Entseiu mikrobiologikoa

ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua

ANALISIA ETA KONTROLA

Entseiu mikrobiologikoak 1

PROGRAMAZIOA

1. MIKROBIOLOGIA

Mikrobiologiaren kontzeptua eta historia

Izaki bizidunen sailkapena

Zelulak: motak eta egitura

Célula prokariotoa

Birusak eta beste izaki ez-zelularrak

Monera Erreinua

Protista Erreinua

2. METABOLISMO MIKROBIANOA

Mikroorganismoen metabolismoa: mantenu erreakzioak

Biosintesia, polimerizazioa eta muntaketa

Mkroorganismoen hazkuntza

3. MIKROBIOLOGIA APLIKATUA

Mikroorganismoen baliagarritasuna

Populazio mikrobianoa

Mikroorganismoen controla

Familia esanguratsuenak

4. PRAKTIKAK

Zelulen behaketa

Hazkuntza-inguruen prestaketa

Laborategiko giroko mikroorganismoak

Hazkuntza puruak lortzeko teknikak

Mikroorganismo bizigarriak berreskuratzea

Hazkuntza-inguru hautagarriak eta bereizgarriak prestaketa

Bakterio-tindaketak

Ezezagun morfologiko baten tindaketen bitarteko ezagutzea

Mikroorganimoen zenbaketa

Ingurumen baldintzen eragina bakterioen hazkundean

Onddoen (lizunak eta legamiak) kultiboa

Urokultiboa

Koprokultiboa




Esne gordinaren azterketa mikrobiologikoa

Uraren analisi mikrobiologikoa

Elikagaien analisi mikrobiologikoa

Antibiogramak




1. Unitatea: MIKROBIOLOGIAREN KONTZEPTU ETA HISTORIA

A. Definizioa: Mikrobiologia mikroorganismoak aztertzen dituen zientzia da. Beraz,

Biologiaren atala da.

Zer dira mikroorganismoak? Zentzu orokorrean, begiz ikustezinak diren

bizidunak. Objetu bat 0,1 mm bat baino txikiagoa bada, begiak ezin du kusi, eta 1 mm

izanda ere detaile gutxi igarri daiteke. Beraz, 1 mm edo gutxiago duten bizidunak

mikroorganismoak dira eta mikrobiologiaren eremuan sartzen dira.

Mikroorganismoak: animalia batzuk, protista, monera, alga asko, bakterioak eta

birusak dira.

Ondorio bezala, mikroskopioa behar beharrezkoa da bizidun hauek aztertzeko,

beraz mikrobiologiak ezinbestekoa du mikroskopia.

B. Mikrobiologiaren garapena.

1632-1723: Antony van Leeuwenhoek. (1. deskribapena) Testua 1

1664: Robert Hooke (zelula hitza 1. aldiz erabili)

1665: Francesco Redi, zizareak okelan. Testua 2

XVIII mendea: Lazzaro Spallanzani, infusioak, berotu eta itxi

XIX mendea: François Appert, elikagaiak kontserbatu. XIX mendearen

erdialdean, zientifiko batzuk konturatzen hasiak zieren erlazio kausala dagoela

mikroorganismoen garapena infusioetan eta infusio hauek jasastzen dituzten aldaketak;

hau da, mikroorganismoek aldaketa kimikoak sortzen dituzte infusioetan.

1861: Louis Pasteur (1822-1895), mikroorganismoak airean zeudela frogatu

zuen. Irudia 3

1870: John Tyndall, bakterioen faseak: tyndalizazioa.

1876: Robert Koch (1843-1910), mikroorganismo batek gaixotasun bat

(tuberkulosia).

1880: Ferdinand Cohn, endosporak.




1884: H.C. Gram-ek tindaketa teknika bat asmatu zuen. Gaur egun ere oraindik

erabiltzen dena. Teknika horri esker bakterioak bi taldetan sailkatzen dira:

Gram + eta Gram –

1920-1935: Bizidun guztion prozesu metabolikoak antzekoak dira, hau da

“biokimikaren batasuna”

1934: Mikroskopio elektronikoaren sorrerak mikroorganismoen barne

egituraren ezagupenean bultzada handia eman zuen. Ordurarte mikrobiologia aparteko

zientzia bezala hartzen bazen ere, aldi honetan gainontzeko zientzien garapenean

lagungarri bihurtu zen. Genetikan adibidez, ekarpen handiak eman ziren:

1944: Avery, McLeod eta McCarthy-k eraldaketa bakterianoa DNA-k eragiten

duela frogatu zuten

1953: Watson eta Crick, DNA-ren egitura eta molekula horren bikoizketa eta

funtzionamendua.

C. Mikroorganismoak eta prozesu kimikoak

Infusioetan gertatzen diren prozesu kimikoak bi motatakoak dira nagusiki:

Ustelketa: Eraldaketa hauetan usain txarra duten gaiak sortzen dira, eta okela

gertatzen da proteinak deskonposatzerakoan

Hartzidura: Prozesu honetan alkoholak edota azido organikoak sortzen dira

gluzidoak –landare eta fruituen osagai nagusiak- deskonposatzerakoan.

1837an hondakin hauek ikertu ziren eta bertan zelula biziak zeudela konturatu ziren

biologoak. Kimikariek, berriz elementu inorganikoak zirela pentsatzen zuten- Pasteurek

frogatu zuen hondakin hauek bizirik zirela, legamiak, hain zuzen.

1857-1876an Pasteurek hartzidura laktikoa eta alkoholikoa bereizi eta aztertu zituen.

Hartzidura mota bakoitzak gai kimiko eta mikroorganismo bereziak zituela ikusi zituen:

Mikroorganismo batzuk aerobioak (oxigenoaren beharra) zirela eta beste

batzuk anaerobioak.

Hartzidura arnasketa baino efizientzia energetiko txikiagoa zuela

Ingurumenaren mikrobiologiaren gurasoak ondoko bi hauek ditugu:

S. Winograsky (1856-1953) eta M. Beijerinch (1851-1931)




Mtaeria organikoa zoruan eraldaketak sortzen zituela behatu zuten eta egoera eta

baldintza desberdinetara egokitzen zirela konturatu ziren. Adibidez, materia organikoa

deskonposatzen zen lekuetan NO3-ak agertzen zirela konturatu ziren. Orduan, hondakin

urak NO3-tan aberatsak zirela ikusi zuten. Suposatu zuten mikroorganismoek NH4 NO3-

ra eraldatzen zutela. Hortik aurrera beste zenbait eraldaketa ikusi ziren, guztietan ziklo

biokimikoak parte hartzen dutelarik.

S2-

--------------------- S

Fe2+

--------------------> Fe3+

H2 -------------------- H

-

N2 ------------------- NH4

Ziklo biokimikoak.

D. Mikroorganismoak eta gaixotasunak

1793: Hunter-ek bi gizakiren arteko gaixotasun (gonorrea) kutsakorraren

transmisioa frogatu zuen.

1840: J.L. Schönlein-ek frogatu zuen gizakion larruaren zenbait gaixotasun

onddo batzuk sortzen zituztela

Semmelweis-ek “fiebre perperal” izeneko gaixotasuna ospitaleko

langileek transmititzen zietela ameei frogatu zuen.

Henle-k mikroorganismo konkretu bat eta gaixotasun konkretu baten

arteko erlazioa frogatzeko beharrezkoa zela mikroorganismoa isolatzea frogatu zuen.

1864: Lister-ek kirurgia antiseptikoa aurrera eramateko prozedurak prestatu

zituen eta hasiera batean harrera oso ona ez bazuten izan ere, denboraz emaitzek lortu

zituen euren onarpena. Euskarri teorikorik gabe bazen ere, prozedura hauek nahiko

froga ez-zuzenak eman zizkioten “zenbait gaixotasun mikroorganismoek sortzen zutela”

zioen teoriari.

1876: Robert Koch-ek karbunkoa bakterio batzuk sortzen zutela frogatu zuen.

Erakutsi zuen osasuntsu ziren arratoiak kutsatzen zirela gaixorik zeudenen odola hartuz

gero. Ondoren, bakterioak hazi zituen, eta hazkundea behatzen orduz ordu, ikusi zuen

baziloak zuntz luze bihurtzen zirela. Euren barruan gorputz obalatu eta errefringenteak

agertzen ziren eta hauek beste inguru batetara pasatuz gero zuntzak berriro agertzen

zirela.




Koch-ek egindako esperientziak bat zetozen Henl-k proposaturiko irizpideekin,

erlazioa lortzeko mikroorganismo eta gaixotasunaren artean. Irizpideak hauek dira

(Koch-en postulatuak):

Mikroorganismoak gaixorik dauden indibiduoengan agertu behar du beti eta ez

ondo dauden indibiduoengan.

Mikroorganismoa gaixoarengandik lortu eta isolatu behar da hazkuntza puruan.

Gaixotasuna agertu behar da garbia den hazkuntza batetik lortutako

mikroorganismoa sartzen denean ostalari gaitzikor eta osasuntsu batean.

Mikrrorganismoa berriro isolatu behar da esperimentuen bitartez kutsaturiko

gaixoarengandik

Koch lehena izan zenez irizpide hauek praktketan jartzen gaur egun Koch-en

postulatuak deitzen ditugu. Irudia 4

Urte batzuk pasatuta Pasteur eta Joubert karbunko aztertzari ekin zioten, Kochen

lanen berri izan gabe, eta antzeko emaitzak lortu zituzten. Ezer berri ez bazuten gehitu

ere, Kochen lanak baieztatu zituzten eta zenbait froga gehitu zituzten erakusteko bazilo

hori eta ez besterik karbunkoaren kausa zela.

