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Tesis Doctoral

Estabilidad de emulsiones yEstabilidad de emulsiones yencapsulación de aceites conencapsulación de aceites con

propiedades nutraceúticaspropiedades nutraceúticas

Alvarez Cerimedo, María Soledad

2013-03-27

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Alvarez Cerimedo, María Soledad. (2013-03-27). Estabilidad de emulsiones y encapsulación deaceites con propiedades nutraceúticas. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidadde Buenos Aires.

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Alvarez Cerimedo, María Soledad. "Estabilidad de emulsiones y encapsulación de aceites conpropiedades nutraceúticas". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. 2013-03-27.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física

Estabilidad de emulsiones y encapsulación de

aceites con propiedades nutraceúticas

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos

Aires en el área Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física

María Soledad Álvarez Cerimedo

Directores de tesis: Dra. María Lidia Herrera

Dr. Roberto Jorge Candal

Consejera de estudios: Dra. Sara Aldabe Bilmes

Buenos Aires, 2013

i

Resumen

En este trabajo se estudió la estabilidad de emulsiones de aceites ricos en ácidos

grasos Omega-3 en soluciones de trehalosa y su utilización como precursores de polvos

conteniendo el aceite encapsulado. Los aceites ricos en ácidos grasos Omega-3 son muy

valiosos nutricionalmente pero fácilmente oxidables. El énfasis del trabajo se centró en

determinar los mecanismos de desestabilización de las emulsiones en función de su

composición, buscando correlaciones entre la estabilidad y la eficiencia de encapsulación.

Las emulsiones se formularon empleando distintas concentraciones de trehalosa y de

caseinato de sodio (NaCas) como emulsificante. Se analizó su estabilidad en el tiempo, su

morfología y el tamaño de las gotas de aceite. Los resultados obtenidos mostraron que los

mecanismos de desestabilización de las emulsiones son dependientes de la concentración de

emulsificante y que la incorporación de trehalosa aumenta la estabilidad de las dispersiones.

Los sistemas con menor concentración de NaCas se desestabilizaron por mecanismos de

cremado. Para concentraciones intermedias, se obtuvieron fenómenos de desestabilización

mixtos. A concentraciones aún mayores de emulsificante se observó la formación de flóculos.

Para concentraciones muy altas de NaCas y en presencia de trehalosa se encontró un intervalo

de estabilidad (5,0-7,0% p/p NaCas) en el cual las emulsiones presentaron una

microestructura homogénea con un tamaño de gota pequeño.

En base a los resultados de estabilidad de emulsiones, se prepararon polvos

deshidratados con el aceite de pescado microencapsulado mediante liofilización. Las

emulsiones que cremaban o floculaban presentaron poca eficiencia de retención del material

encapsulado en la matriz. La emulsión con 5,0% p/p de NaCas y 20% p/p de trehalosa

correspondió al polvo con más eficiencia de encapsulación. En esta emulsión se encontró una

relación estrecha entre el tipo de sólido de la matriz de los polvos y la eficiencia de retención

del aceite. El sistema con mayor retención fue el único que permaneció no cristalino (amorfo)

luego del proceso de deshidratación. El mismo tampoco presentó cambios en el tamaño de

gota con los procesos de congelado y liofilización.

Otra propiedad que se estudió en los polvos encapsulados es el grado de oxidación del

aceite de pescado ya que al tratarse de ácidos grasos muy insaturados presentan una alta

susceptibilidad a la oxidación, en detrimento de su valor nutricional. Se desarrolló una nueva

técnica de estudio de la oxidación del aceite sin extraerlo de la matriz de trehalosa,

mediante la espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método presenta grandes ventajas

frente a las técnicas usuales en el análisis de oxidación de lípidos, y sus resultados mostraron

que la encapsulación de aceites lábiles es una herramienta muy útil a la hora de protegerlos

contra la oxidación.

Palabras clave: estabilidad, encapsulación, emulsiones, ácidos grasos Omega-3, oxidación,

MALDI-TOF, retención, trehalosa, caseinato de sodio.

ii

Abstract

Stability of emulsions and encapsulation of oils

with nutraceuticals properties

In this work, the stability of emulsions prepared with oils rich in Omega-3 fatty acids

and trehalose solutions and their use as precursors of oil encapsulated powders was

investigated. Oils rich in Omega-3 fatty acids are nutritionally valuable but easily oxidized.

The emphasis of the work focused on determining the mechanisms of destabilization of

emulsions depending on their composition, looking for correlations between stability and

encapsulation efficiency.

The emulsions were formulated using different concentrations of trehalose and

sodium caseinate (NaCas) as emulsifier. We analyzed the stability over time, morphology and

size of the oil droplets. The results showed that the mechanisms of destabilization of

emulsions are dependent on the concentration of emulsifier, and that the incorporation of

trehalose increases the stability of the dispersions. Systems with lower concentration of

NaCas were destabilized by creaming. For intermediate concentrations mixed destabilization

phenomena were obtained. At even higher concentrations of emulsifier the formation of flocs

was observed. For very high concentrations of NaCas and in the presence of trehalose it was

found a stability range (5.0 to 7.0% p/p NaCas) in which the microstructure showed

homogeneous emulsions with a small droplet size.

Based on the results of stability of emulsions, dried powders were prepared with fish

oil microencapsulated by lyophilization, for different formulations of trehalose and caseinate.

Emulsions that destabilized by creaming or flocculation showed little retention efficiency of

the encapsulated material in the matrix. The emulsion with 5 wt.% NaCas and 20 wt.%

trehalose corresponded to the powder with the highest encapsulation efficiency. In this

emulsion, a close relationship between the type of solid matrix powders and the oil retention

efficiency was found. The system with the highest retention was the only that remained non-

crystalline (amorphous) after the dehydration process. In addition, these systems did not

show changes in droplet size with freezing and lyophilization processes.

Another property that was studied in encapsulated powders is the degree of oxidation

of fish oil since these consisted of highly unsaturated fatty acids having a high susceptibility

to oxidation, detrimental of their nutritional value. We developed a new technique for the

study of oxidation of the oil without extracting it from the trehalose matrix, by MALDI-TOF.

This method has great advantages over conventional techniques in the analysis of lipid

oxidation, and their results showed that encapsulation of labile oils is a very useful tool at the

time to protect them against oxidation.

Keywords: stability, encapsulation, emulsions, Omega-3 fatty acids, oxidation, MALDI-TOF,

retention, trehalose, sodium caseinate.

A mi familia.

- En efecto, ¿qué voy a sacar? Se trata del arte por el arte, Watson. Me imagino

que también usted, al doctorarse en Medicina, se dedicaría al estudio de

muchos casos sin pensar en sus honorarios.

- Para aprender yo, Holmes.

- Nunca se acaba de aprender, Watson. Aún los más grandes tienen que

aprender muchas cosas hasta el final.

Sherlock Holmes en La aventura del Círculo Rojo. Arthur Conan Doyle.

En el fondo, los científicos somos gente con suerte: podemos jugar a lo

que queramos durante toda la vida.

Lee Smolin

Agradecimientos

vi

Agradecimientos

A la Universidad de Buenos Aires, a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y al

Departamento de Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física por

brindarme la posibilidad de realizar mi trabajo de Tesis de Doctorado. A la Agencia

Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT), al CONICET y a la

Universidad de Buenos Aires por financiar este trabajo a través de los subsidios que

nos otorgaron.

A la Asociación Brasilera de Óleos y Gorduras por alentarme a través del premio

“Segundo premio, XII Congreso Latinoamericano de Grasas y Aceites, Noviembre 12-

14, 2007, Florianópolis, SC, Brasil”. Al Honorable Senado de la Nación por declarar de

interés público el proyecto Alternativas a las grasas trans (VSP-703/11, Buenos Aires,

27 de Julio de 2011) en el que se enmarca este trabajo de tesis.

A mis directores de tesis, Lidia y Roberto, por enseñarme. A mi consejera de

estudios, Sara, por aconsejarme mucho más allá de los temas académicos.

A los CPAs Vicente, Roberto, Gabriela, Adriana y Guille, por ayudarme con los

equipos del demonio: el microscopio confocal, el liofilizador y especialmente con el

Maldi. A Walter, por tanto material prestado (y casi nunca devuelto).

A Flor Cecchi, por ayudarme con el maldito MALDI-TOF y facilitarme los calibrantes.

Al profesor Fabio Cukiernik, porque es mi modelo de científico y de persona. A Juan

Pellegrino y coterráneos, por ayudarme con la caja seca.

A toda la gente del INQUIMAE: Ana L, Césped, Joe, Mercedes, Diego, Juan, Charlie,

Cristián, Vir, Betty, Jerónimo, Darío, Luciano; por compartir el tiempo conmigo y

ayudarme en todo. A Ale, de secretaría de QI, que me sacó las papas del fuego

muchas veces.

A los de Industrias: Caro, Naty, Silvi, Pato, Cris, Flor, Jaime, Betty, Pilar, Vero,

Mario, Nerina, Víctor, Juli, Abel.

A la música, al cine y a los libros. A Buenos Aires. A mi bicicleta.

vii

A mi segunda familia, los amigos desde siempre: Lu, Mati, Toti, La Negra, Laurita y

Laura. A los que ya son también carne de mi carne: Agus, Gus van Sanatan, Ceci,

Richard, Goni, Marie, Woopi. A los que conocí en Exactas, cursando o trabajando:

Reche, Yani, Noé, Anita, Caro, Sole, Marto, Chechu, Nahue, Nico, Fer, Marce, Víctor,

el Dr. Jobbágy, Marce, Peggy, Flor. A todos, gracias por acompañarme, quererme y

reírse de mis chistes. Nada es tan malo si los tengo cerca.

A mis papás, Juan y Rita porque no me dejaron caer cuando todo se cayó. A mis

abuelos que están acá (Amelia y Carmen) y a los que se fueron (Coco y Mario),

porque esto que soy lo empezaron a formar ellos. A mi hermano, Juan, por ser tan

sabio y porque nadie me conoce tanto y aún así me quiere.

A Soty, mi angelito, mi vida. Porque sos lo mejor que me pasó.

Índice

ix

Índice General

Resumen i

Abstract ii

Agradecimientos v

Introducción 1

1. Introducción 2

1.1. Emulsiones alimentarias 2

1.2. Propiedades de las emulsiones 7

1.2.1. La concentración de la fase dispersa 8

1.2.2. La distribución de tamaño de gota (o partícula) de la fase dispersa 8

1.2.3. Interacciones entre las gotas de la fase dispersa 11

1.2.4. Estabilidad de una emulsión 12

1.2.4.1. Mecanismos de desestabilización de emulsiones 13

1.2.4.1.1. Cremado y sedimentación 13

1.2.4.1.2. Floculación y coalescencia 15

1.2.4.1.3. Coalescencia parcial 19

1.2.4.1.4. Madurado de Ostwald 20

1.2.4.1.5. Inversión de fase 21

1.2.4.2. Estudio de la estabilidad de emulsiones 22

1.3. Los sistemas estudiados 23

1.3.1. Los triglicéridos 24

1.3.2. Los ácidos grasos Omega-3 26

1.3.2.1. Características generales 26

1.3.2.2. Su relación con la salud 28

1.3.2.3. Propiedades químicas 29

1.3.2.3.1. Etapas de la reacción de oxidación 31

1.3.2.3.2. Los hidroperóxidos 35

1.3.2.3.3. Esquema integral de oxidación lipídica 38

1.3.2.4. Alimentos enriquecidos con Omega-3 40

1.3.3. El emulsificante 41

1.3.3.1. Los emulsificantes proteicos 44

1.3.3.1.1. El caseinato de sodio 47

1.3.4. Azúcares 51

1.3.4.1. Trehalosa 52

1.4. Encapsulación 59

1.4.1. El proceso de encapsulación 60

1.4.2. El proceso de liofilización 61

x

Objetivos 64

2. Objetivos 65

Materiales y métodos 66

3. Materiales y métodos 67

3.1. Elección de los sistemas 67

3.2. Características de las drogas y materias primas utilizadas 67

3.3. Análisis de ácidos grasos por cromatografía gaseosa acoplada

a espectrometría de masas 68

3.3.1. Condiciones experimentales CG-MS 68

3.4. Preparación de emulsiones 68

3.4.1. Fase acuosa 68

3.4.2. Fase dispersa 69

3.4.3. Homogenización 69

3.5. Estabilidad de las emulsiones 71

3.5.1. Principio de funcionamiento del Turbiscan 71

3.5.2. Caracterización de emulsiones y análisis de estabilidad a través del Turbiscan 72

3.5.2.1. Identificación de mecanismos de desestabilización 73

3.5.2.2. Parámetros cinéticos 76

3.5.2.3. Mediciones con Turbiscan 78

3.6. Microestructura de las emulsiones 78

3.6.1. Observación de las emulsiones 80

3.7. Análisis de tamaño de partícula 80

3.7.1. Determinación del tamaño y distribución de gota 81

3.8. Generación de los polvos deshidratados 82

3.8.1. Medición del tamaño de partícula 83

3.8.2. Determinación del contenido de agua 84

3.8.3. Transiciones térmicas 84

3.8.3.1. Análisis de los polvos liofilizados 85

3.8.4. Cristalinidad de los polvos liofizados 87

3.8.4.1. Obtención de diagramas de Rayos X 88

3.8.5. Determinación de la eficiencia de encapsulación

(retención del aceite en los polvos) 89

3.8.5.1. Determinación del aceite no encapsulado 89

3.8.5.2. Determinación del aceite encapsulado 91

3.9. Estudios de oxidación 92

3.9.1. Determinación del índice peróxido (PV) en el aceite no encapsulado 92

3.9.1.1. Determinación del valor peróxido de las muestras 93

3.9.1.1.1. Curva de calibración 93

3.9.1.1.2. Validación de la curva de calibración 94

xi

3.10. Estudio de oxidación a través de MALDI-TOF 95

3.10.1. Preparación de las muestras 95

3.10.2. Arreglo de siembra 96

3.10.3. Condiciones instrumentales 97

3.10.4. Análisis de la oxidación a través de MALDI-TOF 97

3.11. Análisis estadístico 100

Resultados y discusión 101

4. Resultados y Discusión: Estabilidad de emulsiones 102

4.1. Caracterización del concentrado de aceite de pescado 102

4.1.1. Análisis de parámetros de calidad 102

4.1.2. Análisis de ácidos grasos por CG-MS 103

4.2. Estabilidad de las emulsiones 105

4.2.1. Emulsiones sin trehalosa 105

4.2.1.1. Tamaño de partícula 105

4.2.1.2. Análisis por Turbiscan 107

4.2.1.3. Microestructura 125

4.2.2. Emulsiones con trehalosa 128

4.2.2.1. Tamaño de partícula 128

4.2.2.2. Análisis por Turbiscan 134

4.2.2.3. Microestructura 139

4.3. Cuantificación de los procesos de desestabilización 145

4.3.1. Evaluación de la velocidad de migración 145

4.3.2. Evaluación de la desestabilización por floculación 147

4.4. Estudio de la zona de estabilidad 153

4.4.1. Tamaño de partícula 153

4.4.2. Análisis por Turbiscan 161

4.4.3. Microestructura 166

4.4.4. Evaluación de la desestabilización por floculación 172

4.5. Análisis de la estabilidad global 174

5. Resultados y discusión: Polvos liofilizados 177

5.1. Análisis de los polvos liofilizados 177

5.1.1. Tamaño de partícula 177

5.1.2. Comportamiento térmico 184

5.1.3. Contenido de agua 188

5.1.4. Grado de cristalinidad de los polvos 190

5.1.5. Eficiencia de encapsulación 194

5.2. Análisis del grado de oxidación del aceite por métodos tradicionales 200

5.2.1. Concentrado de aceite de pescado inicial 200

5.2.2. Aceites no encapsulados contenidos en los polvos deshidratados 201

xii

5.2.3. Aceites encapsulados contenidos en los polvos deshidratados 202

5.3. Análisis del grado de oxidación del aceite por MALDI-TOF 204

5.3.1. Concentrado de aceite de pescado inicial 204

5.3.2. Aceites no encapsulados contenidos en los polvos deshidratados 206

5.3.3. Aceites encapsulados contenidos en los polvos deshidratados 209

5.3.4. Análisis del aceite encapsulado en los polvos lavados 212

Conclusiones 217

6. Conclusiones 218

Anexo 221

Anexo. MALDI-TOF 222

1. Generalidades 222

2. Fundamentos 224

3. La matriz 226

4. Preparación y sembrado de la muestra 227

5. Patrones internos 230

6. Límites de detección 231

7. Cuantificación 231

8. Estudio de la oxidación lipídica a través de MALDI-TOF 232

Referencias Bibliográficas 234

Introducción

2

1. Introducción

Los verdaderos tesoros, mi querido Borges, son los que

desafían nuestra inteligencia. Los otros no merecen la pena.

J. Fernández Díaz, El dilema de los próceres

1.1. Emulsiones alimentarias

Aunque el agua y el aceite son sustancias prácticamente inmiscibles, existen

incontables ejemplos de materiales naturales y productos industriales donde los

lípidos y el material acuoso se presentan en alguna forma de dispersión. Entre las

dispersiones más frecuentes se encuentran las emulsiones, donde el aceite está

presente en finas gotas en una fase acuosa continua (Coupland, 2006). Las

emulsiones son ampliamente utilizadas en una gran variedad de aplicaciones debido a

su capacidad para transportar o solubilizar las sustancias hidrófobas en una fase

continua de agua (Leal-Calderon et al., 2007a). Muchos productos alimentarios

naturales y procesados existen parcial o totalmente como emulsiones, o han estado

emulsificados en algún momento durante su generación. La leche, por ejemplo,

constituye la más común entre las emulsiones alimentarias naturales. Las mayonesas,

los aderezos para ensaladas, la crema, los helados, la manteca y la margarina

constituyen emulsiones alimentarias creadas en la industria. Las cremas en polvo

para café, las salsas y muchos postres, en tanto, son productos que en algún

momento del proceso productivo fueron emulsiones (McClements, 2008).

La gran diversidad de características fisicoquímicas y organolépticas exhibidas

por las emulsiones alimentarias son resultado de la formulación del producto y de las

condiciones de procesamiento con las que fueron creadas (McClements y Weiss,

2005). El desarrollo de relaciones cuantitativas entre la composición de emulsiones,

3

su estructura y funcionalidad es uno de los principales éxitos en la fisicoquímica de

alimentos (Coupland, 2006). La ciencia de emulsiones constituye en la actualidad un

tema multidisciplinario que combina la química, la física, la biología y la ingeniería

(McClements y Weiss, 2005). Tradicionalmente, los principios fundamentales de la

ciencia de emulsiones derivaron de disciplinas como la ciencia de polímeros, la

ciencia coloidal, la química interfacial y la mecánica de fluídos (McClements,

2005a).

Los coloides constituyen una clase muy amplia de materiales. Su estructura

básica consiste en una dispersión de una fase en otra, donde la fase dispersa se

encuentra en una escala de tamaños que van desde los nanómetros hasta los

micrones. Algunos coloides son termodinámicamente estables y por lo general se

forman espontáneamente, mientras que otros son metaestables y requieren energía

para su preparación y para la persistencia de sus propiedades específicas (Leal-

Calderón et al., 2007a).

Las emulsiones son un ejemplo de los coloides metaestables. Una emulsión se

puede definir como un material que consiste en pequeñas gotas esféricas de un

líquido disperso en otro líquido en el que es al menos parcialmente inmiscible

(McClements y Weiss, 2005), (Figura 1.1). Las emulsiones convencionales -también

llamadas macroemulsiones- contienen gotas de diámetros de entre 100 nm y 100 m

y suelen presentarse opacas debido a que las gotas tienen un tamaño similar a la

longitud de onda de la luz (d ) por lo que se produce el fenómeno de dispersión

(McClements, 2010). Las nanoemulsiones –también llamadas microemulsiones-, en

cambio, están formadas por gotas cuyo tamaño varía entre 20 a 100 nm (Tadros et

al., 2004) y aparecen como transparentes o ligeramente turbias a la vista dado que

las dimensiones de las gotas son usualmente mucho menores que la longitud de onda

de la luz (d ) y la dispersión es relativamente débil (Herrera, 2012).

4

Pueden distinguirse distintas clases de emulsiones, como las de aceite en agua

(abreviadas normalmente O/W, por sus siglas en inglés) o las de agua en aceite

(W/O). Al primer grupo corresponden, por ejemplo, la leche, la crema, la mayonesa,

las sopas y las salsas, mientras que la margarina y la manteca son típicos

representantes de las emulsiones W/O. La sustancia que conforma las gotas de una

emulsión se denomina fase dispersa, discontinua o interna, mientras que la sustancia

que compone el líquido circundante se llama fase continua o externa (McClements,

2005b).

Además de las emulsiones convencionales W/O y O/W, es posible obtener

distintos tipos de emulsiones múltiples, entre las que se encuentran las de aceite en

agua en aceite (O/W/O), o las de agua en aceite en agua (W/O/W), (Benichou et al.,

2004). Estas emulsiones múltiples, o ‘emulsiones de emulsiones’, son sistemas

complejos en los que las gotas dispersas contienen gotas más pequeñas en su interior

(Figura 1.2). Se utilizan fundamentalmente para encapsular y liberar de forma

controlada principios activos en numerosas aplicaciones, incluyendo la administración

de fármacos, alimentos, cosmética, separaciones químicas y síntesis de microesferas

y microcápsulas (Chu et al., 2007).

Figura 1.1. Imagen de una emulsión tomada con un microscopio de luz polarizada. La fase dispersa es un aceite vegetal y la fase continua es una solución acuosa de sacarosa.

5

Figura 1.2. Esquema de una emulsión de aceite en agua en aceite (O/W/O).

El proceso que convierte dos líquidos inmiscibles separados en una emulsión, o

la reducción del tamaño de las gotas en una emulsión preexistente se denomina

homogenización. En la industria alimentaria, este proceso se lleva a cabo a través de

equipos que someten a los líquidos a una intensa agitación mecánica, como por

ejemplo mezcladores de alta velocidad, molinos coloidales y homogenizadores de

alta presión (Mootoosingh y Rousseau, 2006).

Es posible generar una emulsión a partir de la homogenización entre aceite

puro y agua, pero estas dos fases por lo general se separan rápidamente en una capa

de aceite en la parte superior (debido a su menor densidad) y una capa de agua en la

parte inferior (mayor densidad). El origen de este comportamiento puede explicarse

por la estabilidad de la red de uniones puente de hidrógeno en el agua, que

imposibilita la disolución de lípidos y compuestos derivados, y produce la segregación

entre el aceite y el agua. Este fenómeno es conocido como efecto hidrofóbico

(Southall et al., 2002), y se debe a la incapacidad que poseen las moléculas lipídicas

para formar uniones puente de hidrógeno, por lo que éstas se mantienen unidas

entre sí mediante interacciones dipolo-dipolo. Por lo tanto, cuando una molécula de

aceite se pone en contacto con el agua, la red de uniones puente de hidrógeno se ve

afectada y como consecuencia disminuye la entropía y toda la estabilidad del

sistema. El efecto hidrofóbico, que impulsará la aglomeración de las moléculas de

6

aceite y disminuirá la superficie de contacto con el agua, es en gran medida de

origen entrópico (Meyer et al., 2006).

A pesar de su inestabilidad termodinámica, se pueden generar emulsiones

cinéticamente estables (metaestables) durante un período de tiempo prolongado,

mediante la inclusión de sustancias conocidas como estabilizadores. Un estabilizador

es un ingrediente que se utiliza para mejorar la estabilidad de una emulsión y se

clasifica como emulsificante, modificador de la textura, agente de carga o

retardador de madurado, en función de su mecanismo de acción (McClements,

2010). Los emulsificantes son moléculas de superficie activa que se adsorben en la

interfase de las gotas recién formadas durante la homogenización, facilitando la

disrupción de las gotas en el homogenizador y estabilizándolas contra fenómenos de

agregación. Los modificadores de la textura (entre los que se encuentran la goma

xántica, el alginato y la goma guar) por otra parte, incrementan la viscosidad de la

fase continua, y se utilizan para modificar la textura y mejorar la estabilidad de las

emulsiones retardando el movimiento de las gotas (McClements y Weiss, 2005). Los

agentes de carga son sustancias que se agregan a las gotas para equiparar su

densidad con la fase continua, reduciendo la fuerza impulsora por separación

gravitacional. Los retardadores de madurado, por último, son materiales muy

hidrofóbicos que, agregados a la fase dispersa, reducen o previenen un mecanismo

particular de desestabilización, el madurado de Ostwald (McClements, 2010).

Muchas de las propiedades de este tipo de dispersiones sólo pueden ser

entendidas en referencia a su naturaleza dinámica: para formar una emulsión, se

provoca la ruptura de gotas grandes y deformables a través de la aplicación de

energía mecánica. Este proceso involucra la creación súbita de una gran cantidad de

líquido interfacial (Dickinson, 2009). Aún después de haberse formado, las gotas de

aceite están en continuo movimiento y con frecuencia chocan entre sí debido al

movimiento browniano, la gravedad o fuerzas mecánicas aplicadas.

7

La mayoría de las emulsiones alimentarias son mucho más complejas que los

sistemas de tres componentes descriptos hasta aquí, conformados por aceite, agua y

un emulsionante. La fase acuosa suele contener una amplia variedad de ingredientes

hidrofílicos, incluyendo azúcares, sales, ácidos, bases, alcoholes, surfactantes,

proteínas y polisacáridos. La fase lipídica está formada generalmente por una mezcla

de componentes lipofílicos, como triglicéridos, glicéridos, monoacilgliceroles, ácidos

grasos libres, esteroles y vitaminas. La región interfacial está constituida por un

conjunto de tensioactivos, incluyendo proteínas, polisacáridos, fosfolípidos,

surfactantes, alcoholes y complejos moleculares; su composición puede evolucionar

en el tiempo. Además, los ingredientes que constituyen las emulsiones no se

encuentran exclusivamente en una fase sino que se distribuyen entre las mismas

dependiendo de sus coeficientes de partición (McClements, 2008).

En síntesis, las emulsiones alimentarias constituyen materiales complejos cuya

composición, estructura, dinámica y otros tantos factores impactan directamente en

sus propiedades macroscópicas. El conocimiento actual sobre estos sistemas ha

derivado fundamentalmente del estudio de sistemas modelo sencillos, pero existe un

creciente interés en la necesidad de elucidar los factores que determinan las

propiedades de los productos alimenticios reales, basados total o parcialmente en

emulsiones. Por esta razón, muchos investigadores se encuentran abocados al estudio

de los factores que determinan las propiedades de emulsiones alimentarias.

1.2. Propiedades de las emulsiones

Las propiedades fisicoquímicas de las emulsiones (por ejemplo, la reología,

propiedades ópticas, la estabilidad y la partición molecular) son altamente

dependientes de las características de su fase dispersa (McClements et al., 2007).

8

1.2.1. La concentración de la fase dispersa

La concentración de las gotas de aceite de una emulsión se describe

generalmente en términos de fracción en volumen de fase dispersa (), que es igual

al volumen de las gotas de la emulsión (VD), dividido por el volumen total de la

emulsión (VE): = VD/VE. En algunas situaciones, es más conveniente expresar la

concentración de las gotas en términos de la fracción de fase dispersa en masa (m),

que es igual a la masa de las gotas de la emulsión (mD), dividida por la masa total de

la emulsión (mE): m = mD/mE (McClements, 2005c).

Cuando las densidades de las dos fases son iguales, la fracción en masa es

equivalente a la fracción en volumen. Otros autores informan, de modo más directo,

la concentración de las gotas como un porcentaje de volumen o de masa. Por lo

general se conoce el valor de ya que la concentración de cada ingrediente utilizado

en la emulsión es cuidadosamente controlada. Sin embargo, suelen ocurrir

variaciones locales en la fracción de fase dispersa en volumen en las emulsiones

cuando éstas se desestabilizan, o al someter a la dispersión a distintos

procesamientos (McClements y Weiss, 2005).

1.2.2. La distribución de tamaño de gota (o de partícula) de la fase dispersa

Uno de los métodos más rápidos y utilizados para determinar el tamaño de

gota en las emulsiones es la dispersión dinámica de la luz (DLS, por sus siglas en

inglés). Esta técnica mide la fluctuación en la intensidad de luz dispersada en función

del tiempo, debida al movimiento browniano de las partículas de aceite en la

dispersión. La información dinámica de las partículas se deriva de una función de

autocorrelación, que es esencialmente una suma ponderada de exponenciales que

depende de los coeficientes de difusión de las gotas a través de la fase continua. Esta

técnica es particularmente útil para medir los cambios producidos durante el

procesamiento o almacenamiento de emulsiones ya que puede detectar si se produce

9

una agregación (síntoma de desestabilización) y estudiar los cambios en tiempo real

(Dalgleish, 2004).

Una emulsión cuyas gotas de aceite poseen el mismo tamaño se denomina

monodispersa, mientras que cuando dichas gotas se presentan en una amplia gama

de tamaños se denomina polidispersa (Figura 1.3). El tamaño de la gota de una

emulsión monodispersa puede ser completamente caracterizado por un único

parámetro, como el diámetro de la gota o su radio. Este tipo de dispersiones se

preparan y utilizan por lo general en estudios modelo, porque la interpretación de las

mediciones experimentales es significativamente más simple que en los sistemas

polidispersos.

Las emulsiones reales, sin embargo, siempre poseen una fase dispersa con

distintos tamaños de gotas, por lo que se requiere usualmente información sobre la

distribución de tamaños completa (es decir, las fracciones de gotas de diferentes

rangos de tamaño), la media del tamaño de gota y el ancho de dicha distribución

(McClements, 2005d). Las emulsiones, según el número de poblaciones que poseen

(picos presentes en su distribución), pueden caracterizarse como monomodales,

bimodales o multimodales (uno, dos o más de dos picos).

Figura 1.3. Representación esquemática de emulsiones mono y polidispersas. En una emulsión monodispersa todas las gotas tienen el mismo tamaño, mientras que en una polidispersa presentan un rango de distintos tamaños.

10

Como el número de gotas en la mayoría de las emulsiones es muy grande, su

tamaño puede variar de forma aproximadamente continua desde un valor mínimo a

otro máximo. Usualmente se divide el intervalo total en una serie de rangos discretos

y se informa el número de gotas que pertenece a cada categoría. Los datos

resultantes se presentan en una tabla de datos, un histograma o una curva continua.

En este último caso, puede plantearse una función de distribución o una función

acumulativa (McClements y Weiss, 2005).

El tamaño de las gotas de una emulsión polidispersa suele completarse por

algunos parámetros adicionales, además de la distribución de tamaños. El más

importante es el diámetro medio (D), que constituye una medida de la tendencia

central de la distribución.La determinación de los diámetros promedio D1,0, D2,0 y D3,0

requieren el conocimiento del número total de gotas. El conteo de gotas en una

emulsión es un proceso extremadamente tedioso y complejo, de manera que se

utilizan los diámetros promedio de Sauter (D3,2) y de De Brouker (D4,3), cuyas

fórmulas no contienen el número total de gotas. Estos diámetros se conocen como

“moment diameters” e introducen otro término lineal en el diámetro, de manera que

en el numerador el término superficial tiene una dependencia con D3 y el volumen

con D4 (Walstra, 1999; McClements, 2007). Los diámetros D3,2 y D4,3 se calculan

empleando las siguientes fórmulas (Ec. 1.1 y 1.2):

2

3

2,3ii

ii

Dn

DnD [1.1]

3

4

3,4ii

ii

Dn

DnD

[1.2]

11

Otros parámetros que se emplean para cuantificar emulsiones polidispersas

son W, que es una medida del ancho de la distribución, y %Vd>1, el porcentaje de

partículas con diámetros mayores a 1 µm. Wse calcula con los percentilos 90 (D x, 0,9) y

10 (D x, 0,1) y da idea de la polidispersidad (P) de la emulsión que se calcula de la

siguiente forma (Ec. 1.3):

5,0,5,0,

1,0,9,0, )(

xx

xx

D

W

D

DDP [1.3]

con D x, 0,5, percentilo 50.

El D4,3 posee mayor sensibilidad a la presencia de partículas de gran tamaño en

una emulsión que el D3,2, por lo que el primero constituye un parámetro preferencial

al estudiar fenómenos de agregación (Relkin y Sourdet, 2005).

1.2.3. Interacciones entre las gotas de la fase dispersa

Las emulsiones contienen una variedad de entidades estructurales que

pertenecen al rango de tamaño coloidal -desde unos pocos nanómetros hasta los

micrómetros- como los agregados moleculares, las micelas, las gotas de la fase

dispersa, los cristales de grasa y de hielo y las burbujas. Las características de estas

partículas coloidales y sus interacciones son responsables de muchas de las

propiedades fisicoquímicas y organolépticas de las emulsiones.

Las interacciones entre dos gotas de una emulsión se pueden describir en

términos del potencial intergota, w(h), que es la energía necesaria para desplazar las

gotas desde una separación infinita hasta una distancia h. El potencial intergota

global entre dos gotas es la suma de muchos tipos diferentes de interacciones,

incluyendo fuerzas de van der Waals, estéricas, electrostáticas, hidrofóbicas, de

agotamiento y de hidratación (McClements y Weiss, 2005). Estas contribuciones

individuales pueden variar en su signo (atractivo o repulsivo), en su magnitud (fuerte

12

o débil) y en su alcance (largo o corto). Aunque cada interacción por separado exhibe

una dependencia simple y monótona con respecto a la separación entre las

superficies de las gotas, su suma resulta en un comportamiento complejo que posee

tanto mínimos como máximos a ciertas h.

Cuando las fuerzas de atracción predominan en una dispersión, las gotas

tienden a asociarse entre sí, mientras que si las fuerzas de repulsión son mayores las

gotas suelen permanecer como entidades individuales. El comportamiento de la fase

dispersa, en relación a las interacciones entre las gotas, puede derivar en grandes

cambios en la estabilidad del sistema, en su reología, apariencia y sabor, y es crucial

para entender su origen físico y sus características.

1.2.4. Estabilidad de una emulsión

Las emulsiones poseen un área interfacial total muy grande que está asociada

a una energía libre positiva. Por esta razón son sistemas termodinámicamente

inestables que tienden, con el tiempo, a separarse en sus fases individuales iniciales

(Claesson et al., 2001). No obstante, es posible generar emulsiones cinéticamente

estables, que no cambian apreciablemente durante un período de tiempo

prolongado, incluso durante décadas. Estos sistemas existen en un estado

metaestable, es decir que la barrera de potencial que previene la agregación de las

gotas es suficientemente alta (Duhkin et al., 2006).

El término estabilidad de la emulsión se refiere a la capacidad de una

emulsión para resistir los cambios en sus propiedades fisicoquímicas en el tiempo:

cuanto mayor es la estabilidad, más extenso es el tiempo necesario para alterar sus

propiedades (McClements, 2008). La inestabilidad puede tener origen en fenómenos

físicos, o en procesos químicos. En los primeros, ocurren alteraciones en la

distribución espacial de los componentes, como la separación gravitacional

(cremado/sedimentación), floculación, coalescencia, coalescencia parcial, madurado

13

de Ostwald e inversión de fases. Los procesos químicos, en cambio, influyen en la

estructura química de los componentes (como la oxidación o la hidrólisis), (Huppertz

y Kelly, 2006).

