Rev. Proteccin Veg. Vol. 22 No. 1 (2010): 34-43

INTRODUCCIN

El desarrollo de la agricultura moderna se debe engran parte, a la aparicin y uso de plaguicidas sintti-cos para reducir las prdidas que las plagas causan alos cultivos. Desde los aos 50 a los 90, se produjo laexpansin de los productos fitosanitarios de sntesis(clorados, carbamatos, fosforados y otros) con accinsobre las principales entidades que resultaban perju-diciales al agricultor: insecticidas, acaricidas,fungicidas, bactericidas, herbicidas, entre otros. Sinembargo, a largo plazo, su uso ininterrumpido y masi-vo ha producido graves problemas: aparicin de re-sistencia, presencia de residuos en las cosechas,

contaminacin del medio ambiente y ruptura de equi-librios naturales. Las plagas continan evolucionan-do, convirtindose en resistentes a los plaguicidasdisponibles, por lo que existe una necesidad constan-te de desarrollo de nuevos productos para la protec-cin de plantas (1).

En la bsqueda de soluciones alternativas a estosproblemas en los ltimos aos ha resurgido el intersen las plantas y su quimio-biodiversidad como ricafuente de productos bioactivos para el desarrollo denuevos productos fitosanitarios. Las molculas debenconjugar una mayor selectividad hacia las plagas, ac-tividad contra las que han desarrollado resistencia

Artculo resea

ENSAYO DE Artemia: TIL HERRAMIENTA DE TRABAJO PARAECOTOXICLOGOS Y QUMICOS DE PRODUCTOS NATURALES

Oriela Pino Prez, Fanny Jorge Lazo

Grupo de Plagas Agrcolas, Direccin de Proteccin de Plantas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria(CENSA). Carretera Jamaica y Autopista Nacional, Apartado 10, San Jos de las Lajas,

La Habana, Cuba. Correo electrnico: oriela@censa.edu.cu

RESUMEN: Este artculo pretende divulgar entre los investigadores de nuestro pas las nocionesfundamentales relacionadas con el bioensayo de artemia (Artemia spp.). Se recogen los aspectos biolgicosgenerales de este organismo, las distintas variantes experimentales del ensayo y sus posibles aplicaciones,as como las ventajas y desventajas de esta prueba. Se exponen ejemplos de los avances logrados con suutilizacin, promoviendo su uso entre ecotoxiclogos y qumicos de productos naturales,fundamentalmente en el campo del descubrimiento y desarrollo de nuevos plaguicidas de origen natural.

(Palabras clave: Artemia; bioensayo; productos naturales)

Artemia BIOASSAY: USEFUL WORKING TOOL FOR ECOTOXICOLOGISTS ANDCHEMISTS OF NATURAL PRODUCTS

ABSTRACT: This paper is aimed at divulging the fundamental notions related to the brine shrimp(Artemia spp.) bioassay among the researchers of our country. General biological characteristics of thisorganism, different experimental variants of the bioassay and their applications, as well as theiradvantages and disadvantages are summarized. Several examples about the advances achieved withthe application of this bioassay are included promoting its use by ecolotoxicologists and specialists ofnatural products, mainly those concerned with the discovery and development of new natural pesticides.

(Key words: Artemia; brine shrimp; bioassay; natural products)

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(nuevos modos de accin) y menor impacto sobre losecosistemas. Universidades, institutos de investiga-cin y compaas de agroqumicos estn prestandoespecial importancia al estudio de productos natura-les, en respuesta al creciente inters en el descubri-miento de nuevos productos para el desarrollo de unaagricultura sostenible y amigable con el medio am-biente (2).

La necesidad de sustituir los mtodos de luchacontra plagas basados en los plaguicidas convencio-nales, parece evidente por motivos medioambientalesy esta necesidad de cambio est determinando la in-vestigacin actual en el campo agroqumico. Ademsde los aspectos medioambientales, otros factores fa-vorecen el retorno al estudio de fuentes naturalescomo origen de nuevos plaguicidas. Entre ellos figurael gran desarrollo actual de las tcnicas de aislamien-to y determinacin de estructuras qumicas, pues tra-bajos que hace aos hubieran requerido mucho tiem-po, hoy en da se puedan realizar con rapidez.

