ESCUELA DE BIOLOGÍA DEL MEDIO AMBIENTE

UNIVERSIDAD DEL AZUAY

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

ESCUELA DE BIOLOGÍA DEL MEDIO AMBIENTE

EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE NEMATODOS

ENTOMOPATOGÉNICOS DEL GÉNERO Diplogaster SOBRE Permnotrypes vorax Hustache (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE)

TRABAJO DE GRADUACIÓN PRESENTADO COMO EXIGENCIA PARCIAL

PARA OBTENER EL TÍTULO DE BIÓLOGO

AUTOR:

PEDRO ASTUDILLO WEBSTER

DIRECTOR:

ING. WALTER LARRIVA CORONEL

DICIEMBRE 2005

ii

DEDICATORIA

A mis padres Marcelo y Celia, mi hermano Rafael por su empuje, a mis abuelos Rafico y

Aidita por sus ánimos, a mis tíos Pedro, Luca, Pili, Kiki, Cata, Ñaño por sus esfuerzos.

Este proyecto de tesis no hubiera sido posible sin el apoyo incondicional de toda mi

familia, para ellos este trabajo.

iii

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en las

personas de Walter Larriva y Catalina Bravo por la supervisión del trabajo en el

laboratorio, el desarrollo del pie de cría se llevó a cabo con la colaboración de Hernán

Lucero. Valoro la experiencia en el manejo de nematodos entomopatogénicos y el apoyo

técnico de Hernán Yumbla. Consideraciones a mis compañeros Danilo Mejía, Rommel

Macancela, Sebastián Vasco y Luis Muñoz por su colaboración en campo.

iv

TABLA DE CONTENIDOS

DEDICATORIA..................................................................................................................ii

AGRADECIMIENTOS......................................................................................................iii

TABLA DE CONTENIDOS..............................................................................................iv

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................vi

LISTA DE TABLAS.........................................................................................................vii

RESUMEN.......................................................................................................................viii

ABSTRACT.......................................................................................................................ix

INTRODUCCIÓN..............................................................................................................1

Objetivos............................................................................................................................3

CAPÍTULO I

METODOLOGÍA..............................................................................................................4

1.1 Sitio de Estudio...............................................................................................4

1.2 Obtención de Premnotrypes vorax.................................................................4 1.3 Obtención de Diplogaster sp..........................................................................4

1.3.1 Producción de Madres..............................................................................4

1.3.2 Preparación del Medio de Cultivo............................................................5

1.3.3 Multiplicación de Diplogaster sp.............................................................5 1.4 Levantamiento de Datos.................................................................................5

1.4.1 Primer ensayo: Determinación de la dosis letal media (DL50)..................5

1.4.2 Establecimiento de las dosis para la inoculación......................................5

1.4.3 Segundo ensayo: Evaluación de Diplogaster sp frente a dos agentes de control................................................................................................................6

1.4.4 Análisis Estadísticos.................................................................................7

CAPÍTULO II

RESULTADOS..................................................................................................................8

2.1 Primer Ensayo..............................................................................................8

2.2 Segundo Ensayo...........................................................................................10

v

CAPÍTULO III

DISCUSIONES.................................................................................................................12

3.1 Infección de Premnotrypes vorax...................................................................12 3.2 Eficiencia de Diplogaster sp en el laboratorio................................................13 3.3 Diplogaster sp frente a agentes químicos y biológicos de control..................15

CONCLUSIÓN..................................................................................................................17

BILIOGRAFÍA..................................................................................................................18

ANEXOS............................................................................................................................21

Anexo 1. Cuadro de cálculo para el establecimiento de dosis..............................21

Anexo 2. Cuadro resumen de la mortalidad en el primer ensayo.........................22

Anexo 3. Cuadro resumen de la mortalidad en el segundo ensayo.......................23

Anexo 4. Análisis de significancia del primer ensayo (TUKEY

0.05)......................................................................................................................24

Anexo 5. Análisis de significancia del segundo ensayo (TUKEY

0.05)......................................................................................................................25

Anexo 6. Análisis de regresión para la dosis letal media (PROBIT –

REGRESIÓN NACH FINNEY............................................................................26

Anexo 7. Trampa cebo para la recolección de Premnotrypes vorax....................27 Anexo 8. Premnotrypes vorax parasitado por Diplogaster sp..............................28 Anexo 9. Trampa White para la recolección de Diplogaster sp...........................29 Anexo 10. Diplogaster sp recuperado en la Trampa White.................................30

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribución de la mortalidad de P. vorax en los tratamientos...........................8 Figura 2. Variación de la mortalidad de P. vorax por período de tiempo..........................10 Figura 3. Capacidad de control de P. vorax.......................................................................11

vii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por Diplogaster sp....................................................................................................................9 Tabla 2. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por insecticidas..11

viii

RESUMEN

Es importante brindar una alternativa responsable al control de P. vorax en el laboratorio, para esto se recolectaron individuos adultos de P. vorax en el campo. Se inocularon dosis inundativas de nematodos entomopatogénicos del género Diplogaster sp sobre cinco individuos de P. vorax en cajas petri. Se determinó DL50 y la dosis más eficiente, para ser

evaluadas frente a insecticidas. En todos los tratamientos Diplogaster sp causó la muerte de P. vorax. La DL50 es de 350 nematodos por adulto de P. vorax, la dosis más eficiente fue de 500 nematodos por adulto de P. vorax. Los insecticidas fueron más eficientes al causar la muerte de P. vorax que Diplogaster sp. Se discute la capacidad de infección y eficiencia de Diplogaster sp para el control de P. vorax en el laboratorio.

ix

ABSTRACT

A nonpesticide alternative to control P. Vorax is crucial. In order to test the ability of the nematode Diplogaster in controlling the P. Vorax pest, a breeding stock population of P. Vorax was obtained by collecting adult in the field. The most effective and lethal dose Diplogaster sp medium lethal dose and the most effective dose were determined by flooding dosages for five adult samples of P. Vorax placed on petri dishes. Pest control of the medium lethal dose and the most effective dose were compared to pesticide and

control groups, each treatment with five repetitions. In all treatments, Diplogaster sp distroyed P. Vorax.. The medium lethal dose was 350 nematodes per adult of P. Vorax and the most effective dose was 500 nematodes per adult of P. Vorax. However, the pesticide was more lethal in destroying P. Vorax than Diplogaster sp.