El desarrollo de una estrategia eficaz para prevenir cambios no deseados en

las propiedades de una emulsión particular depende del o de los mecanismos

fisicoquímicos dominantes, responsables de los cambios. En la práctica, dos o más de

éstos pueden operar en simultáneo, por lo que resulta fundamental identificar la

importancia relativa de cada mecanismo, la relación y los factores que influyen entre

ellos, con el fin de establecer medios efectivos de control de la estabilidad y de las

propiedades fisicoquímicas de las emulsiones (Huck-Iriart et al., 2011).

1.2.4.1. Mecanismos de desestabilización de emulsiones

Los mecanismos más importantes de inestabilidad física son el cremado, la

sedimentación, la floculación, la coalescencia, el madurado de Ostwald y la inversión

de fase. En la práctica, todos estos mecanismos pueden actuar simultáneamente y

pueden influir unos sobre otros. No obstante, por lo general uno de estos mecanismos

puede ser dominante, lo que facilita su identificación y permite desarrollar métodos

más eficaces para controlar y mejorar la estabilidad de una emulsión.

1.2.4.1.1. Cremado y sedimentación

La diferencia de densidad entre las gotas y la fase dispersa de una emulsión

provoca que el sistema experimente fuerzas externas, usualmente gravitacionales o

centrífugas. Cuando estas fuerzas superan el movimiento aleatorio de las gotas

provocado por agitación térmica (movimiento Browniano), se acumula un gradiente

de concentración de tal manera que las gotas grandes se mueven más rápidamente

hacia la parte superior del recipiente (si su densidad es menor que la del medio) o

hacia la parte inferior (si es mayor) (Tadros, 2009). Esta migración provoca, en

14

última instancia, la separación de las fases (Figura 1.4). Si las gotas poseen una

densidad menor que el líquido circundante (típicamente, emulsiones O/W) tienden a

ascender, esto es, a cremar. Por el contrario, como suele ocurrir en las emulsiones

W/O, si las gotas son más densas que el medio se produce el descenso o

sedimentación (McClements, 2005d). La tasa de cremado de una gota aislada y

esférica en un líquido viscoso está dada por la ecuación de Stokes (Ec. 1.4):

1

122

9

)(2

gr

, [1.4]

Donde es la velocidad de cremado, g es la aceleración de la gravedad, r es

el radio de la gota, es la densidad, es la viscosidad de cizalladura, y los

subíndices 1 y 2 se refieren a la fase continua y a la gota, respectivamente. El signo

de determina si la gota asciende (+) o desciende (-), (Mootoosingh y Rousseau,

2006).

En las etapas iniciales del cremado (Figura 1.4), las gotas migran hacia la

superficie, lo que produce una zona con una menor concentración de gotas de aceite

en la parte inferior del recipiente. Una vez en la superficie, las gotas se juntan y

forman una capa llamada “fase crema”, cuyo espesor final depende del

empaquetamiento de las mismas. Las fuerzas que interactúan entre las gotas y su

polidispersidad influirán en el empaquetamiento: las capas delgadas son producto de

gotas fuertemente empacadas, mientras que las gruesas presentan gotas ligeramente

unidas. En este último caso existe la posibilidad de redispersar las gotas por

agitación, mientras que si se somete la emulsión a centrifugación o la capa de

cremado permanece un período prolongado, las gotas pueden coalescer, produciendo

la separación final de las fases (McClements, 2008).

15

Figura 1.4. Representación esquemática del proceso de desestabilización por cremado y su dependencia en el tiempo (a hasta h) para emulsiones de aceite en agua. Las gotas se mueven hacia la superficie y forman una capa de ‘crema’. Las gotas más grandes tienden a moverse más velozmente que las pequeñas.

El fenómeno de cremado es, por lo general, un proceso no deseado. La Ec. 1.4

indica que este proceso puede retardarse minimizando la diferencia de densidades

entre las fases, reduciendo el tamaño de gota o aumentando la viscosidad de la fase

continua. Sin embargo, la ecuación de Stokes es aplicable en casos muy particulares,

en los que las gotas son esferas perfectas y homogéneas, cuando otras partículas

presentes en el sistema son considerablemente menores que las gotas de aceite,

cuando el movimiento Browniano es pequeño en comparación con la velocidad de

cremado, y cuando no existe interacción entre las gotas, entre otras condiciones

(Huppertz y Kelly, 2006). Dado que estos supuestos no son válidos para sistemas

complejos, la ecuación debe ser modificada de modo que considere las interacciones

hidrodinámicas, la fluidez y agregación de las gotas, la interfase, etc. (McClements,

2008).

1.2.4.1.2. Floculación y coalescencia

Las gotas de una emulsión están en constante movimiento -debido a efectos

gravitatorios, energía térmica o fuerzas mecánicas aplicadas- lo que produce una alta

frecuencia de choques entre ellas. Producida una colisión, las gotas pueden separarse

o formar agregados, dependiendo de la magnitud relativa de las interacciones

16

atractivas y repulsivas (Mootoosingh y Rousseau, 2006). Estos agregados, a su vez,

corresponden a dos procesos diferentes: cuando dos o más gotas se asocian entre sí

manteniendo su identidad individual, se trata de un fenómeno de floculación;

mientras que se denomina coalescencia al mecanismo por el cual las gotas se unen

para formar una única gota de mayor tamaño (McClements, 2007) (Figura 1.5).

Las gotas que coalescen pueden sufrir (luego de la colisión) una deformación

en su zona de contacto. Esto produce una delgada película de líquido entre las gotas,

que posee un espesor desigual y cuyas propiedades influyen en la estabilidad de las

mismas. Si las fuerzas atractivas en la película son dominantes, se produce un

drenado de la fase dispersa hasta un valor crítico de espesor en el que ocurre la

ruptura del film y la unión de las gotas (Danner y Schubert, 2001). La coalescencia

extensa conduce eventualmente a la expulsión del aceite, esto es, la formación de

aceite libre en la parte superior de la emulsión.

Figura 1.5. Representación esquemática delos procesos de coalescencia y de floculación en emulsiones.

17

Debido a que la coalescencia implica una disminución en el área superficial

del aceite expuesto a la fase continua, es uno de los mecanismos privilegiados por los

cuales una emulsión revierte a su estado termodinámicamente más estable. Este

proceso ocurre con mayor velocidad en las gotas que no contienen emulsionante. En

cambio, cuando existe una membrana de emulsificante presente, la tendendencia a

coalescer depende del potencial de interacción gota-gota y de la estabilidad de la

película a la ruptura (McClements, 2008).

La floculación, por otra parte, ocurre cuando la interacción total entre pares

de gotas se vuelve significativamente atractiva a una separación dada. Si la

profundidad del pozo de potencial es del orden de la energía térmica (kT), se forman

agregados que coexisten con el resto de las gotas. La energía térmica permite

alcanzar un estado de equilibrio mediante un intercambio permanente entre los

flóculos y las gotas libres. A escala macroscópica, transcurridas unas pocas horas de

decantación, las emulsiones experimentan una separación de fases entre una fase

crema/sedimentada concentrada y otra diluida. Cuando la energía de atracción es

mayor en más de diez veces a kT, los agregados se unen fuertemente y la emulsión

original no puede redispersarse por movimiento térmico. Después de un corto período

de tiempo todas las gotas quedan atrapadas en grandes conglomerados que ocupan

todo el espacio. Si, en cambio, las interacciones atractivas son débiles, la floculación

puede considerarse como una transición de fase reversible (Leal-Calderon et al,

2007b).

La estructura de los flóculos formados en una emulsión tiene una marcada

influencia en sus propiedades fisicoquímicas macroscópicas. Una emulsión que

contiene gotas floculadas, por ejemplo, aumenta su viscosidad ya que el agua

atrapada entre los agregados incrementa el diámetro efectivo (y por tanto la fracción

de volumen) de las partículas (McClements, 2008).

18

La velocidad a la que las gotas se agregan depende de dos factores: la

frecuencia y la eficiencia de colisión. La frecuencia de colisión (N) es el número de

encuentros entre las gotas por unidad de tiempo y volumen. Para emulsiones diluídas

que contengan partículas esféricas idénticas, (con n0 número inicial de partículas por

unidad de volumen y G = velocidad de corte) N es:

34 2

0kTnN (sistemas en reposo) [1.5]

20

3

3

16nGrN (sistemas en agitación) [1.6]

Por otra parte, la eficiencia de colisión, E, se define como la fracción de

encuentros entre gotas que conducen a la agregación. Su valor va desde 0 (sin

agregación) a 1 (agregación rápida) y depende del potencial de interacción. De este

modo, N se modifica:

EkTn

N 34 2

0

[1.7]

x

r

dxxkT

xGE

2

1

2)(exp

[1.8]

Donde x es la distancia entre los centros de las gotas (x=2r+s) y G(x) el

potencial de interacción gota-gota. Todas las ecuaciones anteriores son aplicables

sólo en etapas iniciales de agregación, en emulsiones diluidas con partículas esféricas

idénticas. En la práctica, la mayoría de las emulsiones son sistemas concentrados y

las interacciones entre los flóculos y entre las partículas individuales son

19

importantes, por lo que las ecuaciones deben modificarse para tener en cuenta las

nuevas interacciones y propiedades (McClements, 2008).

1.2.4.1.3. Coalescencia parcial

La coalescencia parcial es el proceso mediante el cual dos o más gotas

parcialmente cristalinas se fusionan para formar un único agregado de forma

irregular (Figura 1.6). Las gotas conservan cierto grado de su identidad original,

mientras que forman una intrincada red cristalina unas con otras (Mootoosingh y

Rousseau, 2006). Se trata de un fenómeno similar a la floculación dado que la

fracción en volumen aumenta como resultado de la interacción, pero es también

parecido a la coalescencia porque existe contacto directo entre el aceite de las

gotas. Los sistemas que presentan coalescencia parcial evolucionan hacia la

coalescencia cuando se funde la grasa sólida (Coupland, 2006).

Figura 1.6. Esquema del porceso de desestabilización por coalescencia parcial de las gotas de una emulsión. La red de grasa cristalizada está representada por líneas rectas.

Se ha propuesto que este proceso ocurre cuando dos gotas parcialmente

cristalinas colisionan y un cristal de una de ellas penetra en las membranas

interfaciales y sobresale en la región líquida de otra gota. Normalmente, el cristal

20

quedaría expuesto a la fase acuosa, rodeado de agua; pero al irrumplir en el interior

de otra gota se rodea de aceite, y dado que es una disposición energéticamente

favorable las gotas permanecen agregadas. A medida que transcurre el tiempo, las

gotas se funden más estrechamente, reduciendo el área superficial total expuesta a

la fase acuosa (McClements, 2008).

1.2.4.1.4. Madurado de Ostwald

El madurado de Ostwald es un fenómeno que produce el crecimiento de las

gotas grandes a expensas de las más pequeñas en emulsiones polidispersas. Se trata

de una transferencia de masa a través de la fase continua, en la que las gotas más

grandes aumentan mientras que las más pequeñas disminuyen su tamaño, y pueden

incluso desaparecer (Figura 1.7). La base del proceso se halla en que la solubilidad

del material en una gota esférica aumenta a medida que el tamaño de gota decrece

(Mootoosingh y Rousseau, 2006).

Figura 1.7. Diagrama esquemático del proceso de madurado de Ostwald. Las gotas más grandes crecen a expensan de las más pequeñas debido a la difusión de las moléculas de la fase dispersa entre las gotas.

21

La fuerza impulsora del proceso global es la diferencia de potencial químico

de partículas con distintas curvaturas de superficie (Walstra, 2003). Una vez

alcanzado el estado estacionario, el crecimiento del radio de las gotas con el tiempo

debido al madurado de Ostwald está dado por (Ec. 1.9):

RT

DSV

dt

rdm

9

)(83

[1.9]

Donde D es el coeficiente de difusión del material a través de la fase

continua. Esta ecuación asume que la emulsión es diluída y que el paso limitante de

la velocidad es la difusión de las moléculas de soluto a través del medio acuoso. En la

práctica, las emulsiones suelen ser sistemas concentrados, por lo que es necesario

considerar el efecto de las gotas vecinas (McClements, 2008). De cualquier modo,

el efecto de este fenómeno es poco significativo cuando las solubilidades mutuas de

las fases son lo suficientemente bajas como para provocar que la transferencia de

masa también sea despreciable (Mootoosingh y Rousseau, 2006). Es el caso de los

sistemas modelo seleccionados para este estudio.

1.2.4.1.5. Inversión de fase

Esta denominación se refiere al proceso mediante el cual se produce un

cambio entre la fase dispersa y el medio, donde una emulsión O/W puede

transformase en una W/O o viceversa. Normalmente ocurre como resultado de alguna

alteración en la composición del sistema o de las condiciones ambientales, como la

fracción en volumen de fase dispersa, el tipo de emulsificante o su concentración, la

temperatura o la aplicación de fuerzas mecánicas. Se cree que la inversión de fase es

consecuencia de un mecanismo complejo que implica una combinación de los

procesos que se producen durante la floculación, la coalescencia y la formación de la

emulsión (McClements, 2008). En el punto en el que ocurre este fenómeno –al que

22

se lo suele denominar como punto de balance-, el sistema puede contener regiones

de emulsiones O/W y W/O, emulsiones múltiples (W/O/W o O/W/O) y fases

bicontinuas (McClements, 2007).

1.2.4.2. Estudio de la estabilidad de emulsiones

Las emulsiones son, como se dijo, sistemas termodinámicamente inestables,

pero que pueden considerarse cinéticamente estables si su velocidad de

desestabilización es baja comparada con su vida útil. La determinación de la

estabilidad relativa de estos sistemas es de vital importancia a la hora de formular

una emulsión (Buron et al., 2004).

Hasta hace unos 15 años la estabilidad de las emulsiones se evaluaba por mera

observación visual. De esa forma la desestabilización solo se reconocía al producirse

una clarificación notoria en el sistema. Luego se desarrollaron otros métodos, como

el seguimiento de los cambios en el tamaño de partícula en el tiempo por

microscopía óptica (Nakhare y Vyas, 1996), los cambios en las propiedades

dieléctricas de un sistema por espectroscopía dieléctrica (FØrdedal et al., 1996), el

análisis de turbidez (Reddy y Fogler, 1981) y de tamaño de partícula por dispersión

de luz de un láser (Müller y Heinemann, 1992). Sin embargo, estas técnicas son

aplicables sólo en sistemas diluidos y no permiten investigar en detalle el proceso de

demulsificación ni los mecanismos específicos que provocan los cambios en la

estabilidad de las dispersiones.

El analizador óptico Turbiscan, desarrollado a mediados de los noventa

(Meunier, 1994), es un instrumento que puede utilizarse para monitorear en tiempo

real emulsiones opacas y concentradas (Kim et al., 2008). Se fundamenta en el

análisis multivariable de dispersión de la luz, y puede utilizarse tanto para el estudio

de fenómenos reversibles (cremado y sedimentación), como irreversibles

(coalescencia y segregación), sin necesidad de diluir la muestra original. El análisis

23

de la estabilidad de emulsiones a través del Turbiscan, permite no solamente

identificar los mecanismos involucrados en la desestabilización de un sistema sino

también calcular las variables cinéticas asociadas. Además, pueden detectarse

cambios en la concentración de las gotas de forma temprana, sin que exista

separación visible de fases, de manera simple y directa. El equipo registra la

variación de la transmisión y de la retrodispersión de una emulsión en el tiempo, y

esta información se ha utilizado con éxito para investigar la estabilidad y

homogeneidad de sistemas líquidos tanto en la industria química como farmacéutica

(Liu et al., 2011). Sin embargo hasta el presente trabajo no se había aplicado a

emulsiones estabilizadas con caseinato de sodio.

1.3. Los sistemas estudiados

Las emulsiones en general y las alimentarias en particular pueden contener

una gran variedad de ingredientes, como aceites, emulsificantes, agentes

espesantes, quelantes o gelificantes, soluciones buffers, conservantes, antioxidantes,

endulzantes, sales, colorantes, etc. Cada uno de estos constituyentes posee sus

propias características funcionales y moleculares. Así, las propiedades organolépticas

y fisicoquímicas de un producto dependen del tipo de ingredientes presentes, de su

localización en la dispersión y de las interacciones entre unos y otros. La generación

de una emulsión que luego resulte en un alimento de calidad depende del

conocimiento de las contribuciones de cada ingrediente sobre las propiedades

generales y de cómo estas contribuciones se ven influenciadas por la de los otros

componentes (McClements, 2005a). En consecuencia, la selección de los

componentes más apropiados para una dispersión alimentaria es una decisión

significativa, ya que cada uno de ellos debe cumplir determinadas funciones

fisicoquímicas deseadas, pero además debe ser económicamente viable, fácil de

usar, confiable, compatible con otros ingredientes, saludable, etc. En último caso, la

24

formulación y creación de un alimento resulta de un compromiso, que depende de las

cualidades buscadas y de los materiales disponibles para generarlas (Dalgleish,

2006).

La composición de una emulsión puede definirse de muchas maneras (por la

composición de los distintos átomos o por clases de moléculas) pero en las

emulsiones alimentarias típicamente se indica la concentración de los ingredientes

(harina, sal, huevos, etc.) o de los compuestos funcionales (aceite, agua,

emulsificantes, conservantes, etc.).

1.3.1. Los triglicéridos

Desde un punto de vista químico las grasas y aceites son ésteres carboxílicos

derivados de un único alcohol, el glicerol (HOCH2CHOHCH2OH), y se conocen como

triglicéridos, aunque en rigor se trata de triacilgliceroles (Figura 1.8). Cada grasa y

aceite se compone de glicéridos derivados de muchos ácidos carboxílicos diferentes,

y las proporciones de los diversos ácidos varían de unos aceites o grasas a otros

(Morrison y Boyd, 2002).

Las propiedades fisicoquímicas de las grasas y los aceites en su estado natural

dependen de la estructura molecular y de las interacciones de los triglicéridos que

los componen (Larsson, 2004). La fuerza de las interacciones atractivas entre las

moléculas y la efectividad de su empaquetamiento en una fase condensada

determina su punto de fusión, densidad y reología. Los triglicéridos tienen una

constante dieléctrica relativamente baja, debida a su baja polaridad (Walstra,

2003). El conocimiento de la constante dieléctrica de los aceites es importante

porque influye en el alcance y la magnitud de las interacciones entre las gotas de una

emulsión, especialmente de las fuerzas de van der Waals y las electrostáticas.

25

Figura 1.8. Estructura química de una molécula de triacilglicerol, que consiste en el ensamble de una molécula de glicerol y tres moléculas de ácidos grasos, mediante uniones de tipo éster.

Muchas de las propiedades fisicoquímicas de aceites y grasas comestibles

tienen un papel fundamental en la formación y estabilidad de las emulsiones

alimentarias. La estabilidad al cremado, por ejemplo, depende de la diferencia de

densidad entre las fases acuosa y oleosa y, por lo tanto, cambios en la densidad de la

fase dispersa pueden afectar la estabilidad a largo plazo de la dispersión. Dado que

la viscosidad de los lípidos disminuye apreciablemente con la temperatura y varía con

la composición del sistema, y que, a su vez, el tamaño mínimo de las gotas que

pueden generarse en el proceso de homogenización depende de la relación de

viscosidades de la fases, la capacidad de producir una emulsión con un tamaño de

gota pequeño, dependerá del aceite utilizado así como de las condiciones de

homogenización (McClements, 2005d).

Otra de las propiedades de una emulsión que se ve afectada por la

composición de los aceites es la tensión interfacial, ya que ésta depende de la

polaridad de las moléculas lipídicas presentes en las gotas y de la presencia de

componentes de superficie activa (como ácidos grasos libres, mono y diacilgliceroles,

fosfolípidos, proteínas, etc), (Xenakis et al., 2010). Más aún, la tensión interfacial

se ve afectada significativamente por cambios en el origen y la pureza de los aceites

empleados (Chanamai et al., 2002). Además, la polaridad de los lípidos de una

dispersión afecta el reparto de otros componentes funcionales (como aromas,

26

antioxidantes, conservantes o colorantes) entre las fases del sistema, alterando sus

propiedades fisicoquímicas y sensoriales.

1.3.2. Los ácidos grasos Omega-3

1.3.2.1. Características generales

Los ácidos grasos -3 son parte de los denominados ácidos grasos

poliinsaturados (PUFAs, por sus siglas en inglés), junto con los -6 y los -9. Son

ácidos grasos esenciales y el número que sigue a la letra indica la posición de la

primera doble ligadura contando desde el extremo metilo terminal de la cadena de

ácido graso. En el caso de los ácidos grasos -3, su primer doble enlace está ubicado

entre el C3 y el C4. Están representados principalmente por el ácido -linolénico

(ALA, 18:3), el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5) y el ácido docosahexaenoico

(DHA, 22:6) (Figura 1.9).

El ALA es el principal ácido graso -3 consumido en una dieta occidental

típica. Sus fuentes naturales son los vegetales de hoja, nueces, soja, lino, semillas y

aceites vegetales (Anderson y Ma, 2009). El ALA puede ser convertido en EPA y DHA

en los mamíferos (Figura 1.10). Sin embargo, este proceso ocurre con muy baja

eficiencia: 5-10% para la conversión en EPA y 1-5% para la conversión en DHA (Davis y

Kris-Etherton, 2003). Por esta razón estos PUFAs deben ser aportados por la dieta.

EPA y DHA se encuentran fundamentalmente en fuentes marinas como aceite y

harina de pescado o las algas marinas (Rymer y Givens, 2005). Entre las especies de

pescado que los poseen en mayor proporción se pueden mencionar sardina, anchoa,

arenque, capelán, anguila y lacha.

27

Figura 1.9. Estructuras químicas de los principales PUFAs Omega-3. ALA: ácido linolénico, EPA: ácido eicosapentaenoico, DHA: ácido docosahexaenoico.

Figura 1.10. Vía metabólica de obtención de DHA a partir de ALA.

28

1.3.2.2. Su relación con la salud

En la década del setenta, Bang y Dyerberg encontraron que algunas

poblaciones esquimales de Groenlandia sufrían bajas tasas de enfermedades

coronarias y de cáncer a pesar de que su dieta era alta en grasas (Bang y Dyerberg,

1972; Dyerberg et al., 1975; Bang et al., 1976). Estos autores destacaron la

importancia del ácido eicosapentaenoico en la prevención de ataques al corazón

debido a sus efectos antitrombóticos, el aumento en el tiempo de sangrado y su

influencia en la reducción de la concentración del colesterol sérico (Dyerberg et al.,

1978; Dyerberg y Bang, 1979). Posteriormente, otros estudios epidemiológicos

confirmaron estos hallazgos y se demostró que las poblaciones no esquimales cuyas

dietas incluían altas proporciones de pescado, desarrollaban menos enfermedades

cardiovasculares (Shekelle et al., 1985; Kromhout, 1985; Nordoy y Goodnight,

1990). Otras investigaciones clínicas y estudios experimentales confirmaron las

observaciones iniciales: cuando las dietas se complementan con ácidos grasos -3

este último reemplaza parcialmente a los -6 en las membranas de casi todas las

células (eritrocitos, plaquetas, hepáticas, fibroblastos, monocitos, linfocitos,

granulocitos, células endoteliales, neuronales, de la retina y del neuroblastoma). Los

ácidos grasos -3 modulan el metabolismo de las prostaglandinas y disminuyen los

triglicéridos y, en altas dosis, pueden reducir el colesterol y brindar efectos

antitrómbicos y antiinflamatorios (von Schacky, 1988; Leaf, 1990; Simopoulos et

al., 1991).

Existe evidencia considerable de que tanto los ácidos grasos -3 como los -6

pueden modular una gran cantidad de funciones inmunológicas. Los PUFAs de la serie

Omega-3 son antagonistas de la cascada del ácido araquidónico (20:4, -6); en

general, cuando los ácidos grasos -3 aumentan su concentración en la membrana

celular, se produce un decrecimiento en la concentración de dicho ácido.

Actualmente se encuentra en debate qué valores de la relación -6/-3 en la

29

dieta son los mejores para prevenir enfermedades. Muchos investigadores, basados

en los resultados hallados en ratas, han recomendado un rango amplio desde 4,0 a

7,0 (Klurfeld, 2008). La década de 1980 fue un período de expansión en el

conocimiento de los ácidos grasos poliinsaturados en general, y de los ácidos grasos

-3 en particular. Para 1991 ya se aceptaba que estos ácidos grasos son esenciales

para el crecimiento y el desarrollo y que pueden participar en la prevención y el

tratamiento de numerosas enfermedades (Simopoulos, 1991). Expertos en nutrición

consideran que un nivel del 2 al 5% de ácidos grasos -3 es óptimo para mejorar la

función inmune (Kennedy, 1991).

Toda la evidencia experimental despertó un gran interés tanto en la

comunidad científica como en la industria, y hoy los ácidos grasos -3 son

ingredientes que se utilizan en suplementos dietarios, alimentos saludables y

productos farmacéuticos. EPA y DHA son, entre los ácidos grasos -3, los que poseen

mayor bioactividad. Son precursores de mediadores antiinflamatorios y poseen

beneficios para la prevención de alergias, diabetes, Alzheimer y distintas

enfermedades neurodegenerativas (Lavie et al., 2009).

1.3.2.3. Propiedades químicas

Dado el número elevado de insaturaciones que poseen, DHA y EPA son lípidos

fácilmente oxidables. La oxidación lipídica se produce a través de una reacción en

cadena de radicales libres que ocurre en tres etapas distintas –iniciación,

propagación y terminación- y que da lugar a una serie de cambios químicos complejos

(Shahidi y Zhong, 2010). La Figura 1.11 esquematiza una de las versiones clásicas

del mecanismo.

30

Figura 1.11. Versión clásica del mecanismo de oxidación por radicales libres en el cual se produce propagación a través de series de sustracciones de hidrógeno.

31

La fuerza impulsora de la reacción en cadena es la sustracción reiterada de

átomos de hidrógeno por radicales lipídicos peroxilo (LOO.) para formar

hidroperóxidos y radicales libres en un nuevo ácido graso. El proceso continúa

indefinidamente mientras existan hidrógenos disponibles o hasta que la cadena sea

interceptada. Este mecanismo posee características únicas:

1. La oxidación lipídica es autocatalítica.

2. El rendimiento es 1, se forman muchos hidroperóxidos y se oxidan muchos

lípidos por cada evento de iniciación.

3. Se necesitan cantidades muy pequeñas de oxidantes o de antioxidantes para

generar cambios significativos.

4. La reacción produce múltiples intermediarios y productos, que cambian con

las condiciones de reacción y el tiempo (Schaich, 2006).

En consecuencia, la medición y el control de la oxidación lipídica resultan

procesos complejos, y generan interesantes desafíos en el estudio de la estabilidad

oxidativa de alimentos.

1.3.2.3.1. Etapas de la reacción de oxidación

Iniciación (LH L.)

La etapa de iniciación genera radicales libres lipídicos (L.), y puede ocurrir a

través de tres vías diferentes: (i) autoxidación en cadena no enzimática mediada por

radicales libres; (ii) fotooxidación no enzimática y no radicalaria; y (iii) oxidación

enzimática (Niki et al., 2005). Las vías (i) y (ii) consisten en una combinación de

reacciones que involucran al oxígeno triplete, 3O2 (al que puede considerarse como

un birradical en estado fundamental .OO.), y al oxígeno singulete 1O2, que

corresponde a un estado excitado de la molécula. La vía de iniciación de la oxidación

lipídica a través de oxígeno singulete 1O2 es minoritaria frente a la autoxidación

32

inducida por el oxígeno triplete, definida como la reacción espontánea de los lípidos

con el oxígeno atmosférico a través de una reacción radicalaria en cadena (Shahidi y

Zhong, 2010). Existen muchas fuentes de 1O2, pero su aparición suele estar acoplada

al impacto de fotones UV en presencia de fotosensibilizadores. El mecanismo de

producción del oxígeno singulete depende del tipo de fotosensibilizador: por

ejemplo, la clorofila en su estado triplete es capaz de absorber fotones y convertirse

en singulete, transmitiendo luego la energía al oxígeno molecular:

[1.10]

El oxígeno singulete formado a través de mecanismos como el ilustrado en la

Ec. 1.10 es electrofílico y puede reaccionar directamente con los dobles enlaces de

las moléculas lipídicas (Choe y Min, 2006), pero no es por sí mismo un generador de

radicales libres, sino más bien un generador de hidroperóxidos que son precursores

en la iniciación. En una reacción concertada, el 1O2 se une a cada carbono de un

doble enlace y sustrae un protón alílico para formar un hidropéroxido de forma

directa. Dado que no existe una preferencia en la posición del ataque, se producen

cantidades aproximadamente iguales de LOOH en los dos extremos del alqueno

original. Al mismo tiempo, un nuevo doble enlace en configuración trans se forma

entre el otro doble enlace y la posición alílica (Schaich, 2006).

Desde un punto de vista mecanístico, la etapa de iniciación implica la

sustracción de un hidrógeno (mediante una ruptura homolítica) del lípido. La

reacción directa entre el oxígeno atmosférico y las moléculas lipídicas, sin embargo,

no ocurre espontáneamente (Ec 1.11).

[1.11]

33

El oxígeno triplete en su estado fundamental posee dos electrones libres con

el mismo spin en dos orbitales separados, y un momento angular neto positivo,

mientras que el doble enlace es un estado singulete (no tiene electrones libres, los

pares de electrones ocupan el mismo orbital con spines opuestos y el momento

angular neto es cero). La mecánica cuántica requiere que el spin de momento

angular se conserve en las reacciones, por lo que los tripletes no pueden convertirse

(por inversión de spin) en singuletes.

Para superar esta barrera energética, se necesitan iniciadores o catalizadores

que comiencen el proceso de oxidación lipídica por remoción de un electrón de

cualquiera de los lípidos o cambiando el spin del oxígeno (Ec. 1.11), aunque este

último mecanismo continúa siendo objeto de gran controversia. Dado que hacen falta

cantidades muy pequeñas de catalizadores, muchas reacciones que aparecen como

espontáneas o no catalizadas están en rigor impulsadas por contaminantes que no

han sido detectados o condiciones no consideradas. De hecho, en la mayoría de los

alimentos, en los experimentos de laboratorio o en los sistemas biológicos, se

encuentran siempre múltiples catalizadores e iniciadores (Schaich, 2005).

[1.12]

Esto resulta en la formación de radicales lipídicos, especies que poseen un

electrón desapareado y que por tanto son muy inestables. Constituyen intermediarios

de tiempo de vida muy corto, que se estabilizan sustrayendo un hidrógeno desde otra

molécula. El proceso oxidativo permanece lento en esta etapa, y se acelera hacia el

fin de la misma, cuando el consumo de oxígeno se incrementa, junto con la

formación de peróxidos. La oxidación lipídica comienza a través de los radicales

hidroxilo (HO.), hidroperóxido (HOO.), alcoxilo (LO.) y peroxilo (LOO.), (Laguerre et

al., 2007) y puede iniciarse por diversas causas como por ejemplo la presencia de

34

metales de transición, enzimas, radicales, calor o luz (Yin y Porter, 2005;

Antolovich et al., 2002).

Propagación

[1.13]

[1.14]

En la etapa de propagación, los radicales lipídicos reaccionan con el oxígeno

molecular y generan un radical peroxílico (Ec. 1.13 y 1.14). Si bien la primera

reacción es reversible es menos probable que la segunda. La adición de oxígeno a un

radical carbonílico está controlada por difusión, lo que significa que es

extremadamente rápida y sólo depende de la velocidad con la que el oxígeno pueda

acercarse al radical; pero esencialmente no existe una barrera energética para la

formación del radical peroxílico (Schneider, 2009). El LOO.resultante sustrae un

átomo de hidrógeno desde una molécula lipídica, produciendo otro radical lipídico,

que continúa la secuencia de propagación en cadena. La sustracción de hidrógeno

constituye la etapa limitante (Yin y Porter, 2005) debido a que ocurre muy

lentamente (k = 36-62 L.mol-1.seg-1) y es selectiva, por lo que reacciona con

hidrógenos con baja energía de unión (doblemente alílicos, alílicos, tiólicos,

fenólicos, etc), (Schaich, 2005). Como consecuencia, dependiendo de las

condiciones de reacción, los radicales peroxílicos poseen una vida media

considerable –desde los milisegundos hasta los segundos- lo que abre la posibilidad de

seguir diferentes mecanismos de reacción (Schneider, 2009). Adiciones, ciclaciones

y reacciones de escisión compiten con la sustracción de H para redirigir los radicales

LO.y generar especies adicionales, lo que resulta en una gran mezcla de productos.

En la actualidad se acepta que la oxidación radicalaria de los ácidos grasos se

propaga por cinco vías fundamentales: (1) la sustracción de un hidrógeno desde un

ácido graso por parte de una especie radicalaria, (2) la reacción de un radical lipídico

35

con oxígeno molecular para generar un radical peroxílico, (3) la fragmentación del

radical peroxílico para dar oxígeno y un radical lipídico, (4) rearreglos del radical

peroxílico y (5) ciclación de los radicales peroxílicos (Niki et al., 2005).

Terminación

Aunque, en la práctica, la cadena de oxidación lipídica nunca se detiene, se

suele entender por terminación el proceso en el que una especie radicalaria

reacciona transformándose en un producto no radicalario. Existen cuatro mecanismos

principales para este proceso: recombinación radicalaria, reacciones de escición,

eliminaciones y cooxidación con moléculas no lipídicas como proteínas (Figura 1.12).

La naturaleza y concentración de los radicales, la presión de oxígeno y el solvente

son los factores que influyen en la determinación de un mecanismo por sobre otro

(Schaich, 2005).

1.3.2.3.2. Los hidroperóxidos

Los hidroperóxidos son los intermediarios clave que controlan el progreso de

la autoxidación lipídica, ya que son los primeros productos estables y se acumulan en

ausencia de factores pro-oxidantes como calor, metales, grupos hemo, luz UV o

radicales (Choe y Min, 2006). En el inicio, donde el oxígeno es tomado o eliminado

por radicales lipídicos, no existe un cambio apreciable en la oxidación. Este es el

período inductivo, durante el cual la formación de hidroperóxidos es mínima (Shahidi

y Wanasundara, 2008). Una vez que el contenido de LOOH en un determinado

sistema alcanza un cierto valor crítico, su descomposición se hace significativa y

aumenta la velocidad de la oxidación lipídica (Kamal-Eldin et al., 2003).

En presencia de metales o a altas temperaturas, los hidroperóxidos se

descomponen en radicales alcoxílicos que luego forman aldehídos, cetonas, ácidos,

ésteres, alcoholes y distintos hidrocarburos de cadena corta. La vía más probable de

36

descomposición de hidroperóxidos es la ruptura homolítica de la unión O-O (Choe y

Min, 2006), aunque también se producen rupturas en la unión O-H. Se generan así

radicales LOO. y LO. que propagan la oxidación (Ecs. 1.15, 1.16, 1.17, 1.18 y 1.19).

Figura 1.12. Procesos de terminación típicos en oxidación lipídica.

37

[1.15]

[1.16]

[1.17]

[1.18]

[1.19]

El efecto neto de la descomposición de hidroperóxidos es una transición en

mecanismos y cinéticas. A medida que avanza la oxidación, los radicales alcoxilo se

hacen más importantes y se inician las cadenas secundarias, proceso denominado

ramificación de cadena, que amplía y diversifica los efectos iniciales. Si los LO. no

son interceptados por moléculas no lipídicas, un evento único puede resultar en una

oxidación secuencial de –literalmente- cientos de moléculas (Figura 1.13), (Schaich,

2005).