Hurrengo urteetan, Pariseko eta Berlingo institutuak munduko antzindariak

bihurtu ziren. Alemaniako eskolak, Kochen zuzendaritzapean, gizakiaren gaixotasun

kutsakor garrantzitsuen eragileen isolaketa, kultibo eta ezagupena aztertzeko erabil zuen

denbora eta bitartekoak. Frantsesek, beriz, Pasteuren zuzendaritzapean, arazo latzagoari

heldu zion: nola gertzen da gaixotasuna animaliaren gorputzean eta nola izaten da

osaketa eta nola lortzen du inmunitatea.

25 urtetan, gizakion gaixotasun garrantzitsuen eragileak aurkitu eta ezagutu

zituzten eta, beste aldetik, gaixotasunei aurre egiteko metodoak garatu ere.

1892: D. Iwanowsky-k, bakterio baino xikiagoak ziren eragile infekziosoak

aurkitu zituen, birusak. Ez zekien zer ziren, baina argi zegoen bizidun talde berezia

osatzen zutela, guztiz desberdina bai egitura bai garatzeko era ordurarte ezagutzen

zituzten izaki zelularrak




Irakurgaiak eta irudiak

1. Irakurgaia




2. Irakurgaia




Irudia 3




4. Irakurgaia




mente la madre la que cuenta como primer autor. También, todo lo que alcanza a la mujer -infec-

ci6n, intoxicación, desórdenes nerviosos- tiene el riesgo de que se continúe a través de la descendencia, mucho más

que en el caso del hombre. De lo que le resultan a la mujer responsabilidades y deberes par- ticulares hacia sí misma,

hacia su propia integridad.

En cambio, y por la misma razón, la sociedad tendrá hacia la mujer deberes de protección, de sal- vaguardia y

vigilancia.

Si es verdad -como decfa Ju1liot de La Moran- diere- que la evolución del papel jurídico de la mujer encuentra tal

vez una explicación en el progreso de la biología, está permitido esperar que esta evolución no haya llegado a su

término. Sin ir hasta reivindicar para la mujer una primacía que respondería a su prevalencia biológica, estimamos

que una igualdad en todos los campos es lo menos que se le debe.

La verdad biológica ya ha servido a la causa del sexo femenino; debe servirle todavía.

2. Unitatea: IZAKI BIZIDUNEN SAILKAPENA

A. Sarrera

Izaki bizidun guztiek hiru ezaugarri komun dituzte:

Konposizio berdina

Metabolismo desberdinan izan arren, helburuak berdinak dituzte:

i. Materia konplexuak (makromolekulak) sintetizatzea (proteinak,

DNA,...)

ii. Energia lortzea

Oinarrizko egitura finkoa: organismo guztiak zelulez osatuta daude

Hiru ezaugarri hauen salbuespena birusak dira, zelularik ez dituztelako. Bestalde,

izaki bizidunak hiru taldetan bana daitezke: izaki zelulabakarrak, zelulanitzak eta

egitura zenozitikoak

B. Antolaketa maila

Izaki zelulabakarra: Izaki mikroskopikoak, bakterio gehienak, zenbait alga

eta onddo

Izaki zelulanitzak:

o Bereizketa gabekoa:

Zelula gutxi dituzte

Zelula guztiak berdinak dira

Koloniak osatzen dituzte

Onddo eta alga batzuk

o Berezitakoak:

Zelula askoz osaturik

Zelula desberdinak

Zelulak taldeka elkartuta, ehunak osatzen dituzte eta hauek

organoak eta hauek aparatuak

Egitura zenozitikoa: Organismoa ez dago zelulaz osaturik. Mugarik gabeko

masa da. Zelula baten erdibiketatik sortzen da. Erdibiketa nuklearra egoten

da, baina ez da ehunik sortzen. Talde garrantzitsuenak mixomizetoak (onddo

batzuk) dira.

C. Izaki bizidunen sailkapenerako irizpideak

Aristotelen denboretan izaki bizidunak bi erreinutan banatzen ziren: Animalia eta

landare erreinuak. Bi erreinuak elkarren artean oso desberdinak ziren, batzuk

energia lortzeko materia organikoa eta besteek materia inorganikoa erabiltzen zuten;

batzuen mugimendua eta besteen mugimendu eza; klorofila izatea ala ez; karbono

iturri desberdina izatea,...

XVIII-XIX. mende haseran animalikuluen (mikroorganismoak) aurkikuntzarekin

batera beste sailkapen bat egitera bultzatu zuten. Mikroorganismo asko animalia

(protozoo) eta landare erreinutan sartu zituzten.




Baina mikroorganismo gehiago ezagutzearekin batera beste sailkapen batzuk egin

zituzten:

Flagelatu fotosintetikoak

o Fotosintesia

o Mugimendua

Onddo mukiduna

o Onddoak

o Mugimendua Taula 1

Esfuerzo final (hacia 1860) para asignar los microorgasnismos a los reinos vegetal o

animal

1866an Haeckel-ek hiru erreinutako sailkapena proposatu zuen, hirugarren erreinuan

protista izeneko mikroorganismoak sartzen zituelarik. Bereiztu gabeko zelulaz

osatutako mikroorganismo zelulanitz eta zelula bakarrak sartu zituen.

Taula 2

Grupos que componen los tres reinos de organismos propuestos por Haeckel (1866)

Propiedades Vegetales Animales

Multicelulares; diferenciación profunda

de las células y tejidos

Plantas con semillas

Helechos

Musgos y hepáticas

Vertebrados

Invertebrados

Protistas

Unicelulares, cenocíticos, o multicelulares; estos últimos con poca o

ninguna diferenciación de células y

tejidos

Algas, Protozoos, Hongos y bacterias

D. Izaki bizdunen taldeen ezaugarriak

Monera erreinua. Organismo prokariotoak dira soilik, beraz, antolaketa

zelular prokariotoa duten zelulabakarrak dira denak. Nutrizio mota guztiak

Vegetales Grupos discutidos Animales

Pequeños metazoos

Roíferos

Nematodos (algunos)

Artrópodos (algunos)

Algas (fotosintéticas) Protozoos

Formas inmóviles Flagelados fotosintéticos Flagelados no fotosin.

Hongos (no fotosintéticos) Hongos mucosos Protozoos ameboides

Bacterias




dituzte, asexualki ugaltzen dira, nahiz eta, material genetikoaren truke soilak

bezalako sexualitate-modu oso primitibo batzuk agertu. Bakterioak,

zianofizeoak eta mikoplasmak sartzen dira bertan.

Protista erreinua. Organismo zelulabakar eukariotoak dira eta ehun

antolaketarik ez duten izaki kolonialez osatuta dago; landareetatik eta

animalietatik bereizten dira garapenik ez dutelako, ezta ehunik ere, eta

onddoetatik, berriz, beren bizitzako etaparen batean zilioak eta flageloak

dituztelako. Erreinu honetan protozooak, beste organismo urtar, eta nahiko

ezezagunak diren parasito batzuk eta algak sartzen dira.

Onddoen erreinua (Fungi). Organismo eukariotoak dira, esporaz ugaltzen

dira, ez dute garapen enbrionariorik, beren bizi-zikloaren etapa guztietan ez

dute ziliorik ezta flagelorik ere eta denek nutrizio heterotrofoa dute.

Legamiak bezalako onddo zelulabakarrak eta lizuna eta perretxikoak

bezalako onddo zelulanitzak biltzen ditu, baita likenak ere.

Animalia erreinua (Metazooak). Organismo zelulanitz eukariotikoak dira,

nutrizio heterotrofoa dute, ugalketa sexuala eta ondoren garapen

enbrionarioa; garapen horretan zehar blastula izeneko egoera bat izaten da

beti. Erreinu honetan eskuarki animali zelulanitz bezala kontsideratuak izan

diren organismoak sartzen dira.

Plantae erreinua (Metafitoak). Organismo zelulanitz eukariotoak dira,

nutrizio autotrofo fotosintetikoa dute, ugalketa sexuala eta garapen

enbrionario bakuna (ez da blastula egoerara iristen). Belaunaldi alternantzia

izan ohi da bi ugalketa-motekin. Goroldioak, iratzeak, gimnospermoak

(haziak agerian) eta angiospermoak (haziak estalita – loreak) biltzen ditu.

3. Unitatea: ZELULAK: MOTAK ETA EGITURAK




1. Sarrera

Izaki bizdunok osatzen gaituen egiturarik txikiena zein den jakiteak jakinmina

eragin du historian zehar. Antzinako Grezian hasi ziren arazoei erantzuna emateko

teoriak pentsatzen. XVII. Mendera arte oso gutxi aurreratu zuten, proposatutako

hipotesiak frogatzeko baliabiderik ez zutelako.

1950. urtean Zacahry eta Francis Janseen-ek lehen mikroskopio konposatua asmatu

zuten, tutu batean bi lente ganbil jarrita. Handik urte batzuetara, Robert Hooke-k

(1635-1703) mikroskopio konposatua erabiliz, kortxozko xafla mehe batzuk behatu

zituen 1665. urtean, eta ikusitakoa deskribatzerakoan hitz ezin egokiagoak erabili

zituen:

“...argi eta garbi ikusi ahal izan dut xafla zulatuta dagoela erabat, poroz beteta

dagoela, abaraska baten antzera. Poro edo zelula horiek ez dira batere sakonak,

baina ugariak bai, oso ugariak dira...”

Hooke izan zen egitura biologiko bat deskribatzeko zelula hitza erabili zuen lehena.

Garai hartan, mikroskopiogileak ziren objetu txikiak behatzen ibiltzen zirenak.

Antony van Leeuwenhoek-ek (1632-1723) adibidez, mikroskopi bakun eta garatu

gabeak, baina bereizmen handikoak erabiliz, makina bat mikroorganismo aurkitu

zituen: infusorioak, algak, onddoak, bakterioak, etab. Malpighi-k (1628-1694) ere

hamaika behaketa desberdin egin zituen, kapilarrak, intsektuak, landareak, etab.

Brisseau de Mirbel eta Jean Baptiste de Lamarck-ek 1809. urtean eta Henri

Dutrochet-ek 1837an, izaki bizidunok zelulaz eratuta geundela esan zuten, eta zelula

horiek bizi-funtzio independienteak zituztela.

