Ensayos de toxicidad subcrónica con lombriz de tierra 275

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ClasifiCaCión del ensayo: e

Principio de la prueba

Los ensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como pruebas para evaluar la toxicidad de suelos contaminados (Dorn et al., 1998; Wilson et al., 2002). Cuando se tienen concentraciones subletales que pueden afec-tar el crecimiento o reproducción de la lombriz (como representante de los organismos del suelo), esta respuesta puede ser empleada como un centinela de procesos destructivos que pudieran presentarse en el suelo (Neuhauser y Callahan, 1990).

Lombrices adultas son expuestas al menos a cinco concentraciones dife-rentes de un compuesto, ya sea que se encuentre mezclado con el suelo o se aplique superficialmente (plaguicidas). Los efectos letales sobre los organismos se observan en un plazo de 8 semanas. En las lombrices adultas la mortalidad y los efectos sobre el crecimiento se determinan después de 4 semanas. Por su

Ensayo de toxicidad subcrónica con la lombriz de tierra Eisenia andrei

María del Carmen Cuevas Díaz, Ronald Ferrera Cerrato, Adriana Roldán Martín y Refugio Rodríguez Vázquez

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parte, en las lombrices juveniles se realiza un recuento a las 8 semanas. Esta prueba se basa en el documento USEPA-712-C-96-167 (USEPA, 1996).

Definiciones

Concentración letal media (CL50): es la concentración de un compuesto que ocasiona la muerte de la mitad de los organismos durante el período de prueba. La CL50 se expresa en unidades de masa de la sustancia por masa seca de suelo (mg/kg) o masa de la sustancia por unidad de área de suelo (mg/cm2).

Concentración en la que no se observa efecto (NOEC): corresponde al tratamiento de concentración más alto de la sustancia de prueba que no muestra una diferencia estadística de efecto sobre una población específica del organismo de la prueba en relación al control; también es la concentración que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.

Concentración más baja en la que se observa efecto (LOEC): es la con-centración mas baja de la prueba que tiene un efecto significativo sobre la reproducción (p< 0.05), expresado en función del número de lombrices juve-niles producidas durante el período de exposición, comparado con el control. Todas las concentraciones por encima de la LOEC deben tener un efecto que es estadísticamente diferente del control. Cualquier desviación por encima de lo anterior debe ser justificada en la prueba.

Concentración efectiva (CEx): es la concentración de la sustancia de prueba que resulta en x% de reducción en el número de lombrices juveniles producidas durante un período de exposición, cuando se compara con el control. Las unidades se ex-presan como masa de la sustancia de prueba por masa del suelo seco (mg/kg).

Estimación de la reproducción o densidad poblacional: se refiere al número de lombrices juveniles producidas por tratamiento durante el período de la prueba, para el reporte se puede emplear la metodología de Santamaría y Ferrera, 2002.

Infraestructura en el laboratorio

Cuarto con control de temperatura a 20 ± 2 ºC e intensidad luminosa de 400 a 800 luxes.

Material

Frascos de vidrio de 0.5 L o 1 L. Los contenedores deben permitir el inter-cambio gaseoso, para lo cual se puede colocar una tela (organza) recubierta

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con papel aluminio o un plástico al que se le perforan pequeños orificios. Si el número de lombrices aumenta, la cantidad de suelo también debe aumentar en forma proporcional. Pipetas volumétricas clase A de 1 a 100 mL. Pipetas serológicas de 1 a 10 mL graduadas. Micropipeta de 200 a 1000 µL. Termó-metro. Espátula de acero inoxidable. Pinzas. Guantes. Papel filtro. Malla de 2 a 2.36 mm (organza).

Equipo

Potenciómetro, balanza analítica con capacidad para pesar lombrices de 0.1 g., balanza con capacidad para pesar muestras de suelo de 500 g., base de agitación o vórtex y rotavapor o campana de extracción.

Reactivos y soluciones

Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS o, al menos, 99% de pureza. Para la preparación de soluciones se emplea agua destilada o deio-nizada tipo II. Soluciones amortiguadoras para pH 4, 7 y 10, Carbenzamida 99% pureza y carbonato de calcio (CaCO3).

Sustancia de referencia

La NOEC o CEx de una sustancia de referencia se debe determinar con la finalidad de garantizar que la prueba se realiza en condiciones adecuadas y verificar que la respuesta del organismo no ha cambiado con el tiempo. Se recomienda el uso de carbendazima, ya que se ha demostrado que afecta la reproducción (Neuhauser and Callahan, 1990).

