ENDOCRINOLOGÍA MOLECULAR

La espermatogénesis es regulada por la liberación pulsátil de GnRH desde el núcleo arcuato del hipotálamo que estimula la pituitaria anterior para liberar FSH y LH.

A nivel testicular, LH estimula las células de Leydig para producir testosterona.

La testosterona tiene efecto local sobre el intersticio y en los túbulos seminíferos que resultan en la producción y maduración de esperma.

FSH ejecuta su efecto directamente sobre las células de Sertoli que a su vez promueven y sostienen la espermatogénesis.

Tanto GnRH como la secreción de gonadotropinas puede ser modulada por la testosterona y por estradiol, actuando sobre el hipotálamo o sobre la pituitaria a través de mecanismos de regulatorios de retroalimentación.

En machos, la fuente principal de estrógenos circulantes es a través de la aromatización de andrógenos como consecuencia de la acción del complejo enzimático aromatasa (cyt P450 aro, CYP19A1), que es ampliamente expresado en tejidos como los testículos y el cerebro. Un posible blanco de las dioxinas sería esta aromatasa que podría estar inhibida a nivel genómico en células de Sertoli en testículos. Para dilucidar la posible acción de las dioxinas a este nivel, plantearía un experimento en el que se expongan este tipo de células (Sertoli) a concentraciones significativas de dioxinas. Una vez pasado el tiempo de incubación, se censaría la concentración de ARNm que codifique para la enzima, esto para saber si hubo disrupción a nivel de la transcripción. Si es significativa tal concentración (no hubo daño aparente a este nivel), se proseguiría a censar la existencia de la enzima en sí y su funcionalidad agregando su sustrato (Testosterona). Si existe la enzima pero no es funcional, podría estar formando un complejo con la dioxina inhibiendo así la interacción con testosterona.

En un posible modelo extendido, podría ocurrir que la aromatasa es funcional, sin embargo su sustrato, la testosterona, podría estar mal sintetizada de tal forma que no estuviera ejerciendo una actividad normal en la enzima. En este planteamiento la enzima afectada podría ser la 3-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa presente en células de Leydig en testículos, y no estaría realizando óptimamente la reacción enzimática de androstendiol a testosterona.

La acción de los estrógenos mediada por sus receptores específicos, ERα y ERβ, localizados en el núcleo y citoplasma, actúan como factores de transcripción nucleares uniéndose a elementos de respuesta a estrógenos dentro de genes específicos para alterar su ritmo de transcripción (mecanismo genómico); y los GPER/GPR30 (mecanismo no genómico), receptores de estrógenos en membrana acoplados a proteínas G, en los que al unirse el estradiol, activa diferentes vías estimulando la adenilato ciclasa, movilizando las reservas de calcio intracelular (CA2+) y activando las vías de señalización de las MAPK (Proteina cinasa activada por mitógeno) y PI3K (Cinasa-3 fosfoinositol). Estos receptores tienen diferentes localizaciones y expresiones a través de todo el tracto reproductivo masculino en mamíferos.

La movilización de estradiol hacía hipófisis es la principal vía inhibición en la secreción de gonadotropinas (FSH) por parte de la glándula pituitaria. La aromatización de testosterona in situ se requiere tanto a nivel hipotálamo como en pituitaria para asegurar un mecanismo de retroalimentación completo de las gonadotropinas. Los estrógenos circulantes llevan a cabo un control inhibitorio en la retroalimentación de LH tanto en nivel hipotálamo como en pituitaria. A este nivel, por tanto, es importante la expresión de los receptores de estrógenos, así como su unión a EREs en ADN para su transcripción. Y una vez más la presencia de aromatasa es importante para lograr la completa retroalimentación. En un experimento en células hipofisarias y de hipotálamo embebidas en concentraciones significativas de dioxinas, se mediría la presencia de ARNm de los ERs, la presencia de los receptores mismos y su funcionalidad o no, agregando E2, sugiriendo la unión de dioxinas a receptor si se expresa receptor pero no hay actividad genómica o no ocurre de la manera esperada.

En machos, ERα, es el principal receptor involucrado en la supresión de GnRH por estradiol.

En machos vertebrados, los niveles en plasma de LH y FSH son ampliamente regulados por GnRH y activinas como estimuladores y por esteroides e inhibinas como inhibidores. De ahí que esta vía pueda ser un blanco de disrupción del eje hipotálamo-hipófisis-gónadas.