Urte haietan, 1831 inguruan, Robert Brown-ek egindako ikeerketen ondorioz, beste

ororkortze nagusi batera iritsi ziren, zelulen barruan nukleoa dagoela aurkitu

baitzuten.

Teoria zelularra finkatzeko bidea, beraz, eginda zegoen, berandu baino lehen

etorriko zena bi biologi alemanen –Matthias Jakob Schleiden (1804-1881) eta

Theodor Schwann (1810-1882) biologoen – lanaren ondorioz. Schleidenek

landareen zelularen jatorriari buruzko lana argitaratu zuen 1838. urtean eta nukleoak

zelularen garapenaren duen zereginari buruzko hipotesia plazaratu zuen. Schawnn

bere aldetik, animaliak aztertu zituen. Berak egindako behaketak eta Schleindenek

egin zizkion oharrak kontuan hartuta “izaki bizidun guztien oinarrizko zatiak zelulaz

osatuta daude” esan zuen 1839. urtean.

Schleinden eta Schwannek emandako oinarrizko ideia hori da, hain zuzen, teoria

zelularra gauzatu zuena:




“Animaliak nahiz landareak, independienteki, baina aldi berean batera

funtzinatzen duten zelulez eratuta daude”.

Zelularen jatorriari buruzko teoria zuzenak agertzeko mikroskopioak hobetu eta

tindaketa-metodoetan aurreratu ahala, zatiketa zelulararen nondik norakoaren berri

izaten hasi ziren. R. Virchow 1855. urtean “omnis cellula ex cellula” esan zuen.

Gaur egun egia unibertsaltzat dugun teoria zelularrak denbora luzea behar izan zuen

zientifikoen artean onartua izateko.

Walter Flemming-ek zelularen zatiketa-prozesuak ikusi zituen 1879. urtean.

Kromosomen kopurua beti berdina dela aurreratu zuen eta zelularen zatiketaz hitz

egiteko mitosi hitza erabiltzen hasi zen. Handik urte gutxi batzuetara animali eta

landare-zelulen meiosia beste batzuek deskribatu zuten.

1880-1900 urtealdian mikroskopio optikoz ikus zitezkeen organulurik gehienak

ikusi zituzten; izan ere, orduantxe hasi baitziren teknikak berriak erabiltzen:

tindaketa, ebakidurak, etab. Garai horretan ere, Ramon y Cajal-ek neuronari buruzko

teoria plazaratu zuen eta ondorioz, teoria zelularra ehun guztietara zabaldu zen.

XX. mendeanren haseran zelularen funtzionamendu ikertzeari ekin zioten. 1930-

1940. hamarkadatik aurrera aurrerapauso handia egin zuten zelularen ezagutzan,

tresna berri baten erabilerari esker: mikroskopio elektronikoa. Egitura zelularra

ezezik ultraegitura ere ikus zitekeen, hau da, organulu zelularren xehetasun guztiak.

Mendearen erdialdean zelularen azterketa biokimikoek eurenganatu zituzten eta

gaur egun prozesu zelular guztiak ezagutzen ditugu.

Egitura zelularrari buruzko ezagutzaren kronologia

Aurrerapen teknikoa Urtea Ideien aurrerapena




Mikroskopio konposatua 1590

1665 Hook-ek zelula deskribatu

1670 Espermatozoideak deskribatzeko

animalkulu hitza erabili

Malpighi eta Leeuwwenhoek-en

lanak

1680

Mikroskopio bidezko behaketa 1750 Zuntz-teoria

Nukleoa ikustea 1760

Dolland-ek lente akromatikoak

asmatu

1780 Besikula-teoria

1827 Teoria zelularraren aitzindari

izango diren lehen ideiak

Lehen mikroskopio konposatu

akromatikoa

1833 Brown-ek nukleoa deskribatu

1838

1839 Schawnn eta Schleiden-ek

teoriazelularra formulatu

1840 Purkinje-k proptoplasma terminoa

erabiltzen hasi

Abbe-k mikroskopioari zenbait

hobekuntza

1855 Virchow-ek zelula oro beste zelula

batetik datorrela esan

1879 Flemming-ek mitosia deskribatu

Teknika mikroskopikoen

aurrerakada handia

1880 Plastoak, mitokondriak eta Golgi-

ren aparatua deskribatu

Zeiss-ek lente berriak asmatu 1900 Sutton-ek gen-kromosoma

harremana ezarri Lehen mikroskopio elektronikoa 1931

Fase-kontaste bidezko

mikroskopioa

1933 Organulu berriak deskribatu

Organulu desberdinen funtzioa

Teknika berrien garapena:

zentrifugazioa, zitokimika,...

1955

“Microscopio electrónico de

barrido”

1965 Mintz plasmatikoaren eredua

Kriohausturako mikroskopio

elektronikoa

1979

Teknika berriak..... 1980 Organuluen ultraegitura

1990




ZELULA EUKARIOTA:

a.- Organuloak:

Eukariotak diren zeluletan DNA mintzez inguraturik dago, nukleoa eratuz. Zitoplasma organulo zelular desberdinetan oso aberatsa eta ugaria da. Era honetako antolaketa ondorengo erreinuetan agertzen zaigu: Protista, Fungi, Landare eta Animalia.

Argazkiak konparatu

Ondorengo irudiak kontutan hartuz erantzun itzazu ondoko galderak:

A B

1.- Zein da handiena?

2.- Zein da konplexuena?

3.- Zeinek dauka nukleoa?

4.- Zein da zelulabakarra?

5.- Zer organismo izan daiteke A argazkikoa?

Bakterioa

Beste izakiren bat

6.- Zer organismo izan daiteke B argazkikoa?

Bakterioa

Beste organismoren bat

Zelula eukariotak bizi forma eta mota (landare eta animalia) guztietan komunak diren organuloak dituzte:




Animalia eta Landare zeluletan agertzen diren organuloak

Organuloa Irudia Funtzioa

Mintz Plasmatikoa

Proteina eta fosfolipidoz osaturiko geruza da. Kanpo eta barne inguruak bereizten ditu eta elkartrukeak kontrolatu egiten ditu.

Zitoplasma

Zelularen barne medioa da. Bertan, metabolismo zelularra eta molekulen mugimendua burutzen da.

Nukleoa

Mintzez inguraturiko zonaldea nukleoplasma eta DNAz osaturik nagusiki.

DNA (Kromosoma)

Kondentsatutako DNA zuntzak dira. Informazio genetikoa biltzen dute.

Mitokondria

Arnasketa zelularra egiten dute. Materia organikoa ATPan bilakatzen dute (energia)




Erribosoma

Proteinak sintetizatzen dituzte (itzulpena).

Erretikulu endoplasmatikoa

Erribosometan sortutako proteinak garraiatu eta bildu egiten dute. Baita ere, lipidoak sintetizatzen ditu, eta, mintz nuklearra eratzen dute.

Golgi aparatua

Erretikulu endoplasmatikotik jasotako proteinak bildu eta sailkatu egiten ditu. Pareta zelularra eratzen du. Lisosomak sortzen ditu.

Besikulak

Golgi eta Erretikuloan jatorria duten eta sustantzia biltzen dituzten esfera txikiak dira

Lisosomak

Digeri entzimak biltzen dituzten mintzez inguraturiko esfera txikiak. Eurei esker elikagaiak digeritu egiten dira.

Pareta Zelularra

Landare zelulari babesa, euskarria eta egitura mantentzen laguntzen dio. Zelulosaz osaturiko mintzez egina dago.

Kloroplastoa

Fotosintesia egiten duen organuloa: materia inorganikoa materia organikoan bilakatzen da.




Zentrioloak

Zilioa eta flageloak eratzen dituzten mikrotubulo zilindrikoen multzoa. Animali zeluletan zatiketa zelularrean parte hartzen du.

Amiloplastoak Fotosintesia sortutako almidoia biltzen duen organuloa.

Zilioak eta Flageloak

Mugimendu zelularra eragiten duten organuloak dira.

Bakuolak

Erreserba sustantziak edo hondakinak biltzen ditu.

Forma Animalietan aldakorra eta landareetan prismatikoa.

b.- Animali eta landare zelula:




Aurrekoaren laburpen gisa zera esan dezakegu: Landare zelulak erregularragoa eta prismatikoagoa den forma erakusten duela, animali zelulak oso aldakorrak diren formak agertzen duten neurrian. Organuloak ere desberdinak dira: landareak kloroplastoak, pareta zelularra, amiloplastoak eta zitoplasmaren bolumenaren gehiena okupatzen duen bakuola handi bat dute. Animali zelulak aurreko organulorik ez du eta bai ordea zentrioloak eta lisosomak.

PRAKTIKETAKO PROGRAMA




Segurtasun neurriak mikrobiologiako laborategian araudia

PRAKTIKAK

Kultibo-medioen prestaketa

Mikroorganismoen ereinketa eta kultiboa

Mikroorganismoak ingurugiroan

Mikroorganismoen isolaketa eta identifikazioa lagin batetatik

Mikroorganismoen behaketa

MIKROBIOLOGIA LABORATEGIAN JARRAITU

BEHARREZKO ARAU OROKORRAK




1. Liburu, poltsa eta arropa guztia lan-eremutik at egon behar dute. Lan-eremuan, lanerako

beharrezkoak diren gauzak soilik egon daitezke (koadernoak, protokoloak, lanerako

tresnak), eta ahal bezain garbi, ordenatu eta huts mantenu behar da lan-eremua.

2. Bata eraman beharra dago, era hortan gu eta gure arropak babestuko baititugu (bai

kontaminazioa eta bai koloratzaile eta substantzia kimikoen ekintza). Ez irten laborategitik

laborategiko batarekin (kafea hartzera, hitzegitera, klasera...).