La otra tecnologa de vital importancia para el des-cubrimiento y desarrollo de nuevos productos de ori-gen natural son los ensayos biolgicos (3). En la lti-ma dcada, se han incorporado algunos ensayos degran utilidad y eficacia que requieren pequeas can-tidades de muestras y permiten la evaluacin rpidade extractos crudos y fracciones, conduciendo conseguridad a los principios activos y descartando todolo que no sea de inters. Hay que indicar claramentela diferencia entre un estudio de productos naturalesconvencional, cuyo objetivo es el conocimiento de loscomponentes qumicos de una planta, y la bsquedade nuevos productos bioactivos que depende siem-pre de los ensayos biolgicos que guan el fracciona-miento y el aislamiento final (3, 4, 5). En muchas oca-siones, el factor clave que ha impedido el descubri-miento rpido de nuevos constituyentes bioactivos hasido el uso insuficiente e inadecuado de la tecnologadel bioensayo (3, 4).

En los ltimos aos, el objetivo de muchos labora-torios relacionados con el estudio de productos natu-rales ha sido desarrollar y utilizar nuevos procedimien-tos de bioensayos; tratando de fomentar mtodosbaratos y fciles de utilizar, sin la necesidad de co-operacin de otros grupos de investigacin (3, 4, 6,7). Cada investigador realiza sus propios bioensayosde manera rpida, reproducible y obtiene resultadosconfiables estadsticamente. De esta manera, sondetectados y aislados con rapidez compuestosbioactivos novedosos a travs del cribado y fraccio-namiento biodirigido de los extractos vegetales. Elobjetivo principal de la investigacin no es solamente

aislar molculas con estructuras novedosas, sino ais-lar nuevos compuestos bioactivos que tengan aplica-ciones potenciales o puedan servir como compues-tos guas para las modificaciones sintticas (3, 8).

Un lugar sobresaliente dentro del grupo debioensayos ms utilizados lo ocupa el ensayo deArtemia spp. Este es un ensayo general de ampliouso que determina el efecto letal de los materiales enlarvas de Artemia spp., y de esta manera se predicesu habilidad para producir la muerte de clulas can-cergenas en cultivo de tejidos, matar insectos y/o ejer-cer un amplio rango de efectos farmacolgicos (3, 4,5). Este artculo resea pretende divulgar entre losinvestigadores de nuestro pas, los aspectos funda-mentales relacionados con el desarrollo histrico deeste ensayo, sus distintas variantes experimentalesy posibles aplicaciones, promoviendo su uso entreecotoxiclogos y qumicos de productos naturales.

PARTE ESPECIAL

Aspectos biolgicos generales y significadoprctico

Artemia spp. son camarones minsculos de cuer-po blando, de color carmelita y transparentes a la luz;pertenecen al Phylum Arthropoda, clase Crustaceae,subclase Branchiopoda. Se conocen comnmente porel nombre de artemia, tambin llamados monos demar o brine shrimp en ingls (9). El gnero Artemiaest compuesto por varias especies, de las cuales sehan identificado al menos cinco especies bisexualesy varias poblaciones partenogenticas, entre ellasArtemia salina Leach, Artemia persimilis Piccinelli yProsdocimi, Artemia franciscana Kellogg (bisexuales)y Artemia partenogenetica Bowen y Sterling (10, 11).

Estas especies se encuentran distribuidas en todoel mundo en aguas de elevada salinidad, pueden cre-cer a temperaturas entre 6 y 35C. Se alimentan dealgas y bacterias y son fuente de alimento para pe-ces, pjaros y varios invertebrados. Las hembras pro-ducen huevos que, en condiciones externas favora-bles, eclosionan produciendo larvas de un tamaoaproximado de 1 mm. Los huevos tambin puedenformar quistes y permanecer en esta forma por unao o ms. Las artemias se convierten en adultostranscurridas 6 a 8 semanas, alcanzando un tamaopromedio de 7mm.

Artemia es hasta la fecha el nico gnero animalen todo el mundo cuyo estado criptobitico (quistes)est disponible comercialmente de manera continua,como fuente de alimentos para peces y crustceosen acuicultura. Esto ha constituido un elemento clave

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en su utilizacin en ensayos biolgicos (12). Por ra-zones prcticas, las especies con un estadocriptobitico, durante su ciclo de vida son ms ade-cuadas para el desarrollo de un bioensayo estndar.La disponibilidad permanente de huevos (quistes) apartir de los cuales pueden ser obtenidas las larvasofrece las siguientes ventajas:

- no hay necesidad de mantener una colonia viva per-manentemente,

- las pruebas pueden realizarse dnde y cundo seanecesario,

- se dispone siempre de un nmero suficiente de indi-viduos de la misma edad y condicin fisiolgica.

