“INOCULACIÓN COMBINADA DE HONGOS MICORRÍCICO-ARBUSCULARES Y Azospirillum spp. EN PLÁNTULAS DE BANANO (Musa paradisiaca)

MICROPROPAGADAS: EFECTOS SOBRE EL DESARROLLO Y CRECIMIENTO DURANTE LA FASE DE ACLIMATACIÓN”

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITODEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ESPE-HOLDINGDINE

Tania Carina Villarreal Villarreal

Previo a la obtención del título de:INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

100 millones ha 100 millones ton

(FAO,2004)

230.000 has32%

producción mundial

(AEBE, 2010)

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Mejorar manejo agrícola

Agricultura sostenible

Incremento de la producción

.

Pérdida de fertilidad =

baja producción

Monocultivo

40% del Costo de producción

es para INSUMOS QUÍMICOS

(WRM, 2004)(AEBE ,2010)

Plantas micropropagadas

Hongos micorrícicos arbusculares

(HMA)

Bacterias promotoras

del crecimiento

vegetal

BIOTECNOLOGÍA

Objetivo GeneralAnalizar el efecto de la inoculación combinada de Hongos micorrícicos arbusculares (HMA) y Azospirillum sp, sobre el desarrollo y crecimiento de plántulas de banano (Musa paradisiaca) micropropagadas durante la fase de aclimatación.

Objetivos Específicos

OB

JETI

VO

S

- Aislar y propagar Azospirillum sp. y esporas de HMA nativas del cultivo de banano.

- Inocular y determinar el efecto de diferentes dosis de HMA y Azospirillum sp. así como su interacción, sobre las variables de crecimiento de la planta y el contenido de macro y micronutrientes en el tejido foliar y suelo

- Evaluar el % colonización y la población final de esporas en plántulas de banano micropropagadas durante la fase de aclimatación.

- Determinar la población final de Azospirillum sp. presente en el sustrato y en raíces de las plantas de banano.

- Determinar la dosis de HMA y de Azospirillum sp. que permitan obtener los mejores resultados respecto a las variables evaluadas.

HIPÓTESIS

La co-inoculación de HMA y Azospirillum sp. mejoran el crecimiento (altura, perímetro del pseudotallo, área foliar, biomasa aérea, biomasa radical y contenido de nutrientes) de las plántulas de banano micropropagadas durante la fase de aclimatación

MARCO TEÓRICO

Musa paradisiaca

CULTIVO DE BANANO

Condiciones ambientales

Requerimientos nutricionales

T= 25°CRiego=160-180

mm/mes

MacronutrientesN, P, K

MicronutrientesCa, Mg, S Fe, Mn,

Zn, B, Cu

HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES (HMA)

HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES

Coadyuvante microbiano

Asociación mutualista HONGO-PLANTA

85-95% especies

vegetales

(Bonfante & Anca, 2009)

Fase asimbiótica

Fase presimbiótica

Fase simbiótica

CICLO DE VIDA DE LOS HMA (DESARROLLO DE LA SIMBIOSIS)

Fase asimbiótica

Fase presimbiótica

Fase simbiótica

• Absorción de nutrientes y agua

• Resistencia a patógenos• Agregación del suelo

BENEFICIOS

BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL Azospirillum

Azospirillum

Bacilos Gram (-) Diazótrofa

pH 6 a 7T°= 30°C

Familia Rhodospirillaceae

Colonización interna• Ingreso por tejido

destruido• Acción de pectinasas

Colonización externa• Adsorción• Anclaje

INTERACCIÓN Azospirillum -PLANTA

MECANISMOS DE PROMOCIÓN DEL

CRECIMIENTO VEGETAL Producción de

fitohormonasFijación de Nitrógeno

Interacción con microorganismos rizosféricos

MAT

ER

IAL

ES

Y

MÉ

TOD

OS

Muestreo de suelo de 7 haciendas bananeras de HDineAgros S.A

• Conteo de esporas de HMA (Gendermann y Nicholson, 1963 modificado por Herrera, 2004)

