2. ESCOGIENDO UN VECTOR DE CLONACIÓN Andrew Preston

1. INTRODUCCIÓN

Desde la construcción de la primera generación de vectores de clonación generales a inicios de 1970, el número de plásmidos creados ha aumentado considerablemente. Así, una decisión crítica a la cual actualmente tienen que hacer los investigadores es ¿Qué plásmido usar en un proyecto en particular? A pesar de la desconcertante elección de uno comercial y otros vectores disponibles, la elección de cual vector de clonación utilizar, puede ser decidido aplicación ciertos criterios: tamaño del inserto, número de copias, incompatibilidad, marcador seleccionable, sitios de clonación y funciones especializadas del vector. Muchos de estos criterios son dependientes uno del otro. Este capítulo discute estos criterios en el contexto para escoger un plásmido para su uso como vector de clonación y la Tabla 1 muestra las características de los vectores de clonación más comúnmente usados.

2. CRITERIOS PARA ESCOGER UN VECTOR DE CLONACIÓN

2.1. Tamaño del inserto Para proyectos en los cuales se desea que se clone una pieza especifica de ADN, una consideración es el tamaño del inserto de ADN. La mayoría de los plásmidos de clonación generales pueden llevar un inserto de ADN mayor o tamaño alrededor a las 15kb. Insertos de un tamaño mayor restringen en la correcta replicación de los plásmidos (particularmente para vectores de alto número de copias) y pueden causar problemas con la estabilidad del inserto. Muchos tipos de vectores se encuentran disponibles para la clonación de largos fragmentos de ADN. Estos son los más comúnmente usados para construir librerías de clones que a veces son representativas de todo el genoma. Las librerías de clones son entonces proyectadas para identificar el clon en particular que lleva el ADN de interés. 2.1.1. Cosmidos (1,2) Los cósmidos son un tipo de vector convencional que contienen una pequeña región del ADN del bacteriófago λ conteniendo un extremo cohesivo (cos). Este contiene todos los elementos que actúan en cis para el empaquetamiento del ADN viral dentro de las particulas λ. Para clonar ADN en estos vectores fragmentos de ADN linear genómico es ligado in vitro al vector de ADN y este es entonces empaquetado dentro de las partículas del bacteriófago. En la introducción a células huésped de E. coli, el vector es circularizado para formar un plasmido largo que contendrá el fragmento de ADN clonado. Los cosmidos son usados más comúnmente para generar grandes librerías de insertos. Gracias a estas

restricciones de empaquetamiento, el vector más el inserto deberían abarcar un tamaño entre 28 y 45kb.