Durante las etapas tempranas de oxidación, la toma de oxígeno es lenta y los

hidroperóxidos se descomponen monomolecularmente, mientras las cadenas

principales se extienden, se producen ramificaciones y la concentración de LOOH es

baja. Sin embargo, si los hidroperóxidos se acumulan (por ejemplo, en oscuridad, en

presencia de lipoxigenasas, etc), pueden formar dímeros de transición vía puentes de

hidrógeno (Kamal-Eldin et al., 2003), lo que dispara la descomposición bimolecular y

acelera la oxidación (Ec. 1.20).

[1.20]

38

Figura 1.13. Propagación y ramificación de cadenas en autoxidación lipídica. La cadena principal comienza con el radical L.

1, y es dirigida por la adición cíclica de oxígeno para formar LOO., luego, se sustraen hidrógenos para generar un nuevo propagador L. y LOOH. Las ramificaciones son cadenas secundarias originadas por radicales producidos a través de una gran variedad de descomposiciones de hidroperóxidos.

De este modo, se forman radicales alcoxilo y peroxilo, y si bien LO. se hace

cinéticamente dominante, LOO. puede generar cadenas secundarias.

Existe un gran número de trabajos científicos que sugieren que la pérdida

progresiva de la palatabilidad de alimentos durante la oxidación lipídica se debe a la

producción de compuestos de cadena corta a partir de la descomposición de

hidroperóxidos. Especies como hidrocarburos, alcoholes, furanos, aldehídos, cetonas

y ácidos, generados como productos secundarios, son responsables de los sabores y

olores indeseables asociados con la rancidez (Kiokias et al., 2010).

1.3.2.3.3. Esquema integral de oxidación lipídica

En síntesis, la oxidación lipídica posee múltiples mecanismos y el balance de

los mismos para un dado sistema depende del solvente, de la composición y

concentración de ácidos grasos, de las vías de iniciación, de los catalizadores

39

presentes, de la temperatura, de la presión de oxígeno y, en especial, de la

disponibilidad de hidrógenos sustraíbles -desde los lípidos o de otras fuentes. Todos

los mecanismos deben considerarse al analizar la oxidación, lo que permite el diseño

de estrategias efectivas en la estabilización de alimentos, y el estudio de cómo este

proceso puede mediar patologías in vivo.

La figura 1.13 muestra un esquema expandido para la oxidación lipídica,

propuesto por Schaich (2012), en el que el mecanismo alternativo mayoritario se

suma a la cadena radicalaria clásica. La secuencia de reacción tradicional, que

envuelve la sustracción del hidrógeno, se presenta verticalmente y hacia abajo en el

centro del esquema porque la mayoría de los radicales formados en reacciones

alternativas en última instancia sustraen hidrógenos para propagar la cadena (y

porque es el núcleo del proceso oxidativo).

Los mecanismos que compiten con este último se muestran para radicales

peroxilo y alcoxilo, y las sustracciones de H que están asociadas a estas vías

alternativas se designan específicamente (líneas punteadas) o implícitamente en el

producto de radicales reactivos. Las ciclaciones y adiciones generan intermediarios

radicalarios, que pueden incorporar oxígeno y formar hidroperóxidos. Los

hidroperóxidos pueden sufrir sustracciones de H tradicionales (líneas punteadas) o

reacciones de escisión o adición, fuera del esquema clásico.

Las reacciones alternativas incrementan la complejidad cinética y de la

mezcla de productos de la oxidación de lípidos. Además, debe distinguirse la

terminación de un radical individual de la terminación de la cadena oxidativa:

cualquier radical derivado durante el proceso es potencialmente un iniciador en sí

mismo, equivalente a todo el esquema de reacción. Esta aproximación describe con

mayor precisión la perpetuidad de las reacciones de oxidación en ausencia de

antioxidantes o interruptores.

40

Figura 1.14. Esquema integrado de la oxidación lipídica. El grosor de las flechas se relaciona directamente con la probabilidad de la reacción. Modificado de Schaich (2012).

1.3.2.4. Alimentos enriquecidos con Omega-3

A partir de los documentados beneficios para la salud que produce la ingesta

de ácidos grasos -3, se han realizado grandes esfuerzos en la promoción de un

consumo adecuado de los mismos. Aunque, como se mencionó, aún se debate acerca

del valor de la relación óptima, resulta difícil alcanzar el rango 4-7 a través del

consumo de alimentos convencionales, más aún en el caso de las dietas occidentales,

que se caracterizan por una dieta alta en ácidos grasos -6 y baja en -3

(Simopoulos, 2002).

41

Para paliar estas dificultades, se han empleado una serie de estrategias en la

generación de productos alimenticios enriquecidos con ácidos grasos -3, de origen

tanto vegetal como animal. El aceite de pescado es una mezcla de ácidos grasos en

forma de triglicéridos con EPA y DHA como principales componentes de cadena larga.

La mayoría de los aceites contienen sólo uno de estos ácidos grasos por molécula de

triglicérido. Una de las metodologías empleadas para enriquecer alimentos consiste

en la incorporación de pescado o semillas de lino en la alimentación del ganado, lo

que resulta en la acumulación de PUFAs n-3 en los tejidos de los animales (Kouba et

al., 2003; Kitessa et al., 2004; Bourre, 2005). Otras tecnologías incluyen la

manipulación genética de plantas superiores y animales para crear organismos

transgénicos con habilidades para la síntesis de ácidos grasos -3 (Qi et al., 2004;

Kinney et al., 2004; Lai et al., 2006). La técnica de microencapsulación ha

mejorado aún más la producción de alimentos enriquecidos de alta calidad,

protegiendo a los ácidos grasos de la oxidación (Schrooyen et al., 2001). De este

modo han surgido varias líneas de alimentos funcionales y nutraceúticos, muchos de

los cuales se encuentran actualmente al alcance del público. A pesar de los logros,

sin embargo, existen algunas limitaciones en relación a la calidad, disponibilidad y

aceptabilidad del consumidor, por lo que las investigaciones a nivel tanto académico

como industrial continúan en completa vigencia (Moghadasian, 2008).

1.3.3. El emulsificante

Los emulsificantes, también llamados surfactantes, son conocidos desde la

antigüedad: los griegos, alrededor del año 131 D.C. aprovechaban el poder

emulsificante de la cera de abejas en productos cosméticos. A partir del siglo XIX,

surfactantes de origen natural como la lecitina proveniente de la yema de huevo y

diversas proteínas de la leche fueron utilizados para la elaboración de muchos

productos alimenticios, tales como mayonesa, cremas, aderezos para ensalada,

42

postres, etc. Más tarde se incorporaron a la industria de alimentos lípidos polares

como los monoglicéridos (Xu et al., 1998), y recientemente compuestos sintéticos

como los ésteres de sacarosa.

Proteínas, polisacáridos, lipoproteínas, glicolípidos, lípidos polares y otras

macromoléculas han sido reconocidos como efectivos emulsificantes, tanto en

coloides alimentarios naturales como en productos desarrollados por el hombre

(Garti, 1999). Estos aditivos poseen muchas propiedades funcionales y desempeñan

un papel importante en la calidad alimentaria y la estabilidad a largo plazo.Actúan

en sistemas con más de una fase principalmente en dos formas: 1) como agente

emulsificante permitiendo que se combinen dos fases inmiscibles en un sistema casi

homogéneo que puede ser estable por un largo tiempo y 2) modifican el

comportamiento de la fase continua de un producto alimenticio para proporcionarle

un beneficio específico (como por ejemplo el uso de lecitina en chocolate, que

reduce la viscosidad del producto y mejora la manipulación y el procesamiento).

Para que una emulsión permanezca estable durante un período de tiempo

apropiado, es necesaria la presencia de un emulsificante. Los emulsificantes suelen

ser compuestos ambifílicos (de Castro Santana et al., 2012), es decir que son

simultáneamente hidro y lipofílicos. Esta característica provoca su migración a la

interfase agua-lípido, favoreciendo la formación de la emulsión y, una vez formada,

aumentando su estabilidad durante su uso o almacenamiento. La capacidad de un

agente emulsionante se puede clasificar de acuerdo con el balance hidro-lipofílico

(HLB, por sus siglas en inglés), definido como la relación entre el porcentaje en peso

de los grupos hidrofílicos con respecto al porcentaje en peso de los grupos

hidrofóbicos de la molécula. Los valores comerciales de HLB se hallan en un rango de

1 a 20, donde aquellos emulsificantes con HLB bajos (3 a 6, como los ésteres de

glicerol o de poliglicerol) presentan características lipofílicas (Luan et al., 2009) y

promueven la formación de emulsiones de agua en aceite (W/O). Valores de HLB

43

altos (de 8 a 16, como proteínas, fosfolípidos, alginatos, etc), en cambio, tienen un

carácter hidrofílico y favorecen la generación de emulsiones de aceite en agua

(O/W). En cuanto a su masa, suelen clasificarse en dos categorías: los emulsificantes

de bajo peso molecular (representados por los glicolípidos y los ácidos grasos) y los

de alto peso molecular (que son fundamentalmente polisacáridos y proteínas)

(Kralova y Sjöblom, 2009).

El rol fundamental de los emusificantes en la estabilización de emulsiones

consiste en adsorberse en la superficie de las partículas dispersas recién formadas y

de esa manera prevenir la coalescencia con partículas vecinas (Dickinson, 2009) y

posterior separación de fases. La presencia de una capa de moléculas de

emulsificante adsorbidas en la superficie de las gotas afecta la tasa de cremado en

varias maneras. En principio incrementa el tamaño de partícula, aunque este efecto

es significativo sólo en el caso de nanoemulsiones (con tamaños de partícula

0,1m). Luego, la capa adsorbida puede alterar la densidad efectiva de la fase

dispersa (Tan, 2004). Dado que la densidad de la capa de emulsificante es

usualmente mayor que las de las fases continua y dispersa, la presencia del

surfactante en la interfase incrementa la densidad efectiva de la fase continua. De

este modo es posible retardar el cremado mediante el uso de un emulsificante que

dé lugar a una capa adsorbida relativamente gruesa y densa.

Muchas de las emulsiones de aceite en agua utilizadas en la industria

alimentaria son estabilizadas contra la floculación usando emulsificantes

electrónicamente cargados. Suele tratarse de surfactantes iónicos, proteínas o

polisacáridos, y generan una repulsión electrostática entre las gotas de aceite

(Ogawa et al., 2003), impidiendo que se acerquen. La estabilidad de este tipo de

emulsiones depende fundamentalmente de las propiedades eléctricas de las gotas,

del pH y de la fuerza iónica de la solución acuosa. El número, posición, signo y las

constantes de disociación de los grupos ionizables de las moléculas de emulsificante

44

adsorbidas determina el comportamiento eléctrico de las gotas de emulsión en las

distintas condiciones. Las gotas provenientes de emulsiones estabilizadas por

surfactantes aniónicos (como la lecitina, DATEM, CITREM, ácidos grasos) tienen carga

negativa, aquellas estabilizadas por polisacáridos (como la goma arábica, almidón

modificado, pectina de la remolacha) poseen carga negativa y las estabilizadas por

proteínas (caseínas, proteínas de soja, proteínas del suero) tienen una carga positiva

por debajo del punto isoeléctrico y carga negativa por encima de éste (McClements

et al., 2007).

Otros emulsificantes –como algunos polisacáridos y surfactantes no iónicos-

impiden la floculación de las emulsiones a través de repulsión estérica. Esta repulsión

debe ser lo suficientemente fuerte y de largo alcance para superar cualquier

interacción positiva. Las emulsiones estéricamente estabilizadas suelen ser menos

sensibles a variaciones en el pH y fuerza iónica que las electrostáticamente

estabilizadas (Kyros y McClements, 1998). Sin embargo, pueden transformarse en

inestables si, por ejemplo, se alteran la temperatura o la composición de la fase

continua.

1.3.3.1. Los emulsificantes proteicos

Muchas proteínas son moléculas de superficie activa que pueden ser utilizadas

como emulsionantes debido a su capacidad para facilitar la formación, mejorar la

estabilidad y generar propiedades físicoquímicas de interés en emulsiones (Norde,

2003). Resultan componentes particularmente atractivos como emulsificantes dado

que son de origen natural, no tóxicos, no tienen sabor y se hallan ampliamente

distribuídos en la naturaleza (Harnsilawat et al., 2006).

Las proteínas se adsorben en la superficie de las partículas de aceite recién

formadas y facilitan su ruptura al disminuir la tensión superficial. Además dan lugar a

interacciones repulsivas –tanto estéricas como electrostáticas- entre las gotas de

45

aceite, y generan una membrana interfacial que estabiliza las emulsiones frente a

fenómenos de floculación y coalescencia durante el almacenamiento a largo plazo

(Wilde et al., 2004).

Una vez adsorbidas en la superficie de la gota de aceite, las proteínas pueden

sufrir cambios sustanciales en su conformación debido al cambio en su entorno

(Cohen-Stuart, 2003). Mientras que una proteína en agua se encuentra rodeada

únicamente de moléculas del solvente, en la interfase de una emulsión tendrá agua a

un lado y aceite en el otro, por lo que tratará de maximizar el número de

interacciones favorables a través de cambios conformacionales. El tiempo necesario

para que se produzcan estos cambios depende de la flexibilidad molecular y del

empaquetamiento de las moléculas adsorbidas (Freer et al., 2004). Aquellas

proteínas que sean relativamente flexibles, como las caseínas, experimentarán

cambios en su conformación con rapidez, y aquellas más rígidas –como la lisozima, -

lactoglobulina o BSA- pueden tardar horas o hasta días. La magnitud de estos cambios

dependerá también de la naturaleza de la fase dispersa (Rampon et al., 2004): será

mayor para aceites no polares por el aumento de la fuerza hidrofóbica.

Para muchas proteínas globulares, la desnaturalización superficial genera una

mayor exposición de los residuos que contienen grupos sulfhidrilos y de los residuos

no polares hacia la fase acuosa (Chanasattru et al., 2007). Cuando las gotas de

aceite de una emulsión están muy próximas –por ejemplo, al pH cercano al punto

isoeléctrico o a alta fuerza iónica- estos grupos expuestos pueden sufrir fuerzas

atractivas y, por formación de puentes disulfuro, provocar la floculación. En cambio,

cuando las partículas de la fase dispersa están separadas –a pH lejano del punto

isoeléctrico o baja fuerza iónica-, las interacciones proteína-proteína de las

interfases pueden conducir a la formación de una membrana interfacial más

resistente y que proporciona una gran estabilidad contra fenómenos de coalescencia

(Bos and van Vliet, 2001).

46

La temperatura es otra de las magnitudes que deben considerarse al analizar

emulsificantes proteicos, dado que en muchas aplicaciones prácticas estas

emulsiones deben sufrir etapas de calentamiento (Srinivasan et al,, 2003;

McSweeney et al., 2004). Aquellas dispersiones estabilizadas por proteínas

globulares son particularmente sensibles a tratamientos térmicos, ya que se

desnaturalizan cuando la temperatura excede un valor crítico, exponiendo hacia la

fase continua grupos reactivos localizados originariamente en su interior (Kim et al.,

2002). Por ejemplo, al someter emulsiones estabilizadas con proteínas del suero a

procesamiento térmico, se encontró que su desestabilización depende de la

temperatura y del tiempo del tratamiento, así como también de la concentración de

proteína no adsorbida (Sliwinski et al., 2003a). Las dispersiones estabilizadas con

proteínas que no sufren cambios conformacionales inducidos por calentamiento,

como las caseínas, son menos susceptibles a fenómenos de agregación (Surh et al.,

2006).

Muchos procesos industriales modernos (alimentarios, farmacéuticos,

cosméticos, etcétera) generan polvos deshidratados a partir de emulsiones cuyos

emulsificantes son de origen proteico, por lo que es necesario que las características

fisicoquímicas se mantengan antes, durante y después de la etapa de secado

(Sliwinski et al., 2003b). En ausencia de cosolventes (como azúcares o polioles), las

proteínas suelen perder su funcionalidad durante procesos de deshidratación, pero la

retienen en presencia de dichas sustancias. Los cosolventes pueden actuar de tres

formas: aquellos excluídos de la interfase favorecen el plegamiento de las proteínas

retardando procesos de desnaturalización (por calor, frío o presión); otros

cosolventes son capaces de formar puentes de hidrógeno con las proteínas secas,

reemplazando a las moléculas de agua e inhibiendo la agregación; por último, existen

compuestos capaces de formar una fase vítrea alrededor de las proteínas, que

47

retrasa la degradación de las mismas por disminución de la movilidad molecular

(McClements, 2002).

La composición de la fase acuosa también afecta la estabilidad de emulsiones

con surfactantes proteicos. Las membranas interfaciales formadas por proteínas son

por lo general delgadas y están cargadas electrónicamente, por lo que el mecanismo

principal para evitar la floculación es la repulsión electrostática antes que la estérica

(Claesson et al., 2001). Este tipo de dispersiones, entonces, son muy sensibles a

cambios en el pH o en la fuerza iónica, desestabilizándose cuando el pH se acerca al

punto isoeléctrico de las proteínas adsorbidas o cuando la fuerza iónica es alta (Li et

al., 2012), porque en esas condiciones la repulsión electrostática entre las gotas de

aceite deja de ser lo suficientemente intensa como para superar las fuerzas

atractivas (Kulmyrzaev y Schubert, 2004; Kim et al., 2004). Más aún, la presencia

de otras especies –como azúcares, polioles, biopolímeros, etc- en la fase continua

puede asimismo influir en el comportamiento de las proteínas de la interfase: se ha

demostrado que la estabilidad de emulsiones con emulsificantes proteicos aumenta

por la adición de polisacáridos, que se adsorben en la superficie de las gotas de

aceite y forman una barrera protectora (Guzey y McClements, 2007).

El desarrollo de nuevas emulsiones estabilizadas con proteínas se basa en

comprender el comportamiento de estas biomoléculas adsorbidas y en dilucidar la

relación entre las características interfaciales y las propiedades fisicoquímicas de la

fase continua (McClements, 2004).

1.3.3.1.1. El caseinato de sodio

Las caseínas (cuyo nombre deriva del latín caesus, ‘queso’) son una familia de

fosfoproteínas (S1, S2, , ) que representan aproximadamente el 80% de las

proteínas de la leche bovina (Soriano Lopes et al., 2007). Han sido utilizadas desde

la antigüedad en muchas aplicaciones, como componentes en pinturas o pegamentos

48

hasta en la producción de quesos. Su punto isoeléctrico es de 4,6 y, dado que el pH

de la leche es de 6,6, se encuentran en la misma con carga negativa. Las caseínas

han sido descriptas como proteínas reomórficas, porque adoptan distintas estructuras

moleculares en solución, dependiendo del medio ambiente local. Es decir que se

trata de biomoléculas lo suficientemente flexibles como para ‘ir con la corriente’

(Dickinson, 2006), característica que sin dudas deriva de su elevado número de

residuos prolina y la no existencia de puentes disulfuro, lo que resulta en una

estructura terciaria y secundaria muy poco desarrolladas.

Son relativamente solubles en agua, donde se estructuran formando micelas

heterogéneas, tanto en composición como en tamaño, con una gran polidispersión,

bajo empaquetamiento y alta porosidad (Hussain et al., 2011). Las micelas de

caseína son partículas aproximadamente esféricas que pueden medir desde 50 hasta

600 nm, con un diámetro promedio de 200 nm (Glantz et al., 2010). Si bien

constituyen unas de las proteínas más estudiadas –debido a su fuerte presencia en la

leche bovina y a su importancia comercial y nutricional- la estructura detallada de la

micela de caseína continúa siendo un tema de debate. A pesar de su nombre, las

micelas de caseína no se parecen en nada al típico ensamble de moléculas anfifílicas

al que generalmente se denomina ‘micela’ en la ciencia coloidal (Fox y Brodkorb,

2008). Las micelas de caseína están formadas por muchas moléculas (una partícula

típica contiene más de 20000 moléculas de proteína individuales) pero no se asocian

exponiendo sus cabezas polares hacia la solución y la cola hidrofóbica hacia la fase

lipídica como el resto de las moléculas anfifílicas. Por el contrario, las partículas

resultan de la agregación de fracciones de S1, S2 y -caseína con fosfato de calcio,

estabilizadas superficialmente por –caseína, que genera protuberancias hidrofílicas

en la superficie de la micela, dándole una apariencia de cabello. Estas

protuberancias son flexibles, están altamente cargadas y previenen el acercamiento

y las interacciones entre regiones hidrofóbicas de las moléculas de caseína (Horne,

49

1998). Es importante señalar, además, que las partículas contienen considerables

cantidades de agua (3 a 4 g de H2O por gramo de proteína; Walstra, 1979; Jeurnink

y de Kruijf, 1993), lo que sin duda es significativo en la constitución de sus

estructuras internas.

Debido a su importancia nutricional y a sus propiedades fisicoquímicas, las

proteínas de la leche se utilizan en una amplia gama de productos alimentarios.

Distintos tipos de caseínas y caseinatos, concentrados proteicos de leche, proteínas

hidrolizadas y fracciones proteicas se fabrican en la industria lechera (Mulvihill y

Fox, 1989), con innumerables aplicaciones en productos lácteos y cárnicos, bebidas,

alimentos infantiles, etcétera. Las propiedades funcionales más importantes de las

caseínas incluyen su capacidad de ligar agua, su poder emulsificante, su capacidad

de espumado y batido, su habilidad de formar geles y sus propiedades nutricionales

(Singh, 2010). Dependiendo del producto, el contenido de caseínas en formulaciones

alimentarias varía en un rango de 1 hasta 50% (Dickinson y Golding, 1998).

Entre los productos comerciales de proteínas de la leche, el caseinato de

sodio (NaCas) es el más utilizado. Se extrae de la leche descremada a través de una

precipitación isoeléctrica (a pH 4,6) por adición de un ácido mineral. Luego se

calienta la caseína a 50 – 55 °C, se lava con agua y se realiza una deshidratación para

reducir el contenido de agua a un 50 – 60%. Seguidamente se agrega NaOH hasta

alcanzar un pH de 6,7 – 7, generándose una solución de aproximadamente un 23% de

sólidos. Esta solución se deshidrata por secado por pulverización, obteniéndose el

caseinato de sodio comercial (Singh, 2011). Este procedimiento remueve la mayoría

del fosfato de calcio coloidal que mantiene unida la estructura nativa de las micelas

de caseína en la leche (Dickinson, 2010).

Las proteínas de la leche representan, por un lado, la clase más importante

de agentes emulsionantes poliméricos empleados en alimentos, y, por el otro, los

típicos materiales de prueba utilizados en el estudio de emulsiones modelo

50

(Dickinson, 2010). Las excelentes propiedades que presenta el caseinato de sodio

como estabilizante de emulsiones pueden atribuirse al carácter de polielectrolito

anfifílico que presentan los dos principales monómeros de caseína, s1 y -caseína,

que componen aproximadamente el 75% de la caseína total en la leche (Dickinson,

1989). Varios estudios han demostrado que en soluciones acuosas diluídas, a pH

cercanos a 7, el caseinato de sodio se halla como nanopartículas proteicas (de entre

10-20 nm) en equilibro con moléculas de caseína libres, junto con algunas especies

supramoleculares (polímeros de -caseína), (Lucey et al., 2000; Dickinson et al.,

2001; Hadjsadok et al., 2008; Semenova et al., 2009). La anfifilicidad de su

estructura primaria determina la adsorción en la interfase de las emulsiones. Se han

logrado importantes progresos en el entendimiento del proceso de adsorción, en la

composición y estructura de las capas de proteína adsorbidas y cómo éstas influyen

en las características fisicoquímicas de las emulsiones (Dickinson, 1998, 1999a,

2008; Singh y Ye, 2009). El caseinato de sodio ha demostrado excelentes

propiedades emulsificantes: una cobertura proteica de 1-2 mg/m2 es suficiente para

producir una emulsión estable con un tamaño de partícula pequeño (Singh, 2005).

La composición de la capa interfacial está determinada por la cantidad y el

tipo de estructuras de las proteínas presentes en el momento en que se genera la

emulsión (Dalgleish, 1997), aunque instantes después puede ocurrir un intercambio

rápido entre la proteína adsorbida y la proteína libre. Se ha observado que en

emulsiones formuladas con caseinato de sodio la composición de caseínas adsorbidas

es distinta de la del material original. Cuando la proporción proteína/aceite es muy

baja (alrededor de 1:60), la -caseína es adsorbida preferentemente en la superficie

de la gota de aceite; pero, cuando la cantidad de proteína está muy por encima de la

necesaria para una cobertura total, la s1-caseína es la que tiene una adsorción

privilegiada. A cualquier concentración, la -caseína del caseinato de sodio resulta

ser la menos adsorbida (Srinivasan et al. 1996, 1999).

51

1.3.4. Azúcares

Los azúcares (como la sacarosa, la glucosa, los oligosacáridos) y los

polisacáridos (almidón y sus derivados, alginatos, pectina, goma arábiga, quitosano,

celulosa, ciclodextrinas, etc), son las especies más utilizadas como matrices

encapsulantes (Nedovic et al., 2011). Poseen la capacidad de formar sólidos amorfos

(vidrios) metaestables, que permiten incorporar y proteger ingredientes alimentarios.

Además, pueden unirse a moléculas específicas, como las proteínas, favoreciendo su

estabilidad durante procesos de secado.

Las maltodextrinas, por ejemplo, debido a su baja viscosidad a altos

contenidos de sólidos (Madene et al., 2005), son particularmente adecuadas en

formulaciones en las que se desea alcanzar una alta concentración de sólidos antes

del secado. En el caso del almidón, la longitud de su cadena y la proporción de

amilosa y amilopectina afecta su comportamiento de fase y sus propiedades para

formar estructuras (Parker y Ring, 2001). Los hidratos de carbono aumentan la

viscosidad de la fase continua en las emulsiones, por lo que influyen en la estabilidad

de estos sistemas alimentarios. No obstante, la mayoría de los azúcares no son

tensioactivos y deben utilizarse en combinación con otros ingredientes emulsionantes

(como proteínas u otras especies de superficie activa) en polvos encapsulados a base

de emulsiones. La excepción a este comportamiento es la goma arábiga, compuesta

por polisacáridos y proteoglicanos, que, además de proporcionar estabilidad

estructural en sistemas húmedos y secos, es capaz de funcionar como tensioactivo

(Augustin y Hemar, 2008).

Existen interacciones entre los azúcares y otras moléculas que pueden ser

aprovechadas en la encapsulación, como por ejemplo la formación de complejos de

inclusión helicoidales de componentes de los aromas con la amilosa (proveniente del

almidón): estas moléculas volátiles pueden ser liberadas por calentamiento o a altas

actividades de agua (Wulff et al., 2005). De esta manera, el almidón cumple un

52

papel multifuncional, en el que une, protege y conserva sustancias de interés en un

estado amorfo, para luego liberarlas en la boca, al contacto con la saliva.

1.3.4.1. Trehalosa

La trehalosa (-D-glucopiranosil-(1-1)--D-glucopiranósido, (Figura 1.15) es un

azúcar natural que se encuentra en bacterias, hongos, invertebrados y plantas. Fue

descripta por M. Berthelot en el siglo XIX al aislar un disacárido presente en los

huevos del escarabajo Larinus, denominado entonces trehala, de donde deriva su

nombre actual.

Físicamente se presenta como un polvo blanco, inodoro, y posee una dulzura

moderada (45% relativa a la sacarosa). La molécula de trehalosa es un

homodisacárido no reductor en el cual dos unidades de glucosa están unidas entre sí

a través de una unión -1,1-glicosídica.

La trehalosa se encuentra ampliamente distribuida en el mundo biológico y

está involucrada en innumerables procesos. En organismos procariotas se utiliza

como fuente de carbono, como componente estructural o como soluto compatible

con cianobacterias. Mientras que en Escherichia coli la trehalosa se sintetiza en

respuesta a una alta osmolaridad (Kaasen et al., 1994), en Bacillus subtilis sirve

como fuente de carbono (Whatmore y Reed, 1990).

Figura 1.15. Estructura química de la trehalosa.

53

En el reino animal se encontró trehalosa en, por ejemplo, la hemolinfa de los

insectos (Wyatt y Kalf, 1957), o en la lombriz y en sus huevos (Fairbairn y Passey,

1957). En vertebrados superiores no se ha reportado la presencia de trehalosa, pero

sí de la enzima trehalasa. En humanos dicha enzima se encuentra en las células de la

membrana epitelial del intestino delgado y en los túbulos proximales del riñón

(Sasai-Takedatsu et al., 1996). Este azúcar posee además un bajo poder

cariongénico, una baja higroscopicidad, y una alta temperatura de transición vítrea.

Además disminuye el punto de congelamiento, y protege a proteínas y enzimas,

siendo éstos algunos de los beneficios utilizados en la tecnología de alimentos. Tiene

las mismas calorías que la sacarosa, no posee efectos laxativos y después de la

ingestión es hidrolizada a glucosa. Su índice glucémico es moderado con baja

respuesta a la insulina y debido a su estructura química única, permanece estable a

bajos niveles de pH, aún a altas temperaturas. Es rápidamente soluble en agua.

Comparada con la sacarosa, presenta menor solubilidad a bajas temperaturas y

mayor solubilidad a altas temperaturas (Kim et al., 2011).

La unión glicosídica (1-1) en la trehalosa compromete sus carbonos

funcionales, disminuyendo significativamente su reactividad comparada con la de

otros disacáridos. La baja reactividad es una característica que presenta

innumerables ventajas a la hora de pensar en la formulación de un alimento ya que

no reacciona con proteínas (no participa de reacciones de glucosilación no

enzimática de proteínas como la reacción de Maillard) o aminoácidos que puedan

estar presentes en la mezcla. Esta propiedad le permite enmascarar olores y sabores

desagradables que puedan generarse en los alimentos, por lo que resulta magnífica

en la conservación de la calidad de los mismos. Además su hidrólisis espontánea es

10000 veces más lenta que la correspondiente a la sacarosa (Wolfenden y Yuan,

2008), lo que representa una ventaja durante el procesado y posterior

almacenamiento del producto. Más aún, Higashiyama (2002) encontró que la

54

trehalosa es capaz de proteger a los ácidos grasos de la degradación. La oxidación

lipídica por calor y exposición al aire no solamente causa olores indeseados en

alimentos sino que también genera productos perjudiciales para la salud. Se observó

que la trehalosa posee efectos supresores de la autooxidación de ácidos grasos

insaturados como el -linolénico, en comparación con otros azúcares como sacarosa,

maltosa o sorbitol.

Aunque se conocían sus numerosas aplicaciones, la trehalosa se produjo hasta

los primeros años de la década del noventa en pequeñas cantidades, utilizando

métodos como la extracción de levaduras y otras fuentes naturales, la síntesis

química, la fermentación microbiana, la conversión enzimática de maltosa y, más

recientemente, la tecnología transgénica (Harding, 1923; Robison y Morgan, 1928;

Steiner y Cori, 1935; Leibowitz, 1944; Stewart et al., 1950; Lemieux y Bauer,

1953; Cabib y Leloir, 1958; Birch, 1963; Suzuki, 1969; Murao et al., 1985;

Sugimoto, 1995) . Sin embargo, ninguno de estos métodos fue exitoso en la

producción del disacárido a gran escala, con costos comercialmente viables para su

utilización en la industria alimentaria. El sistema enzimático mejor caracterizado,

por ejemplo, utiliza UDP-glucosa y glucosa 6-fosfato para formar trehalosa 6-fosfato,

que libera trehalosa previo paso de desfosforilación (Birch, 1963; Matula et al.,

1971; Elbein, 1974). Este proceso involucra intermediarios costosos y/o complejos,

y no se considera adecuado para la explotación comercial.

En 1994, la compañía Hayashibara Ltd, de Okayama, Japón, e investigadores

asociados en todo el mundo, iniciaron una búsqueda de enzimas capaces de sintetizar

trehalosa entre miles de bacterias aisladas. Encontraron un grupo de

microorganismos que producen trehalosa a partir del almidón, mediante dos nuevas

enzimas: la maltooligosil-trehalosa sintasa (MTSasa) y la maltooligosil-trehalosa

tetrahidrolasa (MTHasa) (Maruta et al., 1995), derivadas de un microorganismo del

suelo no patógeno, originalmente designado como Arthrobacter sp (Nakada et al.,

55

1995a,b). Este proceso (Arthrobacter sp Q36, tal su nombre actual) permite obtener

cristales de dihidrato de trehalosa con un 98% de pureza, a un costo mucho menor

que el generado por extracción de levadura (Richards et al., 2002). De este modo,

la trehalosa apareció como un recurso viable para la industria alimentaria, y

comenzó a expandirse en la industria farmacéutica y cosmética. Más aún, la Food and

Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos y el sistema regulador europeo

reconocieron al disacárido como ‘seguro’ en 2000 (Schiraldi et al., 2002), lo que sin

duda aumentará el alcance de las áreas donde se utiliza.

Se ha detectado especialmente la presencia de trehalosa en un grupo de

organismos capaces de sobrevivir en condiciones extremas, denominadas criptobiosis.

Durante la criptobiosis se suspenden los procesos metabólicos en respuesta a

condiciones ambientales adversas como bajas temperaturas (criobiosis), largos

períodos de sequía (anhidrobiosis), altas concentraciones de toxinas (quimiobiosis) o

aumento de la concentración de un soluto en la solución donde se halla el individuo

(osmobiosis). Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables (por

aumento de la temperatura, agregado de agua, disminución de la cantidad de

toxinas, etc), los organismos reanudan sus procesos metabólicos.

La existencia del disacárido en dicho grupo sugiere que se trata de un

protector particularmente efectivo en condiciones de stress (Tanghe et al., 2003).

Su habilidad para resguardar células del congelamiento ha sido ampliamente

demostrada (Eroglu et al., 2000; Buchanan et al., 2004; Honadel y Killian, 1988;

Clegg, 1965) y, entre los azúcares, la trehalosa es muy eficiente en términos de

preservación de la actividad de biomoléculas. Se estudió su protección a distintas

proteínas, enzimas, virus y anticuerpos durante desecación (Carpenter y Crowe,

1988; Bieganski et al., 1998; Sampedro y Uribe, 2004) su capacidad para conservar

el contenido y estructura de liposomas y membrana celulares, e incluso su rol en el

almacenamiento hipotérmico de órganos humanos (Crowe et al., 2001). También se

56

encontró que la trehalosa protege a las células contra el estrés oxidativo: se cree que

la exposición a H2O2 causa la agregación de proteínas y que la presencia del

disacárido compensa el daño, probablemente actuando como eliminador de radicales

libres (Benaroudj et al., 2001). Es además muy utilizada en productos industriales –

fármacos, alimentos, cosméticos, etc- porque su incorporación protege distintas

biomoléculas de interés durante y después de procesos de secado como liofilización y

secado por pulverización (o secado spray).

