En qué consiste el proceso de elución de Cómo optimizar...
Transcript of En qué consiste el proceso de elución de Cómo optimizar...
En qué consiste el proceso de elución de gradientes y cuáles son sus ventajas.
Cómo optimizar una separación de gradiente.
Consideraciones prácticas para establecer separaciones de gradientes.
2
Resolución defectuosa de los picos
que eluyen.
Aumento del ancho de pico y
descenso de la altura de pico en
los picos que eluyen más tarde.
Tiempos largos de análisis debido
a valores grandes de k'.
Contaminación de columnas con
componentes de fuerte retención.
3
.
La composición de la fase móvilcambia durante la separación.
Ventajas
◦ Resolución mejorada
◦ Mayor detección
◦ Capacidad para separarmuestras complejas
◦ Tiempos de análisis máscortos
◦ Disminución del deterioro de la columna debido a los componentes retenidos con fuerza
Otros usos
◦ Limpieza de la columna
◦ Análisis de exploración en el desarrollo de métodos
4
Características del gradiente
Se utilizan dos disolventes para
desarrollar el gradiente
La fuerza de elución aumenta con el
tiempo
Tomar en cuenta la forma del gradiente
Tener en cuenta la pendiente del
gradiente
5
1
2 3
4
5
6
7 8
0 2 4 8 10 12 14 16 18 206
Tiempo (min.)
Columna: ZORBAX 300SB-C3
5 µm, 4,6 x 150 mm
Gradiente: 15-35% B en 19 min.
Fase móvil: A: 95:5 H2O:ACN
con 0,1% de TFA
B: 5:95 H2O:ACN
con 0,085% de TFA
1. Leucina Encefalina
2. Angiotensina
3. RNasa A
4. Insulina
5. Citocromo C
6. Lisozima
7. Mioglobina
8. Anihidrasa carbónica
6
% O
rg
0
25
50
75
100
0 10 20 30
Tiempo (min)
k'
Aumento del % de modificador
orgánico
Cambio de partición a fase móvil
Aumento de la velocidad del
compuesto
Se tendrá que determinar lo siguiente:
Disolventes orgánicos
Composición inicial Tiempo del gradiente Inclinación del gradiente
Forma del gradiente
Velocidad de flujo Longitud de la columna Tiempo de reequilibrio de la
columna
7
5%
Orgánico
100%
Orgánico
Comenzar con un análisis de exploración - gradiente largo
y poco profundo
8
100% B
100% B0% B
0% B
tG = 10
tG = 5
0 10 20 30 40min.
100% B
100% B
0% B
0% B
tG = 40
tG = 20
0 10
Muy pendiente
Poco profundo
9
%B
tiempo
Lineal Escalonado
Cóncavo Convexo
10
Gradiente lineal
Gradiente lineal
Gradiente lineal
11
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (min)
5%/min
1 ml/min
5%/min
2,5 ml/min
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16
4,6 x 50 mm
1. GLY-TYR
2. VAL-TYR-VAL
3. [GLU]-ß FRAGMENTO
AMILOIDE DE PROTEINA 1-16
4. [TYR8 ] BRADIQUININA
5. MET-ENK
6. LEU-ENK
7. ANGIOTENSINA II
8. KINETENSINA
9. RNASA
10. INS (EQUINO)
4,6 x 150 mm
12
3
4
5 67
8 9 10
min.
k* = 2,5 k* = 2,6
k* = 4,5
k* = 5,9
0 161284
300SB-C8, 3,5 µm Gradiente: 2-75% B en 30 min.
Fase móvil: A= 5:95, ACN:H2O, 0,1% TFA
B= 95:5, ACN:H2O, 0,085% TFA
Velocidad de flujo: 1 ml / min.
Inyección: 10 µl, 2,6 µg cada uno
Temp: 35 °C
UV: 215 nm
Separación máxima en un espacio de tiempo permitido:
Espacio de tiempo corto = columna cortay alta velocidad de flujo
Espacio de tiempo largo = columna largay velocidad de flujo normal
13
Volumen de espera = volumen desde la formación del gradiente hasta la cabeza de la columna.
Si se aumenta la concentración inicial, se reduce el tiempo de separación, pero estohace que la separación dependa más del instrumento, debido al volumen de espera y la etapa isocrática que produce antes de que se lleve a cabo el gradiente.
14
Volumen externo
a la columna
{Volumen de
espera
Fase móvil Dispositivo
de datos
Detector
Columna
Inyección de la muestra
Bomba
15
Los disolventes deben ser
puros; de otro modo, se
producirán picos fantasmas.
Hay que cerciorarse de que el
tampón es soluble en la
composición final de la fase
móvil del gradiente.
Es necesario dejar pasar un
tiempo para que la columna
se vuelva a acondicionar
entre análisis.
Picos fantasma
0% MeOH 100%
La elución de gradientes podrá no resultar indicada para:
• Aplicaciones que utilicen aditivos de fuerte retención
• Aplicaciones de parejas de iones
• Cromatografía de líquidos de fase normal con sílice pura
Análisis en blanco que produce picos
fantasmas debido a la impureza del
agua.