1

EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE NEMATODOS ENTOMOPATOGÉNICOS

DEL GÉNERO Diplogaster SOBRE Permnotrypes vorax Hustache (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE)

INTRODUCCIÓN

Biocontrol con nematodos entomopatogénicos

La llegada de la revolución verde trajo impactos negativos a los ecosistemas mundiales y,

como consecuencia de aquello los plaguicidas desplazaron al control biológico. Sin

embargo, los muchos efectos adversos de los plaguicidas y el fracaso en el control de

muchas plagas ha provocado que el control biológico tenga un rol importante en la

agricultura actual. La agricultura en el neo trópico se caracteriza por fincas pequeñas de

subsistencia, diversidad de cultivos y plagas, en donde, se presentan problemas de

contaminación con plaguicidas, principalmente sobre el suelo, agua y la población

humana. Actualmente se reconoce al control biológico como una de las áreas principales

de investigación y es un componente importante en las iniciativas de agricultura

responsable de varias instituciones y organizaciones de la región andina (Cruz 1996).

Los nematodos entomopatogénicos son conocidos desde el siglo XVII, pero es desde

1930 que se los considera como una herramienta para el control de plagas en los cultivos

(Smart 1995). El énfasis sobre el control biológico de insectos pestes tiene como

consecuencia un incremento en el uso de nematodos como agentes de biocontrol (Nickle

et al 1988). Algunos nematodos juegan un papel importante en el control de poblaciones

de insectos y, ahora son, agentes decisivos en el control dirigido de plagas específicas de

insectos (Poinar 1999). Muchos nematodos atacan especies especificas, evitando de esta

manera el daño a demás organismos y bajo condiciones naturales no afecta a los

vertebrados, aunque existen otros grupos que prefieren un rango de hospederos y la

mortalidad de algunos artrópodos puede ocurrir (Bathon 1996). Los nematodos

entomopategénicos también pueden eliminar insectos pestes en sus diferentes estados y

estadíos, facilitando de esta manera el trabajo en el control de plagas en el campo (Fuxa

1987). Es importante mantener claro el concepto que solo la población de plagas es la que

se necesita eliminar, por lo que el uso de insecticidas elimina un porcentaje alto de la

Astudillo Webster, Pedro Evaluaciòn de Laboratorio de Nematodos Entomopatogènicos del gènero Diplogaster sobre Premnotrypes vorax Hustache (Coleoptera: Curculionidae) Ing. Walter Larriva Coronel 06/12/2005

2

comunidad de insectos presentes en los cultivos y, su persistencia en el ambiente puede

llegar a unos pocos días hasta algunos años, esto ocasiona contaminación al medio natural

(Larriva et al 1987).

Se ha descubierto que el uso de nematodos entomopatogénicos resulta una interesante

alternativa al control con pesticidas realizado en los cultivos. Esta oportunidad ha

permitido obtener un excelente control en las poblaciones de insectos perjudiciales de

permanencia en el suelo y de hábito rizófago. (Kaya y Gaugler 1993).

Diplogaster sp como nematodo entomopatogenico

Como los demás grupos de patógenos, los nematodos se dividen en dos categorías. La

primera llamada de “daño – rápido” (quickdamage) y la segunda nombrada “patógenos

lentos” (slow pathogens). El primero incluye nematodos que producen toxinas inyectando

al hospedero una bacteria, aunque algunos pueden matar directa o indirectamente, ésta

bacteria ocasiona una septicemia al hospedero, este deja de alimentarse alrededor de 24

horas y pocos días después muere (Fuxa 1987). Esta bacteria por lo general es del género Xenorhabdus o Photorhabdus (Kaya y Gaugler 1993). Diplogaster no lleva consigo estas

bacterias, que causan la muerte violenta del hospedero por septicemia. Se trata de un

género de nematodo cuya acción entomopatogénica está limitada a invadir aquellos

insectos débiles o con heridas, sobre todo cuando este se encuentra en el suelo (Larriva et

al 2004).

Generalidades de Premnotrypes vorax

El gorgojo de los andes (Premnotrypes vorax) destaca por su predominancia y amplia distribución en el área andina, desde los 2700 hasta 4000 m s.n.m. Esta plaga ocasiona

graves daños a los tubérculos en el campo que pueden llegar, en algunos casos, al 100%

de la cosecha (Alcázar 2000, Gallegos 1997). Las larvas barrenan los tubérculos

ocasionando en algunos casos pérdidas cercanas al 100% (Smith 1992). Los adultos se

desarrollan en el suelo del cultivo y se alimentan del follaje, dejando característicos cortes

en forma de medialuna en los bordes de la hoja de papa (Gallegos et al 1997).

Astudillo Webster

3

El adulto es un insecto de mide aproximadamente 7 mm de largo y 4 mm ancho. El

cuerpo es gris, aunque puede tomar la tonalidad del suelo, haciendo difícil su detección.