A pesar de su gran efectividad en criopreservación y protección ante la

escasez de agua, las propiedades que convierten a la trehalosa en un efectivo agente

protector aún no se dilucidaron en forma completa. Existen varias hipótesis acerca

de por qué este disacárido es particularmente eficiente, pero ninguna de ellas

explica todos los hallazgos experimentales. Mientras que algunas teorías se centran

en las propiedades de la trehalosa en su estado sólido, otras atienden exclusivamente

su comportamiento en solución. En las primeras, los autores sugieren que una de las

razones más importantes por las que la trehalosa es un bioprotector tan efectivo

estriba en que exhibe un gran número de polimorfos, tanto cristalinos como amorfos,

y que su temperatura de transición vítrea (Tg) es anormalmente alta, características

que no se presentan en hidratos de carbono similares como la sacarosa y la maltosa.

Se conocen con certeza al menos dos estados cristalinos y muchos intermediarios

transitorios entre ambas formas (McGarvey et al., 2003). El dihidrato de trehalosa

(C12H22O11.2H2O) es la forma cristalina más común, estable a temperatura ambiente

(Taga et al., 1972). El cristal anhidro se obtiene por calentamiento (con

temperaturas menores a 85°C) del dihidrato (Nagase et al., 2003). Estas dos formas

están vinculadas por una transformación reversible, que se realiza sin pérdida de la

integridad de la estructura cristalina, lo que sería una de las claves en la

preservación de materiales de interés (Sussich et al., 2001).

57

La temperatura de transición vítrea de la trehalosa es tal vez la propiedad

que más se utiliza para explicar sus característica protectoras (Crowe, 2002), su Tg

es la de mayor magnitud entre todos los disacáridos (Chen et al., 2000).

Típicamente los vidrios poseen viscosidades muy altas, por lo que cualquier molécula

que esté encapsulada en una matriz vítrea se transforma en algo inmóvil y

estabilizado cuando se expone a condiciones de estrés. La teoría de la inmovilización

o teoría vitrificante afirma que la trehalosa atrapa a las biomoléculas (o células u

órganos) en la matriz sólida. En general, la adición de agua a una sustancia amorfa

aumenta su movilidad y disminuye su Tg, pero en el caso de la trehalosa aún con alta

actividad de agua conserva una temperatura de transición vítrea muy alta. Durante

procesos de secado como liofilización o secado por pulverización el disacárido

permanece en estado amorfo con una Tg de 100°C (Ohtake y Wang, 2011). Además

se ha encontrado que en la trehalosa amorfa aparecen zonas en la que ésta se

encuentra como dihidrato cristalino, atrapando moléculas de agua residuales en

condiciones de desecación. Se ha propuesto que esta capacidad de almacenaje de

moléculas de agua en la matriz vítrea, junto con la transición reversible entre la

forma anhidra y dihidratada conforma un mecanismo por el cual la trehalosa es capaz

de atrapar a una biomolécula y protegerla durante períodos de escasez de agua

(Kilburn et al., 2006). Más aún, en el estado vítreo el agua aparece como

plastificante porque genera la ruptura de las uniones puente de hidrógeno que la

trehalosa tiene consigo misma. Se ha hipotetizado también que el disacárido

previene la inactivación y el agregado de proteínas a baja temperatura y que

estabiliza la membrana celular al restrasar el inicio del cambio de fase desde el

cristal líquido al gel (Kandror et al., 2002) y que aumenta la viscosidad

citoplasmática, disminuyendo la posibilidad de formación de hielo intracelular

(Rudolph et al., 1986).

58

Como se mencionó anteriormente, muchos autores analizan las propiedades

de la trehalosa en función de las características de sus soluciones. En este sentido, se

analizan las propiedades del disacárido como soluto cosmotrópico: la interacción

trehalosa-agua es mayor que la de agua-agua, quebrando la red de moléculas de agua

tetrahédricas y ordenándolas alrededor de la trehalosa (Lerbret et al., 2005). De

este modo se impide la formación de hielo, generando la crioprotección. Esto es

consistente con la observación de que los disacáridos obstaculizan la cristalización de

proteínas por disminución de la cantidad de agua congelable (Forbes et al., 1998).

Además, el oxígeno glicosídico de la trehalosa es de difícil hidratación comparado

con otros oxígenos de la molécula y con otros disacáridos (Choi et al., 2006). Así, las

moléculas de agua no se distribuyen uniformemente alrededor de los hidratos de

carbono, aumentando el resguardo de biomoléculas ante bajas temperaturas. La

teoría de exclusión preferencial fue citada en situaciones de exceso de agua, y

postula que la trehalosa no interacciona directamente con la macromolécula, sino

que las moléculas del solvente se excluyen de la capa de solvatación de la

biomolécula y se ordenan alrededor del disacárido (Timasheff, 1993). De esta

manera, la trehalosa ejerce sus propiedades estabilizadoras al reducir la cantidad de

agua congelable, disminuir su actividad y ordenar su red.

La teoría de reemplazo de agua, en tanto, sostiene que la trehalosa

reemplaza al agua alrededor de la biomolécula, manteniendo su estructura

tridimensional al proveer sitios para uniones puentes de hidrógeno y restringiendo su

movilidad (Liu y Brady, 1996). En estudios recientes de simulación por dinámica

molecular se encontró que ambas teorías no son mutuamente excluyentes, ya que las

moléculas de trehalosa se reúnen en grupos distintivos en la superficie de la proteína

o molécula de interés (Fedorov et al., 2011).

A pesar de lo expuesto hasta aquí, no existe un consenso general sobre

las razones que convierten a la trehalosa en un increíble protector de biomoléculas.

59

El dextrano, por ejemplo, posee una temperatura de transición vítrea

mucho más alta que la Tg de la trehalosa (João et al., 2011) pero es muy poco

efectivo como crioprotector. Por otra parte, las teorías expuestas analizan

situaciones distintas: el mecanismo por el cual la trehalosa protege a las

biomoléculas en condiciones de desecación no puede ser idéntico al que las estabiliza

cuando el agua se halla en exceso.

De cualquier modo –aunque inexplicables- son indiscutibles los beneficios que

ofrece este disacárido, en particular a la hora de pensar en aplicaciones en la

industria alimentaria, fundamentalmente en la estabilización de biomoléculas

durante procesos de liofilizado o secado por pulverización. Dicha estabilización es

compleja, ya que la matriz debe poseer a la vez propiedades crio y lioprotectoras

(protección contra el frío y la desecación, respectivamente). En este punto la

trehalosa aparece como un componente único, cumpliendo ambos requisitos, muy

por encima de otros disacáridos de uso común.

1.4. Encapsulación

La encapsulación o microencapsulación se define como una técnica de

empaque de sólidos, líquidos o materiales gaseosos en pequeñas cápsulas con el

objeto de protegerlos del deterioro químico o para conservar el perfil organoléptico

del producto (Desai y Park, 2005; Anal y Singh, 2007; Kralovec et al., 2012). El

contenido de las cápsulas que se encuentra aislado del medio ambiente circundante

puede ser liberado en respuesta a un disparador como fuerzas de cizalladura, pH o

acción enzimática, permitiendo su escape controlado y programado. Esta tecnología

posee aplicaciones en la industria médica, farmaceútica, cosmética, química,

agrícola y alimentaria (Augustin y Hemar, 2008).

La preparación de los sistemas encapsulados se logra tanto por procesos

fisicoquímicos como mecánicos. Aunque la elección de un proceso en particular

60

depende de las características del sistema de partida y de las propiedades deseadas

en el producto final, la mayoría de las técnicas de microencapsulación se basan en

modificaciones de tres métodos originales: la evaporación o extracción del solvente,

la separación de fases (coacervación) y el secado por pulverización o secado spray

como habitualmente se llama, empleando la palabra en inglés (Dalmoro et al.,

2012).

En la actualidad, debido a sus efectos benéficos para la salud, los aceites de

pescado encapsulados se utilizan como ingredientes funcionales en un número cada

vez mayor de productos como por ejemplo en leche, productos de panadería, sopas,

alimentos para bebés y helados (Velasco et al., 2003; Champagne y Fustier, 2007).

Esto se debe a que los ácidos grasos -3 poseen un gran valor nutricional y

nutraceútico lo que hace que resulte valiosa su incorporación en los alimentos. Sin

embargo, debido a su alto grado de insaturación es difícil protegerlos de reacciones

oxidativas (Drusch et al., 2007). En este sentido, la encapsulación constituye una

herramienta multifuncional para la incorporación de ácidos grasos -3 provenientes

de aceite de pescado en productos alimentarios, ya que permite, por un lado,

incrementar su estabilidad oxidativa y, por el otro, mejorar los problemas de

palatabilidad debidos al mal sabor u olor (Márquez-Ruiz et al., 2000).

1.4.1. El proceso de encapsulación

El proceso de microencapsulación de aceites consiste básicamente en la

preparación de una emulsión de aceite en agua que contiene los componentes de la

matriz en la fase acuosa y que luego se seca, en general mediante técnicas de secado

spray o de liofilización (Velasco et al., 2003). Dado que la encapsulación de

ingredientes alimentarios en materiales de recubrimiento puede lograrse por varios

métodos, la selección de un método particular se rige por las propiedades

fisicoquímicas de los materiales encapsulados y de la matriz y la aplicación prevista

61

del producto final (Desai y Park, 2005). La eficiencia del proceso y la estabilidad del

producto encapsulado se ven fuertemente afectadas por el tipo de material que

compone la pared, la naturaleza química de la fase encapsulada y las propiedades

fisicoquímicas de la emulsión. En particular la viscosidad, el tamaño y distribución de

gota y en especial la estabilidad de la emulsión se relacionan estrechamente con la

capacidad de retención de un aceite encapsulado en una matriz encapsulante

(Cerdeira et al., 2007).

El éxito de la técnica debe dar lugar a un polvo con una mínima cantidad de

aceite en superficie y un máximo en la retención del material activo (Carneiro et

al., 2012). En este sentido, se define la eficiencia de encapsulación a través de la

medida indirecta de la fracción de aceite accesible por extracción simple –también

llamado aceite libre, superficial o no encapsulado-, que se obtiene por lavado de los

polvos con un solvente orgánico, bajo determinadas condiciones (Velasco et al.,

2003). La fracción de aceite inaccesible por lavado se refiere como aceite

encapsulado (cuya liberación involucra la disrupción de la matriz) y representa al

aceite realmente contenido en las cápsulas.

Aunque existen muchas técnicas disponibles para la encapsulación de aceites

en la industria alimentaria, como por ejemplo el secado por pulverización (spray

drying), la refrigeración por pulverización (spray cooling), el revestimiento por

pulverización (spray coating), la extrusión, la liofilización, la coacervación y la

cocristalización, entre otras, los dos métodos más empleados en la industria

alimentaria son el secado por pulverización (spray drying) y la liofilización (Velasco

et al., 2003).

1.4.2. El proceso de liofilización

La liofilización es un proceso utilizado para la encapsulación de casi todos los

materiales sensibles al calor. Se ha aplicado en la encapsulación de esencias solubles

62

en agua, aromas naturales e incluso fármacos (Desai y Park, 2005). En la industria

de alimentos en la actualidad se emplea en productos de alto valor agregado como el

café, sopas instantáneas y los rellenos para bombones. El aceite seleccionado en

estos estudios es un nutraceútico que se agrega en pequeñas cantidades para

enriquecer alimentos y se emplea fundamentalmente en productos destinados a

grupos considerados de riesgo nutricional, como por ejemplo los lactantes y las

embarazadas.

En el proceso de liofilización, en una primera etapa, la emulsión de partida se

congela a temperaturas de entre -90 a -40°C. Cada producto debe congelarse de

manera tal que garantice que sufrirá pocas alteraciones en el proceso posterior de

sublimación. En una segunda etapa este material congelado se coloca en bandejas

para luego ser deshidratado por sublimación del hielo a baja presión y bajas

temperaturas (entre -90 y -40°C). El flujo de vapor formado pasa de la cámara de

liofilización al condensador y el agua resultante se retira del equipo. Durante la

sublimación, la velocidad máxima de remoción del hielo tiene lugar al principio del

proceso. Luego se forma una capa porosa de material seco que opone resistencia al

flujo de calor y vapor. La velocidad de sublimación disminuye hasta hacerse cero y en

la etapa final el agua se pierde por desorción. Después del secado, se obtiene un

sólido frágil que puede romperse en partículas más pequeñas, por ejemplo mediante

trituración. La liofilización ocurre a bajas temperaturas (con el sistema congelado),

lo que enlentece cualquier proceso químico de deterioro y entre ellos la mayoría de

las reacciones de oxidación merced además al vacío que se emplea (Cerdeira et al.,

2007).

Las principales desventajas de esta técnica son la alta energía utilizada y el

largo período de procesamiento (Zuidam y Shimoni, 2010). Sin embargo, como la

liofilización no genera condiciones oxidativas y el concentrado de aceite de pescado

empleado en este trabajo es un ingrediente considerado nutraceútico y con gran

63

valor agregado, fue la técnica seleccionada para nuestros ensayos. De este modo, el

aumento en el costo del proceso se compensa con un mejor perfil organoléptico del

producto, y con la obtención de un polvo de mejor calidad.

Objetivos

65

Objetivos

Describir los principales mecanismos de desestabilización de sistemas modelo

de emulsiones alimentarias estabilizadas con caseinato de sodio cuya fase

lipídica es un nutraceútico, un concentrado de aceite de pescado rico en DHA,

EPA y DPA. Explicar las interacciones entre los distintos mecanismos,

cuantificar las cinéticas de desestabilización e interpretar los resultados con

teorías clásicas provenientes del área de polímeros.

Investigar el efecto del agregado del disacárido trehalosa en la estabilidad de

la emulsión. Encontrar los rangos de concentración de proteína y de azúcar en

los cuales las emulsiones resultan estables evaluando su comportamiento por

medio del registro del perfil de retrodispersión a distintos tiempos.

Relacionar la estabilidad de las emulsiones preparadas con caseinato de sodio

con la capacidad de retención durante la encapsulación a muy baja humedad

de la matriz caseinato/trehalosa. Evaluar el grado de oxidación del material

encapsulado y no encapsulado en las condiciones seleccionadas. Analizar las

propiedades fisicoquímicas del polvo obtenido y correlacionarlas con el grado

de encapsulación del nutraceútico seleccionado para este trabajo de tesis.

Materiales y Métodos

67

3. Materiales y Métodos

Me lo contaron y lo olvidé. Lo vi y

lo aprendí. Lo hice y lo entendí.

CONFUCIO

3.1. Elección de los sistemas

Con el fin de determinar y describir los principales mecanismos de

desestabilización de sistemas modelo de emulsiones alimentarias y de estudiar el

grado de retención de un nutracéutico en una matriz de trehalosa cuando se

encapsula por liofilización, se prepararon emulsiones constituidas por:

Fase dispersa: concentrado de aceite de pescado rico en ácidos grasos -3.

Fase continua: soluciones con concentraciones variables de trehalosa y de

caseinato de sodio (utilizado como emulsificante).

3.2. Características de las drogas y materias primas utilizadas

Se utilizó - dihidrato de trealosa (-D-glucopiranosil-(1-1)--D-

glucopiranósido), de Saccharomyces cerevisiae, grado alimentario, donado por

Hayashibara Company Ltd., Japón y Caseinato de Sodio (NaCas) obtenido de ICN (ICN

Biomedical, Inc., Aurora, Ohio, USA). Los reactivos se emplearon sin ninguna

purificación adicional. En todo el trabajo experimental se utilizó agua bidestilada. La

fase dispersa fue donada por la compañía SPES (Santiago, Chile) y consistió en una

mezcla comercial (concentrado) de aceite de pescado, denominado Omega Balance

1000, utilizada como ingrediente en la industria alimentaria de Chile para preparar

alimentos funcionales.

68

3.3. Análisis de ácidos grasos por cromatografía gaseosa acoplada a

espectrometría de masa

Para conocer la composición y abundancia de ácidos grasos del concentrado

de aceite de pescado se realizó una cromatografía gaseosa acoplada a

espectrometría de masa (CG-MS).

3.3.1. Condiciones experimentales CG-MS

Se derivatizó una alícuota del aceite por calentamiento a 60°C con una

solución de ácido clorhídrico 2% en metanol durante 2 horas para obtener los ésteres

metílicos de los ácidos grasos. La mezcla de reacción se extrajo con cloruro de

metileno:agua (1:1) y se evaporó el solvente bajo corriente de nitrógeno. A

continuación se realizó el análisis por cromatografía gaseosa acoplada a

espectrometría de masa en un equipo Shimadzu GC-MS-QP5050A (Kyoto, Japón). El

programa de calentamiento empleado fue el siguiente: se comenzó a una

temperatura inicial de 100°C, se calentó a 8°C/min y se llegó a una temperatura

final de 290°C. Se utilizó nitrógeno como gas carrier y una columna ULTRA-1

(Agilent/JW, Santa Clara, California, Estados Unidos) de 25 m de largo y 0,20 mm de

diámetro. La temperatura del inyector fue de 250°C. Se detectaron las especies en

un rango de masas de 40 – 700.

3.4. Preparación de las emulsiones

3.4.1. Fase acuosa

A la fase acuosa de las emulsiones se les agregó trehalosa hasta una

concentración final de 0, 20, 30 o 40% p/p del azúcar. Como emulsionante se utilizó

NaCas en concentraciones de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0%

p/p. El NaCas se disuelve lentamente en agua, por lo que para generar estas

soluciones se utilizó agitación a 55°C hasta observar una disolución completa de

69

todos los componentes. Se colocó primero el agua y se agregó el NaCas en pequeñas

porciones agitando continuamente. En el caso de la emulsión con 40% p/p de

trehalosa y 7,0% p/p de NaCas primero se preparó una solución con 20% p/p de

trehalosa y 7,0% p/p de NaCas y luego se agregó el peso de trehalosa necesario para

que la solución fuera 40% p/p. De esta forma se logró una mejor disolución de la

proteína y el azúcar.

3.4.2. Fase dispersa

La combinación entre las distintas concentraciones de trehalosa y caseinato

dio como resultado 44 formulaciones, donde la proporción de aceite de pescado fue

de 10% p/p para todos los casos.

3.4.3. Homogenización

La fase acuosa y el aceite se premezclaron a través de un mezclador de alta

velocidad Ultra-Turrax (UT) T8 (S 8N-5G dispersing tool, IKA Labortechnik, Janke &

Kunkel, GmbH & Co., Staufen, Alemania) operado a 20.000 rpm. Las muestras se

trataron por 1 min y se dejó descansar el equipo UT por 1 min entre cada

homogenización. Este procedimiento se repitió 3 veces. Para lograr una

homogenización más eficiente ambas fases se calentaron a 55°C. A continuación, las

pre-emulsiones resultantes sufrieron una segunda homogenización durante 20

minutos utilizando un procesador de líquidos ultrasónico VIBRA CELL, modelo VCX

(Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA). La temperatura de la celda del

homogenizador se controló por medio de un baño de agua a 15°C. De esta manera, la

temperatura de la muestra nunca superó los 40 1°C durante el tratamiento. Luego,

las emulsiones obtenidas se dejaron enfriar en reposo hasta temperatura ambiente

(22,5°C). Los pH medidos arrojaron un valor promedio de 6,63 con un desvío estándar

de 0,15. Se analizaron las emulsiones sin el agregado de ningún buffer. El pH de

70

trabajo está muy por encima del pH isoeléctrico de la caseína (pH = 4,6) con lo que

en todos los casos la proteína estuvo cargada negativamente. No se agregaron sales,

de modo que los ensayos se realizaron a fuerza iónica constante. Todas las

mediciones se realizaron por duplicado y los resultados se promediaron. La Figura 3.1

muestra el esquema experimental de la preparación de las emulsiones.

Figura 3.1. Esquema experimental de la preparación de las emulsiones.

71

3.5. Estabilidad de las emulsiones

3.5.1. Principio de funcionamiento del Turbiscan

El Turbiscan es un instrumento óptico capaz de analizar la estabilidad de

sistemas coloidales y dispersiones concentradas mediante la medición de la

transmitancia y la retrodispersión de un sistema opaco, atravesado por un pulso de

luz correspondiente al infrarrojo cercano ( = 880nm). Posee dos detectores móviles,

el de transmitancia, ubicado en un ángulo de 180° con respecto a la muestra, que

recibe la luz que atraviesa la emulsión y el de retrodispersión (o backscattering)

ubicado a 135°, que recibe la luz dispersada por la muestra, contenida en una celda

cilíndrica (Figura 3.2). Los detectores exploran la longitud entera de la muestra

(idealmente unos 60 mm), adquiriendo datos de transmisión y de retrodispersión

cada 40 micrones (Buron et al., 2004). Cuando la muestra es transparente el

detector de transmitancia recibe gran parte de la luz, mientras que al aumentar la

turbidez de la muestra el haz se dispersa y atraviesa la muestra cada vez en menor

proporción hasta que (y es el caso de muestras opacas), prácticamente nada de luz

llega al detector ubicado a 180°.

Figura 3.2. Esquema de funcionamiento del equipo Turbiscan, detallando los detectores y la intensidad de señal que reciben en las distintas situaciones.

72

El detector de retrodispersión, por el contrario, recibe mucha luz cuando la

muestra es opaca. En estos casos, cuando las fases se desestabilizan o se separan,

aparece una zona de clarificación –que al principio no existe- y la luz comienza a

atravesar la muestra, lo que disminuye significativamente la cantidad de señal en el

detector de retrodispersión. Cuando la muestra es transparente la luz no llega al

detector colocado a 135° sino al detector de transmitancia.

El análisis de estabilidad se lleva a cabo mediante el estudio de la variación

en los perfiles de retrodispersión o backscattering (BS) y transmitancia (T), aplicando

las siguientes fórmulas:

*

1

BS [3.1]

ir

i eTrT2

0),( [3.2]

Qsg

dd

)1(3

2),(* [3.3]

Donde * es el camino libre medio de transporte de fotones de la muestra,

es la fracción de volumen de partículas, d es su diámetro medio, 2ri es el paso

óptico, y g y Qsson los parámetros ópticos dados por la teoría de Mie (que supone que

no existe absorción de luz por parte de las partículas) (Kang et al., 2012).

3.5.2. Caracterización de emulsiones y análisis de estabilidad a través del

Turbiscan

Una corrida o exploración representa el nivel de retrodispersión de la muestra

en función de su altura en el momento de su medición (Figura 3.3). El primer perfil

obtenido es considerado siempre el perfil correspondiente al tiempo cero (izquierda).

Si el valor de retrodispersión se mantiene constante a lo largo del tubo se puede

73

considerar que la muestra es estable. Realizando sucesivos barridos a lo largo del

tiempo es posible registrar cambios en el perfil (Figura 3.3, derecha) que permiten la

evaluación del o de los mecanismos de desestabilización que prevalecen, la cinética

de los mismos y el grado de desestabilización de una emulsión (Buron et al., 2004).

3.5.2.1. Identificación de mecanismos de desestabilización

La Figura 3.4 muestra los perfiles de retrodispersión de una emulsión,

preparada con 10% p/p de aceite de pescado y 0,5% p/p de NaCas en la fase acuosa,

en función del alto de muestra, a distintos tiempos. Se observa una disminución de la

retrodispersión en el fondo de la celda (0-20 mm) y un aumento de la misma en la

parte superior (50-65 mm) a medida que transcurre el tiempo, y la existencia de un

punto isosbéstico. Este tipo de comportamiento refleja la migración de las gotas de

aceite desde la parte inferior hacia la superficie, generando una disminución

progresiva de la concentración de partículas dispersas en el fondo de la celda

(clarificación) y consecuentemente una disminución en la retrodispersión.

Figura 3.3. Perfil de retrodispersión (backscattering) de una muestra en función de la altura de tubo en mm (eje X). Izquierda: perfil a un dado tiempo. Derecha: perfiles a distintos tiempos.

74

Lo contrario se observa en la parte superior de la muestra, donde se

concentran las partículas y aumenta la retrodispersión. Este tipo de perfiles se

corresponden con fenómenos de cremado. La existencia del punto isosbéstico indica

que no existe cambio en el tamaño de partícula (Mengual et al., 1999). Se obtienen

perfiles análogos en el análisis de muestras que sedimentan, pero dado que la

migración de partículas es hacia abajo, la retrodispersión disminuye en la parte

superior del tubo y aumenta en el fondo.

En el caso de emulsiones que se desestabilizan por floculación o coalescencia,

los perfiles obtenidos con el Turbiscan revelan una disminución del valor de

retrodispersión en la parte central del tubo (intervalo 20-50 mm) en el tiempo, sin

existencia de punto isosbéstico (Figura 3.5). Este comportamiento implica cambios en

el tamaño de las partículas (d), ya que el BS cambia al cambiar d. Como fue

demostrado por Mengual (1999), el BS disminuye cuando crece el tamaño de

partícula (cuando d es mayor que la longitud de onda de la luz incidente, = 850 nm)

o aumenta con el tamaño de partícula si d es menor que de la luz incidente.

Estos cambios en BS ocurren tanto si la emulsión se desestabiliza por

floculación como por coalescencia y no permiten distinguir si las partículas se han

aglomerado de manera reversible o si por el contrario han sufrido un cambio real en

el tamaño de partícula. Una forma de distinguir entre estos dos mecanismos es medir

el tamaño de partícula de las emulsiones por dispersión dinámica de luz (DLS) en

presencia y ausencia de SDS (C12H25NaO4S, dodecilsulfato sódico). El SDS actúa

rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando

que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Si los agregados son

reversibles el tamaño de partícula resulta el mismo en presencia y ausencia de SDS.

Si en cambio se ha producido coalescencia, el tamaño de partícula resulta menor en

presencia de SDS (Palazolo et al., 2005).

75

Figura 3.4. Perfiles de retrodispersión (backscattering (BS), %) en función de la altura de tubo (mm) obtenidos al analizar a distintos tiempos una emulsión preparada con 10% p/p de aceite de pescado y 0,5% p/p de solución acuosa de NaCas como emulsificante.

Figura 3.5. Perfiles de retrodispersión (backscattering (BS), %) en función de la altura de tubo (mm) obtenidos al analizar a distintos tiempos una emulsión preparada con 10% p/p de aceite de pescado y 5,0% p/p de solución acuosa de NaCas como emulsificante.

76

Es un caso corriente que una dispersión se desestabilice a través de más de un

mecanismo, por ejemplo, por migración de partículas seguido de una variación en el

tamaño de las mismas. El Turbiscan permite, aplicando los mismos principios

observados para cada fenómeno por separado, identificar la ocurrencia del

mecanismo particular a medida que transcurre el tiempo.

3.5.2.2. Parámetros cinéticos

A partir de los perfiles de retrodispersión se pueden calcular las velocidades

de desestabilización. En el caso de fenómenos de cremado, se resta el perfil inicial a

todas las curvas y se obtienen perfiles relativizados, llamados usualmente perfiles en

modo referencia o BS (Figura 3.6, parte superior). Al proceder así se obtiene un

pico en la región 0-20 mm que indica una disminución en la concentración de

partículas en la parte inferior del tubo. Luego, se grafica una recta con los valores de

espesor o ancho de pico de cremado (zona 0-20 mm en modo BS) a mitad de altura

del mismo en función del tiempo (Figura 3.6, parte superior), utilizando el software

del Turbiscan. La pendiente de esta recta es un indicador de la velocidad de

migración. Se pueden comparar distintas cinéticas en forma más objetiva que con los

métodos de apreciación a simple vista que todavía se emplean. Se evalúan los

cambios en la zona inferior del tubo porque estos no se hallan afectados por la

formación de espuma o por la migración de flóculos en el caso de que en la muestra

también ocurra floculación. Esta zona sólo se modifica si hay cremado y por lo tanto

permite separar este mecanismo de otros fenómenos. El análisis es análogo para las

muestras que sedimentan.

77

Figura 3.6. Cálculo de la velocidad de migración a partir de los perfiles que se muestran en la Figura 3.4. Los perfiles se expresaron en modo referencia (parte superior) y luego se graficó el espesor o ancho a mitad de altura del pico formado en la región 0-20 mm en función del tiempo (parte inferior).

El tratamiento de los datos en las emulsiones que presentan floculación y

coalescencia comienza del mismo modo que para fenómenos de cremado, en el

sentido en que primero se deben relativizar los perfiles obtenidos en el tiempo

restándole el perfil inicial, es decir los perfiles deben expresarse en modo referencia

(Figura 3.7, parte superior). A continuación se toma el valor promedio de

78

retrotransmisión de cada curva (BSav), en la zona en que ésta permanece constante

(región 20-50 mm del tubo) y se lo grafica en función del tiempo (Figura 3.7, parte

inferior). Se toma esta zona porque no se ve afectada por cremado. De esta forma se

pueden separar ambos mecanismos en caso de que se produjeran simultáneamente.

La gráfica BS (%) vs. tiempo permite estimar cinéticas de floculación y conocer en

qué período temporal ocurre la desestabilización. Esta metodología ha sido empleada

satisfactoriamente para describir diversos sistemas (Chauvierre et al., 2004;

Palazolo et al., 2005; Cerdeira et al. 2007; Álvarez Cerimedo et al., 2008;

Alvarez Cerimedo et al. 2010; Álvarez Cerimedo y Herrera, 2011).

3.5.2.3. Mediciones con Turbiscan

Las mediciones se realizaron inmediatamente después de preparadas las

emulsiones y en distintos tiempos durante una semana, a 22,5°C. Para ello, se colocó

una alícuota de cada emulsión en una celda de Turbiscan y se registró la

retrodispersión y la transmitancia cada 40 m a lo largo de la celda. El tratamiento

de datos se realizó con el software del equipo como se indicó en los puntos 3.5.2.1 y

3.5.2.2.

3.6. Microestructura de las emulsiones

La morfología de las emulsiones se determinó mediante un microscopio de

fluorescencia de barrido confocal Olympus FV300 (Olympus Ltd, London, UK) con un

láser de Ar (= 488 nm). Se utilizó un ocular de 10 X, junto con un objetivo de 60 X y

un zoom de 2,5 X. La intensidad del láser que se empleó fue 20%. De esta forma no

se produjo daño en las muestras cuando se expusieron al haz de luz. La fase grasa de

las emulsiones se tiñó con Nile Red (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA), un colorante

fluorescente liposoluble. Las imágenes obtenidas se registraron a través del software

Olympus Fluoview versión 3.3, provisto por el Olympus FV300.

79

Figura 3.7. Evaluación de la cinética de floculación a partir de los perfiles mostrados en la Figura 3.5. La sustracción del perfil inicial permite expresar los perfiles en modo referencia (parte superior). Graficar BSav (en la zona 20-50 mm) en función del tiempo permite cuantificar la cinética de floculación (parte inferior).

80

3.6.1. Observación de las emulsiones

Obtenidas las emulsiones, se transfirió una alícuota de las mismas a un tubo

de ensayos y se agregaron algunos g del colorante fluorescente. Las muestras se

dejaron a temperatura ambiente durante una noche para permitir la disolución del

colorante. Luego se agitó la muestra en un vortex y se colocó una gota de la misma

sobre un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos. Esta preparación se

observó en el microscopio confocal a las 24 h de preparada la emulsión.

3.7. Análisis de tamaño de partícula

La distribución de tamaño de partícula de las emulsiones se determinó por

dispersión de luz, utilizando un Mastersizer 2000 con una unidad de dispersión Hydro

2000 MU (Malvern Instruments, Ltd, UK).

Las muestras se colocaron en un vaso de precipitados que contiene agua

bidestilada, y que recircula por una cubeta interna transparente. Un láser incide

sobre las emulsiones diluidas en dicha cubeta, donde las gotas de aceite dispersan la

luz en distintos ángulos, en función de su tamaño. Esta técnica mide la fluctuación

en la intensidad de luz dispersada en función del tiempo, debida al movimiento

browniano de las partículas de aceite en la dispersión. La información dinámica de

las partículas se deriva de una función de autocorrelación, que es esencialmente una

suma ponderada de exponenciales que depende de los coeficientes de difusión de las

gotas a través de la fase continua. Estas determinaciones son particularmente útiles

para medir los cambios producidos durante el procesamiento o almacenamiento de

emulsiones ya que puede detectar si se produce una agregación (lo cual es un

indicador de desestabilización) y estudiar los cambios en tiempo real (Dalgleish,

2004).

La luz dispersada atraviesa un sistema óptico e incide sobre un arreglo de

detectores, generando un patrón angular de luz dispersada (Figura 3.8). El software

81

del equipo traduce luego el registro obtenido en distribuciones de tamaño de

partícula.

3.7.1. Determinación del tamaño y distribución de gota

Se determinó la distribución de tamaño de partícula de las emulsiones

inmediatamente después de su preparación y luego de una semana de

almacenamiento a 22,5°C tomando la muestra en la parte media de la celda del

Turbiscan (altura de tubo 20-50 mm). Para ello se colocaron alícuotas de cada

muestra en la unidad de dispersión hasta alcanzar el grado de turbidez adecuado. La

velocidad de la bomba fue colocada en 1800 rpm. Se utilizó 1,4694 como índice de

refracción de la fase dispersa y 0,0001 como parámetro de absorción.

Las determinaciones fueron realizadas por duplicado y los valores de las

desviaciones estándar fueron menores a 0,2 m. El cálculo desde 0,1 a 10 m se

expresó como diferencial de volumen.

Figura 3.8. Esquema de los componentes de un equipo de dispersión dinámica de luz.

82

El ancho de la distribución (S) se expresó como:

S = [d(, 0,9) - d(, 0,1)] [3.4]

Donde d(, 0,9) y d(, 0,1) son los valores del percentilo 90 y el percentilo 10

de la distribución en volumen. S indica el ancho de la distribución

independientemente del valor de la mediana. El parámetro D4,3 es el diámetro medio

ponderado de la distribución expresada en volumen. Constituye una medida más

sensible a los cambios en el tamaño de partícula provocados por procesos de

desestabilización (Relkin y Sourdet, 2005) que el parámetro D3,2 y se utilizó para

evaluar mecanismos que generan un cambio en el tamaño de las partículas

(floculación y coalescencia). También se informó el porcentaje en volumen de

partículas que exceden 1 m en diámetro (%Vd>1) que es una manera de evaluar el

ancho de la distribución (Thanasukarn et al., 2006).

3.8. Generación de los polvos deshidratados

Se seleccionaron 6 de las formulaciones anteriores (20 y 30% p/p de trehalosa,

0,5; 2,0 y 5,0% p/p de NaCas y 10% p/p de aceite de pescado) para los estudios de

encapsulación. Esta elección se basó en el hecho de que las emulsiones con 0,5% p/p

de NaCas se desestabilizaron fundamentalmente por cremado, las emulsiones con

2,0% p/p se desestabilizaron principalmente por floculación y las emulsiones con 5,0%

p/p fueron estables por al menos una semana. 200 mL de cada una de estas

dispersiones se colocaron en tres recipientes de plástico, se congelaron con nitrógeno

líquido (-190°C) y se almacenaron un día a -80°C antes de ser liofilizadas, con el fin

de que la mayor cantidad de agua congelable se hallara cristalizada. Las emulsiones

congeladas se liofilizaron en un equipo Alpha 1-2 LD Plus (Christ, Osterode,

Alemania) durante 48 horas (Figura 3.9).

83

Figura 3.9. Esquema experimental de la obtención de polvos deshidratados.

Una vez obtenidos los polvos liofilizados, se los transfirió inmediatamente a

una caja seca con atmósfera de N2, equipada con un purificador de gas inerte MO 40-

2 (MBRAUN Inertgas-Systeme GmbH, Garching, Alemania). Dentro de la caja se

dividió finamente el polvo mediante un mortero y un pilón, y se separó en fracciones

mezcladas y homogenizadas entre sí, de modo que las muestras fueran

representativas del total del polvo.