3. Laborategian jatea (txiklea mastekatzea barne), edatea edo erretzea debekatuta dago.

Ekiditu eskuak zein beste edozein objektu ahoratzea. Ez haginka egin boligrafoari. Ez ikutu

aurpegia, begiak etabar.

4. Ezer egin baino lehen, protokoloa irakurri. Zer egin behar den eta nola egin behar den

aurrez jakiteak istripuak gutxitzen ditu eta denbora hobeto erabiltzea baimentzen du.

5. Praktika egun bakoitzaren hasieran azalpen labur bat emango da. Ez hasi lanean

azalpenak eta protokoloa irakurri baino lehen. Metodoa edo esperimentuaren helburua

ulertzen ez duzunean, galdetu irakasleari.

6. Praktika hazterakoan desinfektatu lan-eremua desinfetatzailearekin (desinfektatzailea

paperezko toaila batekin zabaldu mahai gainean eta lehortzen utzi). Prozedura bera

errepikatu lana amaitutakoan. Praktika amaitzean mahaia txukundu.

7. Erabilitako gauza guztiak izen, talde, data eta experimentuarekin errotulatu, era hortan

materilaren erabilera ez-zuzena ekidituko baitugu.

8. Lanean zehar, kontaminazioak erraz ditzaketen aire korrenteak ekiditu . Saio-hodi

esterilak edo kultibodunak gradilatan bertikalki mantendu behar dira. Sekula ez mahai

gainean etzanda.

9. Praktiketan egindakoaren ohar guztiak laborategiko koadernoan idatzi.

10.Kontuz metxeroekin , batez ere metxeroaren bestaldean dagoen zerbait hartu nahi




denean. Istripuak ekiditzeko, itzali metxeroak beharez direnean.

11.Kontaminatutako materiale guztia eta erabiliko ez diren kultibo guztiak garbitu edo

bota baino lehen, esterilizatu beharra dago. Esterilizatu beharreko materialea ontzi egokietan

utzi. Pipetak, portak eta kubreak mahaietan dauden lixibiadun untxietara botako dira.

12.Paperak, poxpoloak eta beste material ez kutsagarriak sakar-ontzira botako dira. Inoiz ere

ez, harraskara.

13.Laborategitik atera baino lehen, bai aldi batez edo behin-betiko, eskuak xaboi

germizidaz garbitu behar dira.

14. Edozein istripu edo arazoren aurrean (ebaketak, erredurak, kultiboen isurketak...),

irakasleari jakinarazi berehala dagokion neurriak har daitezen.

KULTIBO MEDIOEN PRESTAKETA

Kultibo-medioak: laborategian mikroorganismoak hazteko erabili daiteken edozein

sustantzia (solido edo likidoa) da;

Kultibo medioaren konposaketan sustratu natural bat (odol plasma edo esnea adibidez)

edota gatz eta sustantzia kimikoen kontzentrazio ezagunak parte har dezakete.

Jatorriaren arabera kultibo-medioak talde desberdinetan sailka daitezke:

Konplexua: honen konposaketan liseritutako konposatuak, landare edo animali

ehunen estraktuak, kaseina... auki daitezke. Mikroorganismoak hazteko

beharrezko dituzten elementu guztiak egongo dira, nahiz eta konposaketa eta

kontzentrazio zehatzak ez ezagutu.

Definitua : kontzentrazio ezagunean aurkitzen diren sustantzia kimiko puruez

osatutako kultibo medioa. Hazkuntzarako beharrezko diren konposatu guztiak

egongo dira, hauek desberdinak izan daitezkeelarik mikroorganismoaren behar




nutrizional konkretuen arabera. Guztiek eskeintzen dute ura, energi iturria

(adibidez karbohidratoak eta gatz ezorganikoak), konposatu nitrogenatuak eta

hazkuntzarako beste faktore batzuk.

Kultibo medioa solidoa bada, solidifikatzaile bezala agarra erabiltzen da (nahiz eta beste

batzuk ere erabil daitezken agarra ez denean egokia, adibidez, mikroorganismoak agarra

erabiltzeko ahalmena duenean).

Ezin formula daieteke mikroorganismo guztien hazkuntza baimen dezakeen kultibo-

medioa. Hala ere, Mueller-Hinton agarra bezalako kultibo medio konplexuetan bakterio

askok hazteko gaitasuna dute eta horregatik sarritan erabiltzen dira.

Mikroorganismoen isolaketa eta identifikaziorako kultibo-medio hautakorrak edota

bereizgarriak erabiltzen dira.

Medio hautakorren konposaketan parte hartzen duten konposaturen bat edo gehiago

zenbait mikroorganismoren hazkuntza inhibitzeko ahalmena izango dute, eta ondorioz,

mikroorganismo edo mikroorganismo-talde konkretuen hazkuntza soilik gertatuko da.

Hauen artean ditugu: MacConkey agarra, Manitol agarra eta beste asko.

Kultibo-medioetan hazi ondoren mikroorganismoen itxuraren arabera (kolonien

tamaina, kolorea, distira, ertzaren izaera...) espezie ezberdinak daudela antzeman

dezakegu. Hala ere, mikroorganismo askok kolonia desberdinezinak ematen dituzte.

Kultibo-medio bereizgarrietan ordea, nahiz eta koloniaren itxura berdintzua izan,

kolonien arteko bereizketa lortuko dugu. Medio bereizgarri hauetan, hazkuntzan zehar,

erreakzioren batek koloniaren kolorea edo beste ezaugarriren bat aldaerazi dezake

erreakzio positiboa eta negatiboa duten koloniak bereiztuko ditugularik.

Kultibo-medio solidoen prestaketa

Medio deshidratu batetatik abiatuz prozedura orokora honako hau litzateke:

Medio deshidratatua pisatu




Ur destilatua gehitu

Nahasketa irakin

Autoklabatu

Hontzietan banadu

Agarra duen kultibo-medioa Petri kutxatiletan prestatu nahi badugu, prosedura

aipaturikoa litzateke. Medioa saiodietan nahi dugunean, nahasketa irakin eta

autoklabatu baino lehen saiodietan banaduko dugu.

Agarra ez duten medioek normalki ez dute irekin beharrrik.

Laborategiko balantza arrunta

Irabiagailu magnetikoa duen plaka

Kultibo-medioaren pH-a finkatzeko,




batzutan pHmetroa erabili beharko dugu. Kultibo medio solidoak prestatzeko medioa saiodiaren barruan dagoela esterilizatzen da autoklabean, eta ondoren erdi etzanda solidifikatu arte utziko dugu. Era hortan ereintza-azalera handiagoa izango da.

MIKROORGANISMOEN EREINKETA ETA

KULTIBOA

Laborategian mikroorganismo baten azterketarako, beharrezkoa

izaten da gehienetan mikroorganismoa kopuru handitan lortzea, hau

da, mikroorganismoaren hazkuntza kultibo-medioan lortzea. Behin

kultibo-medio egokia aukeratu ondoren, mikroorganismoa bertan

ereingo dugu. Honetarako, inokulazioa egiten denean, teknika

aseptikoa erabili behar da, era hortan kutsadurak ekidingo direlarik.

Erabili beharreko tresna guztiak aldez aurretik esterilizatu egin behar

dira eta prozesu osoa suaren ondoan egin behar da.

Mikroorganismoen transferentzia ereintza-euskarri bati loturiko

platino edo kromo-nikelezko alanbre batekin egin daiteke. Alanbre

honek diametro txikiko kiribila izango du muturrean. Ereinketa

ziztadaren bidez egiten bada, ordea, kiribilik ez da egongo eta

ereintz-euskarriaren alanbrea zuzena izango da.

Kutsadura ekiditzeko maiz fluxu

laminarreko kanpaietan egiten da lana.




Ereinketa

Ereinketa saiodietan edo Petri kutxatiletan egin daiteke. Saiodien kasuan kultibo-medio solido edo

likidoa erabil daiteke. Solidoa deneko kasuan, lortu nahi dugun helburuaren arabera, ziztadaren bidezko

ereinketa edo azalekoa erabiliko da. Azken kasu honetan agar inklinatua duten saiodiak erabiltzen dira.

.

Ereintza-euskarria suaren gainean ia bertikalki jarri

behar da gori-gori jarri arte. Honela euskarriaren luzera

osoa esterilizaturik geratuko da.

Esterilitate baldintzak ez galtzeko beti suaren ondoan

egin beharko dugu lan.

Saiodi batean mikroorganismoen kultiboa izango dugu,

hau ezkerreko eskuarekin hartu, eskubiko eskuko

atzamar txikiarekin tapoia kendu eta suaren ondoan

mantendu behar da.

Saiodiaren ahoa suaren gainetik pasatu, esterilizatutako

ereintza-euskarria saiodian sartu eta segundu batzuz,

beirarekin kontaktuan dagoela, hozten utziko da.

Behin hotzituta, inokuloa hartuko dugu, euskarria

saioditik etara eta berriro ere saiodiaren ahoa sutatik




pasatu eta itxi egingo dugu.

.

Inokulatu nahi dugun saiodia hartu, ireki, ahoa sutatik

pasatu eta zelulak dituen ereintza-euskarria saiodiaren

hondoraino sartu behar da. Ondoren, euskarria

ateratzen gaudenean zigi-zaga egingo dugu kultibo-

medioaren azalean.

Amaitzeko, hodiaren ahoa sutatik pasatu eta tapatu

egingo dugu.

Ereintza-euskarria ere sutatik pasatu behar da bertan

dauden mikroorganismoak hiltzeko

Ereinketa Petri kutxatilan egitean pausu berdinak jarraitu behar dira. Kutxatilak suaren ondoan ireki

beharko dira esterilitatea mantentzeko. Kultibo-medioa likidoa denean inokuloa (euskarrian dauden

zelulak) medioan murgildu beharko da.