La cara presenta una tonalidad amarillenta y termina en un pico. La hembra es

ligeramente más grande que el macho, de aspecto redondeado y con una línea amarilla a

lo largo de la parte superior del abdomen. El macho es más pequeño, alargado y no

presenta la línea amarilla de la hembra. Hembra y macho no pueden volar porque sus alas

anteriores están soldadas entre sí, y las posteriores son atrofiadas. Sin embargo son muy

hábiles para caminar (Gallegos et al 1997)

La característica de dureza de los adultos de P. vorax hace que sea una plaga resistente al ataque de predadores y parásitos en general (Alcázar 2000) dificultando el ingreso de

nematodos entomopatogénicos (Mannion y Jansson 1992), por esta razón es muy

abundante en las zonas de producción de papa en el Ecuador (Gallegos et al 1997).

Esta particularidad hace de P. vorax un insecto “difícil” de parasitar y, al ser Diplogaster sp un nematodo con escasa información de su capacitad patogénica, se pretende conocer el alcance de este nematodo para controlar plagas, mediante el desempeño en la

mortalidad de P. vorax en el laboratorio.

Objetivos

Conocer la eficiencia de Diplogaster sp para controlar a Premnotrypes vorax en el laboratorio.

Establecer una dosis letal media (DL50) de Diplogaster sp para el control Premnotrypes vorax en el laboratorio

Determinar la dosis más eficiente de Diplogaster sp para el control Premnotrypes vorax en el laboratorio

Evaluar el control de Diplogaster sp frente a dos agentes de control en el laboratorio

Astudillo Webster

4

CAPÍTULO I

METODOLOGÍA

1.1. Sitio de Estudio

El proyecto se desarrolló en los laboratorios del Instituto Nacional Autónomo de

Investigaciones Agropecuarias (INIAP) ubicado en la localidad de Bullcay, cantón

Gualaceo provincia del Azuay.

1.2. Obtención de Premnotrypes vorax

Se necesitaron 325 individuos adultos, los cuales, fueron recolectados a través de trampas

“cebo”. La trampa puede medir 40 x 40 cm y consiste de tallo y hojas de papa, que son

cubiertas con un cartón, previo a su colocación el suelo tiene que estar apisonado para

facilitar la ubicación de la plaga (Gallegos et al 1997). Después de tres días, la trampa es

retirada y revisada. Se ubicaron 25 trampas en 1000 m 2 en parcelas cosechadas de papa,

en la localidad de San Antonio, cantón Cañar provincia del mismo nombre. La parcela

está ubicada a 3200 m s.n.m. de coordenadas UTM 17 9713986 S 731884 E. P. vorax fue adaptado a las condiciones de temperatura del laboratorio entre 15 – 17°C con abundante

alimento, durante tres semanas, al final de este período se realizó el ensayo con los

individuos sobrevivientes.

1.3. Obtención de Diplogaster sp

1.3.1. Producción de Madres

Se procedió a inocular en larvas de Spodoptera sp (Noctuidae: Lepidoptera) 1000 nematodos larva –1 , las larvas fueron obtenidas de un excedente de pie de cría de

investigaciones desarrolladas en el INIAP. Se observó diariamente las larvas hasta su

muerte por parasitismo, se esperó cinco días hasta que las madres empiecen a salir del

hospedero y se inoculó la larva en medio de cultivo. Se requirieron aproximadamente 70

larvas.

Astudillo Webster

5

1.3.2. Preparación del medio de cultivo

Se necesitó 500 cc de agua destilada calentada a 80°C en un termociclador, se esperó que

las paredes del vaso de precipitación se empañen y el agua alcance la temperatura

deseada, se adicionó 5 g de Agar agar y la barra magnética para ciclar, se mantuvo

durante 5 minutos hasta lograr eliminar la turbidez. En una cubeta se adjuntó 100 g de

alimento de perro y la mezcla del agua y el agar, se bate hasta obtener una sustancia

homogénea. La mezcla es colocada en cajas petri de 15 cm de diámetro, se divide todo el

medio por partes iguales. Las cajas petri con medio de cultivo fueron esterilizadas a

través del autoclave a 120 atmósferas de presión durante 20 minutos (Larriva et al 2004).

1.3.3 Multiplicación de Diplogaster

En cajas petri con medio de cultivo se inoculó la mitad de larva infestada con madres,

este proceso se lo realizó en una cámara de flujo. Todos los medios inoculados fueron

colocados en la estufa a 23°C, luego de 10 días se procedió a lavar los medios con agua

destilada. El agua obtenida es filtrada a través de tres tamaños de ojo de malla: 0.928 mm,

0.038 mm y 0.027 mm este último contiene los infectivos juveniles. Los nematodos son

ubicados en botellas de cultivo de tejido, con 80 cc de agua destilada para dejarlos en

suspensión.

1.4. Levantamiento de datos

1.4.1. Pr imer ensayo: Determinación de la dosis letal media (DL50)

Se realizaron nueve tratamientos, cada tratamiento es una dosis inundativa de Diplogaster sp inoculada sobre cinco individuos adultos de P. vorax, las dosis fueron de: 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 nematodos adulto –1 (2500, 2250, 2000, 1750, 1500,

1250, 1000, 750, 500 nematodos por caja petri) suspendidos en 3 ml de agua destilada,

cada tratamiento tuvo cinco repeticiones, los nematodos utilizados fueron infectivos

juveniles. Las inoculaciones se realizaron en cajas petri de 9 cm de diámetro, en la base

fueron colocados dos hojas de papel filtro para mantener la humedad. Todos los

tratamientos fueron ubicados en gavetas oscuras a una temperatura entre 15 – 17°C.

Astudillo Webster

6

Después de la inoculación se realizaron lecturas diarias durante 20 días, y se separaron a

los individuos muertos, uno a uno en trampas White, que consiste en una caja petri de 9

cm de diámetro, en la base de la misma, se pone la tapa de una caja petri de 5 cm de

diámetro cubierta con papel filtro de 7 cm de diámetro, se vierte de 15 a 20 ml de agua

destilada (Larriva et al 2004), las trampas permanecieron en la estufa a 23°C por siete

días, después de este período, con un estereomicroscopio, se revisó el estado de la plaga y

el contenido del agua de la trampa, en busca de nematodos para saber si es que el

individuo murió por parasitismo o no.