Tabla 1 MCS= Multiplies sitios de clonación Vectores de clonación más usados

Plásmido

Caracteristias

Fuente comercial

pUC18, pUC19

Tamaño pequeño (2.7kb) Alto número de copias

Multiples sitios de clonación Marcador resistente a la

ampicilina Selección Azul/Blanca

NEB

Vector pBluescript

As Puc Sitio de replicación de cadena

sencilla Promotores T7 y SP6

flanqueantes de MCSa

Stratagene

Vectores pACYC Bajo número de copias (15

copias por celula) Origen de replicación p15A

NEB

Supercos

Vector cósmido Dos sitios cos

Tamaño del inserto de 30-42kb Marcador afín a la ampicilina

Promotores T3 y T7 flanqueantes al sitio de

clonación

Stratagene

EMBL3

Vector reemplazante de λ Sitios MCS: SalI, BamHI y

EcoRi

Promega

λ zap

Vector λ

Escisión in vivo en Vector fagémido pBluescript

Capacidad de clonación de 10kb

Selección Azul/Blanco

Stratagene

pBeloBAC11

Vector BAC Inserto mayor de 1Mb Promotores T7 y SP6

flanqueantes al sitio del inserción

Selección Azul/Blanco

NEB

Sitio cos Sitio LoxP

2.1.2. Vectors λ El genoma del bacteriófago λ comprende 48.502 pb. Al entrar en la célula huésped, el fago adopta una de dos ciclos de vida: crecimiento lítico o lisogenia. En el crecimiento lítico, aproximadamente 100 nuevos viriones se sintetizan y envasados antes de la lisis de la célula huésped, liberando la progenie del fago para infectar nuevos huéspedes. En la lisogenia, el genoma del fago se somete a la recombinación en el cromosoma huésped, donde se replica y se hereda junto con la sede de ADN (3). Cuál de los dos ciclos de vida diferentes se adopta, se determina por la multiplicidad de la infección y el estado nutricional de la célula huésped. Cuanto mayor sea la multiplicidad de la infección y el más pobre es el estado nutricional de la célula, la lisogenia se ve más favorecida. El uso de λ como un vector de clonación implica sólo el ciclo lítico. Esto hace que el tercio medio del genoma λ, que codifica funciones para la regulación de la expresión génica y el establecimiento de la lisogenia, sea redundante para estos fines. Es esta la capacidad de reemplazar esta porción del genoma con ADN extraño sin afectar el ciclo de vida lítico que hace que λ útil como vector de clonación. Vectores λ de inserción tienen el ADN no esencial suprimido y contienen un solo sitio para la inserción de ADN. Típicamente 5-11 kb de ADN extraño puede ser acomodado en estos vectores. Los vectores de repuesto contienen sitios de restricción específicos que flanquean los genes no esenciales. La digestión del ADN vector lineal en estos lugares produce dos "brazos" que se ligan al ADN extraño. Muchos vectores λ disponibles comercialmente se venden como brazos predigeridos y purificados. Los vectores de sustitución típicamente pueden alojar entre 8 y 24 kb de ADN extraño, dependiendo del vector. Durante la fase temprana de la infección, λ ADN se replica de manera bidireccional, en forma circular desde un único origen de replicación antes de cambiar a la replicación a través de un modo de círculo rodante. Esto produce un concatémero de genomas en una disposición de cabeza a cola que se procesa a continuación para dar los genomas individuales para el envasado. El cambio a la replicación de círculo rodante depende de la interacción entre las funciones de recombinación del codificado de huésped y el fago. Como el dominio de la recombinación de diferentes vectores λ puede variar, se insta al investigador para asegurar que la cepa de E. coli usado para la infección es capaz de replicarse correctamente el fago. Esta información se suministra generalmente con vectores disponibles comercialmente. Un gran número de características que ayudan en la clonación y selección de fago recombinante también se han incorporado en vectores λ. A menudo, el uso de estas funciones también necesita el uso de cepas huésped particulares. 2.1.2. Cromosomas artificiales bacterianos (5,6)

Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son moléculas de ADN circulares. Contienen un replicón que se basa en el factor F que comprende oriS y repE codificando una helicasa impulsada por ATP junto con parA, parB y parC para facilitar la partición precisa (véase el Capítulo 1). El factor F es capaz de transportar hasta un cuarto del cromosoma de E. coli y, por lo tanto, BAC son capaces de mantener insertos de ADN muy grandes (a menudo hasta 350 kb); sin embargo, muchas bibliotecas BAC contienen inserciones de alrededor de 120 kb. Las versiones más recientes de vectores de BAC contienen sitios para facilitar la recuperación de ADN clonado (por ejemplo, loxP) (7). Un fragmento de ADN se clona en vectores de BAC en una manera similar a la clonación en vectores de clonación generales; ADN es ligado a un vector linealizado y luego introducido en una cepa de E. coli de clonación por electroporación. 2.2. Número de Copias Diferentes vectores de clonación se mantienen a diferentes números de copias, dependiendo del replicón del plásmido (ver Capítulo 1). En la mayoría de los casos en los que se clona un fragmento de ADN para el mantenimiento y amplificación de la manipulación posterior, mayor es el rendimiento del plásmido recombinante a partir de cultivos de E. coli, el mejor. En este escenario, un vector de alto número de copias es deseable, como aquellos cuya replicación es impulsada por el replicón ColE1 (8). Los plásmidos basados en ColE1 originales tienen un número de copias de 15-20. Sin embargo, un replicón ColE1 mutante, como se encuentra en la serie de pUC de plásmidos (9), produce un número de copias de 500-700 como resultado de una mutación puntual dentro de la molécula reguladora de ARNII (ver Capítulo 1) que la hace más resistente a la inhibición por RNAI (10). Cabe señalar que esta mutación es sensible a la temperatura. El ARNII mutante es resistente a la inhibición de ARNI a 37 ° C o 42 ° C pero no a 30 ° C, temperatura a la cual el número de copias de plásmidos pUC vuelve al plásmido ColE1 no mutado. En algunos casos, un número alto de copias puede causar problemas para la clonación de ADN. Por ejemplo, el ADN clonado puede codificar proteínas que son tóxicas para la célula cuando está presente en niveles altos. Esto es particularmente cierto en proteínas de membrana. Incluso si la proteína se expresa pobremente a partir del ADN clonado, la presencia de muchos cientos de copias del gen en el plásmido puede elevar el nivel de proteína a niveles tóxicos. En estos casos, el uso de un plásmido con un número de copias inferior puede reducir la dosis de genes por debajo de un nivel en el que se produce toxicidad. Por ejemplo, pBR322 está basado en el replicón original de ColE1 y por lo tanto tiene un número de copias de 15-20 (11). La serie de plásmidos pACYC están basados en el replicón p15A, que tiene un número de copias de 18-22 (12). Plásmidos de bajo número de copias incluyen pSC101 (número de copias alrededor del 5) (13), mientras que BAC se mantienen a una copia por célula (5). 2.3. Incompatibilidad

