Universidad de Oriente - Núcleo BolívarEscuela de Ciencias de la Salud “Dr. Francisco Battistini Casalta”

Departamento de Ciencias FisiológicasLaboratorio de Bioquímica

Profesora:Amintan Cardozo

Integrantes:GRUPO DE LOS JUEVES A1

Ciudad Bolívar, Junio 2010

Integrantes:Br. Durant, Carlos Br. Lunar, Xiolimar Br. Rodríguez, Jorge

Br. Velásquez, Karina

INTRODUCCIÓN

La enzimología es una disciplina bioquímica ajustada en el estudio y caracterización de las enzimas, que son biomoléculas proteicas o ribonucleicas que catalizan reacciones químicas en los sistemas biológicos. Estudia, por ello: la implicación de las enzimas en el metabolismo; su estructura; su cinética; su posible aplicación en la biotecnología enzimática; su variabilidad en la filogenia; los adyuvantes enzimáticos, como los cofactores y las coenzimas; etc.

Ahora bien, en este caso se investigó con La lactato deshidrogenasa (LDH) que es una enzima catalizadora que se encuentra en numerosos tejidos del cuerpo formada por dos tipos de subunidades M y H, pero su presencia es mayor en el corazón, hígado, riñones, músculos, glóbulos rojos, cerebro y pulmones. Las subunidades M prevalece en el músculo esquelético y el hígado y la subunidades H prevalecen en el corazón.

Pertenece a la categoría de las oxidorreductasas, dado que cataliza una reacción redox, en la que el piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+. Dado que la enzima también puede catalizar la oxidación del hidroxibutirato, ocasionalmente es conocida como Hidroxibutirato Deshidrogenasa (HBD).

Participa en el metabolismo energético anaerobio, reduciendo el piruvato (procedente de la glucólisis) para regenerar el NAD+, que en presencia de glucosa es el sustrato limitante de la vía glucolítica.

Los vertebrados, en algunos tejidos o tipos celulares, obtienen la mayor parte de su energía del metabolismo anaerobio (toda en el caso de eritrocitos dado que carece de mitocondrias).

Por otra parte; los objetivos a estudiar en la experiencia son las siguientes:

Interpretar un diagrama de flujo Extraer una enzima tisular Extraer una coenzima tisular Diferenciar método de extracción para una enzima y para una

coenzima. Describir el concepto de isoenzima Describir el mecanismo de acción del azul de metileno. Explicar el papel del aceite en los tubos de reacción Interpretar la actividad enzimática en distintos extractos tisulares

RESULTADOS

Para la elaboración de esta práctica de laboratorio se requirió los siguientes materiales: 10 ml de una solución buffer salina pH 7,2 por gramo de tejido (en frío); 6 ml de lactato de sodio al 1%; 4 ml de azul de metileno al 0,01%; 8 ml de aceite y un animal de experimentación que en este caso fue un conejo.

A fin de la obtención del homogenado y enzima inactiva (apoenzima) se procedió al sacrificio del animal mediante un golpazo muy contundente. Con el fin de eliminar la LDH y lactato presentes en eritrocitos y plasma, se realiza un corte a nivel del paquete vásculo-nervioso del cuello y se le deja desangrar; luego se procede con la vertiginosa y rápida disección del hígado; con el objeto de obtener un parámetro de peso como referencia se determina y registra el peso del tejido que fue de 20 gramos y se continúa con el seguimiento de los siguientes pasos para la obtención y la separación de la LDH y el NAD+:

Se añadió 10 ml de buffer fosfato NaCl 0,9% por cada gramo de tejido; luego de homogeneizar en frío durante 10 min se separan en 2 tubos de ensayo a cantidades iguales la solución, una mitad se lleva a incubación a ebullición en baño de María por 10 min, luego de transcurrido el tiempo se enfría el dializado, se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min, por último se descarta el precipitado y la coenzima se obtiene del sobrenadante; la otra mitad se llevo a centrifugar a 3000 rpm durante 10 min y del sobrenadante se obtiene la enzima sin dializar.