Se contaron los individuos muertos, y se los separaron entre los parasitados y los que no,

fue anotado el número de replica al que pertenecían y el número del día en que murieron.

1.4.2. Establecimiento de las dosis par a la inoculación

Las botellas de cultivo de tejido que contienen en suspensión infectivos juveniles, fueron

vertidas en una caja magenta, con una micropipeta de 0.01 ml se tomaron cinco muestras,

a través del estereomicroscopio se contó el número de nematodos en cada muestra, se

obtuvo un promedio que fue extrapolado a un mililitro, se relacionó la dosis requerida con

la cantidad de nematodos por mililitro de agua y se obtuvo la cantidad necesaria por

unidad experimental, cinco veces este valor y se conoce el total por tratamiento. El

establecimiento de las dosis, las lecturas de las muestras obtenidas con la micropipeta, el

tamaño de la unidad experimental y los cálculos utilizados se describen en el Anexo 1.

1.4.3. Segundo ensayo: Evaluación de Diplogaster sp frente a dos agentes de control.

Se desarrollaron cinco tratamientos, cada uno con cinco repeticiones y cada unidad

experimental con cinco individuos adultos de P. vorax. El primer tratamiento es DL50 de Diplogaster sp suspendidos en 3 ml de agua destilada. El segundo es la dosis de Diplogaster sp de mayor eficiencia suspendida en 3 ml de agua destilada. El tercero un Biocida conformado por un extracto de Ají y Ajo en los siguientes porcentajes: Ají 10%,

Ajo 10% y Solventes Orgánicos 80% se utilizó la dosis comercial (sugerida por el

fabricante) de 10 ml de extracto en 1000 ml de agua destilada, fueron inoculados 3 ml de

Astudillo Webster

7

solución. El cuarto tratamiento es un insecticida químico convencional de sello azul,

moderadamente toxico (Larriva et al 1999) de nombre comercial VEXTER, de

ingrediente activo Clorpyrifos (órgano difosfato pyridine), se inocularon dosis

comerciales de 400 ml de insecticida en 200 000 ml de agua destilada (Edifarm 2002),

fueron inoculados 3 ml de solución. El último tratamiento, el testigo, fue inoculado 3 ml

de agua destilada. Se realizaron lecturas diarias durante 8 días de los tratamiento tres,

cuatro y cinco. Se consideró que los tratamientos uno y dos no se debían repetir, ya que

las condiciones del primero y segundo ensayo eran las mismas. El ensayo fue ubicado en

gavetas oscuras entre 15 – 17 °C de temperatura.

1.4.4. Análisis Estadísticos

En el primer ensayo los tratamientos fueron evaluados con un análisis de regresión

(PROBIT – REGRESSION NACH FINNEY) para conocer la dosis letal media, también

las dosis se evaluaron con un análisis de varianza (ANOVA) y análisis de significancia

(TUKEY, alfa 0.05) para determinar cual es la dosis más eficiente. El diseño es de

bloques completamente al azar.

En el segundo ensayo los tratamientos fueron evaluados con análisis de varianza

(ANOVA) y un análisis de significancia (TUKEY, alfa 0.05), para evaluar la eficiencia

de control de Diplogaster sp. El diseño es de bloques completamente al azar.

Astudillo Webster

8

CAPÍTULO II

RESULTADOS

2.1. Pr imer Ensayo

En todos los tratamientos Diplogaster sp ocasionó la muerte de P. vorax (Tabla 1), Según Tukey hay dos grupos de dosis que no difieren significativamente dentro de si (F = 6.95;

P < 0.05) en el primero, las dosis de 300 y 350 nematodos por adulto muestran 11

individuos parasitados (44%) cada una y, las dosis 150 y 200 nematodos por adulto

presentan 3 individuos parasitados (12%) y 4 individuos parasitados (16%)

respectivamente, el resto de tratamientos si varían significativamente entre si. El análisis

de significancia muestra que la dosis más eficiente es 500 nematodos adulto 1 con 19

individuos parasitados (76%) y, la dosis con menor mortalidad es 100 nematodos adulto 1

con 2 individuos parasitados (8%). Los tratamientos tienen un promedio 38.2% de

individuos parasitados y la mortalidad aumenta mientras la dosis de Diplogaster sp incrementa (Fig. 1).

DL50

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

100 150 200 250 300 350 400 450 500

Dosis (nematodos por P. vorax )

Mortalid

ad (%

)

Figura 1. Distr ibución de la mor talidad de P. vorax en los tr atamientos.

Astudillo Webster

9

El análisis de regresión Probit señala que la DL50 es 355,34 nematodos por adulto (P =

0.7968), siendo la dosis de 350 nematodos por adulto la más próxima y su diferencia es

pequeña, es considerada como la dosis letal media (Fig. 1).

Hasta 15 días después de la inoculación Diplogaster sp causó la muerte de P. vorax. En todos los tratamientos, en los primeros ocho días se encuentra el mayor número de

individuos muertos, con un porcentaje promedio de 87,62%. Las dosis de 250, 150 y 100

nematodos por adulto, alcanzaron el 100% de su respectiva mortalidad al cabo de ocho

días (Tabla 1).

