteína OmpA

como surfactante llegando a una remoción máxima de 28%. Sin embargo, para poder completarla,

se sugiere realizar pruebas hasta una concentración de 50000ppm.

• Se requiere establecer un método que permita obtener lotes de proteína OmpA muy similares en

cuanto a pureza, dado que las variaciones de la pureza generan variaciones en los resultados y

pueden llevar a conclusiones erróneas.

• Independientemente de los tiempos de medición de la tensión interfacial, se observó el efecto de

la proteína OmpA en la caída de tensión interfacial, gracias a su conformación estructural con

una terminal N hidrofóbica y una terminal C hidrofílica.

• Las pruebas de botella y las pruebas de tensión para la primera proteína producida produjeron

resultados similares, una demulsificacion alrededor de 16000 ppm, registrando una tensión

interfacial de 7 mNm-1 donde las grandes diferencias en la caída de tensión ocurren a las mismas

concentraciones que las pendientes más altas de la curva de recuperación de agua, lo que permite

dar una mayor confianza a los resultados.

• Las nanopartículas presentan un efecto sobre la tensión interfacial de la emulsión aumentando el

efecto de la proteína y permitiendo una mayor migración a la interfase, lo que resulta en una

mayor disminución en la tensión interfacial a bajas concentraciones.

• Para poder determinar el efecto demulsificante de la proteína OmpA inmovilizada en

nanopartículas de magnetita se deben hacer pruebas de botella, para poder determinar la curva de

demulsificacion y establecer si los resultados son comparables y verídicos frente a las pruebas de

tensión realizadas.

• Se sugiere implementar pruebas de tensión interfacial con crudos pesados, para verificar si se

tiene un comportamiento similar al evaluado con n-decano y poder determinar las

concentraciones óptimas para lograr la remoción de agua.

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6. Anexos

Tabla 2. Composición de 100 mL de medio

LB solido

Triptona 1 g

NaCl 1 g

Extracto de Levadura 0,5 g

Agar-Agar 1,5 g

Tabla 3. Composición buffer de sonicación

V=500mL pH=8

Fosfato de sodio Monosodico 3,5 g

NaCl 9 g

Tween 20 50 μL

Trinton 5 mL

Tabla 4. Composición buffer de purificación

V=500 mL pH=8

Fosfato de sodio Monosodico 3,5 g

NaCl 9 g

Tween 20 50 μL

Tabla 5. Composición buffer de elusión

V=500 mL pH=8

Fosfato de sodio Monosodico 3,5 g

NaCl 9 g

Imidazol 10,21 g

Tween 20 50 μL

Tabla 6. Solución de acrilamida

Acrilamida 29,2 g

Bisacrilamida 0,8 g

Agua destilada 100 mL

Tabla 7. buffer Tris HCl pH8

Tris base 9 g

Agua destilada 40 mL

HCl Hasta pH=8

Tabla 8. buffer Tris HCl pH6,9

Tris base 3 g

Agua destilada 40 mL

HCl Hasta pH=6,9

22

Tabla 9. SDS 10% pH 7,2

SDS 10 g

Agua destilada 80 mL

NaOH Hasta pH=7,2

Tabla 10. Solución de Peroxidisulfato de

Amonio

Peroxidisulfato de Amonio 0,1 g

Agua destilada 1 mL

Tabla 11. Buffer de Corrido V=1L

Tris Base 3 g

Glicina 14,4 g

SDS 0,2 g

Azida Sodica 0,5 g

Tabla 12. Buffer de muestra

Glicerol 2,5 mL

Tris 3,125 mL

Azul de Bromofenol 5 mL

Mercaptanol 1,25 mL

Agua destilada 11,87 mL

SDS 10% 5 mL

Tabla 13. Solución de azul de Comassie

Azul de Comassie 0,25 g

Ácido Acético Glacial 20 mL

Metanol 80 mL

Agua destilada 100 mL

Tabla 14. Solución de lavado

Metanol 200 mL

Ácido Acético Glacial 100 mL

Agua destilada 700 mL

Tabla 15. Gel de corrido

Agua destilada 3,35 mL

Buffer tris pH 8.8 2,5 mL

SDS 10% 0,1 mL

Solución Acrilamida 4mL

Tabla 16. Gel de Almacenamiento

Agua destilada 3 mL

Buffer tris pH 6,8 1,25 mL

SDS 10% 0,1 mL

Solución Acrilamida 0,7 mL

Figura 10. Espectro de proteína OmpA