Para la demostración de la actividad enzimática se procede a la preparación de una serie de tubos como se indica a continuación:

Reactivo/ tubo 1 2 3 4 5 6 7Enzima sin dializar 2ml ----- 2m

l---- 2ml ---- ----

Enzima dializada ---- 2ml ---- 2ml 2ml ----Coenzima ---- 2ml 2m

l---- 2ml 2ml 2ml

Lactato de sodio 2ml 2ml 2ml

2ml ---- ---- 2ml

Azul de metileno 1ml 1ml 1ml

1ml 1ml 1ml 1ml

Agua destilada 3ml 1ml 1ml

3ml 3ml 3ml 3ml

El tubo N° 1 corresponde al control de coenzima con enzima sin dializar, el N° 2 al control de reacción con enzima dializada, N° 3 control de reacción de enzima sin dializar, N° 4 control de coenzima con enzima dializada, N° 5 control de sustrato con enzima sin dializar, N° 6 control de sustrato con enzima dializada y el N° 7 control de enzima.

Por último se añade 1 gotero de aceite a cada tobo para cubrir el medio reaccionante y aislarlo del oxigeno del ambiente. Se conducen los tubos de ensayo a un baño de María a 37 grados centígrados haciendo observaciones cada 5 min hasta la total decoloración del azul de metileno (no más de 45 min).

Tabla de resultados de la experiencia:

Tiempo (minutos)

Decoloración del azul de metileno (Hígado)

Tubo n°1 Tubo n° 2 Tubo n° 3 Tubo °4 Tubo n °5 Tubo n° 6 Tubo n° 7

0 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

5 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

10 0% 5% 0% 5% 0% 5% 0%

15 0% 10% 5% 15% 5% 15% 0%

20 0% 25% 10% 20% 10% 20% 0%

25 10% 30% 25% 30% 20% 30% 0%

30 15% 50% 30% 50% 38% 50% 0%

35 20% 55% 35% 50% 50% 50% 0%

40 27% 60% 45% 60% 70% 60% 0%

45 30% 60% 50% 60% 78% 60% 0%

DISCUSIÓN

Las enzimas son catalizadores biológicos específicos que catalizan las reacciones que ocurren en un organismo, aumentando notablemente la velocidad de las mismas en condiciones óptimas.

Existen enzimas que necesitan de uno o más componentes no proteicos para realizar su actividad; estos son conocidos como cofactores y pueden ser coenzimas o iones metálicos. Cuando la enzima está junto con su cofactor, está activa y es llamada Holoenzima; cuando está separada de su cofactor es llamada Apoenzima y es la parte proteica, inactiva.

La diálisis es un proceso en el cual una sustancia pasa a través de una membrana porosa hacia un medio carente de ella misma por simple difusión. Las coenzimas se pueden dializar ya que poseen un peso molecular bajo, lo que hace posible que pasen por los poros de la membrana. Sin embargo, esto no le es posible a la apoenzima, que al tener un peso molecular alto, no puede pasar por los poros de la membrana de diálisis.

Al realizar la diálisis a una holoenzima, separamos la parte proteica de la coenzima y restos de sustrato y tejido. Esto significa que una enzima dializada requiere de coenzima para realizar su actividad.

La L-lactato: NAD+ óxido-reductasa es una enzima que requiere de una coenzima para poder realizar su actividad. Esta utiliza NAD+ como coenzima y realiza su actividad de oxido-reducción sobre el L-lactato. Su mecanismo de reacción es el siguiente:

COOH

C

CH3

HO H

COO-

C

CH3

O

E-NAD+ E-NADH H+

Lactato Piruvato

El Azul de Metileno es un colorante utilizado para medir la actividad enzimática. Este actúa como aceptor de equivalentes reducidos, decolorándose, lo que indica actividad de L-lactato NAD+ óxido-reductasa.

El tejido con el que trabajamos fue el tejido hepático. En el hígado la L-lactato: NAD+ óxido-reductasa actúa oxidando el lactato a piruvato. El tejido hepático es un tejido que contiene una alta cantidad de oxígeno, por lo cual tiene una gran afinidad con el lactato.

En la experiencia de laboratorio, realizamos la experimentación con Hígado de conejo. La práctica fue realizada con la enzima sin dializar y coenzima. En la experimentación se consiguió:

Con enzima sin dializar (Hígado):

Tubo N° 1:

Se preparó con la enzima sin dializar del tejido hepático, lactato de sodio, azul de metileno, agua y aceite. La reacción se colocó en un baño de María a 37ºC y empezó a presentar cambio de color a los 25 minutos alrededor de 10%, y a los 45 minutos de calentarse tuvo un cambio de coloración final de un allegado 30% con respecto al tubo control (tubo Nº7).