Tabla 1. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por Diplogaster sp

Nematodos por

P. vorax Días después de la inoculación

Total de individuos parasitados

en el tr atamiento

2 4 8 15 100 0% 0% 100% 100% 2 150 33,30% 33,30% 100% 100% 3 200 25% 75% 75% 100% 4 250 33,30% 66,70% 100% 100% 9 300 9.10 % 54,50% 90,90% 100% 11 350 36,40% 36,40% 81,80% 100% 11 400 41,70% 58,30% 83,30% 100% 12 450 13,30% 33,30% 73,30% 100% 15 500 63,16% 73,68% 84,21% 100% 19

La tabla muestra el porcentaje de mortalidad que alcanza cada tratamiento en función del tiempo. El porcentaje es relativo para el total de individuos parasitados en cada tratamiento.

En todos los tratamientos las dosis fluctúan cada día, no existe un patrón definido. Las

dosis 250, 300, 350, 400, 450, 500 nematodos por gorgojo en los primeros días muestran

buena cantidad de individuos parasitados, sin embargo después del día cuatro el número

de gorgojos muertos disminuye a excepción de las dosis 350 y 450. Las dosis más bajas,

tienen efecto entre el cuarto y octavo día después de la inoculación (Fig. 2).

Astudillo Webster

10

Figura 2. Var iación de la mor talidad de P. vorax por per íodo de tiempo

2.2 Segundo Ensayo

Los resultados de las dosis de 350 nematodos adulto 1 (DL50) y la dosis de 500 nematodos

adulto 1 (más eficiente) fueron evaluadas frente a dos insecticidas. El primero, Clorpyrifos

(VEXTER) ocasionó la muerte de todos los individuos de P. vorax. El segundo, Biocida (Extracto Ají y Ajo) también causó la muerte de todos los individuos de P. vorax. Clorpyrifos provocó la muerte violenta de todos los gorgojos hasta las 24 horas después

de la inoculación y el Biocida eliminó a todos los individuos de P. vorax en ocho días después de la inoculación (Tabla 2).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

100 150 200 250 300 350 400 450 500

Dosis (nematodos por P. vorax )

Individuos M

uertos

DIA4 DIA8 DIA12 DIA16

Astudillo Webster

11

Tabla 2. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por

insecticidas

Tratamientos Días después de la inoculación Total de individuos eliminados

1 2 4 8 15 Clorpyr ifos 100% 100% 100% 100% 100% 25 Biocida 48% 48% 96% 100% 100% 25

La dosis más efectiva de Diplogaster sp (500 nematodos por gorgojo) tuvo efecto hasta 11 días después de la inoculación parasitando a 19 individuos adultos de P. vorax de 25 y, la DL50 de Diplogaster sp (350 nematodos por gorgojo) tuvo efecto hasta 12 días después de la inoculación parasitando a 11 individuos adultos de P. vorax de 25. Según Tukey (0.05) no existe diferencia significativa entre los insecticidas siendo estos más efectivos

en el control de P. vorax. Las dosis con nematodos si difieren significativamente con todos los tratamientos (P < 0.05; F = 59.47) (Fig. 3).

Figura 3. Capacidad de control de P. vorax Los tratamientos Clorpyrifos y Biocida no difieren significativamente según TUKEY (0.05)

25(100%) 25(100%)

19(76%)

11(44%)

0 0

5

10

15

20

25

30

Clorpy

rifos

Biocida

500 (ne

matodo

s por ad

ulto)

350 (ne

matodo

s por ad

ulto)

Control

Tratamientos

Individu

os M

uertos

Astudillo Webster

12

CAPÍTULO III

DISCUSIONES

3.1 Infección de Premnotrypes vorax

A diferencia de los géneros de nematodos entomopatogénicos Steinernema y Heterorhabditidis que son conocidos por muertes más violentas (Kaya y Gaugler 1993), Diplogaster es un género que invade numerosamente al hospedero y, se aprovecha de insectos débiles o heridos (Larriva et al 2004). Al obtener el pie de cría de P. vorax de recolecciones de campo, la población del insecto plaga es muy variable y se puede

encontrar individuos enfermos, aunque este sesgo se lo corrigió con un período de

seguridad de tres semanas de adaptación a las condiciones del laboratorio, es probable

que los ensayos se hayan desarrollado con una pequeña cantidad de P. vorax que no estuvieron en las mejores condiciones, y en esos individuos Diplogaster sp tuvo facilidad de infección.

Las técnicas de defensa de los insectos al ataque de nematodos entomopatogénicos son un

factor muy importante que limita el control biológico, la encapsulación y melanización

dificulta el ingreso al hospedero (Poinar 1999). P. vorax se caracteriza por no dejar expuesto ningún segmento abdominal y presentar un cuerpo blindado (Smith 1992), en

general los coleópteros no tienen segmentos delgados de su cutícula, dificultando el

ingreso de los nematodos (Gaugler 1988), pero en las lecturas diarias se pudo observar

que Diplogaster sp, indistintamente del estado de salud de la plaga, ingresaban mediante dos vías: 1) Por la boca, es frecuente observar un constante movimiento de los palpos del

insecto que en pequeños intervalos la boca queda abierta, esto es aprovechado por el

nematodo para ingresar al hospedero. 2) Por el ano, al ser una población aleatoria el

número de machos y hembras no es regular y, es muy común observar la copula en las

cajas petri, los nematodos ingresan en el instante que se despliegan los aparatos genitales.

Astudillo Webster

13

Estas dos vías son muy comunes para el ingreso de nematodos entomopatogénicos

(Gaugler 1988, Kaya y Gaugler 1993), pero en especies de coleóptero estos orificios

naturales no se encuentran totalmente disponibles (Gaugler 1993), sin embargo Diplogaster sp presenta una ventaja, al ser un nematodo que actúa con una invasión masiva al hospedero (Larriva et al 2004), fue más fácil encontrar intervalos en el que la

boca y el ano quedan descubiertos en el cuerpo de P. vorax.