Suelos a utilizar

Suelo artificial

El suelo artificial tiene una composición de: 10% musgo (materia orgánica), 20% arcilla y 70% arena. Se utiliza CaCO3 para ajustar el pH a 7.0 ± 0.5. Para el ensayo se deben pesar de 250 a 500 g de suelo artificial, con 4 réplicas por cada concentración.

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Suelo contaminado

Se necesitan cuando menos 1,100g de suelo, ya que se preparan un mínimo de 4 réplicas de 200 a 250g de suelo contaminado. Los 100 a 200 g del remanente se utilizan para realizar las determinaciones de pH, humedad y concentración del compuesto tóxico; pero si se requiere caracterizar la muestra es necesaria la recolección de mayor cantidad de suelo. Los recipientes deben ser llenados en su totalidad. Si el análisis no se realiza de inmediato, las muestras deben ser selladas, empacadas y almacenadas a 4 ºC en la oscuridad, para minimizar la pérdida de compuestos volátiles. De preferencia, la evaluación de la toxicidad se debe realizar en un lapso de 24 horas; de no ser posible se debe procurar hacerlo en un plazo no mayor a 14 días, ya que la toxicidad pudiera no ser representativa por degradación o pérdida del compuesto.

Determinación de la humedad en el suelo

Antes de realizar la prueba, se debe calcular la humedad inicial del suelo para adicionar el agua de hidratación necesaria. Para ello se toma una alícuota de 25 g de la muestra de suelo y se coloca en una cápsula de porcelana, previa-mente preparada a peso constante. Se pesa la cápsula con muestra y se seca a 103-105 ºC durante 24 horas, para posteriormente dejarla enfriar en un desecador. Una vez fría se pesa nuevamente. La diferencia de pesos nos da el valor del peso seco final. (WSDE, 1996).

De forma alternativa, se puede usar una balanza térmica depositando 1.0 g de suelo problema y 10 minutos más tarde se tiene el resultado en por ciento.

Organismos de prueba

Se utilizan lombrices adultas del género Eisenia en su especie andrei, de al menos 2 meses de edad (cliteladas). Esta especie puede tener como fuente de alimento estiércol de caballo o alfalfa (USEPA, 1996).

Previo a su uso, las lombrices seleccionadas deben ser aclimatadas durante 1 a 7 días en el suelo artificial, con el mismo alimento a usar en la prueba.

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Procedimiento de la prueba

Preparación de las lombrices

Se vacían los intestinos de las lombrices aclimatadas, colocándolas sobre papel filtro humedecido de 3 a 8 horas antes de la prueba. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas en grupos de 10. Cada grupo de lombrices se coloca en un contenedor de vidrio con 250 a 500 g de suelo.

Concentración de la sustancia prueba

Para determinar la NOEC se preparan 5 concentraciones con un factor de diferencia entre ellas no mayor de 2; por ejemplo, 500, 250, 125, 62.5 y 31.25 mg/kg. Si se desea además determinar la LOEC, se preparan 10 concentra-ciones diferentes bajo el mismo esquema anterior.

Preparación del suelo con la sustancia de prueba

Antes de adicionar la sustancia de prueba se agrega de 4 a 8% del alimento en relación al suelo (10 a 20 g de estiércol de caballo o alfalfa). Para la adición al suelo se emplean dos métodos en función de la sustancia a probar:

Si se trata de compuestos en general, se mezcla la sustancia en el suelo. Si se trata de un plaguicida, se aplica en la superficie del suelo (USEPA, 1996).

La sustancia de prueba puede ser soluble en agua o en disolventes orgáni-cos. En el caso de ser soluble en agua, se prepara la cantidad necesaria para ajustar la humedad (35 a 50% de máxima capacidad de campo), y la solución es mezclada con el suelo antes de ser colocada en los contenedores.

Si el compuesto es insoluble en agua, pero soluble en un disolvente orgánico, se disuelve en un mínimo de disolvente (por ejemplo, acetona). El disolvente se puede remover posteriormente colocando el suelo en una campana de ex-tracción y mezclando continuamente (1 a 6 horas) o utilizando un rotavapor. Después de la evaporación del disolvente, se ajusta la humedad del suelo a máxima capacidad de campo y se coloca en los contenedores.