Esto demuestra que la actividad enzimática de la Lactato deshidrogenasa fue baja. Este cambio de coloración fue muy bajo al que debe alcanzar el tejido hepático, ya que éste tejido tiene un alto contenido de oxígeno y por lo tanto, alta afinidad con el lactato, y se oxida el lactato a piruvato. Esto pretende decir que posiblemente sobrevino un error al distribuir el material enzimático o en los preparativos de los tubos.

Tubo N° 3:

Se elaboró con la enzima sin dializar del tejido hepático, coenzima, lactato de sodio, azul de metileno, agua y aceite. La reacción se colocó en un baño de María a 37ºC y inició a presentar cambio de color a los 15 minutos aproximadamente de 5%, y a los 45 minutos de calentarse tuvo un cambio de color final de un aproximado de 50% con respecto al tubo control.

La actividad de la Lactato deshidrogenasa en este caso fue un poco mayor en relación al tubo Nº 1, debido a que en esta ocasión se agregó la coenzima (NAD+), que trabaja junto con la holoenzima en la oxidación del lactato, así que hay mayor cantidad de equivalente reducidos, aunque sigue siendo un poco más baja de la que correspondería presentar.

Tubo N° 5:

Se realizó con la enzima sin dializar del tejido hepático, coenzima, azul de metileno, agua y aceite. La reacción se colocó en un baño de María a 37ºC y comenzó a presentar cambio de color a los 15 minutos por ahí del 5%, y a los 45 minutos de calentarse tuvo un cambio de color final de un aproximado de 78% con relación al tubo control.

En este tubo no se adicionó lactato de sodio como sustrato, pero la enzima opera utilizando como sustrato el lactato presente en el tejido hepático, por lo que hubo decoloración. Sin embargo, dado a que la cantidad de sustrato es menor en este caso, el cambio de coloración debería ser menor que en el tubo anterior. Esto hace sospechar un error en la preparación del material enzimático o en la preparación de los tubos.

Con enzima dializada (Hígado).

Las reacciones con enzima dializada fueron ejecutadas por el equipo de laboratorio. Con los datos obtenidos, tenemos:

Tubo N° 2:

Se plasmó con la enzima dializada del tejido hepático, coenzima, Lactato de sodio, azul de metileno, agua y aceite. La reacción se colocó en un baño de María a 37ºC y empezó a presentar cambio de color a los 10 minutos cerca del 5%, y a los 45 minutos de calentarse tuvo un cambio de color final de un acercado del 60% con respecto al tubo control.

La decoloración en este caso fue correcta, ya que hubo actividad enzimática por la presencia de la enzima dializada (apoenzima) y su cofactor o coenzima (NAD+). Estos hacen que haya equivalentes reducidos y por lo tanto, decoloración del azul de metileno.

Tubo N° 4:

Se preparó con la enzima dializada del tejido hepático, Lactato de sodio, azul de metileno, agua y aceite. La reacción se colocó en un baño de María a 37ºC y comenzó a presentar cambio de color a los 10 minutos aproximadamente de 5%, y a los 45 minutos de calentarse tuvo un cambio de color final de un aproximado de 60% con respecto al tubo control.

Dado a que en este tubo solo se agregó apoenzima y no se agregó el cofactor, se supone que no debe haber actividad enzimática porque la apoenzima es inactiva. Sin embargo, hubo decoloración del azul de metileno. Esto puede deberse a un error en los preparativos del material enzimático.

Tubo N° 6:Se realizó con la enzima dializada del tejido hepático, Coenzima, azul de

metileno, agua y aceite. La reacción se colocó en un baño de María a 37ºC y emprendió a presentar cambio de color a los 10 minutos aproximadamente de 5%, y a los 45 minutos de calentarse tuvo un cambio de color final de un aproximado de 60% con respecto al tubo control.

En este tubo no se agregó lactato de sodio, pero la apoenzima y la coenzima actuaron sobre el lactato de sodio que hay presente en el tejido hepático.

EJERCICIOS

1°- ¿Cómo explicaría usted el hecho que, el azul de metileno una vez decolorado por la acción enzimática recupere nuevamente su color?