Aplicaciones y comparacin con otros ensayosbiolgicos

Las larvas de Artemia spp. se han utilizado por msde 40 aos en estudios toxicolgicos yecotoxicolgicos (7, 12) y se ha estudiado su biologay usos potenciales en diversos campos como un m-todo prctico y econmico para la determinacin debioactividad de compuestos sintticos y productosnaturales (3, 13, 14, 15, 16, 17).

Prueba ecotoxicolgica para el ambiente marino

Para la proteccin del ambiente marino, son ne-cesarios mtodos de ensayos ecotoxicolgicos sim-ples y confiables para determinar el impacto poten-cial sobre la biota marina de sustancias xenobiticas(7). Adems, la implementacin correcta de medidasregulatorias, tanto en el mbito nacional como inter-nacional, requiere que los mtodos toxicolgicos usa-dos sean confiables y reproducibles (12, 18).

En 1984, Vanhaecke et al. (12) del Centro de Re-ferencia de artemia en Blgica, despus de un estu-dio extensivo de la literatura cientfica relacionada conel uso de este organismo en investigaciones sobre lacontaminacin ambiental, desarrollaron un ensayoestndar de toxicidad aguda (a corto plazo), conocidocomo ARC-TEST o ensayo del Centro de Referenciade Artemia. Este ensayo est basado en la determi-nacin de la LC50 a las 24 horas de las larvas (instaresII-III) de una cepa especfica de Artemia sp. El proce-dimiento fue sometido a un estudio colaborativo queinvolucr centros de investigacin en Europa y Am-rica para determinar el grado de estandarizacin delprotocolo experimental propuesto. Al comparar losresultados de este estudio con los obtenidos utilizan-do los organismos diana de uso comn en pruebastoxicolgicas, se determin que la repetibilidad yreproducibilidad son al menos iguales que las de unaprueba a corto plazo usando Daphnia spp. y aproxi-

madas en algunos casos a los valores obtenidos utili-zando Brachydanio spp. Aunque la prueba de artemiafue nueva para las dos terceras partes de los 70 labo-ratorios participantes, todos reconocieron que estarequiere poca experiencia y no consume mucho tiem-po, aunque la sensibilidad del ensayo fue relativamen-te baja, resultado que relacionan con la cepa y loscompuestos de referencia utilizados en este estudio.Los autores concluyeron que este bioensayo es unvalioso instrumento como prueba en una primera eva-luacin para categorizar la toxicidad de productosqumicos y como prueba de referencia para el am-biente marino.

Evaluacin biolgica de productos naturales: extrac-tos crudos, fracciones y compuestos puros

Artemia es tambin til para predecir actividadesplaguicidas y farmacolgicas, responde a un ampliorango de compuestos qumica y farmacol-gicamentediversos; es por ello que resulta tan importante suaplicacin en programas de descubrimiento y desa-rrollo de nuevos plaguicidas y medicamentos de ori-gen natural (3, 4, 5, 19, 20). Adems, el ensayo per-mite la evaluacin rpida de las relaciones estructu-ra-actividad y son fcilmente observables lasinteracciones entre compuestos (21).

En 1982, Meyer et al. (13), fueron los primerosen introducir el uso de las larvas de Artemia spp. ensustitucin de animales superiores en la evaluacinde extractos vegetales para el descubrimiento decompuestos con actividad antitumoral y citotxica.Este ensayo se utiliza para la pre-evaluacin de ex-tractos vegetales en el descubrimiento de compues-tos antitumorales (17). Inicialmente, se determin queexiste una correlacin positiva entre la mortalidadde las larvas de artemia y la citotoxicidad frente alas clulas 9KB (carcinoma nasofarngeo humano) yla lnea celular 3PS(P388) (leucemia in vivo) (3). Engeneral, los valores de ED50 para las citotoxicidadesson aproximadamente una dcima parte de los va-lores de LC50 encontrados en los ensayos conArtemia spp. En el Laboratorio de Cultivo de Tejidosdel Pardue Cancer Center se utiliz el ensayo deartemia para la evaluacin inicial de seis lneas ce-lulares de tumores humanos. De este modo, es po-sible detectar y entonces monitorear el fracciona-miento de extractos con actividad citotxica, utilizan-do el ensayo de mortalidad de larvas ms que otrosensayos antitumorales in vivo o in vitro que resultanms tediosos y costosos. En este centro se han des-cubierto hasta el momento ms de 300 compuestosantitumorales y plaguicidas utilizando este bioensayoen la pre-evaluacin (1).

