Enzimoinmunoensayos Nn
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ALUMNA: FÁTIMA KATHERINA CHAUCA DEL ÁGUILA UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL ESCUELA PROFESIONAL DE LABORATORIO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA LABORATORIO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA
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ALUMNA: FÁTIMA KATHERINA CHAUCA DEL ÁGUILA
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
ESCUELA PROFESIONAL DE LABORATORIO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA
LABORATORIO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA
Es una técnica inmunológica que utiliza enzimas como marcadores inmunoquímicos de los complejos Ag – Ac.
Una pequeña cantidad de enzima puede catalizar una gran cantidad de sustrato que permite amplificar la reacción Ag-Ac.
Gracias a esta técnica es posible detectar ínfimas cantidades de Ag o Ac en las muestras estudiadas.
1
• Posee gran sensibilidad, menor riesgo en el manejo de los reactivos y un tiempo de conservación mayor.
2
• Procedimientos técnicos rápidos y sencillos.
• Alta precisión y exactitud.
3
• Reactivos relativamente baratos y de larga vida.
• Procesos estandarizados.
4
• Con propósitos médicos se han aplicado en la determinación de hormonas, proteínas plasmáticas, antígenos tumorales, drogas, Ag de microoragnismos y Ac inducidos por la presencia de estos.
1
• La enzima utilizada debe estar altamente purificada y obtenerse de manera económica, debe poseer una actividad específica asociada.
2
• La enzima necesita para conjugarse con el Ag o el Ac un reactivo bifuncional, que en la mayoría de los casos es el glutaraldehído.
3
• La enzima no debe estar presente en los líquidos biológicos en cantidades suficientes como para interferir en la determinación.
4
• Solubles en agua, incoloros, inodoros, no mutagénicos, atóxicos
• Coeficientes de absorción molar elevado con máximo de absorbancia 340-600 nm.
• Gran estabilidad en el almacenamiento
EIA
EIA
HOMOGÉNEOS
EMIT
EIA HETEROGÉNEOS
ELISA
ELISA
SANDWICH
ELISA DE
CAPTURA
ELISA COMPETITIVO
Es un método sencillo y rápido, aunque su sensibilidad es menor que la de los EIA heterogéneos.
Se utilizan fundamentalmente en la determinación de hormonas y medicamentos.
La reacción Ag – Ac es el modulador de la actividad enzimática, que se puede medir sin necesidad de separar los componentes marcados de los no marcados.
Según técnica de unión no competitiva (clásicas)
EMIT
(ENZYME MULTIPLIED IMMUNOASSAY
TECHNIQUE)
SLFIA
(SUBSTRATE LABELED FLUORESCENT
IMMUNOASSAY)
PGLIA
(PROSTETIC GROUP LABELED
IMMUNOASSAY)
EMMIA
(ENZYME MODULATOR MEDIATED
IMMUNOASSAY)
CEDIA
(CLONED ENZYME DONOR
IMMUNOASSAY)
ECIA
(ENZYME CHANNELING IMMUNOASSAY)
Según técnica de unión no competitiva
EEIA
(ENZYME ENHANCEMENT IMMUNOASSAY)
EIA HOMOGÉNEO CON Ac BIOESPECÍFICO
EIA HOMOGÉNEO CON SUSTRATO INSOLUBLE
UTILIZA UNA ENZIMA PARA MARCAR EL HAPTENO BUSCADO (HORMONAS MEDICAMENTOS O DROGAS).
FRENTE A ESTA CONJUGADO SE UTILIZA UN Ac ESPECÍFICO DEL HAPTENO QUE, AL UNIRSE A ÉL, INHIBE LA ACTIVIDAD DE LA
ENZIMA.
Un hapteno es la parte de un antígeno que por sí sola no dispara la respuesta inmune, pero sí posee especificidad.
1
• SE PRODUCE UNA COMPETENCIA ENTRE EL HAPTENO LIBRE PRESENTE EN LA MUESTRA ANALIZADA Y EL HAPTENO MARCADO ENZIMÁTICAMENTE POR LOS SITIOS DE UNIÓN DEL Ac ANTI- HAPTENO.
2
• POSTERIORMENTE SE MIDE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA QUE PERSISTE DESPUÉS DE ESTA UNIÓN DEL HAPTENO A SU Ac , QUE SERÁ DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DEL HAPTENO LIBRE EN LA MUESTRA.