3.8.1. Medición del tamaño de partícula

Se midió la distribución de tamaño de partícula de las emulsiones recién

preparadas. Otra porción de las mismas se congeló a -20°C por 48 h; luego las

muestras se retiraron del freezer, se descongelaron a temperatura ambiente (22,5°C)

y se analizaron por DLS para determinar el tamaño de partículas.

El tamaño de gota en los polvos liofilizados y conservados en la caja seca

(para mantenerlos deshidratados) se midió luego de reconstituir las emulsiones

agregando la misma cantidad de agua retirada de modo de tener los mismos

porcentajes de todos los componentes que en la emulsión inicial. Para ello se disolvió

1 g de polvo en 4 mL de agua bidestilada, con lo que el sistema contuvo 25 g de

sólido en 100 g de emulsión. La distribución de tamaño de gota de los sistemas se

midió 5 minutos después de la reconstitución a partir del polvo. La Figura 3.10 indica

84

los puntos clave del proceso en los que se realizaron medidas de tamaño de partícula

para cada formulación.

3.8.2. Determinación del contenido de agua

El contenido de agua de los polvos deshidratados se determinó utilizando una

estufa de vacío. Se colocaron aproximadamente 2 g de cada formulación de polvos en

viales y se registró la diferencia de peso antes y después de su secado durante 48

horas a 98°C y un vacío de 600 mBar. Todas las determinaciones se realizaron por

duplicado.

3.8.3. Transiciones térmicas

Se utilizó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la

temperatura de transición vítrea (Tg), la temperatura de fusión (Tf) y la entalpía de

fusión (ΔHf) de los polvos liofilizados. El equipo empleado fue un DDSC Mettler

Toledo modelo 822 (Mettler Toledo, Schwerzenbach, Suiza) con un software de

análisis térmico Mettler Star.

Figura 3.10. Puntos del proceso en los que se determinó el tamaño de partícula de aceite.

85

Esta técnica registra las transiciones de fase a través de la medición de la

cantidad de calor absorbido o liberado (más precisamente, la entalpía H) cuando un

sólido funde o un líquido cristaliza, en función de la temperatura (dH/dT). Cualquier

transición causa un pico de absorción o liberación de calor, donde el área del pico es

proporcional a la entalpía de la transición (Walstra, 2003c).

En particular, las transiciones vítreas se presentan cuando se aumenta la

temperatura de un sólido amorfo y se produce un cambio en la capacidad calorífica

(Cp) sin que tenga lugar un cambio de fase formal. A medida que la temperatura

aumenta, un sólido amorfo se hará menos viscoso hasta que en algún momento las

moléculas obtengan suficiente libertad de movimiento como para organizarse en un

sólido cristalino. Esto es conocido como temperatura de cristalización (Tc). Esta

transición de sólido amorfo a sólido cristalino es un proceso exotérmico y da lugar a

un pico en el termograma. Si la temperatura sigue aumentando, la muestra alcanza

eventualmente su temperatura de fusión (Tf), evidenciado por un pico endotérmico

en el termograma. La Figura 3.11 presenta un termograma típico para la sacarosa en

el que pueden identificarse todas estas transiciones.

Experimentalmente, las muestras se calientan a velocidad constante en una

cápsula sellada utilizando una cápsula vacía como referencia. El equipo registra las

diferencias en el flujo de calor entregado a la muestra y a la referencia en función

de la temperatura y el tiempo.

3.8.3.1. Análisis de los polvos liofilizados

La Tg fue registrada como la temperatura inicial de pico (onset) en las curvas

de flujo de calor versus temperatura. La calibración se realizó usando un estándar de

indio proanálisis (p. a., 156,6 °C) con una rampa de calentamiento de 10 ºC/min.

Seguidamente se colocaron en el DSC cápsulas de aluminio herméticamente cerradas

con 5 a 9 mg de cada muestra, y se mantuvieron a -70 ºC por 5 minutos antes de ser

86

fundidas empleando una rampa de 10 ºC/min desde -70 ºC hasta 120 ºC. Como

referencia se utilizó una cápsula vacía. Cada muestra se midió por duplicado, y se

informó la media y la desviación estándar de las temperaturas de inicio de los picos y

de las entalpías de fusión.

Figura 3.11. Termogramas obtenidos por DSC para sacarosa (a) amorfa y (b) cristalina. En el gráfico (a) se ha ampliado la zona correspondiente a la transición vítrea que experimenta la sacarosa amorfa en el rango de temperaturas 50 – 90°C, donde la Tg es 74°C. Se indican los cambios de calor que tienen lugar durante la transición vítrea, la cristalización y la fusión. Tomado de Nunes et al. (2005), con modificaciones.

87

El pico de fusión aparece a una temperatura casi idéntica al que corresponde

al dihidrato de trehalosa (Cardona et al., 1997), y es indicativo de la cantidad de

dihidrato cristalino presente. El grado de cristalización (GC) se calculó como:

GC = ΔHf / ΔHm [3.5]

Donde ΔHf es el área de la endoterma de fusión de la trehalosa en la muestra

y ΔHm es el área de endoterma de fusión correspondiente a la trehalosa pura (149

J/g).

3.8.4. Cristalinidad de los polvos liofizados

La difracción de rayos X es un fenómeno físico que se produce cuando un haz

de rayos X de una determinada longitud de onda interacciona con una sustancia

cristalina. El fenómeno se describe con la Ley de Bragg, que predice la dirección en

la que se da la interferencia constructiva entre haces de rayos X dispersados

coherentemente por un cristal:

n = 2 d sen [3.6]

donde es el ángulo de incidencia, es la longitud de onda, d es la distancia entre

los planos paralelos considerados y n (número entero igual o mayor que uno) es el

orden de difracción. Cuando la muestra en estudio posee una familia de planos

atómicos paralelos (es al menos localmente cristalina) separados por una distancia d,

y se hace incidir un haz de luz, cada plano refleja una porción de la radiación. El haz

incidente forma un ángulo sobre la familia de planos, y se obtienen haces

difractados cuando las reflexiones en los sucesivos planos paralelos interfieran en

88

forma constructiva. Este fenómeno ocurre cuando la diferencia de trayectoria entre

los mismos sea un múltiplo entero de (Figura 3.12).

La técnica de DRX permite obtener difractogramas (gráficos de intensidad en

función de 2), donde cada valor del ángulo en que se registra un pico máximo

corresponde a una cierta distancia interplanar d, e indica la presencia de estructuras

cristalinas. Esta técnica permite identificar las fases cristalinas de una muestra tanto

en su aspecto cualitativo como cuantitativo.

3.8.4.1. Obtención de diagramas de Rayos X

La cristalinidad de los polvos deshidratados se analizó por difracción de rayos

X (DRX), mediante un difractómetro de rayos X Philips 1730 equipado con un sistema

de control de temperatura (Philips Argentina SA, Buenos Aires, Argentina). Se utilizó

la radiación de cobre K12 a 40kV, 20 mA y una velocidad de barrido de 1°/min desde

5° hasta 50°. Los experimentos se realizaron por duplicado, a 22,5°C (T amb).

Figura 3.12. La difracción de rayos X se basa en la interferencia constructiva de rayos X monocromáticos y una muestra cristalina. La interacción de los rayos incidentes con la muestra produce desfasaje de los caminos ópticos. Cuando hay interferencia constructiva entre rayos difractados se satisfacen las condiciones de la Ley de Bragg, que relaciona la longitud de onda de la radiación electromagnética con el seno del ángulo de difracción y el espaciado reticular de la muestra.

89

3.8.5. Determinación de la eficiencia de encapsulación (retención del aceite en

los polvos)

Los polvos liofilizados contienen el aceite en dos formas: el aceite no

encapsulado o libre, y el aceite encapsulado. La determinación de la eficiencia de

encapsulación (o la determinación de la proporción de aceite íntimamente

encapsulado) involucra la extracción del aceite libre a través del lavado de los polvos

con un solvente orgánico.

3.8.5.1. Determinación del aceite no encapsulado

La fracción de aceite libre o no encapsulada se determinó disolviendo 4 g de

los polvos deshidratados en 200 mL de n-hexano y aplicando 15 minutos de agitación.

Luego se filtró y la fracción soluble se recogió en un vaso de precipitados. Este

lavado se realizó dos veces sobre la misma porción de polvo. El solvente se evaporó a

baja temperatura, presión reducida y en ausencia de oxígeno para obtener el aceite

no encapsulado, evitando cualquier condición oxidativa. La evaporación se realizó

hasta llegar a peso constante. Esta determinación se realizó por duplicado para cada

formulación de polvos, y se promediaron los resultados obtenidos.

El peso del aceite extraído con n-hexano se expresó entonces como

porcentaje de la grasa total contenida en los 4 g de polvo liofilizado. Luego, el polvo

libre de la grasa no encapsulada se secó al vacío en un desecador y, una vez

evaporado el solvente, se transfirió a la caja seca. Un esquema general del

procedimiento experimental se ilustra en la Figura 3.13.

90

Figura 3.13. Esquema experimental para la obtención del aceite no encapsulado y de los polvos lavados.

91

3.8.5.2. Determinación del aceite encapsulado

Para verificar los resultados hallados en forma indirecta se determinó también

la grasa encapsulada a partir del método utilizado por Velasco et al. (2009a), con

modificaciones. 2 g de los polvos lavados (libres de aceite no encapsulado) se

dispersaron en 20 mL de agua a temperatura ambiente, y se mantuvieron con

agitación constante durante 2 horas. Luego se agregaron 4 mL de NH4OH al 25% y se

calentó la dispersión durante 15 minutos en un baño a 65°C con agitación. Se dejó

enfriar a T ambiente y se aplicaron 3 extracciones líquido/líquido: 1) 50 mL de éter

etílico + 50 mL de hexano; 2) 10 mL de etanol + 50 mL de éter etílico + 50 mL de

hexano; y 3) 50 mL de éter etílico + 50 mL de hexano. En todos los casos se recogió la

fracción orgánica, y se filtró dos veces sobre un lecho de Na2SO4 anhidro

(previamente secado en estufa), para separar cualquier resto de agua.Se recuperó el

aceite encapsulado por evaporación del solvente a baja temperatura, presión

reducida y en ausencia de oxígeno, hasta llegar a peso constante.

Un esquema general del proceso experimental se muestra en la Figura 3.14.

92

Figura 3.14. Esquema experimental para la obtención del aceite encapsulado a partir de los polvos lavados según Velasco et al. (2009a).

3.9. Estudios de oxidación

3.9.1. Determinación del Índice de Peróxido (PV)

El grado de oxidación de los aceites iniciales, encapsulados y no encapsulados

se determinó a través del método de naranja de xilenol (FOX, por sus siglas en

inglés). La técnica se basa en la oxidación del ión ferroso (Fe2+) a férrico (Fe3+), por

acción de los hidroperóxidos lipídicos presentes. El ion férrico producido (Ec. 3.7)

forma un complejo con el xilenol -sal tetrasódica de 3,3’-Bis(N,N-

bis(carboximetil)aminometil)-o-cresolsulfoneftaleina (Ec. 3.8). El complejo formado

93

es de color azul-violeta, y presenta un máximo de absorción a 540-600 nm (Bou et

al., 2008).

[3.7]

[3.8]

3.9.1.1. Determinación del valor peróxido de las muestras

El análisis de las muestras se llevó a cabo de la siguiente manera: 0,1000 –

0,1500 g del concentrado de aceite de pescado se pesaron en matraces de 10, 25 o

50 mL y se llevaron a volumen con una solución de cloroformo + metanol (7+3). 1 mL

de esta solución se colocó en un matraz de 10 mL, junto con 25 L de una solución de

naranja de xilenol (Cicarelli, Argentina) 10 mM, 150 L de una solución de Fe2+

(preparada a partir de 0,2 g de BaCl2.2H2O, 0,7 g de sal de Mohr y 1 mL de HCl 10 M,

y luego filtrada) y llevada a volumen con la solución cloroformo/metanol. Se agitó la

mezcla y se midió la absorbancia resultante a los 5 minutos de agregada la solución

de Fe2+ en un espectrofotómetro Ocean Optics DT-Mini (Ocean Optics Inc, USA) a =

560 nm. Todas las medidas se realizaron por triplicado y se promediaron, expresando

los resultados como índice de peróxido (PV), que representa la cantidad de oxígeno

activo (en mg) contenida en 1g de lípidos (Laguerre et al., 2007).

3.9.1.1.1. Curva de calibración

Se utilizó hidroperóxido de cumeno (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) como

patrón para la curva de calibración. Se analizó de forma análoga a las muestras de

aceite. La Figura 3.15 muestra como ejemplo una curva de calibración en la cual se

aprecia la relación obtenida entre la absorbancia y los miliequivalentes de

hidroperóxido.

94

Figura 3.15. Curva de calibración para la determinación del valor peróxido de las muestras a través del método de naranja de xilenol. Se utilizó hidroperóxido de cumeno en reemplazo del aceite y se siguió el mismo protocolo que para las muestras. La absorbancia se midió a = 560 nm. Se señala la ecuación de la recta con su correspondiente coeficiente de correlación (R2).

3.9.1.1.2. Validación de la curva de calibración

La curva de calibración se validó mediante una titulación iodométrica, que se

basa en la oxidación del ión ioduro (I-) a través de hidroperóxidos (LOOH). Se trata de

una iodometría tradicional, donde una solución de ioduro de potasio es agregada a

muestras de aceite para que el I- reaccione con los LOOH y los ROOH liberando iodo

(I2), (Ecs. 3.9 y 3.10). Dicho iodo se tituló luego con una solución de tiosulfato de

sodio (Na2S2O3) estandarizada y almidón como indicador del punto final (Ec. 3.11).

La determinación oficial está descripta en la IUPAC (IUPAC SM N°2501, 1992).

[3.9]

[3.10]

[3.11]

95

3.10. Estudio de oxidación a través de MALDI-TOF

El fundamento de esta técnica y una descripción detallada de las matrices que

se emplean, de los métodos de preparación de la muestra y siembra, y de los

patrones que más habitualmente se seleccionan se detallan en el Anexo I.

3.10.1. Preparación de las muestras

Solución de matriz: 0,05 g de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB, Sigma-

Aldrich, St. Louis, Mo., USA) se disolvieron en 5 mL de una solución de metanol al 1%

con ácido trifluoroacético.

Solución de estándares internos: 0,001 g de 2,3,6,7,10,11-

hexametoxitrifenileno (HMT, masa exacta: 408,16) y 0,001 g de 2,3,6,7,10,11-

hexakis(octiloxi)trifenileno (HOT, masa exacta: 996,81) se disolvieron en 500 mL de

cloroformo. La síntesis de HOT y HMT se realizó en base a procedimientos publicados

para trifenilenos, por acoplamiento oxidativo de FeCl3 (6 equivalentes) con una

mezcla de 1,2-dialcoxilbenceno (2 equivalentes) y 3,3’,4,4’-tetraalcoxibifenilo (1

equivalente, preparado mediante la unión de dialcoxiiodobencenos de Ullman) en

diclorometano (Boden et al., 1993; Boden et al., 1994).

Medición de los estándares: a 50 L de la mezcla de estándares se agregaron

50 L de solución de la matriz. Se sembró 1 L de la solución resultante.

Medición del aceite: 20 L de aceite se disolvieron en 1 mL de cloroformo, se

agregó 1 mL de NaCl 1 M y se agitó. Se tomaron 50 L de la parte orgánica de la

mezcla anterior y se agregaron 50 L de la solución de la matriz. Se sembró 1 L de

la solución anterior.

Medición de los polvos lavados: 0,05 g de polvos libres de aceite no

encapsulado se disolvieron en 5 mL de metanol. Por otra parte se colocaron 2,925 g

de NaCl en 50 mL de una solución metanol + agua (2+1). A 1 mL de esta mezcla se

adicionó 1 mL de la solución de polvos. A continuación se mezclaron 50 L de la

96

solución de la matriz con 50L de la dispersión de polvos en metanol, agua y NaCl.

Finalmente se sembró 1 L de la solución anterior.

3.10.2. Arreglo de siembra

Se utilizó un portamuestras de 49 spots (7 x 7). En las filas A, C, E y G se

sembraron los estándares + matriz; mientras que en las filas B, D y F se sembraron las

muestras + matriz (Figura 3.16). La medición se llevó a cabo una vez evaporado el

solvente. La calibración de cada spot de muestra se realizó contra un spot de

estándares inmediatamente adyacente.

Se cotejó que los espectros obtenidos en mezclas de matriz + estándares +

muestra (doble calibración interna) no difirieran de los obtenidos en los espectros

matriz + estándares y matriz + muestra individuales.

Figura 3.16. Esquema del portamuestras 7 x 7 utilizado en MALDI-TOF. Las muestras se calibraron con el estándar adyacente. Por ejemplo, una muestra (m) sembrada en el spot B1 puede calibrarse con los estándares (e) sembrados en A1 o en C1.

97

3.10.3. Condiciones instrumentales

El espectro de masa se obtuvo en modo positivo utilizando un equipo OMNI

FLEX MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Inc., Billerica, USA) en el rango m/z 500-2500.

Se utilizó un láser de N2 ( = 337 nm), con un voltaje de aceleración de 19 keV. Las

muestras se sembraron en el portamuestras y se dejaron secar a temperatura

ambiente.

Se recolectaron 250 pulsos de láser para cada espectro de masa, y todos

fueron recogidos en modo lineal. Se utilizó una calibración interna con dos

estándares de espectro conocido (HMT y HOT). Para corroborar la reproducibilidad,

las muestras se analizaron por triplicado. Los espectros se elaboraron utilizando el

software Flex Analysis 2.2.

3.10.4. Análisis de la oxidación a través de MALDI-TOF

La puesta a punto de la técnica se realizó analizando aceite de girasol

comercial oxidado y sin oxidar a través de espectroscopía MALDI-TOF. Se eligió este

aceite porque los autores que desarrollaron este método emplearon también aceite

de girasol y nuestro objetivo fue probar que podíamos repetir sus ensayos (Picariello

et al., 2009). El aceite que empleamos consiste en una variedad argentina que es la

que tradicionalmente se siembra en mayores extensiones, y cuya composición en

ácidos grasos es: palmítico 6,7%; esteárico 3,6%; oleico 21,9%; linoleico 66,3% y

trazas de otros ácidos grasos. Picariello et al. (2009) no describieron la composición

química de la variedad que emplearon pero lo más probable es que se trate de la

variedad alto oleico, más empleada en Europa. Por esta razón sería esperable que las

intensidades de las señales de sus espectros presentaran diferencias con las nuestras

considerando la diferente abundancia relativa de los ácidos grasos y por consiguiente

de los triglicéridos del girasol que emplearon.

98

Las muestras analizadas fueron:

-aceite de girasol comercial sin tratamiento.

-aceite de girasol comercial calentado durante 6 horas a 180°C en estufa.

Figura 3.17. Espectros obtenidos a través de MALDI-TOF: para (a) aceite de girasol comercial sin tratamiento y (b) aceite de girasol comercial calentado durante 6 h a 180°C.

99

El espectro obtenido para el aceite de girasol sin oxidar se muestra en la

Figura 3.17 a, mientras que el espectro para el aceite de girasol oxidado se presenta

en la Figura 3.17 b. La asignación de los picos principales se informa en las Tablas

3.1. y 3.2.

El espectro de aceite de girasol con calentamiento muestra la fragmentación

de los triglicéridos principales presentes en el aceite sin oxidar, producto de las

reacciones de oxidación lipídica. También presenta una señal intensa que indica la

formación de dímeros que no se hallaba presente en el aceite sin calentar y otras

señales que corresponden a un triglicérido más un fragmento. Las señales principlaes

concuerdan con las encontradas por Picariello et al. (2009) para el aceite de girasol.

Como era esperable sus espectros presentaron estas señales en las mismas posiciones

pero con diferente intensidad que las nuestras.

Tabla 3.1. Asignación de los picos máximos detectados en el espectro MALDI-TOF de aceite de girasol comercial sin calentamiento.

Masa molar Asignación

551,0 Matriz DHB

601,5 DAG: LO+

639,5 DAG: LL

879,7 TAG: C52:3 (PLO)

903,7 TAG: C54:5 (LLO)

919,7 TAGoxidado: C54:5 (LLO) + 16O

937,8 TAGoxidado: C54:5 (LLO) + 2 16O

1055,7 TAG+fragm: C54:6 (LLL) + C11H20O C54:6 + 16O+ C9H16O

DAG=diacilglicerol, TAG=triacilglicerol L=ácido linoleico, Ln=ácido linolénico, O=ácido oleico, S=ácido esteárico, P=ácido palmítico.

100

Tabla 3.2. Asignación de los picos máximos detectados en el espectro MALDI-TOF de aceite de girasol comercial con calentamiento.

Masa molar Asignación

551,0 Matriz DHB

809,7 Escisión : C54:4 (LOO) - C8H16 + 16O

905,7 TAG: C54:4 (LOO)

919,7 TAGoxidado: C54:5 (LLO) + 16O

1045,7 TAG+fragm: C54:4 (LOO) + C9H18O

1812,4 Dímero: C54:5 (LLO) + C54:6 (LLL) + 2 16O

DAG=diacilglicerol, TAG=triacilglicerol L=ácido linoleico, Ln=ácido linolénico, O=ácido oleico, S=ácido esteárico, P=ácido palmítico.

Las mismas condiciones experimentales fueron utilizadas luego para el análisis

del concentrado de aceite de pescado.

3.11. Análisis estadístico

Las diferencias significativas entre las medias se determinaron mediante el

test t de Student, con un nivel de significación de = 0,05.

Resultados y Discusión

102

4. Resultados y Discusión: Estabilidad de emulsiones

Equivóquese. Equivóquese otra vez.

Pero equivóquese mejor.

Samuel Beckett

4.1. Caracterización del concentrado de aceite de pescado

4.1.1. Análisis de parámetros de calidad

La Tabla 4.1 resume los resultados del análisis de control de calidad del

concentrado de aceite de pescado empleado en este trabajo de tesis.

Tabla 4.1. Parámetros de calidad del concentrado de aceite de pescado

Parámetros Límites Valor Método empleado

Humedad e impurezas Max 0,3 0,18 AOCS Ca 2b-38

Total -3, mg/mL Min 185 192 AOCS Ce 2-66

EPA, mg/mL Min 76 82 AOCS Ce 2-66

DHA, mg/mL Min 82 91 AOCS Ce 2-66

Metales pesados, ppm

Plomo < 0,1 < 0,01 AOCS Ca 15

Mercurio < 0,1 < 0,004 AOCS Ca 15

Arsénico < 0,1 < 0,03 AOCS Ca 15

Cromo (VI) < 0,1 < 0,001 AOCS Ca 15

Pesticidas, ppm

DDT, DDE < 1,33 ND AOCS Cd 23

Aldrin < 0,026 ND AOCS Cd 23

Dieldrin < 0,026 ND AOCS Cd 23

Clordan < 0,33 ND AOCS Cd 23

Mirex < 0,026 ND AOCS Ca 15

103

Según dichos resultados, obtenidos mediante los métodos oficiales de la

American Oil Chemists’ Society (AOCS), el aceite reúne los requisitos de calidad

necesarios para ser comercializado y no contiene cantidades apreciables de metales

pesados o de pesticidas.

4.1.2. Análisis de ácidos grasos por CG-MS

La Figura 4.1 muestra el cromatograma obtenido al evaluar la composición en

ácidos grasos por CG-MS del concentrado de aceite de pescado empleado y la Tabla

4.2 resume los porcentajes hallados al evaluar el cromatograma de la Figura 4.1.

Figura 4.1. Cromatograma obtenido al analizar por CG-MS el concentrado de aceite de pescado.

104

El concentrado de aceite de pescado está formado por ácidos grasos de

diversos largos de cadena. Como puede observarse en la Tabla 4.2, los mismos

variaron entre 14 y 24 carbonos. El contenido de ácidos grasos saturados fue 32,37%

mientras que los ácidos grasos insaturados representaron el 57,91%, la mayoría de los

cuales son poliinsaturados.

Tabla 4.2. Composición en ácidos grasos del aceite de pescado determinada por CG-MS.

Ác. graso Nombre común Tiempo de retención (min) %

C 14:0 (tetradecanoico) mirístico 13,170 11,81

C 15:0 (pentadecanoico ramificado) 13,870 0,78

C 15:0 (pentadecanoico ramificado) 14,005 1,08

C 15:0 (pentadecanoico) 14,530 2,64

C 16:1 (hexadecenoico) palmitoleico 15,760 4,68

C 16:0 (hexadecanoico) palmítico 16,195 0,55

C 17:1 (heptadecenoico) 16,690 1,37

C 17:0 (heptadecanoico ramificado) 16,835 0,88

C 17:0 (heptadecanoico ramificado) 16,955 2,16

C 17:0 (heptadecanoico) margárico 17,280 2,39

C 18:2 (octadecadienoico) linoleico 18,215 0,47

C 18:0 (octadecanoico) esteárico 18,880 6,94

C 19:0 (nonadecanoico) 19,805 0,82

C 20:5 (eicosapentaenoico) EPAa 20,310 10,90

C 20:4 (eicosatetraenoico) araquidónico 20,455 4,58

C 20:2 (eicosadienoico) 20,615 3,66

C 20:1 (eicosenoico) gadoleico 20,750 10,19

C 20:0 (eicosanoico) araquídico 20,995 1,51

Ácido graso insaturado 21,345 1,17

C 22:6 (docosahexaenoico) DHAa 21,365 7,96

C 22:5 (docosapentaenoico) DPAa 22,505 5,21

C 22:1 (docosenoico) cetoleico 22,915 5,66

C 22:0 (docosanoico) behénico 23,190 0,81

C 24:1 (tetracosenoico) nervónico 25,125 2,06

Ácidos grasos minoritarios (0,5%) 9,72

a En negrita se indican los ácidos grasos Omega-3. La desviación estándar para todos los valores fue menor a 1%.

105

Entre los ácidos grasos poliinsaturados, los ácidos grasos Omega-3 se

encontraron en un porcentaje de 24,07%, representado por ácido eicosapentaenoico

(EPA), docosapentaenoico (DPA) y docosahexaenoico (DHA). El 9,72% restante

correspondió a ácidos grasos minoritarios, cada uno de los cuales está representado

en un porcentaje menor al 0,5% de la muestra. Los resultados indican que el aceite

de pescado posee una mayor proporción de ácidos grasos con un mayor grado de

insaturación (más de dos dobles ligaduras) que los aceites vegetales.

4.2. Estabilidad de las emulsiones

4.2.1. Emulsiones sin trehalosa

4.2.1.1. Tamaño de partícula

La Figura 4.2 muestra la distribución de tamaños de partícula de las

emulsiones de concentrado de aceite de pescado preparadas sin trehalosa y

estabilizadas con distintas concentraciones de NaCas (0,5-5,0% p/p, a-f).

En idénticas condiciones de procesamiento, las seis emulsiones mostraron la

existencia de dos poblaciones independientemente de la concentración de NaCas

utilizada. Las emulsiones con 0,5% p/p de proteína presentaron una forma cuasi

Gaussiana con centro en D4,3 (1,35 m, a). Al aumentar la concentración de

emulsificante se observó la aparición de un hombro indicando la formación de una

segunda población de tamaño más pequeño que no se diferenció totalmente de la

primera población. Esta segunda población creció al aumentar la concentración de

proteína (b, c, y d), hasta convertirse en el pico principal con un pequeño hombro a

la derecha (e) cuyo D4,3 resultó similar al de la población inicial mostrado en la parte

(a) de la Figura 4.2. Para 5,0% p/p de NaCas la distribución fue cuasi Gaussiana

mostrando una forma similar a la de la parte (a) de la Figura 4.2 pero con un D4,3 más

pequeño (0,37 m).

106

Figura 4.2. Distribución de tamaños de partícula de emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, sin trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

La Tabla 4.3 resume el diámetro medio de la distribución expresada en

volumen (D4,3), el porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen

un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y el ancho de la distribución (W) para las

emulsiones presentadas en la Figura 4.2. Se puede observar en la misma que los

valores de D4,3, %Vd1 y W se redujeron significativamente con el aumento de la

concentración de emulsificante, indicando que la concentración de proteína limita el

tamaño de los glóbulos de aceite en este intervalo de concentración.

107

Tabla 4.3. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), sin el agregado de trehalosa, inmediatamente después de preparadas.

Concentración de

NaCas (% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

0,5 1,35 64,47 1,87

1,0 0,95 36,19 1,57

2,0 0,73 21,79 1,25

3,0 0,58 12,73 1,02

4,0 0,44 5,73 0,73

5,0 0,37 2,71 0,52 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

4.2.1.2. Análisis por Turbiscan

La Figura 4.3 muestra los perfiles de retrodispersión (BS) en función de la

altura de la muestra (altura total = 65 mm) para las emulsiones de la Figura 4.2. El

valor medio inicial de retrodispersión a través del largo total del tubo (BSav O,del

perfil de BS a t = 0) para concentraciones de NaCas de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 y 5,0%

p/p fueron 82,06%; 80,32%; 77,99%; 77,20%; 76,28 y 75,92%, respectivamente. La

retrodispersión es un parámetro que depende directamente del diámetro medio de

partícula y de la fracción de volumen de partículas (), esto es BS = f (D,). En una

emulsión recientemente preparada la distribución de partículas es homogénea a lo

largo del tubo. Es esperable entonces que a t = 0 las emulsiones tuvieran la misma

fracción de volumen ya que todas fueron preparadas con 10% p/p de concentrado de

aceite de pescado, y que el BSav O dependa predominantemente del diámetro medio

de partícula, D4,3. De acuerdo con esto, los valores de BS se correspondieron con el

tamaño inicial de partícula de las emulsiones (Tabla 4.2): cuanto menor fue D4,3,

menor resultó el BS. En general, el valor de BS aumenta con el diámetro medio de

partículas cuando éstas son menores a la longitud de onda incidente y disminuye con

108

el diámetro medio para partículas mayores a la longitud de onda incidente (Mengual

et al., 1999). El valor de BSav O, promedio obtenido en la zona central del tubo es un

parámetro dependiente del tamaño de gota, por lo que su valor puede aumentar o

disminuir al modificarse el tamaño de las partículas de la fase dispersa.

Figura 4.3. Perfiles de retrodispersión (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana, la flecha roja indica el sentido del tiempo), en condiciones de reposo, de emulsiones de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, sin trehalosa añadida a la fase acuosa y con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas): (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0,% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

109

Con el objeto de estudiar la estabilidad global de las emulsiones, los perfiles

de retrodispersión fueron analizados a diferentes tiempos de almacenamiento. Estos

perfiles constituyen la huella dactilar de la emulsión estudiada en un momento dado

(Mengual et al., 1999) ya que son característicos de una emulsión en particular.

Para las mismas condiciones de proceso, y teniendo en cuenta que todas las

emulsiones se prepararon con el mismo porcentaje de fase lipídica, el principal

mecanismo de desestabilización dependió de la concentración de NaCas (Figura4.3).

Las emulsiones formuladas con 0,5 y 1,0% p/p de proteína se desestabilizaron

fundamentalmente por cremado (a, b). Esto se deduce del cambio del perfil en el

tiempo con respecto al perfil inicial: se puede observar una disminución del BS en la

parte inferior del tubo (lo que indica que la concentración de gotas disminuye) y un

aumento concomitante del BS en la zona superior, que se atribuye a la formación de

una capa de crema (las gotas suben y la concentración en la parte alta del tubo es

mayor). La parte superior del perfil mostró una forma aguda, característica de

fenómenos de migración de partículas individuales (gotas) y no de flóculos.

En la Figura 4.4 se muestra el perfil de la emulsión analizada en la Figura 4.3

(a) en modo referencia, es decir, restándole a los perfiles de BS obtenidos a tiempo t

el perfil a tiempo cero o, dicho de otra manera, la primera curva obtenida

inmediatamente después de preparada la emulsión. Cuando los perfiles se expresan

en modo referencia se puede identificar el mecanismo de cremado porque se observa

un pico en la zona 0-20 mm del tubo (parte inferior) que indica la disminución de la

concentración de partículas en el tiempo y otro pico en la parte superior que indica

una mayor concentración de partículas (zona 50-65 mm). Estas dos regiones del tubo

son las que se ven afectadas por cremado o sedimentación y permiten cuantificar las

cinéticas de desestabilización.

A pesar de los cambios que se registraron en los perfiles de BS, el grado de

clarificación siguió siendo bajo después de 190 horas dado que la fase de suero

110

Figura 4.4. Perfiles deBS en el tiempo graficados en modo referencia (BS), es decir, restando a cada tiempo el perfil inicial. Corresponde a la emulsión preparada con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y 0,5% p/p de caseinato de sodio. Los tiempos en la columna de la derecha de la figura están expresados en horas, y la flecha señala el sentido del tiempo.

ubicada en el fondo del tubo permaneció ópticamente opaca y no se registró luz en

el detector de transmisión (T 0%). Todas las emulsiones permanecieron

completamente turbias a lo largo del tubo durante una semana de almacenamiento a

22,5°C. Debido a esto, los perfiles de transmisión no se reportarán en este estudio.

En la Figura 4.5 se presenta un ejemplo de dos emulsiones luego de una

semana de almacenamiento. El estudio de estos sistemas por mera observación

visual, en base a los tubos que se muestran en la Figura 4.5, hubiera llevado a la

equívoca conclusión de que las emulsiones mantienen su estabilidad durante una

semana.

Aunque no se detectaron cambios cuantificables a simple vista, el análisis de

los cambios del perfil de retrodispersión en el tiempo permitió evaluar la

desestabilización de estos sistemas. En el caso de la emulsión estabilizada con 2,0%

p/p de NaCas la ruptura de la emulsión involucró mecanismos de cremado y de

floculación. El perfil de BS muestra que al comienzo se produce una migración de las

111

Figura 4.5. Tubos de Turbiscan que contienen emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, la fase acuosa no contiene trehalosa y con 0,5 (izquierda) y 5,0% p/p (derecha) de caseinato de sodio como estabilizante almacenadas en condiciones de reposo a 22,5°C por una semana.

gotas (Figura 4.3 c): se observa una disminución en la concentración de partículas en

la base inferior del tubo y un aumento en la parte superior que produce un pico

agudo, denotando la formación de una fase crema. Este fenómeno ocurre en las

primeras 28 h.

El perfil de BS, analizado en modo referencia (Figura 4.6), presenta un pico en

la parte inferior del tubo, típico de fenómenos de migración de partículas pequeñas.

Luego de 1,31 h se puede observar también que en la parte superior del tubo (50-65

mm) aparece un pico agudo, característico de la migración de partículas individuales.