La glándula pituitaria posee ambos tipos de receptores ER, además de AR para la regulación por retroalimentación de esteroides. Dihidroxi-testosterona (DHT) suprime LH en suero vía retroalimentación por AR (en ERKO, modelo de ratones con ERα “knockeado”). AR puede constituir otro vector de disrupción a partir de dioxinas, y su participación se podría medir en células de glándula pituitaria en un experimento similar al mencionado para los ERs y agregando DHT o testosterona en lugar de E2.

Los efectos del estradiol en la glándula pituitaria ocurren principalmente a través de mecanismos genómicos, por ejemplo aumentando los niveles de ARNm de LHβ, debido a la presencia de EREs dentro de la región promotora del gen LHβ. A este nivel, se podría sugerir una participación de las dioxinas como factores inhibidores de la transcripción de LHβ, posiblemente funcionando como ligandos inespecíficos para ER que eventualmente los llevaría a unirse a complejos inhibitorios. Aquí la intervención se mediría por ARNm de LHβ.

Aunque existe una variación muy evidente entre los sistemas de determinación del sexo en distintas especies, los análisis genéticos han revelado que procesos aparentemente diferentes son, en realidad, fundamentalmente similares uno respecto a otro en el contexto de las vías genéticas subyacentes.

Se ha visto que en la tortuga galápago de Florida (o de orejas rojas o Trachemys scripta), ciertos ligandos exógenos como las hormonas esteroides e inhibidores enzimáticos del metabolismo de esteroides pueden anular el efecto de la temperatura si se aplican durante el periodo sensitivo a temperatura (TSP). Esto es, en huevos incubados a la temperatura óptima productora de machos (MPT), 26°C tratados con estradiol (E2) o con inhibidores de la reductasa, se induce el desarrollo de ovarios, mientras en huevos incubados a temperatura óptima para producir hembras (FPT)

tratados con testosterona (T) o con inhibidor de la aromatasa (AI) se induce el desarrollo testicular. Es de resaltarse la interacción entre la temperatura y la dosis de ligandos exógenos; mientras más cerca se encuentra un huevo de la temperatura definitoria de incubación de un sexo específico, menor dosis de ligandos exógenos se van a requerir para anular el sexo. Por ejemplo, se requiere una dosis baja de estrógenos para producir crías hembras a la temperatura umbral de 29.2°C (temperatura media entre las óptimas definitorias de cada sexo, y que resulta en una proporción 50:50) comparada con la dosis que se necesita a la temperatura óptima productora de machos (26°C).

Se ha asumido así que, la cascada de señalización inducida por temperatura se superpone de alguna forma con la cascada inducida por ligandos exógenos. Se tiene así, por ejemplo, que los ovarios que se desarrollan en embriones incubados a 31°C (temperatura óptima para producir hembras) son grandes y gruesos, mientras los ovarios en embriones incubados a 26°C (temperatura óptima para producir machos) tratados con E2 exógeno son de tamaño pequeño y los oviductos no se despegan completamente de los tejidos mesonéfricos subyacentes. De manera similar, el desarrollo testicular puede ser inducido por la administración de inhibidor de aromatasa más testosterona (AI+T) en huevos incubados a 31°C, pero presentan una formación ligeramente alargada, que es una característica típica del desarrollo de ovarios a esta temperatura. Además, ambos testículos muestran vascularización acompañada de la degeneración de oviductos y la formación de túbulos testiculares. De esta manera, a grandes rasgos la morfología de la gónada parece retener su estructura característica inducida por la temperatura, mientras la diferenciación celular interna es dirigida por el ligando.

Se sabe que en mamíferos, el desarrollo de gónadas es determinado por factores genéticos, existen cambios importantes en la expresión de los genes para que la gónada sea diferenciada en testículo (Sox9, Sry) u ovario (Dax1). Paralelamente, en reptiles existen ciertos genes que dan lugar a la diferenciación gonadal, que asociados a la determinación del sexo por temperatura, existen FoxL2 y Dmrt1. La expresión de FoxL2 en el caso de tortugas de orejas rojas, da lugar a diferenciación a ovario, mientras que en ratones adultos, por ejemplo, puede reprogramar a las células y volver a un estadio de diferenciación de testículo a ovario. Además juega un papel en el aumento de la producción de E2, suprimiendo la transcripción de Sox9 al unirse a la región reguladora de este gen y silenciando a otro gen de desarrollo testicular; Dmrt1. Éste último, es un factor en la determinación testicular en cromosomas sexuales, conocido en mamíferos y en pollo, muy conservado entre especies. La baja de Dmrt1 en pollo lleva a gónadas masculinas genéticamente a la feminización, apareciendo histología ovárica y regulación a la alta de marcadores de ovario; aromatasa y FoxL2. En mamíferos Dmrt1 no se expresa hasta que no se encuentra Sox9 que se expresa en la determinación testicular.