Ereinketa egiteko beste modu batzuk:

1. Ziztadaren bidezko ereinketa. Zenbait teknika diagnostikotan erabiltzen da. Eukarriaren alanbrea

zuzena izango da eta medioa ziztatzeko erabiliko da.




Ereintza-euskarri arrunta eta ziztadaren teknikan erabiltzen dena; lehenak kiribil bat du puntan, eta bigarrenean alanbrea zuzena da

2. Kutxatiletan ildoango ereinketa. Kultibo-medio likido zein solido batetatik abiatuz inokuloa

euskarrirekin hartu eta Petri kutxatilak zigi-ziga eginez inokulatuko ditugu.

Ereinketa egiterakoan ereintza-euskarriarekin zigi-zaga mugimenduak egiteko euskarria

ahal bezain horizontalen erabiliko dugu, era hortan agarraren apurketa gutxitu egingo baita.

Ereinketa hontatik abiatuz murrizketa bidezko ereinketa egin daiteke. Kasu hontan asmoa kolonia

isolatuak lortzea litzateke.

Murrizketa bidezko ereinketa:

1. Inokuloa ildoango ereinketaren bidez kutxatilaren albo batetan erein

(marra gorriak). Ondoren euskarria esterilizatu.

2. Euskarri esterilarekin ildoango teknikaren bidez marra urdinak egin.

Asmoa marra gorrietako microorganismo batzuk (marra urdinekin

ikustzen ditugunak) azalera handiago batetan sakabanatzea da.

3. Prozedura berdina jarraituz marra laranjak eta urdin argiak egin




(euskarria esterilizatu marra berriak egin baino lehen).

4. Kutxatila tenperatura egokian inkubatu hondoren hazkuntza

gertatuko da eta kolonia isolatuak garatuko dira.

3. Hedadura bidezko ereinketa. Kasu hontan mikroorganismoak likidoan suspendituta egongo dira eta

Petri kutxatilen gainazal osoa inokulatuko dugu likido horrekin. Pipeta esterilak erabili behar dira, hauen

bidez, mikroorganismoak dituen likidoaren bolumen jakina (0.1-0.2ml) hartu ahal izateko. Hartutako

bolumena kutxatilako agarraren gainean kokatuko dugu. Inokulua beirazko euskarri batekin heda daiteke

(Digradsky euskarriarekin). Beirazko euskarria esterilizatzeko alkoholarekin buzti eta euskarria

sugarretik igaroko dugu alkohola erre dadin (esterilitatea ziurtatzeko hiru aldiz erreko dugu). Ereinketa

metodo honek lagineko mikroorganismo bizien kopurua ezagutzeko balio du (kolonia formatzaileen

unitateak edo ufc).

4. Sakonerako ereinketa. Laginaren bolumen jakin bat (mililitro bat adibidez) agarra duen eta baina

solidifikatu gabeko kultibo-medioarekin (demagun 15 mililitro) nahastuko dugu (agar duen kultibo-

medioa autoklabean esterilizatu ondoren tenperatura hortan likido egoeran aurkituko dugu. Tenperatura

jeistean agarra solidifikatu egingo da). Nahasketa irabiatu eta Petri kutxatila esteriletara botako dugu.

Ondoren mahai gainean zortzi itsurako mugimenduak egingo ditugu apur batez (nahastu eta kutxatila

osoan heda dadin). Agarra solidifikatzean mikroorganismoak agarraren barruan hasi eta kolonien

kontaketa egin ahal izango da.

5. Suspentsioaren bidezko ereinketa, ingurune likido batetik beste ingurune likido batetara.




Inkubazioa

Kultiboak, aztertzen ari garen mikroorganismoaren tenperatura optimoan inkubatu behar dira hazkuntza

egokia lortu ahal izateko. Petri kutxatilak inkubatzean alderantzizko posizioan jarri behar dira, horrela

kondentsatziorik ez baita gertatuko goikaldean eta kondentsazioko tantak ez dira kultiboaren gainean

eroriko. Tenperaturaz aparte, mikroorganismoen oxigeno beharra kontutan hartu behar da.

Mikroorganismoa anaerobio bada, esterila den parafinarekin estali daiteke.

Berogailuak mikroorganismoen inkubazioa tenperatura egokian egiteko erabiliko dira.

Berogailuaren barruan Petri kutxatilak agarra goialdean dutela inkubatuko dira.




MlKROORGANISMOAK INGURUGIROAN

Laborategia, beste edozein girotan bezala, mikroorganismo askorekin kolonizatuta

dago. Mikroorganismo hauek airean edo gainazaletan itsatsiak egon daitezke.

Mikrobiologoek, kontutan hartu behar dute ingurugiroko kutsadura lanerako erabiltzen

dituzten materialak kutsatu ez daitezen. Lehenengo praktikan, gure lan postuan dauden

ingurugiroko baldintzak aztertuko ditugu.

Materiala:

1. TSA edo CPA agar elikagarria duten Petri kutxatilak

2. Hisopo edo torundak

Prozedura:

Bi kutxatila erabiliko ditugu:

o Bata mahaiaren gainean zabalik utxiko dugu 30 minutuz. Ondoren

kutxatila itxi eta berogailuan inkubatuko dugu. Airean

mikroorganismoak dauden detektatzeko erabiliko dugu proba hau.

o Torunda bat mahaiaren gainazaletik igaroko dugu (100 cm2 inguru) eta

bigarren kutxatila hedaduraz inokulatzeko erabiliko dugu (kontuz ibili

agarraren hausketa ekiditzeko).

Kutxatilak 37° C-tan 18-24 orduz inkubatuko ditugu

Kutxatilak aztertu eta kolonien tamaina, itxura eta kolorea deskribatu. Lortutako

kolonia kopurua UFC edo Kolonia Eratzaileen Unitateen Kopuru dela esango

dugu.

Kolonia batzuren GRAM tindaketa egin morfologia aztertzeko.




Torundarekin laginaren ereinketa egiten.

MIKROORGANISMOEN ISOLAKETA ETA

IDENTIFIKAZIOA

LAGIN LIKIDO BATETATIK ABIATUZ

Ingurugirotik hartutako lagin gehienek, mikroorganismoen populazio mixtoak dituzte.

Lagin hoietan dauden mikroorganismoen ezaugarri espezifikoak aztertu baino lehen,

beharrezkoa da, populazio mixto hoietan dauden espeziek kultibo puruan isolatzea. Behin

mikroorganismoak isolatuta daudenean, zenbait proba biokimikoren bidez identifikatuko

ditugu.

ISOLAKETA

Isolaketarako beharko dugun materialea

honako hau da:

MacConkey eta Manitol

agarra kultibo-medio

hautakorrak dituzten plakak.

Agar nutritibo ez selektiboa




(TSA edo CPA) dituzten

plakak.

Kultibo mixtoa duen lagin

problema.

Lanpostuan aurkituko ditugu behar ditugun

materialeak




Jarraitu beharreko metodoa:

Mikroorganismoen suspentzio bat izango dugu, eta suspentzio hortan aurkitzen diren

mikroorganismo desberdinak isolatzeko bi kultibo medio inokulatuko ditugu.

Bikote bakoitzak honako hauek izango ditu:

Mikroorganismoen suspentzio bat (lagin-problema),

2 Petri kutxatila McConkey kultibo-medioarekin eta

2 Petri kutxatila Gatz-manitol kultibo-medioarekin

Murrizketa bidezko ereinketaren bidez kultibo medio hautakorra duten kutxatilak ereingo

dira , eta tenperatura egokian inkubatu 24 orduz

Kultibo puruak ditugula baieztatzeko normalean berrereinketak hiruzpalau aldiz egin

behar izaten dira, baina gure kasuan McConkey-an bi berrereinketa egongo ditugu (ez

bait dugu denborarik berrereinketa gehiago egiteko):

Esperimentuaren lehen egunean mikroorganismoen

suspentziorekin bi McConkey kutxatila inokulatuko ditugu.

Inkubazioaren ondoren, bigarren egunean, bi motatako koloniak

egertu beharko lirateke: kolonia laktosa positiboak eta kolonia

laktosa negatiboak . Lortutako bi kolonia isolatuak aukeratu

(kolonia bat laktosa positiboa eta bestea laktosa negatiboa) eta

berrereinketa egingo dugu McConkey kutxatila berri banetan

murrizketa bidezko ereinketaren teknikaren bidez.

Gatz-manitolean kasuan kultibo bakarra egingo da. Normalean ereinketa bakarrarekin ez

genuke isolaketa ziurtatuko, baina mikroorganismoen suspentzioa irakaslearentzat

ezaguna da, eta kontutan izanik suspentzioa osatzen duten mikroorganismoak,

kontaminaziorik ez badago ez litzateke arazorik egon beharko kultibo bakarrean isolaketa

lortzeko (gainerako mikroorganismo motak ez lirateke haziko). Medio hontan ez da

http://www.vc.ehu.es/imp/MikroGED/Praktikak/ereinketa.html#murrizketa




berrereinketarik egingo mikroorganismoen suspentziotik abiatuz haz daitezkeen

mikroorganismoek hazkuntza geldoa aurkezten dutelako (48 orduz inkubatu beharko

ditugu kutxatilak), eta ondorioz ez genukeelako denborarik izango berrereinketak

egiteko.

Isolaketa prosesuaren ondoren, experimentuaren hirugarren egunean honako kultibo

hauek izan beharko genituzte:

Bi MacConkey Petri kutxatila

Bata kolonia laktosa positiboak dituena

Bestea kolonia laktosa negatiboekin

Bi Gatz-Manitol kutxatila koloniekin.

McConkey Agarra

Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu.

Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu:

Gatz biliarrak eta kristal-bioleta : bakterio Gram positiboen

hazkuntza) eta zenbait Gram negatibo sentikorrena) inhibitzen

du. Ondorioz, Gram negatiboak hasiko dira.