Sin embargo, a partir de ese tiempo y hasta las 28 h,se produjo una disminución del

BSav (en la parte central del tubo que no se ve afectada por fenómenos de cremado

sino que se relaciona con un incremento en el diámetro medio de partículas) y al

mismo tiempo se produjo un aumento en el BS en la parte superior del tubo. La

112

forma del perfil, esto es, la presencia de un pico ancho y plano conjuntamente con el

pico agudo, sugiere que ocurrió además una migración de agregados. Este

comportamiento puede estar asociado a coalescencia o floculación. Para dilucidar

por cuál de los dos mecanismos se desestabiliza este sistema se combinaron las

medidas obtenidas empleando un equipo Turbiscan con las realizadas con un equipo

para medir tamaño de gota basado en la dispersión dinámica de luz (DLS). Se midió

D4,3 luego de una semana a 22,5°C tomando una muestra de la zona media del tubo

(20-50 mm) con y sin el agregado de SDS (dodecilsulfato de sodio). De esta forma, si

el fenómeno de desestabilización predominante es floculación, las medidas con y sin

SDS arrojan los mismos valores de D4,3 porque se trata de un fenómeno reversible y

los flóculos unidos débilmente se separan en partículas individuales en la unidad de

dispersión del equipo de DLS. Si, por el contrario, el valor de D4,3 es menor en

presencia de SDS, significa entonces que se produce la ruptura de uniones no

reversibles entre las proteínas del coágulo. La disminución del valor del diámetro

medio de partícula al agregar SDS sugiere que la desestabilización ocurre por

fenómenos de coalescencia (Palazolo et al., 2005).

En las emulsiones analizadas, el valor de D4,3 obtenido fue el mismo con y sin

SDS y resultó menor que el valor inicial de la emulsión (Tabla 4.4). Esto indica, por

un lado, que los agregados se separaron en el equipo de dispersión de luz como

consecuencia de la dilución y de las fuerzas de corte ejercidas durante la medición

del tamaño de partícula en el Mastersizer, generadas en la recirculación del agua, las

cuales fueron lo suficientemente fuertes como para revertir la floculación débil que

se produjo en la emulsión. Por otro lado, a partir del análisis de tamaño de gota a

distintas alturas del tubo, se observó que luego de una semana de almacenamiento la

distribución de partículas perdió su uniformidad. Estos análisis se realizaron tomando

una alícuota de la parte media del tubo (en la región 20-50 mm) que es la afectada

por los fenómenos de coalescencia/floculación. Muestras tomadas en la parte

113

superior (50-65 mm) arrojaron tamaños de partícula mayores dado que las gotas más

grandes migraron preferencialmente a esta región durante el almacenamiento y se

concentraron en ella.

Figura 4.6. Perfiles de BS en el tiempo graficados en modo referencia (BS) de la emulsión preparada con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y 2,0% p/p de caseinato de sodio. Los tiempos en la columna de la derecha de la figura están expresados en horas, y la flecha señala el sentido del tiempo.

Tabla 4.4. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), sin el agregado de trehalosa, almacenadas a 22,5°C en condiciones de reposo por una semana. Las medidas se realizaron en la zona central (20-50 mm) del tubo.

Concentración de

NaCas (% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

0,5 1,24 47,44 15,90

1,0 0,87 33,14 15,34

2,0 0,54 4,37 0,43

3,0 0,36 5,00 0,50

4,0 0,26 1,21 0,24

5,0 0,26 0,00 0,29 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

114

Este comportamiento de desestabilización fue observado previamente en

emulsiones de aceite en agua preparadas con caseinato de sodio. De acuerdo con

Dickinson y Golding (1998) las emulsiones de hidrocarburos estabilizadas con NaCas

se desestabilizan por floculación, sin ocurrir fenómenos de coalescencia. En esos

sistemas el tamaño de partícula se mantenía constante en el tiempo formándose sólo

agregados débiles que se separaban cuando se medía tamaño de gota.

Como lo demuestran los cambios en el perfil de BS con el tiempo, el

mecanismo de desestabilización principal para las emulsiones estabilizadas con 3,0;

4,0 y 5,0% p/p de caseinato de sodio fue la floculación (Figura 4.3 d, e y f). La Figura

4.7 muestra, a modo de ejemplo, el perfil de la emulsión estabilizada con 5,0% p/p

de caseinato de sodio expresado en BS, es decir restándole a los perfiles medidos a

tiempo t de la Figura 4.3 f el perfil inicial (tiempo 0). Los perfiles de retrodispersión

para las tres emulsiones (3,0; 4,0 y 5,0% p/p) fueron similares y mostraron un pico

mucho menor que en la emulsión con 2,0% de caseinato en la parte inferior del tubo,

en el análisis en modo referencia. Esto indica que existió una migración de las

partículas pequeñas en menor proporción que en la emulsión con 2,0% p/p de

proteína antes de que se produjera la floculación de la emulsión. Se evidenció

además un cambio drástico en la estabilidad con una importante disminución en el

BS, relacionada con un fenómeno de floculación.

La forma del perfil en la parte superior del tubo es una consecuencia de la

migración de los flóculos formados durante el proceso. Aunque se observa un pico

agudo provocado por la migración de partículas individuales, estos perfiles indican

que el mecanismo principal de desestabilización en este caso fue la floculación,

seguida por cremado de los flóculos.

115

Figura 4.7. Perfiles de BS en el tiempo graficados en modo referencia (BS) de la emulsión preparada con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y 5,0% p/p de caseinato de sodio. Los tiempos en la columna de la derecha de la figura están expresados en horas, y la flecha indica el sentido del tiempo.

Los D4,3 medidos en las emulsiones de 3,0; 4,0 y 5,0% p/p de NaCas después de

una semana a 22,5°C confirmaron el mecanismo propuesto (Tabla 4.4). Los valores

hallados para estas emulsiones tomando muestras de la región 20-50 mm resultaron

menores que los valores de las emulsiones originales.

Los primeros estudios en emulsiones estabilizadas con NaCas se realizaron con

el objeto de encontrar evidencia experimental que probara que la teoría de

polímeros se aplicaba también al campo de alimentos. Si a pH 7 la proteína está

cargada negativamente, como ocurre con el NaCas en los sistemas en estudio, el

efecto estabilizante está dado tanto por efectos electrostáticos como poliméricos.

Sin embargo, dado que las emulsiones aquí presentadas no contienen electrolitos de

bajo peso molecular -como podría ser cloruro de sodio u otra sal- la diferencia

principal entre las emulsiones de 3,0; 4,0 y 5,0% de caseinato de sodio es la

concentración del polímero. Según la teoría de polímeros, un resumen simplificado

116

de los posibles efectos de las cadenas poliméricas en una dispersión podría

expresarse de la siguiente manera (Hiemenz y Rajagopalan, 1997):

1. Para dispersiones con muy bajas concentraciones de polímero, puede

ocurrir floculación por formación de puentes entre las capas interfaciales de las

partículas. Esto se produce cuando dos o más gotas comparten la misma molécula de

polímero, que se encuentra en defecto en el sistema.

2. A concentraciones mayores del polímero, se pueden formar interfases con

forma similar a las cerdas de un cepillo sobre la superficie de la partícula. Estas

capas pueden ser lo suficientemente extensas como para apantallar las fuerzas

atractivas de van der Waals entre las partículas, provocando interacciones estéricas,

lo que resulta en la repulsión entre las gotas y estabiliza la dispersión.

3. En concentraciones moderadas a altas, se produce la cobertura total de la

interfaz de las gotas y aparecen cadenas libres del polímero en solución, que pueden

generar la desestabilización del sistema a través de un efecto denominado

floculación por agotamiento. Este fenómeno tiene origen en la exclusión de las

cadenas del polímero desde el espacio entre dos partículas cuando se encuentran

muy juntas (es decir que la distancia entre ellas es menor que el radio de giro de las

cadenas poliméricas). El vaciado de polímero libre entre las gotas (zona de

agotamiento) genera una diferencia de presión osmótica en comparación con el resto

de la dispersión, y provoca la colisión entre las mismas. Este tipo de comportamiento

implica una desmezcla entre el solvente y el polímero o, dicho de otra manera, da

lugar a zonas de solvente puro.

4. Finalmente, a concentraciones aún mayores de polímero puede ocurrir la

estabilización de la dispersión por imposibilidad de agotamiento. Las regiones de

agotamiento del polímero entre las partículas se pueden crear solamente cuando las

cadenas del polímero y el solvente se separan. Si el solvente es bueno o la

concentración de polímero es muy elevada, este proceso es termodinámicamente

117

desfavorable y las cadenas del polímero permanecen entre las partículas y

estabilizan el sistema.

La Figura 4.8 muestra un esquema simplificado de los fenómenos descriptos

en los puntos 1 a 4.

Dickinson et al. (1997), quienes publicaron trabajos pioneros en este área,

estudiaron emulsiones de NaCas (1 - 6% p/p) y n-tetradecano (35 o 45% v/v) con un

D4,3 de alrededor de 0,5 m a pH = 6,8 y sostuvieron que la estabilidad de las

emulsiones preparadas con NaCas como único emulsificante está determinada por la

concentración de la proteína. Las principales conclusiones de sus trabajos se pueden

resumir de la siguiente forma:

Figura 4.8. Esquema de los efectos de la concentración de las cadenas poliméricas en dispersiones de polímeros, según la teoría esgrimida por Hiemenz y Rajagopalan, (1997).

118

1. Cuando las concentraciones de caseinato de sodio fueron bajas (1%), y la

concentración en la superficie de las gotas aproximadamente la mitad de la

requerida para cubrir las mismas con una monocapa completa de caseinato, se

produjo floculación por formación de puentes aparentemente acompañada por

coalescencia.

2. Las emulsiones más estables en lo que respecta al cremado eran aquellas

en las cuales la concentración de proteína fue la necesaria para cubrir

completamente a las gotas con una monocapa de NaCas, provocando una

estabilización estérica y electrostática, con (a su vez) una baja concentración de

caseinato en solución. Esto ocurría cuando sus sistemas se preparaban con una

concentración de proteína del 2% p/p. De acuerdo con Dickinson et al. (1997) las

gotas individuales completamente protegidas generaban emulsiones estables que no

floculaban por varias semanas.

3. Si la concentración total de proteína aumentaba (3% p/p), el caseinato en

solución se hallaba en exceso, es decir por encima de la concentración necesaria

para que se produzca floculación por agotamiento (llamada concentración crítica) y

las emulsiones se desestabilizaban. Este tipo de floculación era reversible y no estaba

asociada al aumento en el tamaño de gota. De acuerdo con estos autores, este

fenómeno se produce porque las moléculas de caseína no absorbidas en la interfase

de la gota se hallaban en la solución formando “micelas”.

4. Con concentraciones de NaCas de 6% p/p, las interacciones entre las

moléculas de caseinato son muy fuertes y puede producirse estabilización por

formación de gel (Dickinson, 1999b).

En un trabajo posterior estos autores relacionaron la estabilidad de emulsiones

de NaCas con la relación aceite/proteína y no exclusivamente con la concentración

de proteína. Nuestros estudios mostraron que el comportamiento de estos sistemas

es más complejo que el descripto en la literatura. A concentraciones bajas lo que se

119

produce es el cremado de partículas individuales (gotas) y no una floculación por

formación de puentes. Si bien al aumentar la concentración de caseinato se suprime

la migración no encontramos en estos sistemas ninguna concentración de caseína

intermedia en la cual el sistema sea estable. La floculación, que es un fenómeno más

lento, se favorece al suprimir el cremado y, según lo obtenido en los estudios por

Turbiscan (Figura 4.3 c y d), las muestras con 2,0% o 3,0% de NaCas resultaron ser las

más inestables de todas. Sorprendentemente, como se muestra en la Figura 4.3 d, e

y f, la desestabilización se produjo en menor medida al aumentar la concentración

del estabilizante. La emulsión con 5,0% p/p de NaCas demostró ser la más estable de

las tres formulaciones. Estos resultados no concuerdan con los obtenidos por

Dickinson y Golding (1997) que sostienen que la presencia excesiva de caseinato en

la fase acuosa de una emulsión constituida por una alta concentración de proteína

puede inducir la floculación por agotamiento y la consiguiente desestabilización. Este

fue el comportamiento observado en la emulsión preparada con 2,0% p/p de NaCas y

no en las emulsiones estabilizadas con de 3 a 5% p/p de proteína. La adición ulterior

de NaCas aumentó la concentración de proteína tanto en la fase acuosa como en la

interfase, dado que el D4,3 disminuyó al aumentar la concentración de proteína. De

este modo, el tamaño de partícula (relacionado con el método de preparación de la

emulsión) constituye también un parámetro fundamental en el estudio de la

estabilidad de estos sistemas.

Con el objeto de determinar el rango aceite/proteína adecuados para

estabilizar emulsiones de interés alimentario, Day et al. (2007) estudiaron sistemas

preparados con aceite de pescado variando la concentración de NaCas. Emplearon

25% p/p de aceite y concentraciones de proteína entre 0,1 y 1,0% p/p, dando una

relación aceite/proteína comprendida entre 250 y 25. Es decir, relaciones mayores

que las empleadas en este trabajo, donde el rango fue de 20 a 2. Aunque estudiaron

los sistemas mediante el Turbiscan, no cuantificaron los mecanismos de

120

desestabilización. Estos perfiles mostraron claramente que para relaciones

aceite/proteína mayores a 100 (muy baja concentración de proteína) se producía la

separación de fases en las primeras 24 horas. Los autores informaron que cuando

había exceso de proteína en una emulsión (de acuerdo con ese estudio, cuando la

concentración de caseinato fue de 1% p/p) ocurría la agregación de las gotas de

aceite a través de floculación por agotamiento, lo que resultaba en una baja

estabilidad al cremado y en una alta viscosidad. Esta relación aceite/proteína es aún

mucho mayor que la de nuestros sistemas y de acuerdo a nuestros resultados

esperaríamos desestabilización por cremado. De acuerdo con Day et al. (2007),

cuando la concentración de la proteína era intermedia (0,5% p/p), la emulsión

mostraba una mayor estabilidad a la formación de crema. Sin embargo, el perfil de

retrodispersión obtenido a las 24 horas para esa emulsión presenta un ligero aumento

del BS en la zona superior del tubo, indicativo de una desestabilización por cremado.

Dado que las dispersiones no fueron analizadas más allá de las 24 horas, es difícil

predecir su comportamiento para tiempos más largos. La emulsión con 0,1% p/p de

NaCas (la más inestable) arrojó un D4,3 de 13,3 3,6 m cuando se analizó por DLS, a

partir de lo cual podría esperarse una desestabilización aún más rápida que la

registrada (del orden de los minutos), dado que gotas de ese tamaño migran con

mucha facilidad. Estos autores utilizaron un equipo de alta presión para preparar las

emulsiones con una presión de homogenización de 14 MPa. Al emplear esta presión se

deberían haber generado gotas de un tamaño inferior al mencionado, lo que significa

que en este sistema, la relación aceite/proteína parecería estar por debajo de la

requerida para cubrir la totalidad de las gotas con una monocapa de proteína. Según

nuestros estudios el rango evaluado por estos autores debería corresponder a

emulsiones muy inestables que en todos los casos se deberían separar en dos fases en

menos de 24 h.

121

Perrechil y Cunha (2010) estudiaron distintas maneras de estabilizar

macroemulsiones de aceite en agua, compuestas por 1% p/p de NaCas y 30% p/p de

aceite lo que corresponde a una relación aceite/proteína de 30. Las emulsiones

preparadas por homogenización mediante un Ultra Turrax tuvieron un diámetro

promedio expresando la distribución en superficie (D3,2) de entre 6 a 15 m. Para

evaluar la estabilidad, las emulsiones se caracterizaron por análisis visual. La

mayoría de los sistemas no fueron estables, presentando separación de fases unos

minutos después de preparada la emulsión. Sin embargo, la velocidad de formación

de crema se vio fuertemente afectada por el pH, el proceso de homogenización o la

concentración de goma garrofín que agregaron para estabilizar sus sistemas.

En un trabajo previo de nuestro laboratorio (Cerdeira et al., 2007) se estudió

la estabilidad de emulsiones preparadas con mezclas grasas con bajo contenido de

isómeros trans y distintos emulsificantes. Se emplearon emulsificantes no iónicos de

moléculas pequeñas como los ésteres de sacarosa, proteínas como NaCas o una

mezcla de ésteres de sacarosa y NaCas. El objetivo de ese trabajo fue determinar

cuál de los emulsificantes generaba la mayor estabilidad en los sistemas en estudio.

Según los resultados obtenidos el NaCas fue el mejor emulsificante de todos los

ensayados. La emulsión formulada con aceite de girasol y NaCas con una relación

aceite/proteína de 8 fue muy estable luego de 195 horas a 22,5°C. No se produjo

cremado ni coalescencia y, como resultado, permaneció totalmente turbia y no se

detectó ninguna clarificación en el detector de transmisión. En Cerdeira et al.

(2007), se realizó una pre-emulsión que luego se sometió a dos etapas de

homogenización a alta presión, generando D4,3 de 1,10 0,13 m. En el presente

trabajo, las pre-emulsiones fueron homogenizadas durante 20 minutos utilizando un

procesador ultrasónico. Como se mencionó anteriormente, las proporciones

aceite/proteína empleadas variaron entre 20 y 2, obteniéndose los D4,3 que se

resumen en la Tabla 4.3. Las emulsiones presentaron estabilidad solamente cuando la

122

relación aceite/proteína fue de 2. Esto significa que el valor de la relación

aceite/proteína que generó estabilidad a largo plazo dependió a su vez de las

condiciones de procesamiento que determinaron entre otros factores la estructura de

la proteína y los tamaños de gota de las emulsiones. Cuando se empleó un

homogenizador de alta presión se necesitó menor cantidad de proteína para lograr la

estabilidad que en el caso de ultrasonido.

En las Figuras 4.9 y 4.10 se presentan los perfiles de BS, como se registran en

el equipo Turbiscan (4.9) y los perfiles en modo referencia (4.10), de la pre-

emulsión que se preparó con 5,0% p/p de caseinato de sodio y 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado. Este sistema fue homogeneizado con Ultraturrax

exclusivamente. Esta es la única diferencia que presenta con la emulsión cuyos

perfiles se muestran en las Figuras 4.3 f y 4.7, es decir que en ambos casos la

relación aceite/proteína fue la misma. Al no emplearse ultrasonido el tamaño de

gota aumentó, siendo de 16,3 0,5 m, un orden de magnitud mayor que cuando se

emplea ultrasonido. Como puede observarse a partir de los perfiles incluidos en las

Figuras 4.9 y 4.10, el principal mecanismo de desestabilización fue cremado y no

floculación como en el caso de la Figura 4.3 f y 4.7. Asimismo, la velocidad de

desestabilización fue muy superior cuando se empleó exclusivamente Ultraturrax

para preparar las emulsiones. Los valores que figuran en la parte derecha de la

Figura 4.9 están expresados en minutos y el intervalo de medida fue 28 min. En ese

tiempo se observó un cremado importante. En cambio, al aplicar 20 minutos de

ultrasonido a la pre-emulsión, los perfiles de BS tomados en los primeros 28 minutos

mostraron que el sistema era estable.

123

Figura 4.9. Perfiles de retrodispersión (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante 28 minutos) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas empleando sólo Ultraturrax, con concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, sin trehalosa añadida a la fase acuosa y con una concentracion de caseinato de sodio (NaCas) de 5,0% p/p.

Figura 4.10. Los mismos perfiles de BS presentados en la Figura 4.9 pero graficados en modo referencia (BS). Los tiempos en la columna de la derecha de la figura están expresados en minutos.

Cuando se aplica ultrasonido luego de formar una pre-emulsión con

Ultraturrax el diámetro promedio de las gotas de grasa disminuye, aumentando el

área interfacial. De acuerdo con los resultados de Kalnin et al. (2004), la

124

concentración de proteína total en una emulsión de caseinato es igual a la suma de la

concentración en la fase acuosa más la concentración de la proteína en la interfase.

Las emulsiones de las Figuras 4.7 y 4.10 poseen la misma concentración total de

caseinato (5,0% p/p). En una pre-emulsión existirá una mayor cantidad de proteína

en la fase acuosa en comparación con una emulsión tratada con ultrasonido, aunque

en ambas la concentración total permanezca constante. En el caso del tratamiento

con ultrasonido el tamaño de partícula se reduce en un orden de magnitud al realizar

la segunda etapa de homogenización y, por lo tanto, habrá más proteína en la

interfase y menos en la fase acuosa. En el caso de la pre-emulsión preparada con

5,0% de caseinato de sodio y 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, el

mecanismo de desestabilización principal fue cremado, mientras que para la misma

emulsión sometida a una segunda etapa de homogeneización con ultrasonido se

observó un fenómeno de floculación. Dickinson et al. (1997) asociaron la floculación

con la concentración de proteína en solución. Según estos autores, para que se

produjera floculación debía existir una concentración total de proteína mínima en la

emulsión (que estimaron como 3% p/p en el caso de emulsiones homogeneizadas con

Ultraturrax y con posterior aplicación de Ultrasonido) para que la concentración en la

fase acuosa fuera suficiente y ocurriera así este fenómeno. Sin embargo, los

resultados aquí presentados parecen indicar que la hipótesis de Dickinson et al.

(1997) no es correcta: el hecho de que una emulsión pueda desestabilizarse por

cremado o por floculación según el tamaño de gota generado para una misma

cantidad de proteína total, indica que el área interfacial y la concentración de la

proteína en la interfase son factores muy relevantes para que se produzca la

desestabilización por floculación e incluso más importantes que la concentración de

la proteína en la fase acuosa. En nuestros sistemas la emulsión con mayor

concentración de proteína en solución se desestabilizó por cremado mientras que la

125

que contenía una menor concentración de proteína en solución se desestabilizó por

floculación.

Kalnin et al. (2004) demostraron que al aumentar la concentración total de

caseinato, la proteína en solución aumentaba en mucha mayor proporción que la

proteína en la interfase. La emulsión con 5,0% de NaCas es la que contiene la mayor

concentración de proteína en solución de las tres emulsiones que floculan (3,0, 4,0 y

5,0% p/p de NaCas) ya que el tamaño de gota disminuye sólo ligeramente. Esta

emulsión es también la que tiene mejor cobertura de gota de las tres. Los trabajos

que pueden encontrarse en la literatura sostienen la hipótesis de Dickinson et al.

(1997), que interpreta la desestabilización por floculación como resultado del

aumento de la proteína en solución y en especial del aumento con respecto a la

proteína necesaria para formar una monocapa alrededor de la gota. Sin embargo, los

resultados del análisis de las emulsiones por Turbiscan muestran que los valores de

BSav t disminuyen en menor proporción con respecto al valor inicial (BSav 0) al

aumentar la concentración total de proteína. Es decir que la estabilidad crece con la

concentración de proteína. Este resultado es el opuesto al esperado de acuerdo con

la interpretación que la mayoría de los autores hizo hasta este momento de las

emulsiones estabilizadas con NaCas, lo que indica que la estabilidad de estos

sistemas no puede explicarse exclusivamente teniendo en cuenta la proteína en

solución. Factores como el tamaño de gota (relacionado con el método de

procesamiento) que determinan el área superficial y la cantidad de proteína en la

interfase no pueden ser despreciados.

4.2.1.3. Microestructura

La Figura 4.11 muestra las imágenes obtenidas por microscopía confocal al

analizar la microestructura de las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado

de aceite de pescado y estabilizadas con distintas concentraciones de NaCas. Las

126

emulsiones se almacenaron en condiciones de reposo por 24 h a 22,5 °C. Las

muestras estabilizadas con 0,5 y 1,0% p/p de caseinato de sodio (parte a y b de la

Figura 4.11) presentaron gotas individuales de tamaño pequeño como era esperable,

dado que estos sistemas se desestabilizaron principalmente por cremado. Cuando la

concentración de proteína en las emulsiones fue de 2,0% p/p, la microestructura de

la emulsión fue muy diferente: en la Figura 4.11 c se registra la aparición de

agregados o flóculos, ausentes en las muestras con menor cantidad de caseinato. De

acuerdo con los resultados hallados al analizar las emulsiones con Turbiscan esta

muestra fue la más inestable de todas. En principio se observó una desestabilización

por cremado pero seguidamente el mecanismo principal fue floculación, con un

marcado descenso del BSav t. Las imágenes muestran que se trata de la

microestructura con mayores flóculos y es la más inhomogénea de las 6 emulsiones.

Las dispersiones estabilizadas con 3,0, 4,0 y 5,0% p/p de caseinato de sodio se

desestabilizaron por floculación y, tal como se esperaba, se encontraron

microestructuras que muestran la presencia de flóculos (Figura 4.11 d, e y f).

127

Figura 4.11. Microscopía confocal con barrido de láser de las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, sin agregado de trehalosa en la fase acuosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), almacenadas a 22.5°C durante 24 horas: (a) 0,5% p/p; (b) 1,0% p/p; (c) 2,0% p/p; (d) 3,0% p/p; (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

128

4.2.2. Emulsiones con trehalosa

4.2.2.1. Tamaño de partícula

El comportamiento de los sistemas seleccionados para el presente estudio

resultó ser más complicado que las descripciones que otros autores han publicado en

sistemas similares. De acuerdo con nuestros resultados, la proporción de

aceite/proteína que generó condiciones que condujeron a una mayor estabilidad se

vio afectada, como en los casos anteriores, por las condiciones de procesamiento.

Según la teoría de polímeros ya descripta, las interacciones entre las cadenas

poliméricas y los componentes de la fase acuosa de la emulsión son muy relevantes

en la estabilidad de la misma (Hiemenz y Rajagopalan, 1997). Con el objeto de

explorar esta hipótesis se agregó trehalosa (un azúcar crioprotector y un excelente

encapsulante de lípidos) a la fase acuosa. La selección del azúcar tuvo en cuenta uno

de los objetivos principales de este trabajo que consiste en relacionar la estabilidad

de una emulsión con la capacidad de la fase continua para retener la fase dispersa en

un polvo microencapsulado.

La Figura 4.12 muestra la distribución del tamaño de gota de las emulsiones

de concentrado de aceite de pescado preparadas con 20% p/p de trehalosa y

estabilizadas con distintas concentraciones de caseinato de sodio (0,5 – 5,0 % p/p a-

f). El D4,3, %Vd1 y W para estos sistemas se muestran en la Tabla 4.5. La Figura 4.13 y

la Tabla 4.6 muestran los mismos resultados pero para emulsiones con 30% p/p de

trehalosa. Los resultados correspondientes a las emulsiones con 40% de trehalosa se

muestran en la Figura 4.14 y la Tabla 4.7.

129

Figura 4.12. Distribución de tamaño de partícula de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, 20% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas) (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

Las emulsiones con 20% p/p de trehalosa también mostraron la existencia de

dos poblaciones pero con menos desviaciones de la forma Gaussiana que las

formulaciones sin azúcar, lo que sugiere un tamaño de gota más homogéneo. El D4,3

fue menor en todos los casos que para las emulsiones sin trehalosa, lo que podría

indicar la existencia de interacciones entre el disacárido y el caseinato de sodio. Las

emulsiones con 4,0 y 5,0% p/p de caseinato de sodio presentaron una distribución

130

muy estrecha (W = 0,61 y 0,45 m, repectivamente) y un diámetro medio en volumen

muy pequeño (D4,3 = 0,42 y 0,35 m, respectivamente).

El agregado a la fase acuosa de porcentajes de trehalosa superiores a 20% p/p

trajo como consecuencia una reducción aún mayor del tamaño de partícula obtenido

para emulsiones sin el agregado de azúcar. La parte a de la Figura 4.13,

correspondiente a una emulsión con 30% p/p de trehalosa, muestra una distribución

con una población principal cuyo valor de diamétro fue 0,32 m (máximo del pico)

con un hombro a 1,26 m. El diámetro promedio en volumen fue 0,82 m (Tabla 4.6),

significativamente menor que el diámetro sin azúcar (D4,3= 1,35 m). Este hombro

fue desapareciendo con el decrecimiento de D4,3 (4.13 b, c, d), hasta obtenerse una

población cuasi monomodal angosta y con forma Gaussiana, de D4,3 pequeño (Figura

4.13 e y f).

Tabla 4.5. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), con el agregado de 20% p/p de trehalosa, analizadas inmediatamente después de preparadas.

Concentración de

NaCas (% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

0,5 0,88 29,50 1,52

1,0 0,85 27,37 1,31

2,0 0,63 13,96 1,01

3,0 0,52 8,02 0,82

4,0 0,42 3,68 0,61

5,0 0,35 1,17 0,45 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

131

Figura 4.13. Distribución de tamaño de partícula de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, 30% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

132

Tabla 4.6. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), con el agregado de 30% p/p de trehalosa, analizadas inmediatamente después de preparadas.

Concentración de

NaCas (% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

0,5 0,82 23,08 1,58

1,0 0,86 23,51 1,35

2,0 0,56 9,78 0,88

3,0 0,43 3,79 0,60

4,0 0,35 1,18 0,44

5,0 0,30 0,43 0,36 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

Tabla 4.7. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), con el agregado de 40% p/p de trehalosa, analizadas inmediatamente después de preparadas.

Concentración de

NaCas (% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

0,5 0,80 16,77 1,35

1,0 0,67 15,11 1,10

2,0 0,49 5,87 0,69

3,0 0,39 2,63 0,49

4,0 0,31 0,84 0,36

5,0 0,29 0,00 0,33 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

133

Figura 4.14. Distribución de tamaño de partícula de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, 40% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

Las emulsiones con 40% p/p de trehalosa fueron las que presentaron un menor

D4,3 de entre todas las emulsiones analizadas (Tabla 4.7 y Figura 4.14). Como en el

caso del agregado de 20 o 30% p/p de azúcar, los sistemas estabilizados con 4,0 y

5,0% p/p de NaCas mostraron las distribuciones más Gaussianas (Figura 4.14 e y f).

Estas distribuciones no presentaron hombros que pudieran indicar una segunda

población en menor proporción. En los casos a, b, c y d de la Figura 4.14, en cambio,

pudo detectarse una segunda población, especialmente en el caso de la Figura 4.14

134

a. Sin embargo, los porcentajes en los que se halló esta segunda población fueron

más bajos que los de la población de menor tamaño y no se observó un pico separado

dando una distribución bimodal sino que se mostró como un hombro del pico

principal. Es importante destacar que para la emulsión en la Figura 4.14 f el

porcentaje de partículas cuyo D4,3 fue mayor que 1 m (%Vd1) fue cero y W fue 0,33.

Sería esperable que la emulsión preparada con 5,0% de caseinato de sodio y 40% de

trehalosa fuera muy estable dado que la distribución de tamaño de gota es muy

homogénea y las gotas son muy pequeñas.

Para verificar que el mecanismo de desestabilización principal en las

emulsiones preparadas con 3,0 y 4,0% p/p de caseinato de sodio fue floculación y no

coalescencia se midieron los diámetros medio de partícula de la distribución en

volumen (D4,3) en la zona central del tubo de Turbiscan (20-50 mm). Los resultados

obtenidos se resumen en la Tabla 4.8. Como puede observarse, al igual que en el

caso de las emulsiones sin trehalosa, los valores de D4,3 indican que el mecanismo

principal de desestabilización fue floculación.

4.2.2.2. Análisis por Turbiscan

La Figura 4.15 muestra los perfiles de retrodispersión en modo referencia

(BS%) en función de la altura del tubo para las emulsiones de la Figura 4.12. Los

perfiles correspondientes a las Figuras 4.13 y 4.14 se muestran en las Figuras 4.16 y

4.17, respectivamente. El valor medio inicial de la retrodispersión a lo largo del tubo

(BSav 0, zona 20-50 mm) para las emulsiones de la Figura 4.15 estabilizadas con

concentraciones de caseinato de sodio de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 y 5,0 % p/p fue de

70,80%, 70,16%, 69,22%, 69,17%, 68,80%, 66,81%, respectivamente. Estos valores

fueron inferiores a los encontrados para emulsiones sin trehalosa, lo que concuerda

con el menor valor D4,3 medido con la adición de azúcar. Como en el caso de las

emulsiones sin trehalosa, para las mismas condiciones de procesamiento, el principal

135

mecanismo de desestabilización de cada sistema dependió de la concentración de

caseinato de sodio (Figura 4.15).

Tabla 4.8. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), con el agregado de 20, 30 o 40% p/p de trehalosa, analizadas luego de una semana de almacenamiento en condiciones de reposo a 22.5°C.

Concentración de

NaCas(% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

Emulsiones con 20% p/p de trehalosa

0,5 0,76 22,41 1,16

1,0 0,76 20,09 1,03

2,0 0,47 6,66 0,73

3,0 0,37 3,60 0,47

4,0 0,30 0,00 0,35

5,0 0,34 1,4 0,44

Emulsiones con 30% p/p de trehalosa

0,5 0,63 17,01 1,19

1,0 0,78 21,41 1,08

2,0 0,44 4,06 0,56

3,0 0,33 1,25 0,39

4,0 0,41 2,67 0,56

5,0 0,30 0,42 0,36

Emulsiones con 40% p/p de trehalosa

0,5 0,60 15,17 1,18

1,0 0,64 14,46 1,06

2,0 0,48 5,58 0,68

3,0 0,38 2,18 0,47

4,0 0,32 0,68 0,37

5,0 0,29 0,00 0,33 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

136

Figura 4.15. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana, la flecha roja indica el sentido del tiempo) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, 20% p/p de trehalosa disuelta en la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

En las dispersiones de las partes a y b de la Figura 4.15 el mecanismo principal

de destabilización fue cremado. La emulsión con 2,0% p/p de NaCas se desestabilizó

en principio por cremado y luego por floculación (Figura 4.15 c). Los sistemas con 3,0

y 4,0% p/p de proteína se desestabilizaron fundamentalmente por floculación (partes

d y e). Hubiera sido esperable que la emulsión con 5,0% p/p de NaCas también se

desestabilizara por floculación -como fue el caso de la emulsión sin trehalosa en la

137

fase acuosa. Sin embargo, la misma se mantuvo estable durante una semana a

22,5°C, dado que el valor de BS se mantuvo constante en ese lapso de tiempo.

Figura 4.16. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana, la flecha roja indica el sentido del tiempo) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, 30 % p/p de trehalosa disuelta en la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

138

Figura 4.17. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, 40 % p/p de trehalosa disuelta en la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 0,5% p/p, (b) 1,0% p/p, (c) 2,0% p/p, (d) 3,0% p/p, (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

Aunque hasta el presente ningún autor ha mostrado evidencia experimental

que pruebe que existe un segundo intervalo de concentraciones de proteína en las

cuales la emulsión es estable (concentraciones mayores a las que producen

desestabilización por floculación), diversos trabajos han postulado que a altas

concentraciones de NaCas puede producirse la formación de un gel que le puede

conferir estabilidad al sistema. Es decir que la microestructura se mantiene sin

cambios en el tiempo (Dickinson, 2006). La emulsión estabilizada con 5,0% p/p de

139

NaCas permaneció completamente turbia, en estado líquido, y no se evidenció la

formación de gel en al menos tres semanas, indicando que las causas de la

estabilidad debieron ser otras.

Tal y como se observó en el caso de las emulsiones preparadas con 20% p/p de

trehalosa, las emulsiones incluidas en las Figuras 4.16 y 4.17 también mostraron un

descenso del BS al aumentar la concentración de caseinato de sodio. Los valores de

BSav 0 (zona 20-50 mm) encontrados para las emulsiones incluidas en las partes a-f

fueron 69,41%, 67,39%, 65,65%, 63,35%, 61,65% y 55,17%, respectivamente y las

correspondientes a la Figura 4.17 partes a-f fueron 61,43%, 57,06%, 54,88%, 52,29%,

49,80% y 49,66%; respectivamente. De la misma forma que para los sistemas

constituidos con 20% p/p de trehalosa, al agregar 30 y 40% p/p de trehalosa en la

fase acuosa el BS disminuyó con el tamaño de gota.