Rta: El azul de metileno es utilizado en la práctica como aceptor de equivalentes reducidos y se decolora en presencia de los mismos. En la reacción de oxidación de lactato a piruvato ocurre la reducción de la coenzima de NAD+ a NADH+ produciendo la decoloración del azul de metileno. Es ineludible recordar que la reacción de la LDH es reversible. Por lo tanto, ocurre la trasformación de lactato a piruvato y de piruvato a lactato.

En el caso de la segunda reacción, ocurre la reducción de piruvato a lactato y la oxidación de NADH+ a NAD+, por lo tanto no se presentan equivalentes reducidos de la coenzima sino oxidados y por esta razón el azul de metileno recobra su color original.

2°- ¿Qué resultados pueden tener concentraciones altas de oxígeno sobre la proteína catalítica estudiada?

Rta: Las concentraciones altas de oxígeno pueden modificar la dirección de la reacción catalizada por la LDH. En tejidos donde se hallan en altas concentraciones de oxígeno (por ejemplo: tejido hepático) ocurre la oxidación de lactato a piruvato, produciendo mayor cantidad de NADH+ como equivalente reducido de la reacción.

3°- ¿Cuál sería el método ideal para separar el complejo enzima – coenzima?

Rta: La diálisis, debido a que la enzima por su elevado peso molecular no atraviesa la membrana de diálisis, mientras que la coenzima por su pequeño peso molecular atraviesa la membrana; logrando así separar la enzima de la coenzima, conservando las propiedades de la enzima y por ende su actividad.

CONCLUSIÓN

1.- Cada célula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que produce continuos cambios en su estado bioquímico, en la base de la cual están las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintéticos y analíticos.

2.- La coenzima puede considerarse como un segundo sustrato por dos razones: en primer lugar, los cambios químicos en la coenzima compensan exactamente a los que realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones u oxidorreducción (deshidrogenasa), una molécula de sustrato es oxidada y una molécula de coenzima es reducida.

3.- El significado fisiológico se expresa en la capacidad del músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no residen en el piruvato ni en el lactato. La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD+. Sin NAD+ la glucólisis no puede continuar y la síntesis anaerobias de ATP tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reducción del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la síntesis de ATP.

4.- Las isoenzimas es otro tipo de regulación metabólica, de forma múltiple de una determinada enzima, que se puede presentar en una sola especie de organismo e incluso en una sola célula. La existencia de estas formas puede detectarse y separarse. La lactato- deshidrogenasa por ser de esta clase, se presento en varias fracciones, difieren en su composición de aminoácido y por lo tanto en los valores de sus pH isoeléctricos.

5.- La biosíntesis de los tipos de cadenas y por lo tanto, las cantidades relativas de las isoenzimas del lactato-deshidrogenasa presentes en una determinada célula están bajo regulación genética. Además, las proporciones relativas de los lactatos-deshidrogenasa en un tejido pueden variar durante el desarrollo embrionario.

6.- Algunos estudios cinéticos del lactato-deshidrogenasa han demostrado que aunque todos ellos catalizan la misma reacción, difieren significativamente en sus valores de Km respecto a sus sustratos, particularmente respecto al piruvato, así como en los valores de Vmáx cuando el sustrato es el piruvato.

7.- Después de haber cumplido la experiencia se logró obtener la reacción del lactato- deshidrogenasa de los tejido usados (corazón, músculo e hígado), constado por la decoloración del azul de metileno, ya que capta los equivalentes reducidos, en las muestras de corazón e hígado, por la presencia de alta concentraciones de oxigeno, además de la presencia de la enzima no dializada, coenzima y sustrato. Considerando que en la muestra de músculo esquelético no hay cambios por bajas concentraciones de oxígeno, que llevan a la no producción de equivalentes reducidos.

BIBLIOGRAFÍA

Lehninger, Albert L. Principios de Bioquímica. Ediciones Omega, S.A. X 3era Edición. Año: 2000.

McKee, T., McKee, J. Bioquímica: La base molecular de la vida. Editorial McGraw-Hill Interamericana. 3ra edición. Año: 2003.

Spinetti, M. Manual de Bioquímica. Editorial Científico-Medica. 3ra Edición. Año: 1959.