Laktosa eta Glukosa 10:1 proportzioan. Mikroorganismo

gehienek glukosa erabiltzeko gaitasuna dute, eta gutxi batzuk

laktosa ere erabili dezakete. Mikroorganismoek glukosa soilik

erabiltzen badute glukosaren hartzidura egitean konposagai

azido gutxi ekoiztuko dituzte. Aldiz, glukosa eta laktosa

erabiltzen badute, hartziduran konposatu azido asko ekoiztuko




dituzte.

pH indikatzailea. Koloniak azido asko ekoizten badituzte kolore gorria izango

dute (hots, laktosa erabiltzen dutenean). Ekoiztutako azido kopurua txikia

denean koloniak zuriak izango dira.

MacConkey agarrean hazitako koloniak.

Kolonia zuriak laktosa negatiboak dira, eta kolonia gorriak laktosa positiboak.

Manitol-gatz agarra

Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu.

Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu:

Kloruro sodikoaren kontzentrazio altua (7.5%). Gatz

kontzentrazio altua jasan dezaketen mikroorganismoak soilik

haziko dira.

Manitola. Manitolaren hartzidura ematen bada azidoak

ekoiztuko dira kopuru handitan.

pH indikatzailea. Medioa berez gorrizka da, eta manitol

positiboak diren kolonien inguruan halo horia ikusi ahal izango

dugu (azidoen ekoizpenaren ondorioz).




Hazkuntzaren ondoren kolonia manitol positiboen inguruan halo horia

eratuko da.

Halo horiaren hedapena gerta daiteke kutxatila osoa hori gera daitekeeelarik.




IDENTIFIKAZIOA

Identifikaziorako, lehenengo aztertu egingo ditugu gure kultiboak puruak diren

beieztatzeko.

Gram tintaketaren bidez, kolonien morfologia zelularra aztertuko dugu.

Kolonia isolatu bana aukeratuko dugu McConkey agarrean

kutxatila bakoitzetik. Kolonia hori zelula bakarraren hazkuntzaren

ondorioa izanik, kolonia hortan agertuko diren organismo guztiak

berdinak izan beharko lirateke. Horrela izanik kolonia bakarraren

Gran tindaketa egiten badugu zelula guztiek Gram tindaketarekiko

emaitza berdina eman beharko da (zelula guztiak edo Gram

positibo edo Gram negatibo izango dira), eta morfologia berdina

aurkeztuko dute (denak bazilo, koko edo beste morfologiaren bat

izango dute, baina denak morfologia bakarra izango dira). Horrela

ez balitz, berereinketak egin beharko genituzke.

Gauza berdina gertatu bejarko litzateke Gatz-manitol agarrarekin.

Kultibo puruak ditugula baieztatu ondoren, proba biokimikoak egingo ditugu. McConkey

agarreko koloniak proba biokimikoak egin baino lehen kultibo medio ez selektiboan

kultibatuko ditugu (TSA edo CPA). Arrazoia oso simplea da: kultibo-medio

hautakorretatik abiatuz egiten baditugu proba biokimikoak, gerta daiteke proba

biokimikoen emaitzak aldatzea (baldintza ez estandarrak erabiltzen ditugulako).

Lagin probleman dauden bakteria mota ezberdinak isolatu eta medio ez-hautakorrean

hazi ondoren, identifikaziorako beharrezkoak diren froga biokimikoen bateriak egingo

dira. Zein proba egingo den erabakitzeko dagokion eskema jarraitu.

http://www.vc.ehu.es/imp/MikroGED/Praktikak/Tindaketa.html




Honako proba biokimiko hauek egin ditzakegu:

Katalasaren proba.

Karbohidratoen metabolismo oxidatzaile aerobikoan amaierako produktuetariko bat ur

oxigenatua da (H2O2). Produktu hau toxikoa izanik, mikroorganismoek konposatu hau

suntsitzeko metodoak dituzte, hauen artean katalasa entzimaren ekintza dagoelarik.

Katalasak honako erreakzioa burutuz ur oxigenatua suntzitu egingo du:

H2O2 ---------> H2O + 1/2 O2

Katalasa mikroorganismo aerobio eta aukerazko anaerobioetan egoten da, eta ez dugu

aurkituko aerotoleratzaileetan (azido laktikoaren bakterioak) eta anaerobioetan.

Proba hau egiteko, porta baten gainean eta ur tantakarik gabe, aztertu nahi ditugun

mikroorganismoak jarriko ditugu (ereintza-euskarria erabiliko dugu Petri kutxatilatik

portara mikroorganismoen transferentzia egiteko). Ondoren ur oxigenatuaren diluzioa

gehituko dugu mikroorganismoen gainean. Burbuilak azalduko balira adierazitako

erreakzioa ematen dela esango genuke, hots, mikroorganismoak katalasa entzima

daukala.

Oxidasaren proba.

Arnasketa kate aerobioan c zitokromoa duten mikroorganismoak identifikatzeko

erabiltzen da (enterobakterioek ez dute, eta Pseudomona-k bai).

Proba hau egiteko jadanik prestatuta dauden erreaktibo kometzialak erabiliko ditugu.

Ereintza-euskarriarekin mikroorganismoen kolonia bat hartuko dugu eta erreaktiboak

dituen paperrraren gainean jarriko ditugu (urik gabe). Paperaren kolorea zuria izatetik

urdina izatera igarotzen bada proba positiboa dela esango dugu (mikroorganismoa




oxidasa positiboa dela).

Koagulasaren proba.

Odolean fibrinogenoa dago, eta mikroorganismo batzuk fibrinogenoa polimerizatu eta

fibrina sortzen duten entzimak dituzte. Proba hontan entzima hori duten

mikroorganismoak identifikatuko ditugu. Proba komertziala izango da, eta kontrol

positiboa eta negatiboa izango ditu. Koagulasa entzimaren presentzia birulentzia faktorea

da.

Proba hontan latex bolatxoak izango ditugu fibrinogenoarekin estalita. Mikroorganismoa

kultibo-medio solidotik ereintza euskarriarekin hartu eta dagokion tanpoiaren tanta

batetan suspendituko dugu. Ondoren latex bolatxoen tanta bat gehituko ditugu.

Mikroorganismoa eta bolatxoak nahastu eta minutu pare batez mugitu egingo ditugu

(errotazio mugimendua). Mikroorganismoaren paretan koagulasa entzima egonik latex

bolatxoak bildu egingo dira eta bikorrak azalduko dira.

Koagulasaren proba komertziala: Goian ezkerrean, kontrol positiboa. Goian eskuman, kontrol negatiboa.

Behean ezkerrean, lagin positibo bat. Behean eskuman, hutsik.




Proba biokimikoen bateria saiodietan. Inokulatu gabeko saiodiak. Ezkerretik eskumara:

indolaren proba, urearen proba, Metilo gorriaren proba, Vorgues-proskauer proba, Zitratoaren proba, KIA

multi-proba medioa.




IMViC.

Lau proba biokimikoz osoturiko proba da eta enterobakterioen desberdintzapenerako

erabiltzen da. Probak honako hauek dira:

Indolaren proba (I).

Proba hau egiteko behar den kultibo-medio likidoa (salda) saiodian izango dugu. Medio

inokulatu eta berogailuan inkubatuko dugu 37°C-tan 24 orduz. Ondoren Kovacs

erreaktiboa gehituko dugu kontu handiz kultibo medioaren gainean kokatuko delarik

erreaktiboa (erreaktiboa oliotsua baita). Interfasean eraztun gorria eratzen bada

mikroorganismoak medioan dagoen triptofanoaren degradazioz indola ekoiztu duela

adieraziko du. Kolore aldaketarik ez bada ematen proba negatiboa izango da.

Metilo gorriaren proba (M).

Saiodian MR-VP salda (Metilo gorria-Vorgues-Proskauer salda) izango dugu.

Indolarekin bezala inokulatu, inkubatu eta irakurketa egiteko MR erreaktiboa gehituko

dugu. Erreakzio gorria izanik proba posiboa izango da. Negatiboan ez da kolore

aldaketarik emango.

Vorgues-Proskauer proba (V).

Saiodian MR-VP salda izango dugu (Metilo gorriaren proban ere medio berdina da).

Inkubazioaren ondoren VP1 eta VP2 Erreaktiboak gehituko dira eta proba positiboa

izanik kolore gorria emango du. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emango

Metilo gorriaren proban eta Vorgues-Proskauerren proban enterobakteriak burutu




dezakeen hartzidura mota aztertzen da. Hatzidura bi motatakoa izan daiteke: hartzidura

azido-mixtoa edo hartzidura butilenglikolikoa. Lehen kasuan azidoen ekoizpen

garrantzitsua gertatzen da eta ondorioz Metilo gorriaren proba positiboa irtetzen da

(azidotasun aldaketa bortitsa detektatzen da). Hartzidura butilenglikolikoan ez da azidoen

ekoizpen garrantzitsurik ematen eta besteak beste, azetoina ekoizten da. Vorgues-

Proskauerren proban erreaktiboak gehitzean azetoinaren presentzia detektatuko dugu.

Metilo gorriaren proba eta Vorgues-Proskauer proba ezin dira biak batera positibo izan.

Zitratoaren proba (C).

Saiodian zitratoa duen medioa solidoa daukagu. Jatorriz medioa orlegia da eta

inokulazioaren eta inkubazioaren ondoren mikroorganismoak zitratoa erabiltzeko

gaitasuna badu kolore aldaketa emango da (medioa urdina bilakatuko da).




Urearen proba.

Salda hontako kultibo-medioak urea izango du (NH2-CO-NH2 ). Mikroorganismoak urea

erabiltzeko gaitasuna izanik, amonioa askatuko da eta ondorioz pH aldaketa emango da

(pH-a gehitu egingo da nabarmenki, eta medioaren kolorea gorria bilakatuko da). Kolore

aldaketa ematen bada proba positiboa dugula esango dugu.

KIA (Kligler Iron Agar) muti-proba kultibo-

medioa.