• Selección de Hacienda Central

Figura 1. Conteo poblacional de esporas de HMA nativas del cultivo de banano en 7 hdas. Bananeras de HDineAgros S.A

Desarrollo del inóculo micorrícico mediante cultivo

trampa

Elaboración de cultivo trampa a) Desinfección y lavado de semillas, b) Llenado de macetas con sustrato, c) Siembra de semillas de avena, d) Riego con agua destilada,

d) Mantenimiento de cultivos trampa.

30% arena10% turba negra60% suelo negro

Figura 2. Incremento de la densidad poblacional de esporas de HMA en cultivo trampa de avena.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Diseño completamente al azarRepeticiones: 9UE: 1 plantaTotal: 144 plantas

Transplante e inoculación de plántulas de banano con HMA

• Adecuación de cámara de crecimiento• Inoculación con HMA

a) Fraccionamiento de inóculo por tratamiento, b) Llenado de macetas con sustrato, c) Aplicación de tratamientos, d) Trasplante de plántulas de banano, e) Riego con solución nutritiva, f) Ubicación de macetas en cámara de crecimiento

Incubación 30°C /

14 d

Aislamiento de bacterias diazótrofas

Inoculación de Azospirillum• Aislamiento e identificación • Selección de la cepa inóculo• Inoculación

Selección de cepas Azospirillum “sospechosas”

Aislamiento y selección de Azospirillum

• Pruebas fenotípicas• Pruebas bioquímica

Pruebas de identificación

• Curva patrón AIA (Bric et al. 1991).

• Producción de AIA

Selección de la cepa inóculo

0 10 20 30 40 50 60 700

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8f(x) = 0.0126533120760261 x + 0.0302726562255798R² = 0.980749629416034

Concentración (μg/ml)

Abs

530

nm

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

1

2

3

4

5

6

7

Concentración de AIA producido por cepas de Azospirillum a di-ferentes tiempos de incubación

G1r G2r G3ra G3rb G4r G2 G4a G4b

Tiempo (h)

Con

cent

raci

ón (μ

g/m

l)

Figura 3. Curva patrón de ácido indól acético

Figura 4. Concentración de AIA producido por las cepas de Azospirillum

HMA •0, 50, 100 y 200 g•Transplante

AZO 1 •Volumen: 20 ml•70 días tras inoculación fúngica

AZO 2 •Volumen: 40 ml•98 días de inoculación con HMA

FIN•Evaluación a 150 días•Variables de crecimiento: H, P, AF, Biomasa, Nutrientes•Población final HMA y % colonización (Philips & Hayman, 1970)•Población final Azospirillum

RE

SULT

AD

OS

POBLACIÓN FINAL DE ESPORAS Y % COLONIZACIÓN MICORRÍCICA

Tabla 1. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento la población final

de esporas de HMA

Figura 5. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento la población final

de esporas de HMA

Tabla 2. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el porcentaje de

colonización micorrícica

Girish, 2006: Azospirillum y Glomus fasciculatum en tomate

Población final de AzospirillumR

ESU

LTA

DO

S

+

Belimov et al, 1999: Azospirillum y HMA en cebada

Tabla 3. Población final de Azospirillum en suelo y raíces de banano

ALTURAR

ESU

LTA

DO

S

b = 0,05 d= 21,29

Figura 6. Modelo de Gompertz para la altura

Tabla 4. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de altura

para el período 70-150 días

Figura 7. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de altura para el

período 70-150 días

b = 0,05 d= 11,24

7H / Control

RE

SULT

AD

OS

PERÍMETRO

Figura 8. Modelo de Gompertz para el perímetro.