Además, en las Figuras 4.16 y 4.17 puede observarse que la estabilidad de las

emulsiones preparadas con caseinato de sodio se incrementó con el agregado de

azúcar. Ambos mecanismos, cremado y floculación, resultaron más lentos cuando la

fase acuosa contiene trehalosa y en particular la muestra con 5,0% p/p de caseinato

de sodio presentó una gran estabilidad (Figuras 4.16 f y 4.17 f).

4.2.2.3. Microestructura

Las imágenes obtenidas por microscopía confocal con barrido de láser para las

emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 20% p/p

de trehalosa en la fase acuosa, distintas concentraciones de NaCas y mantenidas a

22,5°C durante 24 horas se muestran en la Figura 4.18. Las microestructuras

correspondientes a las emulsiones preparadas con 30 o 40% p/p de trehalosa se

presentan en las Figuras 4.19 y 4.20, respectivamente. De forma análoga a lo

encontrado para las emulsiones sin trehalosa, en la Figura 4.18 se puede observar

que los sistemas estabilizados con 0,5 y 1,0 % p/p de caseinato (parte a y b de la

140

Figura 4.18) mostraron una microestructura de partículas individuales, con gotas

distribuidas en forma casi homogénea. La emulsión estabilizada con 0,5% p/p de

proteína presentó gotas mayores que la estabilizada con 1,0% p/p. Este resultado

está de acuerdo con las medidas de distribución de tamaño de gota realizadas por

DLS en las que se evidenció una disminución del D4,3con el aumento de la

concentración de caseinato de sodio. Cuando la concentración de proteína fue de

2,0; 3,0 y 4,0% p/p (parte c, d y e de la Figura 4.18) se observó la aparición de

agregados o flóculos, coincidiendo con las mediciones realizadas por Turbiscan. En

estos sistemas el principal mecanismo de desestabilización fue floculación.

Hubiera sido esperable (a partir de la microestructura de las emulsiones sin

trehalosa) que la emulsión con 5,0% p/p de caseinato de sodio (parte f de la Figura

4.18) presentara flóculos. Sorprendentemente, los estudios de estabilidad de esta

dispersión no mostraron cambios en los perfiles de BS por una semana, indicando que

el agregado de trehalosa modifica el comportamiento de estabilidad de este sistema.

Se obtuvo una microestructura con partículas individuales muy pequeñas, una

distribución de gota muy homogénea y un menor D4,3 que en la emulsión sin

trehalosa. Esta imagen de microscopía confocal es la primer prueba experimental en

la que se describe una microstructura que demuestra que existe una re-estabilización

de la emulsión a altas concentraciones de proteína (Álvarez Cerimedo et al., 2010).

Este segundo intervalo de estabilidad fue previsto por la teoría de polímeros

(Hiemenz y Rajagopalan, 1997). Hasta el presente diversos autores han propuesto

este comportamiento de estabilidad para las emulsiones de NaCas pero no lo han

documentado. Las imágenes de algunos artículos que describen sistemas en los cuales

se ha teñido la fase grasa con Nile red muestran microestructuras con flóculos pero

no describen sistemas estables. Otros autores tiñeron las proteínas en lugar de la

fase lipídica y mostraron imágenes en las cuales los espacios de la red proteica (en

negro en las imágenes) correspondientes a las áreas donde se ubica la materia grasa

141

presentaban tamaños menores en determinadas condiciones lo que parecía indicar

una mayor estabilidad (Radford et al., 2004). Sin embargo, las zonas negras no son

esféricas -probablemente porque la proteína presente en la interfase no se tiñe de

manera homogénea- y por lo tanto no se pudo asegurar de forma concluyente que el

sistema no presentara flóculos.

Las emulsiones con 30% p/p y 40% p/p de trehalosa, en tanto, muestran

comportamientos similares a las preparadas con 20% p/p de disacárido (Figura 4.19 y

4.20, respectivamente). La Figura 4.20 muestra que el agregado de trehalosa en altas

concentraciones (40% p/p) conduce a una microestructura homogénea y suprime la

formación de flóculos.

142

Figura 4.18. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de láser (LSCM) de las emulsiones con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, 20% p/p trehalosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio, mantenidas a 22,5°C durante 24 horas: (a) 0,5% p/p; (b) 1,0% p/p; (c) 2,0% p/p; (d) 3,0% p/p; (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

143

Figura 4.19. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de laser (LSCM) de las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, 30% p/p de trehalosa disuelta en la fase acuosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio almacenadas a 22,5 °C por 24 h: (a) 0,5 % p/p, (b) 1,0 % p/p, (c) 2,0 % p/p, (d) 3,0 % p/p, (e) 4,0 % p/p, y (f) 5,0 % p/p.

144

Figura 4.20. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de láser (LSCM) de las emulsiones con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, 40% p/p trehalosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio, mantenidas a 22,5°C durante 24 horas: (a) 0,5% p/p; (b) 1,0% p/p; (c) 2,0% p/p; (d) 3,0% p/p; (e) 4,0% p/p y (f) 5,0% p/p.

145

4.3. Cuantificación de los procesos de desestabilización

4.3.1. Evaluación de la velocidad de migración

La migración de las gotas de aceite de las emulsiones estabilizadas con 0,5;

1,0 y 2,0 % p/p de NaCas conducen a la aparición de un pico en la parte inferior del

tubo (zona 0-20 mm), que aumenta a medida que se extiende la migración en las

gotas. Evaluando los cambios en el ancho de pico a mitad de altura en función del

tiempo fue posible estimar una velocidad de migración. La Figura 5 a-c muestra el

aumento del ancho de pico a mitad de altura, evaluado a partir de los perfiles de BS

en modo referencia, durante las primeras 100 horas a partir de la preparación de la

emulsión. En este período se produjeron los mayores cambios. También es en esta

etapa cuando el ancho de pico a mitad de altura se incrementa en forma lineal con el

tiempo. Se calcularon las pendientes de las rectas trazadas en la zona de

comportamiento lineal y los resultados se presentan en la Tabla 4.9. Como se observa

en la Tabla 4.9 y en la Figura 4.21 partes a y b, la adición de trehalosa a la fase

acuosa de las emulsiones con 0,5 y 1,0% p/p de NaCas disminuye la velocidad de

cremado especialmente cuando la concentración de azúcar es de 40% p/p (línea

violeta).

Tabla 4.9. Pendientes (mm/h) y coeficientes de correlación (R2) de las rectas mostradas en la Figura 4.20 a, b y c.

Muestra 0,5% p/p NaCas 1,0% p/p NaCas 2,0% p/p NaCas

Pendiente R2 Pendiente R2 Pendiente R2

Sin trehalosa 0,035 0,972 0,033 0,974 0,149 0,951

20 % p/p trehalosa 0,031 0,982 0,033 0,985 0,035 0,981

30 % p/p trehalosa 0,029 0,976 0,029 0,976 0,027 0,937

40 % p/p trehalosa 0,024 0,901 0,016 0,880 0,017 0,901

Los valores de las pendientes se calcularon ajustando los datos experimentales por cuadrados mínimos.

146

Fig 4.21. Espesor (o ancho) del pico medido al 50% de la altura a distintos tiempos en el fondo del tubo (zona 0-20 mm), almacenado en reposo a 22,5°C, para emulsiones de aceite de pescado y distintas concentraciones de NaCas: (a) 0,5% p/p, (b) 1,0 % p/p, y (c) 2,0 % p/p, analizado durante 100 horas. La longitud del tubo es de 65 mm. Celeste: sin trehalosa, bordó: con 20% p/p de trehalosa, verde: con 30% p/p de trehalosa, violeta: con 40% p/p de trehalosa.

En los sistemas estabilizados con 2,0% p/p de proteína (Figura 4.21 c), la

velocidad de cremado para las emulsiones sin trehalosa fue notoriamente mayor

147

durante las primeras 20 horas, hasta que se alcanzó una meseta (línea celeste).La

adición de trehalosa a la fase acuosa de las emulsiones disminuyó de forma

significativa la velocidad de cremado para todas las concentraciones de azúcar. Este

efecto creció notoriamente con la concentración de azúcar, sugiriendo que el

disacárido debe desempeñar un papel muy importante en la estructura de la

emulsión.

4.3.2. Evaluación de la desestabilización por floculación

Las variaciones en la retrodispersión (BS) en la zona comprendida entre los 20-

50 mm del tubo que se produce en las muestras cuyo principal mecanismo de

desestabilización es la floculación se muestran en la Figura 4.22 a-c.

Las emulsiones con 40% p/p de trehalosa (Figura 4.22 a-c, líneas violetas)

estabilizadas con 3,0; 4,0 o 5,0% p/p de NaCas no presentaron variaciones

significativas en la retrodispersión con el tiempo (los cambios en BS desde el inicio

fueron 0,5%). Por el contrario, las dispersiones sin azúcar agregada a la fase acuosa

(Figura 4.22 a-c, líneas celestes) presentaron en todos los casos una disminución

brusca en la retrodispersión en las primeras 24 h, para luego estabilizarse en

mesetas cercanas al 17%, 12% y 8% de BS para 3,0%, 4,0% y 5,0% de NaCas,

respectivamente. Estos resultados evidencian que el aumento en la concentración de

proteína disminuye la desestabilización por floculación.

Las emulsiones formuladas con 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de caseinato

de sodio tampoco exhibieron cambios significativos en el perfil de BS con el tiempo

(Figura 4.22 c, línea bordó). Sin embargo, para concentraciones de proteína de 3,0 y

4,0% p/p se observó una disminución de la retrodispersión del 12% y 4%

respectivamente, en las primeras 10 h de almacenamiento. A tiempos más largos los

valores de BS alcanzaron un valor asintótico que se mantuvo constante hasta las 200

h (Figura 4.22 a y b, línea bordó).

148

Fig 4.22. Variación de la retrodispersión en la zona 20-50 mm de la muestra monitoreada durante 160 h, para emulsiones almacenadas en reposo a 22,5°C. Las emulsiones fueron formuladas con aceite de pescado como fase dispersa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas): (a) 3,0% p/p, (b)4,0% p/p, y (c) 5,0% p/p. Largo del tubo: 65 mm. Celeste: sin trehalosa, bordó: con 20% p/p de trehalosa, verde: con 30% p/p de trehalosa, violeta: con 40% p/p de trehalosa.

Para las formulaciones con 30% p/p de trehalosa, sólo la emulsión con 3,0% p/p

de caseinato de sodio (Figura 4.22 a, línea verde) mostró una disminución

149

significativa en el BSav(zona 20-50 mm) durante el almacenamiento (8%).Cuando las

dispersiones se estabilizaron con 4,0 o 5,0% p/p de proteína los valores de BS

cambiaron en forma poco significativa durante las 200 h de almacenamiento (Figura

4.22 a y b, línea verde). El sistema con 4,0% p/p de caseinato de sodio mostró una

pequeña disminución de 1,5% en la retrodispersión, mientras que para una

concentración de proteína de 5,0% p/p los cambios desde el tiempo cero fueron

menores al 0,5%. Los datos mostrados en la Figura 4.22 a-c permiten concluir que el

agregado de trehalosa estabiliza las emulsiones de caseinato de sodio retrasando el

proceso de floculación.

De acuerdo con los manuscritos que han publicado diversos autores, la

estabilidad global y el comportamiento reológico de las emulsiones de aceite en agua

(O/W) preparadas con caseinato de sodio como único emulsificante dependen de la

combinación de varios factores como temperatura, pH, fuerza iónica, contenido de

calcio y relación aceite/proteína (Dickinson, 2001). Los sistemas empleados en este

trabajo se prepararon y almacenaron a 22,5°C, su pH varió entre 6,6 y 6,8 y no

contenían calcio u otra sal. En función de los resultados obtenidos, encontramos que

el comportamiento de dichos sistemas fue modificado además por el agregado de un

azúcar en la fase acuosa. Si bien la teoría de polímeros introdujo la idea de la

importancia de las interacciones de la proteína con otros componentes de la

emulsión, se trata de un concepto que la mayoría de los autores no han explorado al

analizar la estabilidad de estos sistemas.

No obstante, pueden encontrarse trabajos en emulsiones alimentarias en los

cuales la presencia de algún componente en la fase acuosa modifica el tamaño de

gota. El agregado de alcohol a la fase acuosa de dispersiones con caseinato de sodio

como emulsificante, en concentraciones muy por debajo de las necesarias para

precipitar la proteína conduce a un aumento en la estabilidad del sistema (Dickinson

y Golding, 1998; Huck-Iriart et al., 2011). Esta estabilidad se debe a que el etanol

150

produce una reducción de la tensión interfacial entre la fase lipídica y la fase acuosa.

De este modo, si se desea reducir el tamaño de gota de una emulsión se puede

agregar alcohol a la fase acuosa y así obtener un D4,3 significativamente menor que el

que se mide en la emulsión sin agregados. Dicha reducción en el tamaño de gota

conduce a una reducción en la velocidad de cremado.

Se ha descripto que el proceso de floculación también puede demorarse con el

agregado de alcohol (Dickinson y Goldin, 1998). De acuerdo con los trabajos de

estos autores el alcohol modifica el tamaño promedio y la composición de las

submicelas de caseína no absorbidas en la superficie de la gota, que son las

responsables del comportamiento de floculación. Dickinson y Davies (1999)

demostraron que para un mismo tamaño de gota y la misma relación aceite/proteína,

los iones calcio tienen distinto efecto en la estabilidad de emulsiones de NaCas si se

agrega la sal de calcio antes o después de la homogenización. De acuerdo con estos

autores esta diferencia de comportamiento se puede atribuir a cambios en la

estructura de la capa de proteína adsorbida en la interfase y a modificaciones en la

cobertura de las gotas producidas por cambios en la densidad de carga y estado de

agregación de la proteína. En un trabajo posterior Radford et al. (2004) encontraron

que algunas combinaciones de etanol y calcio permitían preparar emulsiones

estables. En el mencionado trabajo estos autores describieron una zona estrecha de

estabilidad, que explicaron a partir de una hipótesis de cooperación entre los iones

calcio y el etanol. Medina-Torres et al. (2009) también estudiaron la influencia del

alcohol en la estabilidad y reología de emulsiones de caseinato de sodio con exceso

de proteína en solución con respecto a la necesaria para la cobertura completa de las

gotas con una monocapa de emulsificante. Encontraron que, dependiendo de las

concentraciones de alcohol y proteína, se podían encontrar emulsiones estables en

las que no se registraron cambios durante al menos 45 días de almacenamiento.

151

Eliot y Dickinson (2003) definieron una emulsión estable como aquella que

posee una distribución de tamaño de partícula monomodal, un comportamiento

reológico Newtoniano y que no crema o flocula en forma evidente en dos días.

Asimismo, hay consenso entre los distintos autores en que un tamaño de gota menor

conduce a mayor estabilidad. Como se muestra en las Tablas 4.5, 4.6 y 4.7, las

emulsiones con 20, 30 y 40% p/p de trehalosa en la fase acuosa poseen D4,3 menores y

distribuciones de tamaño de gota más angostas. Cabe destacar que el efecto sobre el

tamaño y el ancho de la distribución fue mayor a mayores concentraciones de

trehalosa y que los resultados hallados al analizar estos sistemas con el equipo

Turbiscan coinciden con los obtenidos con la técnica de DLS. De acuerdo con la

definición de Elliot y Dickinson (2003), las emulsiones con altas concentraciones de

trehalosa (30 y 40% p/p) y altas concentraciones de proteína (4,0 y 5,0% p/p)

resultaron estables.

Con el fin de retardar la desestabilización de emulsiones se utilizan

frecuentemente compuestos que aumenten la viscosidad de la fase acuosa entre los

que se puede mencionar agentes espesantes tales como polisacáridos e hidrocoloides.

Los experimentos de Medina-Torres et al. (2009) mostraron que el agregado de

algunos polisacáridos que no tienen actividad superficial, como la goma xántica a la

fase acuosa de emulsiones estabilizadas con caseinato de sodio, no afecta el tamaño

de gota medido por DLS.

Según los resultados obtenidos en este trabajo, la incorporación de trehalosa

provoca una disminución del tamaño de gota, lo que sugiere fuertemente que

ocurren interacciones entre la proteína y el disacárido. De acuerdo con Garti (2002),

se puede disminuir el tamaño de gota en una emulsión si a la misma se le agrega un

polisacárido en forma conjunta con la proteína durante la homogenización. De esta

forma se reduciría la velocidad de cremado siempre y cuando no ocurra floculación

por formación de puentes.

152

Las interacciones entre polisacáridos y proteínas se basan en la formación de

puentes de hidrógeno y las asociaciones dipolo-dipolo, en las cuales la presencia de

grupos oxidrilos (OH-) juega un rol fundamental. En el campo de la bioquímica se

pueden encontrar numerosos trabajos en los que se postula que las fuertes

interacciones que existen entre péptidos y oligosacáridos tienen un papel

protagónico en el reconocimiento de sitios receptores en proteínas (Walker et al.,

2009). Los trabajos publicados en estos sistemas señalan que hay numerosos

ejemplos de interacción azúcar-proteína.

Teniendo en cuenta las propiedades tan particulares con que cuenta la

trehalosa, es posible suponer que pueda actuar como coadyuvante en la formación de

micelas y que también tenga la capacidad de modificar la calidad del agua como

solvente, mejorando las interacciones proteína-agua, lo que redunda en un menor

tamaño de partícula y en emulsiones más estables.

A pesar de que la sacarosa es un monosacárido de estructura diferente a la

trehalosa (uniones C1-C4) y con distintas propiedades fisicoquímicas, parece

presentar el mismo efecto en la estabilidad de las emulsiones de NaCas. Belyakova et

al. (2003) han demostrado que en presencia de sacarosa a pH por encima del punto

isoeléctrico de la proteína, se produce una disociación de las sub-micelas de

caseinato, probablemente por formación de puentes de hidrógeno entre el caseinato

y la sacarosa. En los sistemas estudiados en este trabajo podría ocurrir algo similar.

Esta hipótesis concuerda con los resultados obtenidos al estudiar las emulsiones de

caseinato por microscopía confocal con barrido de láser, donde las imágenes tomadas

correspondien a microestructuras con una distibución de tamaño de partícula más

homogénea y con gotas de menor tamaño.

En las tablas 4.5, 4.6 y 4.7 se observa que el efecto de la trehalosa fue más

allá de la capacidad para formar soluciones viscosas ya que disminuyó los valores del

D4,3 en idénticas condiciones de procesamiento. No solamente la relación

153

aceite/proteína condiciona la estabilidad de estos sistemas sino que también las

interacciones entre las proteínas y los azúcares, analizadas en función del tamaño de

partícula, juegan un papel importante en los procesos de desestabilización. A partir

de nuestros resultados y de otros descriptos en la literatura, es evidente que la

estabilidad de las emulsiones de NaCas se ve fuertemente afectada por las

condiciones de procesamiento y la composición de la fase acuosa. La estructura de la

proteína y la interacción proteína-azúcar poseen una gran influencia en los procesos

de cremado y floculación ya que afectan de modo significativo la microestructura de

la emulsión, estrechamente relacionada con la estabilidad.

4.4. Estudio de la zona de estabilidad

Como fue previsto por la teoría de polímeros, una concentración de proteína

superior a la necesaria para producir floculación puede conducir a la estabilidad de

las emulsiones de NaCas. En nuestros estudios existió una clara estabilización del

sistema para concentraciones de proteína del 5,0% en presencia de azúcar. Estos

resultados constituyen la primera evidencia experimental que se ha publicado sobre

esta hipótesis.

Con el fin de explorar más detalladamente en qué rango se produce

estabilización, se prepararon soluciones con 4,5; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0% p/p de proteína

sin azúcar en la fase acuosa o con el agregado de 20, 30 o 40% p/p de trehalosa.

4.4.1. Tamaño de partícula

La Figura 4.23 muestra la distribución del tamaño de gota de emulsiones

formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, sin trehalosa agregada

y estabilizadas con distintas concentraciones de NaCas (4,5 – 7,0% p/p a-f). Al igual

que en las emulsiones preparadas con una concentración menor de NaCas (0,5 a 4,0%

p/p), todos los sistemas presentaron una distribución bimodal. Las distribuciones

154

Figura 4.23. Distribución de tamaños de partícula de emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, sin trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

mostraron un pequeño hombro a la derecha como ocurrió en el caso de las

emulsiones estabilizadas con 5,0% p/p de NaCas.

La Tabla 4.10 resume los valores de D4,3, %Vd1 y W obtenidos para las

emulsiones sin agregado de trehalosa a la fase acuosa. Los valores de D4,3, %Vd1 y de

W fueron muy pequeños y no variaron significativamente para ninguna de las

concentraciones de proteína analizadas, indicando que en las condiciones de

preparación seleccionadas para emulsiones sin azúcar este es el mínimo valor que se

puede obtener.

155

Tabla 4.10. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas),sin el agregado de trehalosa a la fase acuosa.

Concentración de

NaCas(% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

4,0 0,44 5,73 0,73

4,5 0,49 8,22 0,85

5,0 0,45 5,99 0,72

5,5 0,46 7,18 0,80

6,0 0,47 7,21 0,80

6,5 0,46 6,20 0,75

7,0 0,45 6,01 0,74 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

Las Figuras 4.24, 4.25 y 4.26 presentan las distribuciones obtenidas para

emulsiones con 20, 30 y 40% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa,

respectivamente. Las emulsiones preparadas con 20, 30 y 40 % p/p de azúcar

presentaron una distribución de tamaño de gota bimodal como en el caso de las

emulsiones sin azúcar, pero con menor desviación de la forma Gaussiana. Como

puede verse en las Figuras 4.24, 4.25 y 4.26 c-f el ancho de la distribución se reduce

ligeramente al aumentar el contenido de proteína. La Figura 4.26 f muestra una

distribución muy angosta y simétrica alrededor del diámetro medio (D4,3).

156

Figura 4.24. Distribución de tamaño de partícula de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, 20% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

157

Figura 4.25. Distribución de tamaño de partícula de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, 30% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

158

Figura 4.26. Distribución de tamaño de partícula de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase dispersa, 40% p/p de trehalosa agregada a la fase acuosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

159

Tabla 4.11. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) para las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas) y de trehalosa.

Concentración de

NaCas(% p/p)

D4,3a

(m)

%Vd1

(%)

W

(m)

Emulsiones con 20% p/p de trehalosa

4,0 0,42 3,68 0,61

4,5 0,37 2,83 0,52

5,0 0,35 1,17 0,45

5,5 0,36 2,44 0,50

6,0 0,34 1,70 0,45

6,5 0,32 1,25 0,41

7,0 0,32 1,12 0,39

Emulsiones con 30% p/p de trehalosa

4,0 0,35 1,18 0,44

4,5 0,30 0,79 0,35

5,0 0,30 0,63 0,36

5,5 0,29 0,55 0,32

6,0 0,28 0,59 0,30

6,5 0,28 0,53 0,30

7,0 0,27 0,51 0,29

Emulsiones con 40% p/p de trehalosa

4,0 0,31 0,84 0,36

4,5 0,24 0,00 0,23

5,0 0,29 0,00 0,33

5,5 0,22 0,00 0,16

6,0 0,21 0,00 0,15

6,5 0,21 0,00 0,15

7,0 0,21 0,00 0,14 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

La Tabla 4.11 resume los valores de D4,3, %Vd1 y W para las emulsiones con

trehalosa agregada a la fase acuosa. Al cuantificar estas distribuciones se encontró

160

que los valores de D4,3, %Vd1 y W disminuyeron significativamente con el aumento de

la concentración de proteína para una dada concentración de azúcar.

La incorporación creciente de trehalosa, en idénticas concentraciones de

proteína (Figuras 4.24, 4.25 y 4.26) generó una disminución en el ancho de la

distribución de tamaños de gota y una disminución de su diámetro medio en volumen

(D4,3), (Tabla 4.11). El promedio de los valores de D4,3 hallados para las emulsiones sin

trehalosa en el rango 4,0 – 7,0 de NaCas fue de 0,46, y disminuyó a 0,35; 0,30 y 0,24

para 20, 30 y 40% p/p de azúcar, respectivamente. Si bien estos valores son

cercanos, la tendencia indica una reducción con el agregado del disacárido. Las pre-

emulsiones correspondientes a estos sistemas procesados en una segunda etapa con

ultrasonido mostraron tendencias semejantes, aunque en esos casos las diferencias

con respecto al contenido de trehalosa fueron aún mayores: por ejemplo, para la

pre-emulsión estabilizada con 5,0% p/p de NaCas y cuya fase acuosa no poseía

azúcar, el D4,3 fue de 16 m. Cuando se preparó una pre-emulsión con la misma

cantidad de proteína pero agregando 20% p/p de trehalosa el valor de D4,3 fue de 12

m, significativamente menor.

El porcentaje de partículas de la distribución en volumen que poseen un

diámetro mayor a 1 m (%Vd1) también disminuyó con el agregado de azúcar hasta

reducirse a cero en casi todas las muestras con 40% p/p de trehalosa. El ancho de la

distribución (W), finalmente, también decreció con el aumento en la concentración

del disacárido (el promedio de W para todas las concentraciones de proteína

analizadas fue de 0,77; 0,48; 0,34 y 0,22 para 0, 20, 30 y 40% p/p trehalosa,

respectivamente). Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos

anteriormente, en los que se analizó el efecto del agregado de azúcar en el tamaño y

la distribución de partículas de las emulsiones.

161

4.4.2. Análisis por Turbiscan

La Figura 4.27 muestra los perfiles de retrodispersión en modo referencia

(BS%) en función de la altura del tubo para las emulsiones de la Figura 4.23. Para

todas las concentraciones de proteína se observó desestabilización por floculación,

excepto en el caso de la emulsión preparada con 6,0 % p/p de caseinato, que

permaneció estable durante una semana (Figura 4.27 d).

Figura 4.27. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, sin trehalosa añadida a la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p. La flecha roja indica el sentido del tiempo.

162

Las emulsiones preparadas sin trehalosa presentaron un intervalo de

estabilidad muy estrecho. Los sistemas con 5,5 y 6,5% p/p de NaCas se

desestabilizaron en mayor proporción que la de 6,0% p/p. Este comportamiento es

similar al informado en la literatura para las emulsiones de caseinato en presencia de

alcohol.

Los perfiles de retrodispersión de las emulsiones con 20% p/p de trehalosa

agregada para el mismo intervalo de NaCas (4,5-7,0% p/p) se muestran en la Figura

4.28. Las Figuras 4.29 y 4.30 presentan idénticas concentraciones de proteína con

30% y 40% p/p de trehalosa, respectivamente.

Los valores de BSav 0 (a t = 0, zona 20-50 mm) para los sistemas con 20% p/p de

trehalosa y concentraciones de NaCas de 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0% p/p fueron de

67,61%, 66,81%, 65,10%, 66,33%, 65,33% y 64,96%, respectivamente En el caso de

emulsiones con 30% p/p de trehalosa, se obtuvieron valores de BSav 0 de 55,22%,

55,17%, 55,16%, 56,05%, 54,03% y 53,62%, para las mismas concentraciones de

proteína. Finalmente, aquellas formulaciones constituidas con 40% p/p de trehalosa

presentaron BSav 0 de 42,55%, 39,80%, 39,94%, 37,64%, 37,06% y 37,14%. En todos los

casos los valores fueron significativamente menores que los obtenidos para los

mismos sistemas sin trehalosa y se observó además una dependencia inversa entre el

BSav 0 y la cantidad de azúcar incorporada: a medida que aumentó la proporción de

trehalosa disminuyó la retrodispersión a tiempo cero en la zona central de la

emulsión. Más aún, estos resultados concuerdan con la disminución secuencial del

D4,3 observado en la Tabla 4.10 al incrementarse desde 0% a 40% p/p la concentración

del azúcar.

En cuanto a los mecanismos de desestabilización, la emulsión preparada con

20% p/p de trehalosa y 4,5% p/p de caseinato de sodio presentó una desestabilización

por floculación (Figura 4.28 a), mientras que el resto de las emulsiones

permanecieron estables durante una semana (Figura 4.28 b-f), en lo que representa

163

una clara ampliación del intervalo de estabilidad con respecto a lo observado para

los mismos sistemas sin azúcar agregada.

Los sistemas con 30% y 40% de trehalosa, en tanto, no sufrieron

desestabilización para ninguna de las concentraciones de proteína analizadas (4,5 a

7,0% p/p). En el primer caso (30% p/p de azúcar) se observó estabilidad a partir de

4,5% p/p de proteína, mientras que para 40% p/p de trehalosa todos los sistemas a

partir de 3,0% p/p de caseinato resultaron estables.

Figura 4.28. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, 20% p/p de trehalosa añadida a la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p. La flecha roja indica el sentido del tiempo.

164

En síntesis, se obtuvo una ampliación del intervalo de estabilidad con el

aumento de concentración del azúcar, lo que indica que el efecto de la trehalosa en

el comportamiento de emulsiones estabilizadas con NaCas no puede ser despreciado

sino que, por el contrario, las interacciones azúcar/proteína son importantes en la

estabilidad de las emulsiones cuyas fases acuosas contienen ambos componentes.

Figura 4.29. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, 30% p/p de trehalosa añadida a la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p. La flecha roja indica el sentido del tiempo.

165

Figura 4.30. Perfiles de retrodispersión en modo referencia (BS) en función de la longitud del tubo a distintos tiempos de almacenamiento (las muestras fueron estudiadas durante una semana) en condiciones de reposo de emulsiones preparadas con concentrado de aceite de pescado al 10% p/p como fase dispersa, 40% p/p de trehalosa añadida a la fase acuosa y estabilizada con diferentes concentraciones de caseinato de sodio (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

A partir de los resultados publicados por nuestro laboratorio, Chen et al.

(2013) analizaron la estabilidad de emulsiones de aceite de colza ( = 0,25)

estabilizadas con fosvitina (5 mg/mL) y estudiaron el efecto del agregado de

trehalosa, glicerol y pectina (en concentraciones de 0,1% y 0,5% p/p) en la

estabilidad de esos sistemas. Encontraron que la adición del azúcar aumentó la

estabilidad de la emulsión, lo que no solamente confirma que la trehalosa posee un

166

efecto estabilizante en otros sistemas distintos a los estudiados en este trabajo de

tesis, sino que –además- la naturaleza de su influencia resulta semejante a la que

hemos planteado. En cuanto al mecanismo de acción, la trehalosa y el glicerol

modificarían la estructura de la proteína, mientras que la pectina que actuaría por

interacciones electrostáticas.

4.4.3. Microestructura

La Figura 4.31 muestra las imágenes obtenidas por microscopía confocal con

barrido de láser para las emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de

aceite de pescado, sin agregado de trehalosa en la fase acuosa, distintas

concentraciones de caseinato de sodio y mantenidas a 22,5°C durante 24 h. Las

microestructuras correspondientes a las emulsiones preparadas con 20%, 30% y 40%

p/p de trehalosa se presentan en las Figuras 4.32, 4.33 y 4.34, respectivamente.

Las muestras sin trehalosa, estabilizadas con 4,5% y 5,0% p/p de NaCas (parte

a y b de la Figura 4.31) presentaron agregados, y corresponden a sistemas que se

desestabilizan por floculación. La emulsión formulada con 6,0% p/p de caseinato, que

resultó ser la más estable según el análisis por Turbiscan, muestra una distribución

de partículas individuales de tamaño pequeño (Figura 4.31 d). En los sistemas con

5,5%, 6,5% y 7,0% p/p de proteína, en tanto, se observa una microestructura formada

por flóculos pequeños (Figura 4.31 c, e y f). Estos sistemas se desestabilizaron por

floculación pero en menor grado que los preparados con concentraciones de

caseinato de sodio de entre 2,0 y 5,0% p/p. La ausencia de flóculos grandes se debe a

que la desestabilización de estas emulsiones comienza más allá de las 24 h, que fue

el momento elegido para el análisis por microscopía confocal. Las emulsiones con

menor concentración de caseinato (4,5% y 5,0% p/p de NaCas, Figura 4.31 a y b), por

otra parte, presentan una significativa desestabilización durante el primer día de

167

almacenamiento, por lo que fue posible observar la formación de grandes agregados

apenas transcurridas las primeras 24 h.

Figura 4.31. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de láser (LSCM) de las emulsiones con 10%p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, sin agregado de trehalosa en la fase acuosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio, mantenidas a 22,5°C durante 24 horas: (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

168

Figura 4.32. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de láser (LSCM) de las emulsiones con 10%p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, 20% p/p trehalosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio, mantenidas a 22,5°C durante 24 horas: (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

169

Con el agregado de 20% p/p de trehalosa (Figura 4.32), se observan también los

resultados esperables de acuerdo al análisis por Turbiscan: los sistemas con 4,5% p/p

de NaCas muestran agregados (parte a de la Figura 4.32), en concordancia con la

desestabilización por floculación encontrada. El resto de las formulaciones (5,0% a

7,0% p/p de caseinato, Figura 4.32 b - f), que presentaron estabilidad durante una

semana, muestran una microestructura de gotas dispersas y ausencia de flóculos.

La Figura 4.33 muestra la morfología de las emulsiones preparadas con 30%

p/p de trehalosa. En todos los casos se observa una distribución de gotas dispersas,

sin formación de flóculos. El tamaño de gota presenta una disminución a medida que

aumenta la concentración de caseinato. Estos resultados están de acuerdo con el

análisis por Turbiscan, en el que todos estos sistemas resultaron estables.

Una situación análoga ocurre con las emulsiones formuladas con 40% p/p de

trehalosa (Figura 4.34), donde la microestructura muestra en todos los casos

partículas individuales, con ausencia de cualquier tipo de agregado. Estos sistemas se

mantuvieron estables durante una semana.

Las imágenes de las Figuras 4.33 y 4.34 muestran con claridad que el intervalo

de estabilidad es considerablemente mayor cuando las emulsiones presentan

trehalosa en la formulación que cuando no poseen azúcar. No se realizaron ensayos

con concentraciones de caseinato superiores a 7,0% p/p debido a que se trata de la

mayor cantidad de proteína que puede disolverse cuando la fase acuosa contiene 40%

p/p de trehalosa.

170

Figura 4.33. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de láser (LSCM) de las emulsiones con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, 30% p/p trehalosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio, mantenidas a 22,5°C durante 24 horas: (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

171

Figura 4.34. Imágenes tomadas con un microscopio confocal con barrido de láser (LSCM) de las emulsiones con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase lipídica, 40% p/p trehalosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio, mantenidas a 22,5°C durante 24 horas: (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p.

172

4.4.4. Evaluación de la desestabilización por floculación

La Figura 4.35 presenta la evaluación del grado de floculación, seguida por

cambios en la retrodispersión (BS) en la zona comprendida entre los 20 – 50 mm del

tubo, para las emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de

pescado; 0%, 20%, 30% y 40% p/p de trehalosa; y 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5% y 7,0%

p/p de NaCas.