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La actividad detectada a travs del ensayo deartemia es un indicador de la toxicidad frente a pla-gas de insectos. Mawardi et al. (19) comprobaron lacorrespondencia entre el efecto frente a las larvas deartemia del extracto crudo de Glycosmis pentaphylla(Retz.) Correa y un alcaloide activo aislado como re-sultado de su fraccionamiento biodirigido, y la activi-dad inhibidora del crecimiento de ambas sustanciasfrente a la mosca de la fruta (Drosophila melanogasterMeigen). Otros investigadores, encontraron corres-pondencia entre los altos niveles de actividad frente aartemia de coumarinas y cromonas presentes en unextracto de Flourensia thurifera (Mol.) D.C. y la activi-dad antialimentaria del mismo frente a Spodopteralittoralis Boisduval (22).

El ensayo de artemia result preponderante en eldescubrimiento de una nueva clase de compuestosconocidos como acetogeninas, reconocidas por susefectos biolgicos diversos (23). En los aos 80, in-vestigaciones detalladas condujeron al aislamiento deun nmero elevado de estos derivados de cidosgrasos de cadena larga, con actividad insecticida.Estas sustancias son venenos estomacales de ac-cin lenta, particularmente efectivos frente a insectostales como lepidpteros y Leptinotarsa decemlineataSay (23, 24). Leatemia e Isman (25, 26) demostraronrecientemente que extractos etanlicos y acuosos desemillas de Annona squamosa L. son efectivos frentea Plutella xylostella L. Un buen nmero de estos com-puestos, tales como asimacina y annonacina, quedemostraron una actividad citotxica potente en elensayo de artemia (valores de LC50 entre 0,002 y 33mg. mL-1) poseen un futuro comercial muy promisoriocomo plaguicidas. Existen patentes obtenidas por in-vestigadores estadounidenses sobre insecticidas ba-sados en acetogeninas provenientes de Asiminatriloba Dunal (27) y otra patente similar obtenida porBayer AG (Alemania) basada tambin en este tipo decompuestos pero a partir de otras especies vegetalespertenecientes al gnero Annona (28). McLaughlin etal. (29) han aislado cientos de acetogeninas a partirde las Anonceas, y muchas de ellas poseen poten-cial no solo como plaguicidas sino tambin como agen-tes anticancergenos.

Otra aplicacin potencial del ensayo de artemia,se relaciona con las ventajas especiales que ofrecenlos bioensayos en la estandarizacin y control de lacalidad de productos botnicos heterogneos (3).Tales productos pueden ser heterogneos debido ala presencia de mezclas de compuestos bioactivosprovenientes de la misma fuente botnica o puedenser mezclas preparadas a propsito. La respuestabiolgica deseada con frecuencia no se debe a un

solo compuesto activo sino a una mezcla de ellos, ylas proporciones relativas de los compuestosbioactivos individuales pueden variar de un lote a otromientras que la actividad biolgica permanece dentrode los lmites tolerables. Por lo tanto, el anlisis fsicoo qumico de un componente individual en tales mez-clas no es completamente satisfactorio. Para lograrla estandarizacin y control de la calidad de las mate-rias primas, procesos y productos deben emplearsede forma armonizada los ensayos biolgicos y losmtodos fsico-analticos, tales como cromatografa,para lograr la sensibilidad requerida frente a las com-plejidades qumicas encontradas en los productosnaturales. La estandarizacin de los productos, em-pleando este anlisis integral qumico y biolgico delos componentes bioactivos, contribuir a una acep-tacin ms generalizada de los productos botnicosheterogneos y generar beneficios pues resultar enla confianza del consumidor.

Comparacin del ensayo de artemia con otros ensa-yos biolgicos utilizados en la investigacin y desa-rrollo de productos naturales bioactivos

En general, todos los sistemas de ensayos biol-gicos usados en la investigacin de nuevosagroqumicos a partir de productos naturales poseenaspectos positivos y negativos. Cada equipo de in-vestigacin debe realizar la seleccin de cul o cu-les utilizar en correspondencia con los objetivos pro-pios de cada proyecto de investigacin, nmero demuestras a evaluar y cantidad disponible de cada unade ellas, infraestructura y recursos existentes, prepa-racin tcnica del personal requerida, entre otros.

