Introducción

Materiales y métodos

Materiales:

Hielo

Solución de cianuro de sodio(NaCN) 0.1mM

Fotocolorímetro

Mortero

Tela para filtrar

Arena para realizar la trituración de la fruta

Fuente de tirosina(banano)

Solución de L-DOPA 0.03M

Buffer(pH=6.0)

Solución de fosfato 0.1M en

buffer(pH=7.2)

Metodos

Primero se preparó el extracto de la siguiente manera:

Se colocó entre 10 a 15 gramos de banano en el mortero preenfriado con 60 mL de buffer de fosfato 0.1M (pH= 7.2), se trituro la mezcla anterior agregando arena. Se filtró el extracto de fruta con la ayuda de un pedazo de tela para filtrar, después de esto se centrifugo durante 5 minutos, el sobrenadante se colocó en un beaker y este se enfrió introduciéndolo en un beaker mucho mas grande que contenía hielo. El extracto se diluyo en la proporción de 4 volúmenes.

Seguido de esto se procedió a preparar concentraciones finales de sustratos diluyendo volúmenes V1 de sustrato con 1 mL de extracto enzimático y se completaron con solución buffer (pH6.0) teniendo en cuenta que el volumen final de las diferentes diluciones debía ser 5 mL.

Tubo

Sustrato mL( L-DOPA 0.03M) extracto Buffer mL pH=6.0

1 0,5 1mL 3,52 1,0 1mL 3,03 1,5 1mL 2,54 2,0 1mL 2,05 2,5 1mL 1,5

Para hallar la nueva concentración de sustrato se aplicó la formula general de dilución:

CiVi/Vf=Cf

Tubo Concentración final (M)1 0,0032 0,0063 0,0094 0,0125 0,015

Una vez preparada cada dilucion de sustrato se comenzó a tomar las lecturas de absorbancia con intervalos de 5 minutos. Antes de la primera lectura se calibro el fotocolorímetro utilizando un tubo con solución blanco, el cual se preparó mezclando 1mL de extracto enzimático, 3mL de buffer (pH=6.0) y 1 mL en lugar de sustrato.

Absorbancia 445nm.

Se repitió el paso x pero agregando inhibidor gotas de solución de cianuro de sodio(NaCN) 0.1 mM.

Una vez obtenidos los resultados de absorbancia para cada concentracion de sustrato (C), se procedio a graficar la absorbancia vs tiempo. Se obtuvo una línea recta , cuya dependiente corresponde a la velocidad inicial.

Resultados

Sin inhibidor

Sustrato (S)f 1/(S)f Vi(abs/min)

1/vi Vi(l=0.1mM)

1/vi(=0.1mM)

0,5 0,003 -1470,5881,0 0,006 -12501,5 0,009 -3846,153852,0 0,012 2564,102562,5 0,015 6250