3
• LAS ENZIMAS MÁS UTILIZADAS SON B- GALACTOSIDASA LA MALATO-DESHIDROGENASA Y LA GLUCOSA-6-FOSFATO-DESHIDROGENASA.
Un grupo prostético es el componente no aminoacídico que forma parte de la estructura de las heteroproteínas o proteínas conjugadas, estando unido covalentemente a la apoproteína
Este tipo de análisis son los que presentan mayor sensibilidad .
Para medir la actividad de la enzima es necesario la separación de los componentes marcados, que puede ser por precipitación o por la fijación del Ac o Ag a una fase sólida.
ELISA (ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY), técnica que permite detectar tanto Ag como Ac y consiste en una enzima conjugada a un Ac que reacciona con el sustrato adecuado produciendo color.
Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa.
UTILIZAREMOS UN
Ac ESPECÍFICO FIJADO A UNA FASE SÓLIDA.
INCUBAMOS EL SUERO PROBLEMA QUE CONTIENE EL Ag BUSCADO, DESPUÉS PROCEDEMOS AL LAVADO
PARA ELIMINAR LOS COMPONENTES DEL SUERO
PROBLEMA QUE NO HAN REACCIONADO.
AÑADIMOS Ac MARCADO ENZIMÁTICAMENTE QUE SE UNE AL Ag DEL SUERO POR
OTRO DETERMINANTE ANTIGÉNICO, FORMANDO
ASÍ EL SANDWICH. LAVAMOS Y AÑADIMOS EL SUSUTRATO CROMOGÉNICO ESPECÍGICO
DE LA ENZIMA Y SE PRODUCE COLOR.
ESTA TÉCNICA SE UTILIZA
FUNDAMENTALMENTE EN LA DETECCIÓN DE Ac.
SE UTILIZA UNA ANTI INMUNOGLOBULINA
HUMANA FIJADA A LA FASE SÓLIDA.
LOS Ac PRESENTES EN LA MUESTRA SE UNIRÁN AL Ac
ANTIGAMMAGLOBULINA HUMANA, SE PROCEDE AL
LAVADO
POSTERIORMENTE SE AÑADE UN Ag ESPECÍFICO PARA EL Ac BUSCADO . SE INCUBA Y DESPUÉS SE HACE OTRO LAVADO. AHORA SE AÑADE UN Ac ESPECÍFICO PARA EL Ag DE LA FASE ANTERIOR, PERO MARCADO ENZIMÁTICAMENTE. EL ÚLTIMO PASO ES LA EDICIÓN DE UN SUSTRATO CROMOGÉNICO ESPECÍFICO DE LA ENZIMA.
ESTA TÉCNICA
DETERMINA PRINCIPALMENTE EL
Ag. UTILIZAREMOS UN Ac ESPECÍFICO FIJADO
A UNA FASE SÓLIDA.
EL PRIMER PASO ES AÑADIR AL POCILLO CON
EL Ac FIJADO, LA MUESTRA PROBLEMA CON EL Ag
BUSCADO
Y ESE MISMO Ag MARCADO ENZIMÁTICAMENTE. AL
INCUBAR SE PRODUCE UNA COMPETENCIA POR LOS
SITIOS E UNIÓN DEL AC . SE LAVA Y SE AÑADE EL
SUSTRATO ESPECÍFICO DE LA ENZIMA. EL COLOR SERÁ
INVERSAMENTE PROPORCIONAL A LA
CONCENTRACIÓN DEL ANTÍGENO PRESENTE EN LA
MUESTRA.
Simplicidad Reactivos empleados en pequeños volúmenes. La separación de reactante libres y ligados es hecha por un simple procedimiento de lavado La adsorción pasiva de proteínas al plástico es fácil El equipo especializado es de fácil disponibilidad Lectura El producto final coloreado puede ser leído a simple vista para evaluar como ha sido trabajado el test (evitando esperar los resultados como en el RIA) Espectrofotómetros multicanal cuantifican los resultados Sensibilidad Niveles de detección de 0.01 a 1.0 ug/ml Niveles ideales para la mayoría de diagnósticos Reactivos Comercialmente disponibles Ofrecen diseños bastante flexibles Costo Aceptabilidad (Estandarizados) Seguridad Reactivos no mutagénicos La eliminación de los desechos no es problemática Disponibilidad Elisa puede ser desarrollado en cualquier lugar aun en laboratorios de baja complejidad
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