La incompatibilidad se refiere al hecho de que los diferentes plásmidos a veces no pueden coexistir en la misma célula. Esto ocurre si las dos plásmidos diferentes comparten funciones que son necesarias para la replicación y / o partición de las células hijas. La competencia directa para estas funciones a menudo conduce a la pérdida de uno de los plásmidos de la célula durante el crecimiento de un cultivo. El tamaño de plásmido también puede influir en el mantenimiento dentro de un cultivo, como plásmidos más grandes requieren más tiempo para la replicación y, por lo tanto, puede ser invadida por una replicación más rápida de los plásmidos más pequeños. Por lo tanto, plásmidos basados en ColE1 son incompatibles con otros plásmidos basados en ColE1 pero son compatibles con R6K o plásmidos basados en p15A. La incompatibilidad sólo se convierte en un problema si se requiere que los dos plásmidos se mantengan juntos (por ejemplo, si la clonación en una cepa de E. coli que contiene un plásmido auxiliar) (véase el Capítulo 3) 2.4. Marcador seleccionable La introducción de plásmidos en células de E. coli es un proceso ineficiente. Por lo tanto, se requiere de un método de selección de aquellas células que han recibido un plásmido. Además, las células que no contienen un plásmido tienen una ventaja de crecimiento sobre los que lo hacen y, por lo tanto, tienen que replicar tanto en el cromosoma como en el ADN plásmido adicional. Esto tiene una consecuencia particular cuando se trata de un alto número de copias o grandes plásmidos. En este caso, una presión selectiva debe ser impuesta para el mantenimiento del plásmido. Casi todos los plásmidos convencionales utilizan un gen de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable, llevado en la columna vertebral del vector. Por lo tanto, la adición del antibiótico adecuado al medio de crecimiento matará las células que no contienen el plásmido y producen un cultivo en el que todas las células contiengan un plásmido. En muchos casos, la elección del antibiótico no está restringido. Sin embargo, algunas cepas de clonación de E. coli son inherentemente resistentes a algunos antibióticos y, por lo tanto, el mismo antibiótico no se puede utilizar como una selección de aquellas células que llevan un plásmido en particular. El genotipo de la cepa de clonación deseado se debe comprobar antes de la clonación (ver Capítulo 3). En algunas situaciones, las aplicaciones posteriores hacen que algunos antibióticos no sean opciones adecuadas. Por ejemplo, la mutación de los genes en fragmentos de ADN clonados se realiza generalmente mediante la interrupción del gen mediante la inserción de un casete de resistencia a los antibióticos. Este tanto muta el gen como actúa como un marcador para la mutación. A menudo, la mutación se introduce en el organismo del que se deriva el ADN. En este caso, sólo algunos antibióticos son adecuados para su uso debido a las restricciones particulares sobre la introducción de resistencias a antibióticos en algunas bacterias contra las que el antibiótico se utiliza como un agente terapéutico o debido a la resistencia inherente del organismo original al antibiótico. En estos proyectos, el vector no debería conferir resistencia al antibiótico para ser utilizado en la aplicación de corriente abajo.