KIA medioa multi-proba medioa dela esango dugu zenbait gauza

desberdin jakiteko erabili ahal daitekeen medioa delako. Medio

solidoa da eta siodietan izango dugu (argazkian, inolkulatu gabeko

medioa ezkerraldekoa da).

Medioa ziztadaz inokulatu eta ondoren zigi-zaga egingo dugu

medioaren azalean.

Besteak beste, medioko osagaien artean honako hauek daude:

sulfato ferrosoa

glukosa kontzentrazio baxuan

laktosa kontzentrazio handitan

pH indikatzailea daude.

Mikroorganismoak sulfatoa elektroi hartzaile bezala erabiltzeko gai

bada arnasketa anaerobioaren bidez, sulfidrikoa ekoiztuko da, eta

KIA




medioan burdin ferroso ioia dagoenez, FeS eratuko da. Sulfuro

ferrosoa eratu eta prezipitatzean prezipitatu beltza ikus daiteke.

Mikroorganismoaren metabolismo hartzitzailearen ondorioz CO2

ekoizten bada, medioa ziztatutako lekuan burbuilak agertuko dira.

Batzutan, gasaren produkzioaren ondorioz medioak gora egin edo

apurtu egin daiteke (argazkian eskumako saiodian gertatzen den

bezala).

Mikroorganismoak glukosa erabilitzeko ahalmena badu baina

laktosa erabiltzekoa ez, hartzidura egitean azido kopuru txikia

eratuko da. Azidoaren ekoizpenak medioaren kolore aldaketa

erakarriko du saiodiaren hondoan (gorritik horira), baina azalean

oxigenoaren prezentziaren ondorioz eta medioan dagoen peptonaren

erabileraren ondorioz amonioa ekoiztu eta pH-a altuagoa izango da,

kolore aldaketarik ez delarik nabarituko medioaren gikaldean.

Beraz, mikroorganismoak glukosaren hartzidura egiteko gai bada,

baina laktosarena ez, medioaren gainazala gorria izango da eta

hondoa horia.

Mikroorganismoak bai glukosa eta bai laktosa erabiltzeko gai bada,

hartziduraren ondorioz azido asko ekoiztuko dira eta amonioaren

ekoizpenak ezingo du medio osoaren azidifikatzea ekiditu. Ondorioz

medio bere osotasunean gorritik horira pasatuko da (argazkian

eskumako saiodian gertatzen den bezala).




Proba biokimikoen bateria komertziala.

Guk API 20E (Biomerieux, France) proba biokimikoen bateria komertziala erabiliko

dugu.

Plastikozko tiratxo batetan hodi eta kupula anitz izango ditugu eta hodi bakoitzean

deshidrataturik dagoen substratoa dago. Mikroorganismoen suspentzioa prestatu eta

proba komertziala inokulatzen (mikroorganismoa dagokion tanpoioan suspenditu eta hodi

eta kupula hoiek fabrikatzaileak adierazten duen eran inokulatuko ditugu) badugu

deshidratatutako konposatuak disolbatu eta mikroorganismoek erabiliko dituzte edo ez.

Hodi konkretu batetako konposatuen erabilera ematen bada, orduan medioan kolore

aldaketa emango da.

Inkubazio aldia (24 ordu) igaro ondoren kolore aldaketak emango dira. Aldaketa hoiek

proba positiboa den edo ez adieraziko dute. Kasuren batzutan erreaktiboak erabili

beharko ditugu erreakzioaren emaitza ezagutzeko.

API 20E proba biokimikoen bi bateria komertzial. bakoitza mikrooorganismo batekin

inokulatua izanda,

eta ondorioz proba desberdinen emaitzak desberdinak dira (kolore desberdinak ematen

dituzte).




MIKROORGANISMOEN BEHAKETA.

MIKROSKOPIOAREN

ERABILERA

1. Objetiboak, okulareak eta kondentsadorea

garbiak daudela ziurtatu. Ez baleude kontu

handiarekin garbitu.

2. Lagina 10X objektiboarekin fokatu. Fokatzeko

hasieran torloju makrometrikoa erabiltzen da.

Fokatze finagoa lortzeko torloju mikrometrikoa

erabiliko dugu.

3. Ondoren, 40X objektiboa jarri eta fokatzeko

torloju mikrometrikoa erabili (makrometrikoa ez

litzateke beharrezko izan beharko).

4. Laginaren gainean olio tanta bat jarri eta 100X

objektibora pasatu. Objektibo hau erabiltzeko

olioa beharrezkoa da, era hortan difrakzio

arazoak ekiditzen baitira. Fokatzeko torloju

mikrometrikoa erabili

5. Beharrezkoa izanik, argi kopurua kontrolatzeko,

diafragmaren bidez argiaren sarrera kontrolatu

6. Behaketa guztiak amaitu ondoren eta

mikroskopioa gorde aurretik objektiboak garbitu

egin beharko dira (batez ere 100X objektiboa

olioa kentzeko). Bukatzerakoan estalkia jarri.

7. Mikroskopioa erabiltzen ez den bitartean argi-

iturria itzalita mantendu.




TINDAKETEN PRESTAKETA

Mikroskopioarekin mikroorganismoak behatzeko, hauek

portatan jarri beharko ditugu. Horretarako portatan

bakterioen hedapena prestatu beharko dira. Kasu

guztietan portan oso garbi egon beharko dira.

Bakterio hedapenaren prestaketa

1. Ereintza-euskarriarekin ur tanta bat jarri portaren

erdian.

2. Suaren gainean euskarria bertikalki jarriz

esterilizatu gori jarri arte bere luzera osoan.

3. Bakterioen kultiboa duen hodia hartu, suaren

ondoan ireki eta sutatik pasa, tapoia sutatik gertu

mantenduz. Esterilizatutako euskarria hodian

sartu, hoztu beirarekin kontaktuan eta zelula

kantitate txiki bat hartu. Euskarria hoditik atera,

hodia sutatik pasatu eta hodia itxi.

4. Euskarriarekin hartutako zelulak portan dagoen

ur tantan suspenditu eta ondoren hedatu portaren

azalera zehar kapa fin eta homogeneo bat lortuz.

5. Euskarria esterilizatu.

6. Prestaketa lehortu arte itxaron.

7. Zelulak portaren azalean finkatzeko, porta bi

aldiz sutatik pasatu. Honela bakteriak portan

geratzea lortuko dugu. Azkenengo hau lortzeko

alkohola eta zenbait konposatu kimiko ere erabili

daitezke, baina beroa da erabiliena.




Medio likido batetik abiatzen bagara, pauso berdinak

jarraitu behar dira, baina ur tantarik ez dugu behar

izango (mikroorganismoen suspentsioa jadanik

badaukagulako).




BEHAKETA FRESKUAN

Muntai hezea

Legamia, onddo eta algak behatzeko erabiltzen den prestaketa mota. Bakterio biziak

ikusteko ere erabili daiteke.

Mikroorganismoaren tanta bat portan jartzen da eta kubreobjektuarekin estali (aire

burbuilak ekiditu beharko dira). Ondoren mikroskopioan behatzen da.

Zintzilikaturiko Tanta

Kultibo-medio likido batetan hazten ari diren mikroorganismoak ikusteko erabiliko

dugu teknika hau.

1. Kubreobjektu baten lau izkinetan baselina pixka bat jarriko dugu.

2. Ereintza-euskarrierekin kultiboaren tanta bat hartuko dugu eta kubreobjektoaren

erdian jarriko dugu.

3. Kubreobjektuari buelta eman eta induzturiko porta baten sakonaldearen gainean

kokatuko dugu laginaren tanta.

Mikroorganismoaren tanta

Behaketarako, mikroskopioaren lOX objektiboarekin tantaren ertza fokatuko dugu

(ertza itsura ondulatudun lerro bat bezala ikusiko da). Ondoren 40X objektiboa jarri,

berriz ere ertza fokatu, eta azkenez lOOX objetiboa jarriko dugu (olioarekin). Tantaren

ertzean bakterioak ikusiko ditugu. Bakterio hauek, baldin eta flageloak badituzte

mugitzen ikusiko ditugu.

Experimentu hontan, behaketa mikroskopikoa egitean, bakterioak ez daudenez

tindatuta, behaketa zaila izango da. Behar beharrezkoa izango da kondentzadoretik




sartzen zaigun argi kopurua oso ondo kontrolatzea mikroorganismoak ikusi ahal

izateko.

TINDAKETA BEREIZGARRIAK

Tindaketa berezgarriak bakterioak sailkatzeko edo bereizteko erabili daitezke bakterioek

tintatzeko orduan erakusten dituzten propietateen arabera.

GRAM tintaketa

Bakterioen azterketarako erabiltzen den tintaketa bereizgarri garrantzitsuena da.

Tintaketa honek bakterioak bi taldetan banatzen ditu, bakterioen pareta

zelularraren ezaugarrien arabera: GRAM positiboak eta GRAM negatiboak.

Tindaketa egiteko mikroorganismoaren hedapen bat egingo da porta batetan,

sugarrean finkatu, eta ondoren tindatu:

1. Lagina kristal bioteta koloratzaile basikoarekin estali (minutu bat)

2. Urarekin garbitu

3. Lugolarekin estali (1 minutu). Lugola, iodoa duen fixatzailea da (Kristal

bioletaren finkapena baimentzen du).

4. Urarekin garbitu

5. Alkohol-azetonarekin dekoloratu (30 segundu). Gram negatiboetan,

pausu honek kristal bioleta kendu egingo du. Gram positiboetan ez da

dekolorazioa emango.

6. Urarekin garbitu

7. Safraninarekin edo fuktsinarekin tindatu (1 minutu). Kontraste tindaketa

da hau. Gram negatiboek kolore larrosa hartuko dute, eta Gram

positiboek kristal bioleta dutenez, azken koloratzaile hau ez da

Gram tindaketa:

Bazilo Gram negatiboak

Gram tindaketa:

Koko Gram positiboak




antzemango.