En los ltimos aos se ha incrementado el uso debioensayos muy especficos, computarizados, in vitrobasados en los mecanismos de accin. Estosbioensayos simulan los efectos de algunos compues-tos previamente conocidos que poseen un mecanis-mo de accin especfico. Muchas compaas qumi-cas multinacionales utilizan una batera de bioensayosin vitro o incluso pruebas biolgicas sin clulas, quese centran en la actividad sobre enzimas especficas,receptores o rutas bioqumicas. Mientras que talespruebas biolgicas requieren cantidades bajas de ma-terial y se logran altos rendimiento de procesamientothroughput, no existe una correspondencia confiablecon la eficacia bajo condiciones reales (en campo).Por otro lado, los investigadores deben ser muy cui-dadosos con los ensayos biolgicos basados en me-canismo de accin, pues deben asegurar que el al-cance de estos sea lo suficientemente amplio paraincluir mecanismos desconocidos y diversos, as comonuevas entidades qumicas. Adems, en estos

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bioensayos especficos los extractos deben ser anali-zados muchas veces antes de detectar actividades.Es ms recomendable realizar una preevaluacin uti-lizando ensayos generales, desechar los negativos, yutilizar los ensayos especficos con los activos.

Si se trata de ensayos in vivo y el propsito de lainvestigacin es descubrir nuevos plaguicidas, hahabido mucha discusin en cuanto al organismo msapropiado para el bioensayo. Algunos investigadoreshan utilizado las larvas de mosquito (generalmenteAedes aegypti L.) como organismo de prueba (3). Siel propsito de la investigacin es el desarrollo de unproducto contra el mosquito, el mrito de esta pruebabiolgica es obvio. Por otra parte, Isman et al. (30)plantean que si el propsito del estudio es descubrirun insecticida de amplio espectro, o al menos un pro-ducto eficaz contra insectos fitfagos, entonces laslarvas de mosquito son probablemente un mal indica-dor pues los extractos de plantas y los productos na-turales que son altamente activos contra las larvas demosquito a menudo muestran una actividad dbil, sila hay, contra los insectos fitfagos.

Isman et al. (30) en un programa de investigacin,dirigido al descubrimiento y desarrollo de insecticidasbotnicos, utilizaron rutinariamente dos especies deorugas noctuidas para el estudio de extractos crudosde plantas, su fraccionamiento biodirigido y el aisla-miento de los compuestos activos. Estas sonSpodoptera litura (Fabricius) y Peridroma saucia(Hubner); ambos insectos son altamente polfagos deplantas cultivables. Sin embargo, es muy posible ob-viar compuestos activos al utilizar solo los noctuidos;por ejemplo, los gingkolidos, sesquiterpenos delGingko biloba L., son insecticidas potentes contraNilaparvata lugens (Stal), aunque son inactivos con-tra S. litura (3).

Desventajas comunes a estos ensayos in vivo, in-dependientemente de la diana, son la necesidad demantener una colonia del organismo, se pueden pro-bar cantidades limitadas de muestras al mismo tiem-po, la obtencin de los resultados toma varios das, yen ocasiones no es posible discriminar si la inhibicindel crecimiento se presenta por alteracin del com-portamiento (efecto antialimentario) o por efecto fisio-lgico post-ingestin.

Los sistemas de ensayos biolgicos simples, sonde gran importancia para identificar los principios ac-tivos; la prueba de Artemia spp. es una prueba biol-gica general, particularmente til con este propsito.Un bioensayo general debe ser sensible a un ampliorango de actividades ms que estar dirigido a un sis-

tema particular de compuestos o de reacciones (20,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). La respuesta biolgicadebe ser lo suficientemente amplia como para incluirdiferentes y nuevos mecanismos de accin y estruc-turas qumicas novedosas. La utilidad del ensayo deartemia como un bioensayo general, indicador de va-rios tipos de actividades, se ha validado por el descu-brimiento de centenares de compuestos activos (35,39, 40).

La eficiencia del mtodo para predecir actividadesplaguicidas y farmacolgicas es reconocida, no obs-tante se debe prestar especial atencin a dos aspec-tos al estandarizar este bioensayo: sensibilidad de laespecie utilizada y correspondencia entre la actividadfrente a artemia y la actividad biolgica de inters.Var et al. (11) plantearon que la existencia de dife-rencias en la biologa y fisiologa entre especies ycepas del gnero Artemia puede provocar variacio-nes en las sensibilidades de las distintas formas a losmismos compuestos. Estas observaciones alertansobre el uso indiscriminado de cualquier fuente deArtemia spp., e indican la importancia de reoptimizarel bioensayo general para cada nueva especie y/ocepa usando compuestos de referencia para estable-cer el grado de sensibilidad de la cepa empleada.Tambin, debe corroborarse en cada caso la corres-pondencia entre la actividad frente a este organismoy la actividad plaguicida de inters, pues existen au-tores que sugieren que la ausencia en A. salina deestructuras desarrolladas como receptores puedegenerar la posibilidad de obtener falsos resultadosnegativos (10).