Algunos vectores plasmídicos contienen dos casetes de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, pACYC177 contiene tanto genes de resistencia a la kanamicina como a la ampicilina. Muchos de los sitios de clonación en este vector se encuentran en estos genes y la clonación en uno de estos sitios inactiva la resistencia de un antibiótico particular. Los perfiles de las resistencias a los antibióticos de clones recombinantes son una manera de seleccionar aquellos que llevan fragmentos de ADN de inserción. Vectores más recienten llevan ahora sitios de clonación especializados (poliengarce, sitio de clonación múltiple; ver Subtítulo 2.5.) que aquellos en los que la clonación de ADN del inserto no interfiere con funciones vectoriales inherentes. Las resistencias a los antibióticos más comunes realizados en los vectores utilizados en E. coli son la resistencia a la ampicilina, kanamicina, tetraciclina y cloranfenicol. 2.4.1. Ampicilina Este fármaco inhibe la transpeptidasa bacteriana implicada en la biosíntesis de peptidoglicano y por lo tanto inhibe la biosíntesis de la pared celular (14). Como tal, la ampicilina inhibe las fases log de las bacterias pero no aquellos en una fase estacionaria. La resistencia a la ampicilina es conferida por una β-lactamasa, que rompe el anillo de β-lactama de ampicilina (14). La β-lactamasa más comúnmente expresada por los vectores de clonación que es codificada por el gen bla (15). 2.4.2. Kanamicina Es miembro de la familia de antibióticos aminoglicósido, la kanamicina fue aislada por primera vez de Streptomyces kanamyceticus en Japón en 1957. Este policatión se tiene en la célula bacteriana a través de los poros de la membrana externa, pero cruza la membrana citoplasmática en un proceso dependiente de energía que utiliza el potencial de membrana. La molécula interactúa con tres proteínas ribosomales y con rRNA de 30S en la subunidad ribosómica, para evitar la transición de un complejo de iniciación a un complejo de cadena de alargamiento, y por lo tanto inhibe la síntesis de proteínas. La resistencia a la kanamicina es conferida por aminofosfotransferasas. Estos comúnmente codificados por los vectores Aph (3 ')-I de Tn903 y Aph (3')-II a partir de Tn, 5 el cual transfiere de fosfato desde el ATP a la kanamicina para inactivarla (16). Es importante señalar que estos dos genes de resistencia tienen diferentes secuencias de ADN y, por lo tanto, diferentes mapas de restricción. No va a haber una hibridación cruzada en condiciones rigurosas en hibridaciones Southern. 2.4.3. El cloranfenicol Primeramente aislado de un actinomiceto del suelo en 1947, el cloranfenicol se usa ampliamente como un antibiótico de amplio espectro aunque su uso clínico se ha visto limitado debido a la toxicidad de la médula ósea y la aparición de resistencia a cloranfenicol bacteriano inducida por fármacos. El cloranfenicol inhibe la actividad de la peptidil transferasa ribosómica y por lo tanto inhibe la síntesis de proteínas (17). La resistencia al cloranfenicol es conferida por la