8. Urarekin garbitu

9. Sikatu

10. Behaketa mikroskopikoa.

Beraz, kolore urdinak direnak GRAM positibok direla esango dugu, eta kolore

larrosadunak GRAM negatiboak, eta normalki tindaketaren emaitza paretaren

izaerarekin erlaziona dezakegu.

Dena den, GRAM positibo edo negatiboak izateak tindaketa baten ondorioz

lortzen dugun kolorea adierazten du (urdina edo larrosa), eta ez derrigorrez

pareta zelularraren izaera. Hala ere, mikroorganismo askorentzat, eta batez ere

guretzat garrantzitsuak izan daitezkeen mikroorganismo askorentzat,

tindaketaren emaitza eta paretaren izaera erlazionatzea posible da.

Tindatzaileak gehitu ondoren, porta urarekin

garbitzen

Tindaktea ondoren porta sikatzen utziko dugu.

Gram tindaketa:

Koko Gram positiboak eta

bazilo Gram negatiboak




TINDAKETA SELEKTIBOA

Kapsularen tintaketa

Bakteria asko lodiera desberdina izan dezakeen kapsula batez inguraturik daude;

kapsula hauek zelula baino intentsitate txikiagoarekin tintatzen dira, eta ondorioz,

tindaketa arruntekin ez dira nabarmentzen. Kapsula hauek behatzeko tindaketa mota

egokia tindaketa negatiboa da. Tindaketa hontan koloratzaile azidoak erabiltzen dira

(koloratzaile azidoetan kolorea gatzaren ioi negatiboan oinarrituta dago, eta zelula

gehienak kanpoaldean karga negatiboa dutenez, ez dute koloratzailea hartzen eta

koloratzailea zelula inguratzen dagoen likidoan geratuko da).

Portaren izkina batetan tinta txina edo negrosina tanta bat jartzen dugu. Ereintza

euskarriarekin mikroorganismoen kopuru txiki bat hartuko dugu eta koloratzailearen

tantan suspendituko ditugu. Ondoren, beste porta baten ertzarekin eta koloratzailearen

tantatik hasita frotis bat egiten da portaren luzeran zehar. Era hontan koloratzailearen

kapa fin bat lortzen da, kapa fin hortan mikroorganismoak egongo direlarik. Lagina

airean lehortzen usten da, eta ondoren mikroskopioan behatzen da. Bakterioak dauden

lekuan kolore argia izango dugu (koloratzailerik gabe).

Tindaketa mota hau bakterioen morfologia ikusteko ere erabili daiteke.

Kapsulen tindaketa: hutsune zuriak kapsulen presentzia adierazten dute




Endosporen tintaketa

Bacillus eta Clostridium generoetako espezieek ingurune baldintzekiko oso

erresistenteak diren egiturak eratzen dituzte: endosporak. Endosporak, zelula

begetatiboak ez bezala, denbora epe luzetan baldintza desfaboragarrietan iraun

dezakete. Egitura hauek, tintatzaileekiko ere erresistentzia erakusten dute, tintaketa

mota gehienetan ez direlarik koloreztatzen. Hala ere, tintatu ondoren, koloratzailea

kentzea oso zaila da. Endosporak tintatzeko tintatzaile kontzentratuak berotan erabiltzen

dira.

Endosporen tindaketa: Wirtz metodoa

Endospora asko dituen bakterio kultibo zahar baten tanta bat portan jarri eta lehortzen

utzi (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium). Beroarekin fixatu. Malakita berdearekin

estali eta berotu lurrina irten arte. Horrela mantendu hiru minutuz. Urarekin garbitu eta

kontrastea lortzeko fuksina koloratzailea gehituko diogu minutu batez. Esporak kolore

berdea hartuko dute eta zelulek larrosa.

Endoporen tindaketa: endosporak kolore orlegi argia azaltzen dute, eta zelula begetatiboak larrosa.

Endosporak zelula begetatiboen barruan edo aske ager daitezke.

Gorputz metakromatikoen tindaketa

Bakterio batzuk polifosfatoz osoturiko bikorrak dituzte (gorputz metakromatikoak edo

bolutina bikorrak). Bikor hauek koloratzaile basikoekin tindatu eta koloratzailearen argi

xurgapenaren ezaugarriak alda ditzakete (horregaitik deritze metakromatikoak). Egitura

hauek lehenengo aldiz Spirillum volutans espezien aurkitu ziren (horregaitik bolutina




bikorrak izena). Lactobacillus generoan ere agertzen den egitura da (yogurta egiteko

Lactobacillus vulgaricus eta Streptococcus thermophilus erabiltzen dira)

Egitura zelular gehienak koloratzaile basikoekin tintatzen dira hauen inguruko pH-a

puntu isoelektrikoaren gainetik dagoenean (5 baino handiagoa). Bolutina osagai azidoez

osatua dagoenez, koloratzaile basikoekin tindatu ahal izateko medioaren azidotasuna

jeitsi egin beharko da bolutina bikorren eta koloratzaile basikoaren arteko afinitatea

lortzeko (pH <4).

Albert tintaketa

1. Lactobacillus kultiboaren (yogurta) hedapena portan egin eta airean lehortu.

2. Albert tintatzailearekin 5 minutuz estali.

3. Tintatzailea kendu, lugola gehitu minutu batez, urarekin garbitu, lehortu eta

100X objektiboarekin mikroskopioan behatu.

Gorputz metakromatikoak orlegi-urdin kolorez tintaturik ikusten dira, bakterioaren

gainontzeko zatiak orlegi argiak. Lactobacillus zelulen barruan puntotxoen segida bat

bezala azalduko dira gorputz metakromatikoak.

Yogurteko Lactobacillus -en barruan gorputz metakromatikoen tindaketa.

Gorputz metakromatikoak hiladatan agertzen dira baziloen barruan aurkitzen dutelarik,

eta batzutan kokoen hiladak dirudite.




ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

TEMA: Recuento de hongos en un alimento balanceado de marca comercial para

pollos

OBJETIVO: Determinar la presencia y recuento de hongos en un alimento

TÉCNICA: Método de las diluciones sucesivas y siembra en superficie de Agar

FUNDAMENTO: El presente análisis permite determinar la presencia de hongos

contaminantes, sean éstos ambientales o propios del alimento por contaminación

durante o después de su elaboración.

DESARROLLO: Pesar exactamente 10 gr del alimento a analizar cuya población

fúngica se desea estudiar. Añadir la muestra de alimento a 90 ml de H2O d/e (agua

destilada estéril contenida en un erlenmeyer, agitar hasta alcanzar la mayor disolución

posible. El contenido del erlenmeyer (agua más alimento) constituye la “suspensión

madre” .

Tener preparado 10 tubos de ensayos estériles con 9 ml de H2O d/e cada uno y 10

placas de Petri estériles con 0,1 ml de Rosa de Bengala (colorante), 0,1ml de

Clorenfenicol (antibiótico inhibidor de crecimiento bacteriano) y 10 ml de Agar papa

dextrosa (o Saboraud Glucosa).

Colocar en el primer tubo 1 ml de la suspensión madre , de esta forma obtendremos así

la primera dilución de la muestra, esto equivale a la dilución 1:10 que es lo mismo 10-1.

Colocar 1 ml de la dilución 1:10 al segundo tubo, obtendremos así la segunda dilución,

esto equivale a la dilución 1:100 que es lo mismo 10-2.

Colocar 1 ml de la dilución 1:100 al tercer tubo, obtendremos así la tercera dulución,


Colocar 1 ml de la dilución 1:1000 al cuarto tubo, obtendremos así la cuarta dilución,


Colocar 1 ml de la dilución 1:10000 al quinto tubo, obtendremos así la quinta dilución,


En todos los casos se hace por duplicado (utilizando de esta manera los 10 tubos

estériles con 9 ml de H2O d/e.

Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante y




Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante y

antibiótico y luego agregar el Agar estéril a una temperatura que pueda ser soportado

por la mano. (tener cuidado que solidifica muy rápidamente).

Una vez agregado el Agar agitar la placa por movimientos giratorios sobre la mesada.

En cada una de las placas de Petri se colocará 0,1 ml de cada uno de los tubos (utilizar

por cada una de las diluciones una pipeta estéril distinta) Tendremos así 5 placas

originales y 5 duplicados.

Proceder a sembrar la muestra sobre la superficie del Agar con espátula de Drigalsky

estéril (flameado sobre la llama y enfriada sobre la tapa de la placa). Dejar secar

sobre mesada y luego proceder a incubar las 10 placas previo rótulo con la dilución

que contiene, en forma invertida en estufa de cultivo a 27ºC durante 5 días.

Al cabo del 5º día de incubación proceder al realizar el recuento de colonias.

RECUENTO

Generalmente las placas que contienen las diluciones 1:10 y 1:100 (primeras dos

diluciones no se tienen en cuenta por la gran cantidad de colonias.

Se comienza la lectura de la última dilución hacia atrás.

Contar las colonias crecidas en cada una de las placas originales (se supone que tiene

que se idético al contaje en su duplicado).

El total de colonias se multiplica por 10 por el factor de dilución, es decir:

p. ej.: en la placa 5 cuya dilución es de 1:100000 lo que equivale a 10-5 se contaron 8

colonias, tendremos:

8 X 10 X 105 = 800.000 UFC/gr de alimento

Cuanto mayor sea la dilución, menor será el númeo de colonias que se tienen que

contar.

Nota: cuidado que no se multiplica p. ej.:X 10-5 sino por 105)




(Ver esquema de trabajo)

ESQUEMA DE TRABAJO:

10 grs.

90 ml agua

destilada estéril

1 ml

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e

dil. 1:10 dil. 1:100 dil. 1:1000 dil. 1:10000 dil. 1:100000

01 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb

0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color.

10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar

MUESTRA

ALIMENTO

Entseiu mikrobiologikoa

Education

Transcript of Entseiu mikrobiologikoa