El ensayo de Artemia spp. tiene las ventajas deser ms rpido (24 horas), barato y sencillo (no serequieren tcnicas aspticas). Se pueden utilizar f-cilmente un gran nmero de organismos para la vali-dacin estadstica, no necesita equipamiento espe-cial y se emplean pequeas cantidades de muestras(2-20mg o menos). Adems, no se requiere sueroanimal que si es necesario para las citotoxicidades.Este sistema de bioensayo puede ser utilizado fcil-mente por farmaclogos y qumicos de productosnaturales; cada tcnico de laboratorio conduce suspropias pruebas biolgicas, y obtiene de una manerarpida y reproducible los resultados estadsticosconfiables del bioensayo. De esta manera, los com-puestos bioactivos novedosos se pueden detectar yaislar rpidamente mediante un fraccionamientobiodirigido de los extractos de las plantas. Por ltimo,los defensores de los derechos de los animales nohan objetado el uso de estos invertebrados para eltrabajo experimental (3).

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Variantes experimentales del ensayo de Artemiaspp.

Segn Vanhaecke y Persoone (12) los aspectosque deben ser considerados para desarrollar una prue-ba de Artemia spp. estndar son los siguientes:

- utilizar los estadios larvales tempranos para prue-bas de toxicidad aguda,

- los huevos tienen que eclosionar bajo condicionesestrictamente controladas de temperatura, salinidad,aireacin, luz y pH,

- las larvas tienen que ser exactamente de la mismaedad al inicio de cada prueba,

- durante la prueba, la larva no debe transformarseen otro estadio con una sensibilidad diferente,

- las pruebas deben realizarse con quistes del mismoorigen geogrfico,

- las condiciones experimentales de la prueba tienenque ser definidas con gran exactitud,

- realizar una prueba control en paralelo con un qu-mico de referencia.

Existen diferentes variantes experimentales delprocedimiento cuyas principales caractersticas sepresentan a continuacin.

Ensayo del Centro de Referencia de Artemia

Alcance y campo de aplicacin

Este mtodo estndar se desarroll en el Labora-torio de Maricultura del Centro de Referencia deArtemia, Universidad Estatal de Ghent, Blgica; conel objetivo de determinar la toxicidad aguda en larvasde Artemia spp. de: sustancias qumicas y afluentesindustriales y domsticos considerados por su verti-miento en el ambiente marino (12).

Principio

Se basa en la determinacin de la concentracinque causa la muerte 50% de las larvas de artemia en24 horas bajo las condiciones descritas por este pro-cedimiento. Esta concentracin es conocida como LC50.

Ensayo de toxicidad general

La prueba se realiza en pequeas placas Petride vidrio de 5 cm de dimetro. Se transfieren diezlarvas con una pipeta Pasteur a cada placa Petri. Elvolumen de agua de mar que se toma con las larvasno debe exceder 0,05mL. Posteriormente 10 mL delas concentraciones respectivas del compuesto txi-co (ya aclimatado a 25C) se aaden a las placas,

que son incubadas en la oscuridad a una tempera-tura de 251C.

Se desarrolla una prueba preliminar para determi-nar el rango crtico (una placa Petri por concentraciny una como control). Para ello se prepara una seriede diluciones del txico con agua de mar artificial. Parasustancias qumicas: 10 000; 1 000; 100; 10; 0,1; 0,01mg.L-1 y para afluentes: 1 000 000; 100 000; 10 000;1 000; 10 mg.L-1.

Despus de 24 horas, se determina el nmero delarvas muertas en cada placa Petri. La larva es consi-derada muerta si no se observa movimiento de losapndices durante 10 segundos. Inmediatamentedespus del conteo, se mide la concentracin de ox-geno en la placa Petri con la menor concentracin decompuesto txico que induce un 100% de mortalidad.