Se utilizan 4 réplicas por concentración, considerando un mínimo de 5 con-centraciones por sustancia problema. Asimismo, se preparan dos controles: uno libre de contaminante y otro con el disolvente empleado para valorar el efecto del mismo; en ambos casos, también se preparan 4 réplicas (Kula y Larink, 1997).

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Aplicación de las lombrices

Una vez que se tiene el suelo preparado con el compuesto y los controles, se adicionan 10 lombrices por contenedor, tapando con la tela para permitir el intercambio gaseoso (figura 17.1).

Condiciones de la prueba

Los contenedores se mantienen a 20 ± 2 °C y en un régimen de 16 horas en luz y 8 horas en la oscuridad. Los contenedores se abren a los 7, 14, 21 y 28 días para la evaluar a las lombrices. También se evalúa la humedad y se ajusta cuando es necesario. Al final de la prueba, no debe haber una diferencia mayor de 10% en relación a la humedad inicial.

Duración de la prueba y mediciones

A los 7 días se revisan los contenedores para evaluar el movimiento o muerte de las lombrices; la mortalidad también se determina a los 14 días. A los 28 días (4 sema-nas) se hace una evaluación más detallada de las lombrices; las adultas son pesadas y contadas y se revisa su morfología, cualquier anormalidad debe anotarse. Las lombrices adultas son separadas y los capullos o lombrices juveniles son contados, dejándolas en el contenedor 28 días (4 semanas) más bajo las mismas condiciones, adicionando alimento sólo al inicio de esta fase. Al final de estas 4 semanas los capullos y lombrices juveniles se cuentan para determinar su viabilidad.

Figura 17.1. Frasco con tela para la prueba de toxicidad subcrónica con lombriz de tierra

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Límites de la prueba

Si no se observan efectos en la concentración más alta (ejemplo 1000 mg/kg), la prueba de reproducción puede ser considerada como un límite, usando una concentración de 1,000 mg/kg para demostrar que la NOEC o CE10 para la reproducción es mayor que este valor.

Expresión de resultados

Para la reproducción, correspondiente al número de juveniles, se calcula la media aritmética y la varianza por tratamiento y por control. La media y varianza son usadas para el análisis de varianza (ANOVA) utilizando técni-cas tales como t-Student, Dunnet o Williams o un software como SAS, para obtener el intervalo de confianza de 95%.

Se determina la NOEC y la CEx. La CL50 y la CEx se pueden determinar por los métodos Probit, Logit o Spearman-Trimmed Karber.

Condiciones para validar la prueba

Para que una prueba se considere válida, cada réplica (10 adultos) del control debe presentar un coeficiente de variación de la reproducción ≤ 30%, además la mortalidad a las 4 semanas de la prueba debe ser ≤ 10% (Kula, 1997).

Reporte de la prueba

El reporte de la prueba debe incluir la siguiente información:

Nombre del técnico, investigador principal y datos de la prueba (nombre de la sustancia prueba, tipo de prueba).Para el caso de compuestos se debe incluir el número CAS, nomenclatura IUPAC, pureza, composición (identificación y concentración de los prin-cipales ingredientes e impureza), número de lote y propiedades físicas y químicas. Asimismo, se debe mencionar la forma en que se ha adicionado y mezclado la sustancia en el suelo.Género y especies de los organismos de prueba, así como detalles de cultivo de lombrices (condiciones de cultivo y forma de alimentación.Condiciones de la prueba

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Cambios en los pesos de las lombrices adultas al inicio y al término de la prueba de 28 días (Santamaría y Ferrera, 2002)Resumen estadísticopH, temperatura y humedad del suelo al principio y final de la prueba (0 y 8 semanas).

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Tabla 17. 1 Condiciones recomendadas para la prueba de toxicidad subcrónica con la lombriz de tierra Eisenia andrei

Duración del bioensayo 28 días (4 semanas)Temperatura 20 ± 2 ºCContenedores Frascos de vidrioCantidad requerida de muestra de suelo 1100 gCantidad requerida por réplica 200–250 gHumedad del suelo 35–45 %Organismo prueba Eisenia andreiEdad del organismo > 2 meses (clitelada)Número de organismos por réplica 10Número de réplicas 4pH del suelo 5 – 9, no realizar la prueba si el rango no es aceptableAlimentación Adicionar de 4-8% de estiércol de caballoEfectos medidos Supervivencia en 14 días, reproducción en 28 días y viabilidad a los 56 días (8 semanas)Control positivo CarbenzamidaControl negativo Suelo artificial o suelo blanco no contaminado

Bibliografía

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