cloranfenicol acetil transferasa (CAT), que transfiere un grupo acetil de la acetil CoA al cloranfenicol y lo inactiva (18). 2.4.4. Tetraciclina Originalmente aislada de Streptomyces aureofaciens en 1948, en la actualidad hay muchos derivados de la tetraciclina disponibles. Se unen a un solo sitio en la subunidad ribosómica 30S para bloquear la unión del aminoacil ARNt al sitio aceptor y por lo tanto inhiben la síntesis de proteínas (19). La resistencia a la tetraciclina es conferida por las proteínas de eflujo, TetA (A-E), que catalizan la exportación dependiente de energía de la tetraciclina de la célula contra un gradiente de concentración (19). 2.5. Sitios de Clonación La clonación de ADN en un vector por lo general implica la ligación del fragmentos de ADN inserto a un vector de ADN que ha sido cortado con una endonucleasa de restricción. Esto es facilitado por los fragmentos de ADN de inserción y el vector que tiene extremos cohesivos compatibles. Por lo tanto, el vector de elección puede ser uno que tienga un sitio de restricción de endonucleasa que es compatible con el inserto de fragmento de enzima generadora. Cabe señalar, sin embargo, que cualquier fragmento de extremos romos se puede ligar a cualquier otro fragmento de extremo romo y que incluso los fragmentos de ADN generados por enzimas de restricción generan salientes pueden hacer extremos romo (véase el capítulo 15). En muchos vectores antiguos, los sitios restricción de endonucleasa se dispersan alrededor del plásmido y eran a menudo uno de los genes vectoriales. Por ejemplo, muchos de los sitios de clonación en la serie pACYC de vectores se encuentran dentro de uno de los genes de resistencia a antibióticos de estos plásmidos. La clonación en estos sitios inactivan el gen de resistencia y la posterior sensibilidad al antibiótico que se utiliza como una pantalla para los plásmidos recombinantes que contienen el inserto de ADN. Los vectores más modernos a menudo contienen un tramo artificial de ADN que tiene una alta concentración de sitios de restricción de endonucleasas que no se producen en otras partes del plásmido. Estos múltiples sitios de clonación (SCM) o polienlazadores dan una amplia variedad de endonucleasas de restricción para su uso en la etapa de clonación. También limitan el sitio de clonación para una pequeña región del vector y por lo tanto permiten el posicionamiento específico del inserto de ADN cerca de otras características del vector. Por ejemplo, los SCM de muchos vectores tales como la serie pUC están flanqueadas por secuencias complementarias a una serie universal de cebadores, la cebadores M13 directo e inverso. Estos sitios promotores están orientados de tal manera que la extensión de los cebadores hibridados a estos sitios permiten la secuenciación de ambos extremos de un inserto de ADN en el MCS. De esta manera, un conjunto de

cebadores universales se puede utilizar para secuenciar cualquier inserto de ADN, independientemente de que el sitio de ADN se insertó en el MCS. Muchos plásmidos contienen los SCM que se encuentran dentro de la secuencia codificante del fragmento α de lacZ. Esta característica (azul / blanco de selección) facilita la identificación de las construcciones recombinantes que llevan un fragmento clonado diferenciándolas de clones que se derivan de la religación del vector de clonación. Esta función se describe en el Capítulo 19. 2.6. Funciones especializadas del plásmido Algunos proyectos implicarán aplicaciones posteriores específicas que requieren funciones de plásmidos especializados que sólo están presentes en algunos plásmidos. Por ejemplo, tanto la serie de vectores pUC y pBluescript son de alto número de copias, plásmidos de resistencia a ampicilina que contienen los SCM que facilitan el uso de una amplia gama de endonucleasas de restricción en la etapa de clonación. Sin embargo, una característica presente en vectores pBluescript que no está presente en vectores pUC son los promotores que flanquean el MCS que permiten la transcripción de la inserción de ADN en cualquiera de las cadenas. El T7 y SP6 son dos promotores son reconocidos por ARN polimerasas de bacteriófagos que deben ser suministradas en trans. Estos no transcriben los genes del hospedador u otros genes del plásmido, que permite la transcripción específica de la inserción de ADN (véase el capítulo 27). Los vectores pBluescript son fagémidos. Ellos contienen un origen de una sola cadena de bacteriófago filamentoso de replicación (el fago M13) y, por lo tanto, son útiles para generar ADN de cadena sencilla (ver Capítulo 13) para aplicaciones tales como la secuenciación de ADN o la mutagénesis dirigida al sitio. La replicación de cadena sencilla se inició mediante la infección con un fago auxiliar que codifica las funciones necesarias. Estos vectores también pueden replicarse como plásmidos de doble cadena convencionales. El origen de una sola cadena puede existir en dos orientaciones. Esas versiones en el que está en la misma orientación que el origen del plásmido se denotan como "+", mientras que aquellos con el origen en la orientación opuesta se designan como "-". Muchos plásmidos han sido diseñados para conseguir la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes a partir del ADN clonado. Estos vectores de expresión se discuten en el Capítulo 28. 3. Resumen Al elegir un vector de clonación para su uso en un proyecto de clonación, el investigador se enfrenta a una enorme variedad. Sin embargo, la aplicación de un pequeño número de criterios puede guiar de forma rápida la selección de un vector adecuado. Muchos plásmidos contienen suficientes características que las hacen adecuadas para una amplia gama de proyectos. Por lo tanto, el investigador debe estar equipado con sólo un pequeño número de vectores con el fin de satisfacer la mayoría de necesidades.