Bioensayo general para productos naturales con acti-vidad biolgica

Alcance y campo de aplicacin

Esta variante la desarrollaron en 1982, Meyer etal. (13) y ha sido mejorada desde entonces por dife-rentes investigadores. Aqu se presenta la versin pu-blicada en 1998 por McLaughlin et al. (3). El ensayopermite la evaluacin rpida y conveniente de extrac-tos crudos, fracciones y compuestos puros; y ade-ms comparar varias partes de la planta y establecervariaciones estacionales en plantas individuales. Tam-bin puede ser utilizado para establecer la actividadbiolgica de compuestos sintticos.

Principio

Se basa en la determinacin de la mortalidad invivo de un organismo zoolgico simple, las larvas deArtemia spp. en 24 horas a dosis iguales o menoresde 1000 mg.mL-1 (3, 13).

Ensayo de toxicidad general

Los extractos crudos, fracciones o compuestospuros de origen natural son evaluados a concentracio-nes iniciales de 10, 100 y 1000 mg.mL-1 en viales quecontienen 5mL de solucin salina y 10 larvas, cada unoes considerado una rplica (tres por concentracin).Despus de 24 horas, se cuenta el nmero de larvasmuertas. La muerte de las larvas se establece por lafalta total de movimientos durante 10 segundos de ob-servacin bajo el estreo microscopio (11, 12). Los va-lores de LC50 e intervalos de confianza 95%, se calcu-lan usando el mtodo anlisis estadstico Probit, pro-grama Polo (LeOra Software, Berkeley, California) (41).La LC50 se define como la concentracin de un mate-rial txico letal al 50% de los organismos de la prueba.

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Ensayo de la movilidad ptica de las larvas deArtemia spp.

Usualmente, un parmetro conveniente para ex-presar la toxicidad es la LC50, pero sus valores noconsideran los efectos que son menos severos queaquellos que resultan en la muerte y que sin embar-go, constituyen un signo de toxicidad (4). Un nuevomtodo ptico que mide la movilidad de las larvas deartemia se desarroll con el objetivo de obtener re-sultados ms exactos y definidos biolgicamente. En1985, Schmidt (9) determin la inhibicin de lamotilidad de las larvas en lugar de su letalidad. Laactividad de los animales se mide utilizando un con-tador ptico de motilidad. Esta se calcul consideran-do el nmero de interrupciones del haz de luz en10seg. El procedimiento es ms fcil y menos tedio-so que contar con un estreo microscopio. Puedenser detectados an pequeos daos en las larvas yesto es una mejora significativa en comparacin conotras variantes del mtodo y permite la deteccin depequeas cantidades de toxinas. La desventaja prin-cipal relacionada con esta variante experimental, esque exige la disponibilidad de un contador y por esarazn su uso es menos frecuente.

Las dos primeras variantes experimentales des-critas se diferencian fundamentalmente en las con-centraciones de las muestras que se sugieren para eltrabajo, lo que se encuentra condicionado a la inter-pretacin final de los resultados. Como ensayo paraestablecer las propiedades txicas de algunas sus-tancias es conveniente determinar la cantidad mni-ma de cada sustancia que representar un peligro parael medio ambiente y el hombre y por tanto, se ajustael rango de concentraciones en cada caso hacindo-se lo ms estrecho posible. Para productos natura-les, sin embargo, es ms eficaz evaluar las muestrasen un rango que garantice que los compuestos selec-cionados posean el potencial para el desarrollo futurode un medicamento o un plaguicida y no se inviertanrecursos y tiempo en la investigacin de compuestosno promisorios.

A partir de estos protocolos de referencia han tra-bajado numerosos investigadores introduciendo pe-queas variaciones encaminadas fundamentalmentea reducir el volumen de muestra necesario, aspectoeste de vital importancia, sobretodo en las ltimas eta-pas de purificacin y aislamiento de los compuestos.Por ejemplo, en lugar de viales o placas Petri han sidoutilizadas placas de 24 96 pocillos, que requierenmenor cantidad de muestra para realizar los estudiosbiolgicos. Estas placas, adems, proporcionan laposibilidad de evaluar simultneamente un mayor

nmero de muestras y diluciones (8, 10, 21, 42). Otrosautores han utilizado discos de papel de filtro sobre elcual se absorbe la muestra y esto contribuye a que lasolucin de las larvas de artemia se encuentre mslimpia de contaminantes y los compuestos a evaluarentren en contacto ms eficientemente con los orga-nismos (43).