3.2 Eficiencia de Diplogaster sp en el laborator io

Todos los tratamientos ocasionaron la muerte de Premnotrypes vorax, pero la mortalidad no se pudo incrementar, ya que no se podía producir, en 3 ml de agua, dosis más altas en

suspensión. Las dosis reales por cada caja petri, desde la mayor hasta la menor van de la

siguiente manera: 2500, 2250, 2000, 1750, 1500, 1250, 1000, 750, 500 nematodos por

caja petri, se observó que más de 2500 nematodos en 3 ml de agua es difícil alcanzar,

para subir las dosis se necesita más volumen de agua, e inocular sobre los 3 ml representa

demasiada humedad y, los gorgojos empiezan suspenderse, el exceso de humedad afecta

a la supervivencia de P. vorax (Fernández 1997). Sin embargo se realizó un tratamiento

de 1000 nematodos por P. vorax (5000 nematodos por caja petri), el cual quedó excluido de los resultados por la alta mortalidad de Diplogaster sp, este tratamiento causó la muerte del 56% de gorgojos. La mortalidad de nematodos es alta cuando se inocula sobre

los 4000 nematodos por caja petri, el espacio disponible se limita en dos dimensiones

(largo y ancho) al inocular dosis altas, los nematodos se acumulan uno encima de otro,

limitando su espacio de acción y, causando de esta manera su muerte (Wang et al 2002),

es necesario realizar ensayos con nematodos entomopatogénicos en laboratorio, sobre

insectos poco susceptibles como especies de coleóptero, ya que, demuestran la capacidad

del nematodo para el control de la plaga y, su perspectiva para el control en el campo

(Wilson et al 1999).

Astudillo Webster

14

Los nematodos dejan de ser eficientes para el control de plagas en el campo después de

varias semanas de no encontrar hospedero (Smart 1995). En el laboratorio después de

ocho días de la inoculación, pierden gradualmente la capacidad de parasitar (Wang et al

2002). En estos ensayos Diplogaster sp produjo mayores resultados dentro de los primeros ocho días, después la infección fue esporádica hasta 15 días, luego la infección

es nula. Dentro de los primeros cuatro días después de la inoculación los nematodos

entomopatogénicos son muy virulentos, pueden alcanzar porcentajes altos de control de la

plaga, que dependen de la especie de hospedero y de factores físicos del suelo (McCoy et

al 1992, Shapiro y McCoy 2000). La virulencia de los infectivos juveniles de Diplogaster sp disminuye después de 48 horas de extraídos del medio de cultivo, se realizaron inoculaciones de prueba que demostraron mayor eficiencia de control con nematodos con

pocas horas de extraídos del medio de cultivo.

Inoculaciones de nematodos entomopatogénicos de los géneros Steinernema y Heterorhabditidis en adultos Cylas formicarius (Coleoptera: Apionidae) en cajas petri, señalan que no existe resultados significativos en la mortalidad de la plaga (< 6%)

después de 4 días de la inoculación, debido al cuerpo bien esclerotizado de los

coleópteros en general, que dificulta el ingreso del nematodo (Mannion y Jansson 1992),

las larvas son más susceptibles a los nematodos entomopatogénicos (García del Pino y

Morton 2005) y los esfuerzos para controlar la plaga se centran en los juveniles (McCoy

et al 2002). Diplogaster sp pudo alcanzar una mortalidad entre 76% y 8% bajo condiciones de temperatura favorables para la plaga (15 – 17°C), porque los nematodos

se los multiplico bajo condiciones estables de temperatura (23°C), pudiendo ser la

diferencia de temperatura un factor que afecta la mortalidad del nematodo, por que se

presentan mejores resultados de control en temperaturas que fluctúan entre 26 30°C

(Shapiro y McCoy 2000). El mecanismo de invasión masiva al hospedero de Diplogaster sp (Larriva et al 2004) es un factor determinante en la eficiencia del control de Premnotrypes vorax, pudiendo magnificarse con temperaturas favorables para el desarrollo del nematodo.

Astudillo Webster

15

3.3 Diplogaster sp frente a agentes químicos de control

Los pesticidas órgano fosforados, como el clorpyrifos, son recomendados para el control

de Premnotrypes vorax en el campo (Gallegos et al 1997), bajo condiciones controladas los pesticidas en general se vuelven muy efectivos (Oliveira y Rodríguez 2002). En los

ensayos este insecticida, logró eliminar el 100% de la población de la plaga. La gran

toxicidad de los órgano fosforados permite obtener buenos resultados en el control de

pestes, pero a grandes costos ambientales (Oliveira y Rodríguez 2002). Por el contrario

los insecticidas naturales no tienen niveles altos de toxicidad y son fácilmente

degradables y, pocas veces son considerados para controlar plagas en cultivos grandes por

su capacidad de control limitada, sin embargo presentan una buena solución en granjas

pequeñas (Oliveira y Rodríguez 2002). En los ensayos el biocida también pudo ocasionar

la muerte del 100% de individuos de P. vorax. Es difícil alcanzar el grado de control de un insecticida químico, con el uso exclusivo de nematodos entomopatogénicos, pero

como parte de un manejo integrado de plagas se puede obtener un buen control de pestes

en los cultivos (Fuxa 1987), también las técnicas preventivas y de monitoreo de P. vorax permiten reducir los niveles de daño a los cultivos de papa (Gallegos et al 1997).

Llegar a controlar el 76% de individuos adultos de P. vorax en cajas petri para Diplogaster sp es muy bueno, considerando que las experiencias con este nematodo se limitan a larvas de Spodoptera sp (Lepidoptera: Noctuidae) y los géneros Steinernema y Heterorhabditidis tardan menos de la mitad del tiempo que Diplogaster sp para controlar larvas de plagas susceptibles (Larriva et al 2004). La ventaja mayor que llevan los

tratamientos clorpyrifos y el biocida frente a este nematodo, es el tiempo en el que pudo

llegar a ocasionar la muerte de P. vorax, mientras el insecticida químico logró provocar la muerte en menos de 24 horas, el biocida en ocho días, Diplogaster sp lo hizo en 11 días.