Tabla 5. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de

perímetro para el período 70-150 días

Figura 9. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de perímetro para el período 70-150 días

b = 0,03 d= 6,60

b = 0,13 d= 4,45

4P/Control

RE

SULT

AD

OS

ÁREA FOLIAR

Figura 10. Modelo de Gompertz para el área foliar

Tabla 6. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el

incremento de área foliar para el período 70-150 días

Figura 11. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento del área foliar

para el período 70-150 días

16AF/Control

RE

SULT

AD

OS

BIOMASA AÉREA

Figura 12. Modelo de Gompertz para la biomasa aérea

Tabla 7. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa aérea

Figura 13. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa aérea de plantas de

banano.

12BA/Control

RE

SULT

AD

OS

BIOMASA RADICAL

Figura 14. Modelo de Gompertz para la biomasa radical

Tabla 8. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa radical

Figura 15. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa radical de plantas de

banano.

Yano-Melo et al, 1999: Glomus y Acaulospora (banano)Baset et al, 2009: Azospirillum Sp7 bananoJaizme et al, 2004: Bacillus+Glomus (banano)

4BR/Control

RE

SULT

AD

OS

CONTENIDO DE NUTRIENTESa b

cNUTRIENTES EN TEJIDO FOLIAR

a. Contenido de Nitrógenob. Contenido de Fósforoc. Contenido de Potasio

NUTRIENTES EN SUELOa. Contenido de Nitrógenob. Contenido de Fósforo

a b

Jaizme & Rodríguez, 2002: Glomus (3P , 3N)Baset et al (2009): Azospirillum Sp7 (2N , 2P)Girish, 2006: Glomus+Azospirillum (2N, 2P)

CONCLUSIONES1. La Hacienda Central poseía la mayor densidad poblacional de propágulos de HMA entre las 7 hdas.

bananeras evaluadas.

2. Utilizando 30% de suelo de la Hacienda Central, un sustrato de suelo - arena (1:1) y plantas de avena como hospederas, se obtuvo (tras cinco meses de propagación) un inóculo micorrícico que contenía 10 esporas/g de suelo.

3. La cepa G4b de Azospirillum fue la que produjo mayor cantidad de AIA (6,33 μg/ml) en relación a las cepas restantes y fue seleccionada como cepa inóculo.

4. La co-inoculación de 200 g de HMA y 1,5E8 UFC/ml de Azospirillum favorece el crecimiento de las plántulas de banano, permitiendo incrementar 7 veces la altura, 4 veces el perímetro, 16 veces el área foliar, 12 veces la biomasa aérea y 8 veces la biomasa radical, en relación a las plantas control.

CONCLUSIONES

5. La co-inoculación de 200 g de HMA y 1,5E8 UFC/ml de Azospirillum promueve una mejor absorción de fósforo y nitrógeno.

6. La población final de esporas de HMA y el porcentaje de colonización, son favorecidos por la co-inoculación de Azospirillum, alcanzando los mayores valores (62,67 esporas/g y 96,67%) para la interacción de HMA- Azospirillum en sus mayores dosis

7. La población final de Azospirillum incrementa cuando se co-inoculan con HMA.

RECOMENDACIONES• Realizar un ensayo similar utilizando menor número de tratamientos y más repeticiones para lograr obtener

resultados que permitan determinar en forma concreta el efecto de cada uno de los microorganismos y de su interacción sobre el desarrollo y nutrición de banano.

• Evaluar el efecto de mayores concentraciones de Azospirillum sobre el desarrollo de plántulas de banano, a fin de determinar la concentración máxima que beneficia a la planta y la dosis a la que se registran perjuicios sobre su desarrollo.

• Incrementar el porcentaje de turba en el sustrato para el crecimiento de las plantas o aumentar el tiempo de aplicación de solución nutritiva, a fin de alcanza niveles óptimos de fósforo en el suelo que no perjudiquen a los HMA pero que permitan una adecuada nutrición de las plantas.

• Evaluar la productividad de las plantas de banano co-inoculadas con HMA y Azospirillum en campo.

GRACIAS