En tortugas se ha propuesto un modelo donde los genes determinantes del sexo FoxL2 y Dmrt1 son potencialmente los factores genéticos río arriba que subyacen al mecanismo. FoxL2 activa directamente la expresión de la aromatasa y suprime la expresión de Dmrt1 y Sox9 a FPT. Por otro lado, a MPT, Dmrt1 suprime la expresión de FoxL2, llevando a la activación de Sox9 por diferenciación testicular. El nivel de la expresión de aromatasa balancea el nivel de las hormonas

sexuales en la gónada, que a su vez interactúan con los genes de determinación sexual. Sin embargo, aún queda por confirmar este modelo.

Se han realizado estudios en líneas celulares GC-1 de espermatogonias de ratones que han mostrado que el estradiol activa rápidamente la vía de EGFR/ERK/fos/ciclinaD1 a través de un entrecruzamiento funcional entre los receptores acoplados a proteínas G; GPER y el receptor de estrógenos; ERα, responsable de la proliferación celular. A la inversa, la vía de activación rápida mediada por estradiol en ERα y/o GPER/EGFR/ERK/c-jun en cultivos primarios de espermatocitos en paquiteno (PS) de rata y en células GC-2, línea celular derivada de espermatocitos en paquiteno de ratón, induce un mecanismo apoptótico. En particular, en células PS la activación de GPER se relaciona con la reducción de la expresión de ciclina A1 y B1 a la vez que un incremento en la expresión de la proteína bax (pro-apoptótica), mientras en células GC-2, la señalización de GPER se asocia con la fosforilación de todos los miembros de la familia de las MAPK iniciando la vía intrínseca de apoptosis.

El mecanismo de entrecruzamiento se explicaría a partir de la interacción de GPER en membrana plasmática, retículo endoplásmico o vesícula endocítica con estradiol, llevando a la separación de subunidades β y γ que activaran a c-Src para liberar la Metaloproteinasa de matriz (MMP) de la membrana y pueda realizar proteólisis en péptido de superficie creando molécula bioactiva. De esta manera se va a liberar HB-EGF que se va a unir al receptor de factor de crecimiento epidermal (EGFR) activando así una de las vías de cinasas de tirosinas; SHC/GRB2/SOS va a activar GTPasas pequeñas Ras, Raf y vía de las MAPK cinasas mediante MEK1/2, ERK1/2, que en último término van a activar factores de transcripción y respuestas génicas dependientes del fenotipo celular y el ligando. Así se tienen tres vías de señalización entrecruzadas: la vía de esteroides clásica, vía de proteínas G y vía de RTKs.

Para comprobar la existencia del entrecruzamiento entre vías, se podría experimentar en alguna de las líneas celulares mencionadas, por ejemplo GC-1, cuantificando, por Western blot, la cantidad de HB-EGF unido a EGFR en un contexto donde se agreguen determinadas concentraciones de estradiol para activar la vía GPER, se determina por marcación del estradiol, la cantidad del mismo unido a GPER, a la vez que se inhiban con algún antagonista los receptores de estrógenos para suprimir en la medida de lo posible la vía genómica. Así se podría comparar la cantidad de HB-EGF unido a EGFR (unión resultado de la acción de vía GPER) con estradiol marcado unido a GPER (activación no genómica de E2, proporcionalmente respecto a la respuesta de ciclinaD1 hacia proliferación y determinar si existe una relación significativa entre Los resultados. De esta manera se determinaría si existe la interacción entre las distintas vías.

Fig.1 Entrecruzamiento de vías de estrógenos, receptores asociados a proteínas G y RTKs.

REFERENCIAS

Chimento A, Sirianni R, Casaburi I, Pezzi V. (2014) Role of estrogen receptors and G protein-coupled estrogen receptor in regulation of hypothalamus–pituitary–testis axis and spermatogenesis. Frontiers in endocrinology. 16;5:1.

Matsumoto Y, Crews D. (2012) Molecular mechanisms of temperature-dependent sex determination in the context of ecological developmental biology. Molecular and cellular endocrinology. 354(1-2):103-10.

http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=Estrogen_Pathway

http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=EGF_Pathway