Hay mucho que aprender acerca de la biología, ecología y las relaciones con los

hospederos (Wang 2002). Diplogaster sp no es un género de nematodo entomopatogenico con el que se puede conseguir muertes más eficientes, como lo son Steinernema y Heterorhabditidis (Larriva et al 2004), incluso algunas especies de este género fueron descritas como nematodos oportunistas que se aprovechan de los desperdicios del ganado

(Sudhaus y Klaus 1990). Pero esta especie en particular, con la que se trabajó, ha podido

alcanzar resultados positivos, que los géneros tradicionales de nematodos

Astudillo Webster

16

entomopatogénicos, en muchos de los casos, no han podido lograr con especies de

coleópteros y curculionidos adultos. Es importante determinar la capacidad de control

bajo condiciones semicontroladas y controladas, realizar ensayos en contenedores con

suelo y con fuentes permanentes de alimento (McCoy et al 2002), recrear las condiciones

del hábitat de la plaga (Shapiro y McCoy 2000), evaluar la eficiencia del nematodo

frente a factores físicos del suelo como estructura y composición que contribuyen a la

variación de la eficiencia en el campo (McCoy et al 2002) deberían ser la próximas

investigaciones. No se puede utilizar a nematodos entomopatogénicos como medida única

de control (Fuxa 1987) contar con el concurso de medidas preventivas y técnicas

culturales de control de plagas (Fernández 1996) así como dosis subletales de químicos

ligeramente tóxicos u otros patógenos, permitirían que las plagas se encuentren más

susceptibles al ataque de nematodos entomopatogénicos (Wang 2002).

Es importante determinar la biología Diplogaster sp, evaluar su persistencia mediante la capacidad de reciclar infectivos juveniles en el cuerpo del hospedero, ampliar los estudios

con otras especies de plagas en el laboratorio y en el campo, conocer los diferentes

factores que rigen su rendimiento como agente de control, al ser un género diferente a los

nematodos entomopatogénicos comunes, es muy probable que los factores que ocasionan

la variación de la eficiencia actúen de diferente modo y, es fundamental determinar a que

especie pertenece este género, para validar aún más futuros trabajos que se desarrollen.

Astudillo Webster

17

CONCLUSIÓN

Diplogaster sp al ser un género de nematodo entomopatogénico que invade

numerosamente al hospedero tiene más oportunidades de ingresar que algunas especies de Steinernema y Heterorhabditidis. Este mecanismo permite al nematodo encontrar pequeños intervalos en el que los orificios naturales de Premnotrypes vorax quedan abiertos y causar la infección, a pesar de su cuerpo bien esclerotizado.

En todos los tratamientos Diplogaster sp causó la muerte de P. vorax, sin embargo no se aumentó la mortalidad de 76%, por que no se pudo suspender más de 2500 nematodos en

3 ml de agua. Dentro de los primero ocho días, en todos los tratamientos, se obtuvieron

resultados significativos, después la mortalidad fue esporádica hasta 15 días, luego es

nula.

La virulencia de los infectivos juveniles de Diplogaster sp disminuye después de 48 horas de extraídos del medio de cultivo, es importante realizar la inoculación con nematodos

recién extraídos.

Alcanzar una mortalidad máxima del 76% de P. vorax es un gran logro, ya que la experiencias de Diplogaster sp se limitan a larvas de Spodoptera sp y por otra parte, los géneros tradicionales de nematodos entomopatogénicos (Steinernema y Heterorhabditidis) han alcanzado, en muchos de los casos, mortalidades menores al 6% en pruebas de laboratorio sobre coleópteros adultos en general.

Es imposible competir con la capacidad de control de los insecticidas químicos con el uso

exclusivo de Diplogaster sp, sin embargo se puede lograr buenos resultados con un manejo integrado de plagas, que en todos sus componentes se desarrollen actividades

preventivas y de monitoreo, hay que recordar que el control de insectos plagas depende

básicamente del conocimiento profundo de los factores que causan o favorecen la

abundancia de las especies involucradas, la supresión de estos factores, cuando ello es

posible, es la primera medida de control a ser aplicada

Astudillo Webster

18

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Astudillo Webster

21

ANEXOS

ANEXO 1

Cuadro de cálculo para el Establecimiento de las Dosis

TRATAMIENTOS T1 T2 T2 T2 T6 T2 T2 T2 T2 Dosis Individuo 500 450 400 350 300 250 200 150 100 # P. vorax 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Total P. vorax 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Dosis Tratamiento 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

11 11 11 9 9 9 11 11 11 13 13 13 8 8 8 10 10 10 9 9 9 10 10 10 8 8 8 10 10 10 12 12 12 9 9 9

LECTURAS

9 9 9 11 11 11 13 13 13 SUMA 52 52 52 50 50 50 51 51 51 PROMEDIO 10,40 10,4 10,4 10 10 10 10,2 10,2 10,2 Cant. ml. 1040,00 1040 1040 1000 1000 1000 1020 1020 1020 Cant. Unid. Exp. 2,40 2,16 1,92 1,75 1,50 1,25 0,98 0,74 0,49 Cant. Trat 12,02 108,17 96,15 87,50 75,00 62,50 49,02 36,76 24,51

Dosis Individuo: El número de nematodos por cada individuo de P. vorax # P. vorax: Es el tamaño de la unidad experimental Total P. vorax: Es la sumatoria de todas las repeticiones Dosis Tratamiento: El total de nematodos utilizados en todas las repeticiones

Cant. ml: Es la aproximación del contenido de nematodos en un ml de agua

(PROMEDIO x 100)

Cant. Unid. Exp: Es la cantidad de agua con nematodos en ml utilizada por cada unidad

experimental (DOSIS TRATAMIENTO / Cant. ml)

Cant. Trat: Es la cantidad de agua con nematodos en ml utilizada en todas las

repeticiones (CANT. UNID. EXP x 5).