Potencialidades de uso del ensayo de artemia enla bioprospeccin de la flora cubana como fuentede plaguicidas

Para desarrollar plaguicidas fitoqumicosambientalmente benignos, se deber dar un nfasisapropiado a la conservacin y estudio de labiodiversidad, an inexplorada en relacin con suspropiedades plaguicidas. Al afrontar estos estudios laqumica de productos naturales deber, para lograraplicacin prctica, combinar el uso de tcnicas deseparacin, mtodos de elucidacin estructural y prue-bas biolgicas simples, enfoque investigativo que fa-cilita el descubrimiento y desarrollo de nuevos pro-ductos bioactivos de origen natural.

Debido a la diversidad de la flora tropical, existe lanecesidad de realizar evaluaciones masivas de ex-tractos vegetales para determinar la presencia de com-puestos bioactivos pues productos naturales poten-cialmente activos permanecen sin descubrir, sin in-vestigar, sin desarrollar y/o sin utilizar en este grandepsito de material vegetal. La flora cubana poseeenormes potencialidades como fuente de productosactivos de origen natural; sin embargo, estas solo hansido explotadas muy someramente. Nuestro pas esconsiderado como uno de los de mayor biodiversidadbotnica en el mundo, en lo que se refiere al nmerototal de especies, y tiene la biodiversidad florstica msrica de todas las islas en el continente americano y elCaribe insular. Se informan alrededor de 6 700 espe-cies de plantas superiores (agrupadas en 1300 gne-ros y 101 familias), aproximadamente el 50% de laflora terrestre conocida es endmica y la mayor partede nuestras especies no han sido investigadas a pro-fundidad (44).

Existe informacin relacionada con la actividad bio-lgica de muchas de estas plantas y su uso popularcomo medicamentos y plaguicidas naturales, pero loscompuestos activos no se han estudiado en la mayo-ra de los casos (8). El trabajo realizado en el rea deldescubrimiento y desarrollo de sustancias con activi-dad plaguicida es an ms reducido (45). Si bien escierto, que el campesinado cubano ha hecho usoemprico de las propiedades de las plantas para pro-teger sus cultivos de las plagas, no existe un estudiocientfico sistemtico y riguroso que sustente o res-

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palde este conocimiento tradicional, y mucho menosque abarque un grupo numeroso de especies vege-tales que no han sido estudiadas como plaguicidaspotenciales. Las investigaciones encaminadas al ais-lamiento y caracterizacin de los compuestos respon-sables de la actividad plaguicida son tambin muyescasas (21).

Pino et al. (8) realizaron la evaluacin biolgicafrente a A. salina de 123 extractos obtenidos a partirde plantas de las familias Anacardiaceae, Asteraceae,Clusiaceae, Myrtaceae y Poaceae. Este trabajo es elprimero desarrollado en Cuba en el cual la investiga-cin de nuevas fuentes de plaguicidas potenciales serealiza utilizando el fraccionamiento dirigido por elensayo de artemia. Los resultados de este estudioqumico y biolgico de varias especies de la flora cu-bana, la mitad de ellas endmicas y algunas de ellasinvestigadas por primera vez, representan un aporteal conocimiento de nuestra biodiversidad botnicavalorando sus potencialidades como fuentes deplaguicidas. Desde el punto de vista social y econ-mico la identificacin de compuestos activos comocandidatos potenciales para el desarrollo de nuevosproductos fitosanitarios brinda nuevas alternativas,eficaces y ambientalmente seguras, para nuestraagricultura en el campo de la Proteccin de Plantas.

La extensin del uso de este ensayo general alestudio de nuestra biodiversidad, como fuente de com-puestos activos, simplificara y aumentara las posibi-lidades de evaluacin biolgica incrementando el co-nocimiento en general sobre nuestros recursos natu-rales y consecuentemente su uso sostenible. Las ven-tajas del uso de un ensayo general como este, po-drn ser aprovechadas adems para la evaluacinbiolgica de compuestos de origen sinttico, lo cualrepresenta un elemento muy importante en el avanceno solo de la Qumica de Productos Naturales sinotambin de la Sntesis Orgnica y la Bioinformtica.

CONCLUSIONES

El uso combinado de ensayos biolgicos como elde Artemia con las tecnologas de separacin y eluci-dacin estructural actuales guiar a los qumicos deproductos naturales en el descubrimiento de compues-tos altamente promisorios para su desarrollo comoplaguicidas de origen natural. Su aplicacin en nues-tro pas, proporcionar un valioso instrumento quecontribuir a la bsqueda de nuevas alternativas parael control de plagas en la agricultura, centrando lasinvestigaciones y los recursos disponibles en los can-didatos ms prometedores.

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(Recibido 30-9-2008; Aceptado 8-9-2009)