Astudillo Webster

22

ANEXO 2

Cuadro resumen de la mortalidad en el pr imer ensayo

Nematodos por

P. Vorax Repeticiones

Número total de individuos parasitados en el tr atamiento

1 2 3 4 5 100 0 0 1 0 1 2 150 1 0 1 1 0 3 200 0 2 1 1 0 4 250 3 2 2 1 1 9 300 2 2 3 3 1 11 350 1 3 1 3 3 11 400 4 3 3 1 1 12 450 4 2 4 3 2 15 500 5 4 3 3 4 19

Astudillo Webster

23

ANEXO 3

Cuadro resumen de la mortalidad en el segundo ensayo

Tratamientos Repeticiones Número total de individuos

eliminados en el tr atamiento

1 2 3 4 5 Clorpyr ifos 5 5 5 5 5 25 Biocida 5 5 5 5 5 25 500

nematodos adulto 1

5 4 3 3 4 19

350 nematodos adulto 1

1 3 1 3 3 11

Control 0 0 0 0 0 0

Astudillo Webster

24

ANEXO 4

Análisis de significancia del pr imer ensayo (TUKEY 0.05)

TUKEY (HSD) PAIRWISE COMPARISONS OF MEANS OF MUERT BY TRAT

HOMOGENEOUS TRAT MEAN GROUPS

1 3.8000 I 2 2.8000 I I 3 2.4000 I I I 4 2.2000 I I I I 5 2.2000 I I I I 6 1.8000 .. I I I 7 0.8000 .... I I 8 0.6000 .... I I 9 0.4000 ...... I

THERE ARE 4 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.

CRITICAL Q VALUE 4.662 REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 1.9779 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.6000

1 500 nematodos por P. vorax









Astudillo Webster

25

ANEXO 5

Análisis de significancia del segundo ensayo (TUKEY 0.05)

TUKEY (HSD) PAIRWISE COMPARISONS OF MEANS OF MUERTOS BY TRAT

HOMOGENEOUS TRAT MEAN GROUPS

1 5.0000 I 2 5.0000 I 4 3.8000 .. I 3 2.2000 .... I 5 0.0000 ...... I

THERE ARE 4 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.

CRITICAL Q VALUE 4.232 REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 1.1667 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.3898

1 Clorpyrifos 2 Biocida 3 350 nematodos por P. vorax 4 500 nematodos por P. vorax 5 Control

Astudillo Webster

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ANEXO 6

Análisis de regresión para la dosis letal media (PROBIT REGRESSION NACH

FINNEY)

ProbitRegression nach Finney

Konzen tr ation

Konzen tration (log)

n r (% ) r (cor r .)

Empi r ische Probit

Expec ted

Probit P z (y0) Wor king

Probit Weighting coefficient

Weight (nW)

x muertos Y (Y1) y nW 500,00 2,70 25 19 76,00 76,0% 5,71 5,5 0,6764 0,3593 5,69 0,5897 11,8 450,00 2,65 25 15 60,00 60,0% 5,25 5,3 0,6249 0,3792 5,25 0,6135 12,3 400,00 2,60 25 12 48,00 48,0% 4,95 5,2 0,5646 0,3937 4,95 0,6305 12,6 350,00 2,54 25 11 44,00 44,0% 4,85 5,0 0,4945 0,3989 4,85 0,6366 12,7 300,00 2,48 25 11 44,00 44,0% 4,85 4,8 0,4139 0,3896 4,85 0,6258 12,5 250,00 2,40 25 9 36,00 36,0% 4,64 4,5 0,3233 0,3591 4,64 0,5896 11,8 200,00 2,30 25 4 16,00 16,0% 4,01 4,2 0,2256 0,3004 4,03 0,5164 10,3 150,00 2,18 25 3 12,00 12,0% 3,83 3,9 0,1285 0,2098 3,83 0,3932 7,9 100,00 2,00 25 2 8,00 8,0% 3,59 3,3 0,0475 0,0990 3,66 0,2166 4,3

Steigung der Regression = Summe xy / Summe xx = 2,9908b +/ s = 1,1504 Ordinatenabschnitt = 2,6284 a Die korrigierte LogitRegression lautet y = 2,6284 + 2,9908 x Chi2 = 1,666317041 1,666 Prüfung auf Anpassung der kor rigierten ProbitRegression Die Anpassung der Geraden an die Beobachtungen ist gut p weil Chi2 = 1,6663 << Chi2(Tab:0,05) 9,49 0,7968 Schätzung des DL50Wer tes

DL50: 2,5506m Antilog: 355,34 +/ s = 31,6563584 (= S.E. L50)

DL50 (~ Konzentration) = 350 Schätzung der Standar tabweichung des L50Wer tes

sL50: 0,0387 s m Antilog: 1,0932 Schätzung der Standar tabweichung der Regressionssteigung b

sb2 = 1,3233 V(b) 10m 355,3354649

Astudillo Webster

27

ANEXO 7

Trampa cebo para la recolección de Premnotrypes vorax

Astudillo Webster

28

ANEXO 8

Premnotrypes vorax parasitado por Diplogaster sp

Astudillo Webster

29

ANEXO 9

Trampa White para la recolección de Diplogaster sp

Astudillo Webster

30

ANEXO 10

Diplogaster sp recuperada en la Trampa White

Astudillo Webster

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