En el caso de las emulsiones sin trehalosa agregada, hubo una única

concentración de caseinato para la cual no se registraron variaciones de la

retrodispersión en el tiempo: la correspondiente a 6,0% de NaCas (Figura 4.35 d,

línea celeste). Para todo el resto de las formulaciones, se encontró una variación

significativa de la BS con el tiempo: para la emulsión estabilizada con 4,5% p/p de

caseinato, se observó una disminución de la retrodispersión del 8% en las primeras 21

h de almacenamiento, que luego alcanzó un valor asintótico constante (Figura 4.35 a,

línea celeste). Para 5,0% de proteína, se encontró una disminución brusca en la BS de

4% a las 14 h y, para tiempos más largos, se observó una disminución continua pero

suave durante 100 h (Figura 4.35 b, línea celeste). Al incorporar 5,5% p/p de NaCas la

retrodispersión disminuyó aproximadamente un 2% en las primeras 23 h, y continuó

decreciendo hasta las 44 h (BS = 3%), momento a partir del cual se produjo una caída

brusca de la BS, ya que en 52 h alcanzó un valor de 9%. Desde allí y hasta las 100

horas se produjo una meseta en alrededor de un valor de retrodispersión de 10%

(Figura 4.35 c, línea celeste). Con 6,5% p/p de caseinato la emulsión presentó una

disminución menor al 2% de la BS durante 89 horas, desde donde comenzó a caer

abruptamente hasta registrar un valor de BS de 6% a las 100 h (Figura 4.35 e, línea

celeste).

173

Fig 4.35. Variación de la retrodispersión (BS) en la zona 20-50 mm de la muestra monitoreada durante 100 h, para emulsiones almacenadas en reposo a 22,5°C. Las emulsiones fueron formuladas con aceite de pescado como fase dispersa y diferentes concentraciones de NaCas: (a) 4,5% p/p, (b) 5,0% p/p, (c) 5,5% p/p, (d) 6,0% p/p, (e) 6,5% p/p y (f) 7,0% p/p. Largo del tubo: 65 mm. Celeste: sin trehalosa, bordó: con 20% p/p de trehalosa, verde: con 30% p/p de trehalosa, violeta: con 40% p/p de trehalosa.

Por último, con la mayor concentración de proteína agregada (7% p/pNaCas,

Figura 4.35 f, línea celeste) no se observaron diferencias significativas en los valores

de retrodispersión durante 49 horas. A continuación se produjo un marcado

decrecimiento que generó valores de BS cercanos al 8%, para luego volver a subir

hasta valores positivos de retrodispersión.

Los sistemas con 20% p/p de azúcar y concentraciones de 5,0% a 7,0% p/p de

NaCas no exhibieron cambios significativos en la BS con el tiempo. La diferencia

174

entre BSav t y BSav 0 arrojó valores dentro del error del método (menores a 1%, Figura

4.35 b - f, línea bordó). En cambio, en los sistemas con 4,5% p/p de proteína se

observó una disminución de la retrodispersión del 3% en las primeras 20 horas de

almacenamiento (Figura 4.35 a, línea bordó). A tiempos más largos los valores de BS

alcanzaron un valor asintótico que se mantuvo constante hasta las 100 h.

Las emulsiones con 30% y 40% p/p de trehalosa no presentaron variaciones

significativas en la retrodispersión con el tiempo para ninguna de las concentraciones

de proteína analizadas. La cuantificación de la desestabilización por floculación en

este rango de concentraciones de NaCas también pone de manifiesto el efecto

estabilizador de la trehalosa.

4.5. Análisis de la estabilidad global

La Tabla 4.12 resume los resultados obtenidos en el análisis de estabilidad de

todas las emulsiones preparadas con Ultrasonido estudiadas en este trabajo.

Se observa que los sistemas estabilizados con las menores concentraciones de

caseinato (0,5 y 1,0% p/p) sufren, invariablemente, una desestabilización por

cremado para todos los contenidos de trehalosa. Es probable que este

comportamiento tenga su origen en la baja cantidad de estabilizante, insuficiente

para cubrir la interfase de las gotas de aceite.

Al aumentar el contenido de proteína a 2,0% p/p, aparece la floculación como

nuevo mecanismo de desestabilización, que ocurre luego del cremado inicial para los

sistemas con 0, 20 y 30% p/p de trehalosa (mecanismo mixto). Con 40% p/p de

azúcar, en tanto, sólo se observa un ligero cremado. Con 3,0% p/p de emulsificante,

el efecto estabilizador de la trehalosa es aún más manifiesto en los sistemas con 40%

p/p de azúcar. A partir de 3,0% p/p y para todas las concentraciones de NaCas

estudiadas las emulsiones con 40% p/p de trehalosa resultaron estables.

175

Tabla 4.12. Estabilidad de las emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y distintas concentraciones de trehalosa y caseinato de sodio, analizadas durante una semana a 22,5°C. % p/p

NaCas

% p/p trehalosa

0 20 30 40

0,5 cremado cremado cremado cremado

1,0 cremado cremado cremado cremado

2,0 Cremado + floculación Cremado + floculación Cremado + floculación cremado

3,0 floculación floculación floculación estable

4,0 floculación floculación floculación estable

4,5 floculación floculación estable estable

5,0 floculación estable estable estable

5,5 floculación estable estable estable

6,0 estable estable estable estable

6,5 floculación estable estable estable

7,0 floculación estable estable estable

En general, las emulsiones con 40% de trehalosa resultaron mucho más

estables que las emulsiones sin azúcar para todas las concentraciones de NaCas

seleccionadas. Para formulaciones con menores contenidos de azúcar y 3,0 y 4,0%

p/p de caseinato, las emulsiones resultan menos estables, y el principal mecanismo

de desestabilización fue la floculación.

Como en el caso de 40% p/p de azúcar para 20 y 30% p/p de trehalosa se

encuentra también un intervalo de estabilidad pero se produce a mayores contenidos

de NaCas a medida que disminuye la cantidad de disacárido: mientras que con 30%

p/p de trehalosa las emulsiones son estables en el rango de 4,5 – 7,0% p/p de NaCas,

con 20% p/p de trehalosa el rango disminuye a 5,0 – 7,0% p/p de proteína.

El rango de estabilidad más angosto se encuentra en las dispersiones

preparadas sin azúcar, donde se obtiene una única emulsión estable, conformada con

6,0% p/p de caseinato de sodio. El resto de las formulaciones se desestabilizaron por

floculación.

176

En general, el aumento en la concentración de emulsificante generó sistemas

más estables, a excepción de aquellas formuladas sin azúcar, donde aparece un

punto de estabilidad y no un rango.

Con respecto al efecto de la trehalosa, el aumento en la concentración del

disacárido no solamente produjo emulsiones más estables sino que generó

dispersiones con menores tamaños de gota, lo que indica que su influencia va más

allá de su capacidad para aumentar la viscosidad de la fase continua y manifiesta la

presencia de interacciones proteína-azúcar.

177

5. Resultados y Discusión: Polvos liofilizados

La experiencia es engañosa: nos enseña que alguna vez ya hicimos esto que

estamos haciendo ahora. Nada más falso. Todo ocurre por primera vez.

Pablo De Santis, El enigma de París

5.1. Análisis de los polvos liofilizados

5.1.1. Tamaño de partícula

La Figura 5.1 muestra la distribución de tamaños de gota de las emulsiones de

concentrado de aceite de pescado preparadas con 20% p/p de trehalosa y

estabilizadas con distintas concentraciones de caseinato de sodio, de las mismas

emulsiones congeladas y descongeladas y de los polvos deshidratados preparados a

partir de esas emulsiones y reconstituidos de manera tal de obtener la composición

original. La Figura 5.2 presenta los resultados obtenidos para las emulsiones

formuladas con 30% p/p de trehalosa. La Tabla 5.1 resume el diámetro medio de la

distribución expresada en volumen (D4,3), el porcentaje de partículas de la

distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y el ancho de

la distribución (W) para todos los sistemas presentados en las Figuras 5.1 y 5.2.

Las emulsiones preparadas con 20% p/p de trehalosa y 0,5%, 2,0% y 5,0% p/p

de proteína, medidas inmediatamente después de su preparación (Figura 5.1, líneas

celestes) mostraron una distribución con un pico mayoritario y un marcado hombro a

la derecha, correspondiente a una población de mayor tamaño. Al aumentar la

concentración de emulsificante dicha población disminuyó, aumentando la

proporción de partículas con menor tamaño. En la Tabla 5.1 puede observarse la

disminución de los parámetros D4,3, %Vd1 y W para estos sistemas, a medida que

aumenta la proporción de NaCas.

178

Figura 5.1. Distribución de tamaños de gota de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase grasa, 20% p/p de trehalosa y (a) 0,5% p/p de NaCas; (b) 2,0% p/p de NaCas y (c) 5,0% p/p de NaCas. Se evaluaron las emulsiones inmediatamente después de preparadas (línea celeste), descongeladas luego de haber sido congeladas (línea bordó) y los polvos deshidratados reconstituidos con agua en las proporciones de la formulación inicial (línea verde).

179

Figura 5.2. Distribución de tamaños de gota de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado como fase grasa, 30% p/p de trehalosa y (a) 0,5% p/p de NaCas; (b) 2,0% p/p de NaCas y (c) 5,0% p/p de NaCas. Se evaluaron las emulsiones inmediatamente después de preparadas (línea celeste), descongeladas luego de haber sido congeladas (línea bordó) y los polvos deshidratados reconstituidos con agua en las proporciones de la formulación inicial (línea verde).

180

Tabla 5.1. Diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3), porcentaje de partículas de la distribución en volumen que tienen un diámetro mayor a 1 m (%Vd1) y ancho de la distribución (W) de las emulsiones formuladas con 10% en peso de concentrado de aceite de pescado como fase grasa, 20 o 30% p/p de trehalosa (T) y 0,5; 2 o 5% p/p de caseinato de sodio (NaCas). Se evaluaron las emulsiones inmediatamente después de preparadas, descongeladas luego de haber sido congeladas y los polvos deshidratados reconstituidos con agua en las proporciones de la formulación inicial.

Emulsión

Muestra D4,3(m) %Vd1(%) W(m)

20 T 0,5 NaCas 0,78 11,15 0,98

20 T 2,0 NaCas 0,54 11,37 0,98

20 T 5,0 NaCas 0,42 6,37 0,74

30 T 0,5 NaCas 0,62 15,17 1,18

30 T 2,0 NaCas 0,46 5,92 0,74

30 T 5,0 NaCas 0,32 1,09 0,39

Congelada/descongelada

Muestra D4,3(m) %Vd1(%) W(m)

20 T 0,5 NaCas 0,72 19,90 1,30

20 T 2,0 NaCas 0,53 11,15 0,98

20 T 5,0 NaCas 0,44 9,31 0,76

30 T 0,5 NaCas 0,64 15,76 1,20

30 T 2,0 NaCas 0,51 6,47 0,76

30 T 5,0 NaCas 0,32 1,20 0,39

Polvos deshidratados reconstituidos

Muestra D4,3(m) %Vd1(%) W(m)

20 T 0,5 NaCas 3,03 45,77 10,13

20 T 2,0 NaCas 1,15 22,67 2,23

20 T 5,0 NaCas 0,51 11,27 1,00

30 T 0,5 NaCas 26,09 82,82 48,30

30 T 2,0 NaCas 5,68 52,48 15,08

30 T 5,0 NaCas 1,86 31,45 4,59 a Valores de D4,3 que difieran en más de 0.20 m son significativamente diferentes aplicando el test t-de Student (p<0.05).

En el caso de las emulsiones que sufrieron un proceso de congelado y

descongelado (Figura 5.1, líneas bordó), se observó un comportamiento similar con

muy poca variación en todos los parámetros analizados: el valor del diámetro medio

181

de las emulsiones no varió significativamente entre las emulsiones recién preparadas

y las congeladas y descongeladas; el parámetro %Vd1 presentó un leve aumento con

respecto a las dispersiones originales para 0,5% p/p de proteína. Para esta misma

emulsión, el ancho de la distribución (W) registró un muy pequeño incremento en la

emulsión congelada y posteriormente descongelada, en relación a la emulsión de

partida. Esto significa que estos sistemas fueron estables al congelamiento y

descongelamiento independientemente de la concentración de la proteína. Cuando

una emulsión O/W se enfría, pueden ocurrir una variedad de procesos fisicoquímicos

como por ejemplo la cristalización de la materia grasa, formación de hielo,

concentración por congelación, transiciones de fase en la interfase y cambios

conformacionales del biopolímero (McClements, 2004). En este trabajo la fase

lipídica empleada es líquida por encima de -40°C. Por lo tanto el único cambio de

estado que se produce es la congelación del agua. El tratamiento al que se

sometieron las emulsiones (congelado/descongelado) produce desestabilización en

muchas emulsiones alimentarias. Para que la emulsión conserve las características

iniciales luego de descongelar es necesario que se mantenga la integridad de la

película interfacial a través de esos procesos (Palazolo et al., 2011). De la misma

manera que las emulsiones de NaCas y girasol estudiadas por Palazolo et al. (2011),

nuestros sistemas permanecieron inalterados como se desprende de los perfiles de

distribución de tamaño de gota. De acuerdo con estos autores, otras proteínas como

los aislados de soja nativos y desnaturalizados no presentan dicha propiedad.

Los polvos liofilizados, por el contrario, mostraron diferencias muy

significativas entre las emulsiones congeladas y luego descongeladas y las emulsiones

originales. Los sistemas deshidratados a partir de emulsiones con 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado, 0,5 % p/p de NaCas y 20% p/p de trehalosa

(Figura 5.1 a, línea verde) presentaron una distribución bimodal con un D4,3 de 3,034,

más de cuatro veces mayor que el obtenido para las emulsiones originales y las

182

congeladas y luego descongeladas. Un fenómeno análogo se observó para el caso de

los sistemas con 2,0% p/p de proteína (Figura 5.1 b, línea verde), donde la

distribución de tamaño de partícula presentó una forma trimodal, con un aumento

significativo de los parámetros D4,3, %Vd1 y W, aunque levemente inferior al

registrado con 0,5% de NaCas.

En el caso de los polvos deshidratados preparados a partir de 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado, 5,0 % p/p de NaCas y 20% p/p de trehalosa

(Figura 5.1 c), la distribución de tamaño de partícula de la emulsión, reconstituida

adicionando al polvo la cantidad de agua necesaria para obtener la misma

composición que la emulsión original, presentó diferencias muy poco significativas

con respecto a los resultados obtenidos para las emulsiones originales y las

congeladas y luego descongeladas. El D4,3 fue 0,507m, mientras que para las

emulsiones originales fue 0,421 m y para las congeladas y luego descongeladas

0,435 m. El ancho de la distribución (W) tampoco varió significativamente, a

diferencia de lo observado para los sistemas con idéntico contenido de azúcar y

menores proporciones de proteína.

La emulsión preparada con 30% de trehalosa y 0,5% p/p de NaCas presentó

una distribución de tamaño monomodal con un pequeño hombro a la derecha (Figura

5.2 a, línea celeste) y un D4,3 de 0,620m, ligeramente menor al obtenido para la

emulsión con la misma concentración de NaCas pero con 20% p/p de azúcar. Los

parámetros %Vd1 y W, sin embargo, fueron mayores para la emulsión con 30% p/p de

trehalosa que para la preparada con 20% p/p. Si bien estas diferencias fueron

significativas, resultaron muy pequeñas para esperar cambios en el comportamiento

de estabilidad asociados a cambios en D4,3, %Vd1 y/o W. Al incrementar la

concentración de proteína a 2,0% el hombro, correspondiente a partículas de mayor

tamaño, disminuyó significativamente hasta desaparecer en las emulsiones con 5,0%

p/p de NaCas (Figura 5.2 b y c, respectivamente). En la Tabla 5.1 puede observarse

183

la disminución de los parámetros D4,3, %Vd1 y W a medida que aumenta el contenido

de proteína para estos sistemas. En comparación con las emulsiones preparadas con

20% p/p de trehalosa, estas dos emulsiones (Figuras 5.2 b y c) presentan D4,3, %Vd1 y

W menores.

Los sistemas congelados y descongelados con 30% p/p de azúcar y distintas

concentraciones de proteína (Figura 5.2, línea bordó) presentan distribuciones

prácticamente idénticas a las obtenidas para las emulsiones recién preparadas por lo

que sus distribuciones se superponen en los gráficos. Tampoco se observaron

diferencias significativas en los parámetros analizados en la Tabla 5.1. Estos

resultados concuerdan con los de las emulsiones con 20% p/p de azúcar, indicando

que para esta concentración de trehalosa (30% p/p) el tratamiento

congelado/descongelado tampoco afectó la película de caseinato interfacial y sería

esperable que no se produjeran cambios en la microestructura de las emulsiones

durante el proceso de congelación.

Para el caso de las emulsiones obtenidas al reconstituir los polvos liofilizados

a partir de emulsiones con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 30% p/p de

trehalosa y todas las concentraciones de NaCas (Figura 5.2, línea verde) se encontró

un cambio notorio con respecto a los resultados arrojados al analizar las emulsiones

originales y las congeladas y luego descongeladas con idéntica composición. En el

caso de la emulsión con 0,5% p/p de proteína, la distribución fue bimodal, con

preminencia de la población de mayor tamaño (Figura 5.2 a). Al aumentar el NaCas a

2,0% p/p (Figura 5.2 b), ambas poblaciones se presentaron con la misma proporción

en volumen, mientras que con la máxima concentración de NaCas analizado (5,0%

p/p, Figura 5.2 c) la población con partículas de menor tamaño fue mayoritaria. Se

observó un aumento significativo del diámetro medio de la distribución expresada en

volumen (D4,3): unas 4,3 veces para 0,5% p/p de NaCas, 1,1 veces para 2,0% p/p de

NaCas y 0,6 veces para 5,0% p/p de NaCas con respecto a las emulsiones sin liofilizar.

184

El ancho de la distribución (W) también registró una variación muy significativa y fue,

en todos los casos, superior a la encontrada para polvos preparados con 20% p/p de

trehalosa, a igual contenido de proteína.

Por otra parte, la mayoría de los parámetros de distribución obtenidos (D4,3,

%Vd1 y W) para las emulsiones originales y las congeladas y descongeladas

preparadas con 30% p/p de azúcar fueron menores que los obtenidos para los

sistemas con 20% p/p de trehalosa, en concordancia con los resultados presentados

en el capítulo 4, en el que se mostró que el aumento en la cantidad de azúcar genera

emulsiones con gotas de menor tamaño y distribuciones más angostas. La única

formulación que no presentó variaciones significativas luego del proceso de

liofilización fue la emulsión preparada con 10% p/p de concentrado de aceite de

pescado, 20% p/p de trehalosa y 5,0% de NaCas. En esta emulsión en particular el

film de proteína interfacial mantuvo sus características aún después de liofilizar y

reconstituir la emulsión original a partir del polvo deshidratado.

5.1.2. Comportamiento térmico

La Figura 5.3 presenta los diagramas de calorimetría diferencial de barrido

(DSC) para polvos deshidratados preparados a partir de soluciones con 20% y 30% p/p

de trehalosa, donde se observa una importante transición endotérmica

correspondiente a la fusión del azúcar a 97,2 1,1°C y 97,4 0,9°C,

respectivamente. El cálculo del grado de cristalización (DC) a partir de la entalpía de

fusión de dicha transición y el empleo de la ecuación [3.5] arrojó valores promedio

de 5,0% y 8,1% para cada uno de los polvos, respectivamente. El grado de

cristalinidad que presentaron estas soluciones liofilizadas permite considerar que la

trehalosa se encuentra mayoritariamente amorfa en estas condiciones.

185

Figura 5.3.Diagramas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de polvos liofilizados a partir de soluciones de (a) 20% p/p de trehalosa y (b) 30% p/p de trehalosa.

La Figura 5.4 presenta los diagramas de calorimetría diferencial de barrido para

los polvos deshidratados preparados a partir de emulsiones con 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado, 20% y 30% p/p de trehalosa y 0,5%, 2,0% y 5,0%

p/p de NaCas. En los diagramas de DSC se observa que en el caso de los polvos

formulados a partir de 20% p/p de trehalosa y 0,5% y 2,0% p/p de NaCas el pico de

fusión del azúcar es significativamente mayor que en el resto de los polvos, lo que se

refleja también en el GC obtenido, el mayor de entre todos los sistemas. Los polvos

liofilizados a partir de 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de proteína, en tanto,

presentan el pico de fusión más pequeño entre todos los analizados. En este sistema,

186

como el grado de cristalinidad es muy bajo, es posible observar también otra

endoterma, correspondiente a la temperatura de transición vítrea (Tg) del azúcar,

que se produce alrededor de los 50°C (Figura 5.5).

Figura 5.4.Diagramas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de polvos liofilizados a partir de emulsiones preparadas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado; (a), (b) y (c) 20% de trehalosa; (d), (e) y (f) 30% de trehalosa; (a) y (d) 0,5% p/p de caseinato de sodio (NaCas), (b) y (e) 2,0% p/p de NaCas y (c) y (f) 5,0% p/p de NaCas.

187

Figura 5.5. Ampliación del diagrama de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de polvos liofilizados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de NaCas. La Tg onset fue de 45,54 0,6°C y la Tg endset de 54,48 0,8° C.

La Figura 5.5 muestra una ampliación de la zona donde se registró la

transición vítrea. Si bien esta transición es muy pequeña y podría atribuirse a ruido

en la línea de base, su existencia se puede confirmar enfriando la muestra en la

misma cápsula inmediatamente después de fundida a velocidad rápida (20°C/min). Si

la transición reaparece en la misma posición, se puede tener cierta certeza de que se

trata de una transición vítrea. Este fenómeno no se produce cuando se trata de

señales provocadas por ruido de la línea de base. Por otra parte, se observa que la

caída de la Cp está registrada por una línea sin ondulaciones. Este polvo es el único

donde se pudo detectar una Tg, mientras que en el resto de los sistemas el grado de

cristalinidad fue suficientemente elevado como para que no se registre el

comportamiento térmico de la porción del azúcar que se encuentra amorfa.

188

Tabla 5.2. Temperaturas de pico (°C), entalpías (J/g) y grado de cristalización (%) de las soluciones de trehalosa liofilizadas y de los polvos liofilizados preparados a partir de emulsiones.

Muestra Temperatura de pico

(°C)

Entalpía

(J/g)

Grado de cristalización

(%)

Trehalosa 20%p/p 97,2 1,1 7,4 0,2 5,0

Trehalosa 30% p/p 97,4 0,9 12,7 0,1 8,1

0,5% p/p NaCas 20% p/p T 99,5 2,0 30,2 1,7 20,3

2,0% p/p NaCas 20% p/p T 99,3 1,7 22,2 1,1 14,9

5,0% p/p NaCas 20% p/p T 99,0 1,8 3,5 0,1 2,4

0,5% p/p NaCas 30% p/p T 95,9 2,2 14,9 0,2 10,0

2,0% p/p NaCas 30% p/p T 98,8 0,7 14,7 0,6 9,9

5,0% p/p NaCas 30% p/p T 99,0 0,8 12,6 0,2 8,4

Grado de Cristalización: ΔHm/ΔHT x 100, donde ΔHm es el área de la endoterma de fusión de una muestra dada y ΔHT es el área correspondiente a la endoterma de fusión de la trehalosa pura (149 J/g).

La Tabla 5.2 resume las temperaturas de pico, entalpías y grado de

cristalización para todos los sistemas deshidratados. Las muestras con 20% p/p de

trehalosa presentaron un menor grado de cristalización al aumentar la concentración

de NaCas. Los polvos formulados a partir de emulsiones con 20% p/p de trehalosa y

5,0% p/p de NaCas presentan el menor grado de cristalización (2,4%) de los 6 polvos

analizados. Dicho de otra forma, se trata del polvo que presentó el mayor porcentaje

de trehalosa amorfa.

5.1.3. Contenido de agua

La Tabla 5.3 resume el contenido de agua expresado en porcentaje (%) en

base seca de los 6 sistemas deshidratados que se estudian en esta sección. Los polvos

preparados a partir de las emulsiones con 30% p/p de trehalosa presentaron

contenidos de agua menores que los obtenidos a partir de las emulsiones con 20% p/p

de azúcar para la misma concentración de proteína. Esto correlacionó con un menor

grado de cristalización en comparación con los polvos que contenían 20% p/p de

trehalosa y 0,5% y 2% p/p de Nacas. Sin embargo, el polvo preparado a partir de la

189

emulsión con 30% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de NaCas presentó un grado de

cristalización mayor que el polvo con la misma cantidad de caseinato pero con 20%

p/p de trehalosa. Esto indica que el contenido de agua no es el único factor

relacionado con el porcentaje de azúcar cristalizado y que la presencia de otros

componentes como el NaCas debe influir en la cristalización de la trehalosa.

De acuerdo con numerosos autores (Buera et al., 2005), los azúcares que

forman cristales anhidros como la sacarosa y lactosa pueden cristalizar a

temperatura ambiente después de adsorber la cantidad de agua necesaria para

disminuir la Tg por debajo de la temperatura ambiente (esto ocurre con contenidos

de agua de alrededor de 3 a 4% para sacarosa y 5% para lactosa, en base seca). Los

azúcares que forman cristales hidratados (dihidrato de trehalosa, tri, tetra y

pentahidratos de rafinosa) retienen mayor cantidad de agua (alrededor de 10-12%, en

base seca) sin cristalizar porque necesitan no solo el contenido de agua necesario

para llevar la Tg a un valor inferior al de la temperatura ambiente sino que también

necesitan suficiente agua para formar cristales dihidratados. Claramente en nuestros

sistemas no es necesario tener contenidos de agua tan elevados para que se produzca

cristalización.

Tabla 5.3. Contenido de agua (% en base seca) de polvos deshidratados preparados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes proporciones (% p/p) de trehalosa (T) y caseinato de sodio (NaCas).

Muestra 0,5% NaCas 2,0% NaCas 5,0% NaCas

20% T 7,13 0,71 4,93 1,32 5,73 0,67

30% T 2,99 1,90 3,80 1,40 3,16 1,47

190

5.1.4. Grado de cristalinidad de los polvos

Para confirmar los resultados obtenidos por calorimetría diferencial de barrido

(DSC) se caracterizaron los polvos liofilizados por difracción de Rayos X (DRX). La

Figura 5.6 muestra los difractogramas de Rayos X de los polvos cuyos diagramas de

DSC se presentaron en la Figura 5.4. La técnica de rayos X se ha empleado en forma

cualitativa para confirmar la cristalización de la trehalosa ya que de acuerdo con lo

publicado en la literatura la misma no debería ocurrir en estas condiciones. Por otra

parte como el grado de cristalización es bajo los espectros muestran variaciones con

la cantidad de muestra y menor reproducibilidad que los diagramas obtenidos por

DSC. Por esta razón la cuantificación se realizó solamente por esta última técnica.

En todos los diagramas de difracción se registró una señal muy intensa a 3,7 Å

(siendo = 1,5406 Å) y otras menos intensas correspondientes a la cristalización del

azúcar (Álvarez Cerimedo et al., 2008), excepto en el caso de los polvos liofilizados

a partir de 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de caseinato. Dichos polvos presentaron

un diagrama de DRX que indicó que el polvo era mayoritariamente amorfo, y donde

las señales debidas a la cristalización del azúcar no se detectaron como ocurrió en el

resto de las formulaciones. Estos resultados concuerdan con el bajo grado de

cristalización (DC) obtenido por calorimetría diferencial de barrido.

191

Figura 5.6. Patrón de difracción de Rayos X de los polvos liofilizados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y (a) 20% p/p de trehalosa y 0,5% p/p de caseinato de sodio; (b) 20% p/p de trehalosa y 2,0% p/p de caseinato de sodio; (c) 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de caseinato de sodio; (d) 30% p/p de trehalosa y 0,5% p/p de caseinato de sodio; (e) 30% p/p de trehalosa y 2,0% p/p de caseinato de sodio y (f) 30% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de caseinato de sodio.

La Figura 5.7 presenta el porcentaje de cristalización de los polvos en función

del contenido de emulsificante para las dos concentraciones de trehalosa

seleccionadas. Se puede ver que para los polvos preparados a partir de emulsiones

con 30% p/p de trehalosa existe muy poca variación en el grado de cristalización en

el rango 0,5% a 5,0% p/p de proteína, donde el DC oscila desde 8,5 a 10%. El

comportamiento de los polvos preparados a partir de 20% de azúcar es más complejo:

192

el grado de cristalización presenta un máximo para 0,5% p/p de caseinato (DC =

20,3%) y luego disminuye rápidamente hasta alcanzar el valor más bajo entre todos

los polvos analizados (DC = 2,3%).

Una posible explicación para el comportamiento presentado por los polvos

preparados con 20% p/p de trehalosa es que la presencia de la proteína impidió la

cristalización del azúcar. Existen numerosos trabajos en la literatura que describen el

efecto de diversos compuestos en la cristalización de azúcares y que muestran como

la co-cristalización de los mismos con algún azúcar disminuye el grado de

cristalización y la velocidad del proceso por efecto sobre la nucleación del azúcar

(Kedward et al., 1998; Gabarra y Hartel, 1998; Mazzobre et al., 2001; Bhandari y

Hartel, 2002; Buera et al., 2005; Schebor et al., 2010).

Figura 5.7. Grado de cristalización (%) en función del contenido de caseinato (% p/p) para polvos liofilizados a partir de emulsiones con 20% p/p de trehalosa (línea celeste) y 30% p/p de trehalosa (línea bordó).

193

Es probable que en el caso de los polvos preparados con 30% p/p de azúcar se

necesite una concentración de proteína mayor para obtener el mismo efecto sobre la

nucleación y que por esta razón el grado de cristalinidad se mantenga prácticamente

constante. Para estos tres polvos el contenido de agua es muy similar y parece ser el

factor principal que afecta la cantidad de azúcar cristalizado.

Buera et al. (2005) han reportado para diversos sistemas que los azúcares en

estado amorfo suelen ser muy higroscópicos y pueden absorber grandes cantidades de

agua desde los alrededores, mientras que las matrices cristalinas presentan menores

contenidos de agua. En este trabajo, sin embargo, se observó que todos los polvos

liofilizados a partir de dispersiones con 30% p/p de azúcar presentaron menores

contenidos de agua que los polvos con 20% p/p de trehalosa (Tabla 5.3). Para estos

polvos el grado de cristalinidad, cuyo promedio fue de 9,4%, resultó menor que para

los polvos preparados con 20% p/p de trehalosa a excepción del preparado con 5,0%

de NaCas. El único polvo amorfo, preparado en base a una emulsión con 20% p/p de

trehalosa y 5,0% p/p de caseinato, tuvo un contenido de agua mayor que los polvos

con 30% p/p de azúcar y menor que los polvos con 20% p/p de azúcar y 0,5% y 2,0%

p/p de Nacas, en los que el azúcar cristalizó en un grado detectable por DRX. Esta

muestra de contenido de agua intermedio tuvo el menor DC (2,3%). Nuevamente este

análisis parece indicar que en nuestros sistemas el contenido de agua no es la

variable que determina el grado de cristalinidad en todos los casos, sino que en el

caso de 20% p/p de trehalosa otros factores como las interacciones caseína-trehalosa

son muy importantes. Por otra parte, las condiciones de proceso como la eficiencia

de la liofilización pueden ser también responsables del comportamiento de algunos

de estos sistemas.

194

5.1.5. Eficiencia de encapsulación

La eficiencia de encapsulación para todos los polvos deshidratados se

determinó a través del aceite extraído por lavado de cada polvo con n-hexano luego

de la liofilización. Esta grasa, liberada de las matrices y expresada como porcentaje

del contenido inicial de fase lipídica, indica el grado en que la fase dispersa fue

encapsulada en cada caso. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5.4.

Estos valores fueron confirmados extrayendo el aceite encapsulado en los polvos

lavados como se explicó en la sección Materiales y métodos.

Los polvos formulados a partir de emulsiones con 10% p/p de concentrado de

aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de NaCas presentaron la mayor

eficiencia de encapsulación (79,4 0,9%). El resto de las formulaciones presentaron

pobres propiedades encapsulantes (Tabla 5.4), aunque es posible hacer una distinción

entre aquellas obtenidas mediante dispersiones con 20 y 30% p/p de trehalosa: las

primeras presentaron, en conjunto, mayores eficiencias que las segundas.

Entre los factores primarios que determinan la eficiencia del proceso de

encapsulación se encuentran las propiedades de los materiales de pared y del núcleo

como también las características de la emulsión y los parámetros de secado en el

caso de spray-drying (de Vos et al., 2010). En el caso de nuestros sistemas depende

también de la eficiencia del proceso de liofilización.

Tabla 5.4. Porcentaje de retención en la matriz de polvos deshidratados preparados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado y diferentes proporciones (% p/p) de trehalosa (T) y caseinato de sodio (NaCas).

Muestra 0,5% NaCas 2,0% NaCas 5,0% NaCas

20% T 26,8 2,0 41,0 1,0 79,4 0,9

30% T 1,0 0,1 11,5 0,6 18,8 0,3

195

Pueden encontrarse en bibliografía numerosos estudios pioneros que analizan

la retención de compuestos encapsulados en función de las características de las

moléculas dispersas (Rulkens y Thijssen, 1972; Reineccius, 1988), de las matrices

utilizadas (Inglett et al., 1988; McNamee et al., 1998; McNamee et al., 2001) de la

composición de la emulsión (Risch y Reineccius, 1988; Soottitantawat et al., 2003),

de las condiciones de liofilización (Rulkens y Thijssen, 1972; Chang et al., 1988;

Rosenberg et al., 1990; Bhandari et al., 1992; Finney et al., 2002), y de la

morfología del polvo durante y después del secado (Moreau y Rosenberg, 1996). En

estos resultados es clara la importancia de las concentraciones de los distintos

componentes del polvo, así como también el porcentaje de materia sólida es

fundamental para la eficiencia de liofilización.

En estos últimos años se ha hecho hincapié en las propiedades de la emulsión

antes del secado, particularmente en el tamaño de gota de la dispersión. Muchos

autores destacaron la importancia de la preparación de emulsiones finas antes del

secado por pulverización (Risch y Reineccius, 1988; Sheu y Rosenberg, 1995;

Soottitantawat et al., 2003) y se ha sugerido que la reducción en el tamaño de gota

de las emulsiones de partida permite la obtención de polvos con mayores eficiencias

de retención (Jafari et al., 2008). En efecto, los resultados obtenidos en este

trabajo muestran que los polvos liofilizados a partir de emulsiones con 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado y 20% o 30% p/p de trehalosa presentan una mayor

retención a medida que disminuye el tamaño de gota de la dispersión original. Más

aún: para los sistemas generados a partir de dispersiones con 30% p/p de trehalosa es

posible establecer una relación lineal entre el tamaño de gota de las emulsiones de

partida y la eficiencia de retención de los polvos (Figura 5.8).

196

Figura 5.8. Porcentaje de retención de polvos deshidratados formulados a partir de emulsiones con 30% p/p de trehalosa y distintas concentraciones de caseinato de sodio (NaCas), en función del diámetro medio de la distribución expresada en volumen (D4,3) de las emulsiones de partida. Se indica en cada punto la formulación del polvo analizado. Ajuste lineal, R2= 0,9997.

La Tabla 5.5 resume los valores de D4,3 y el análisis de estabilidad de las

emulsiones de partida, y las eficiencias de retención de los polvos liofilizados. Si bien

el tamaño de partícula es un parámetro muy importante no es el único factor que

influye en la retención.

Tabla 5.5. Valores de D4,3, y estabilidad de las emulsiones de partida en relación con el porcentaje de retención de los polvos liofilizados para las muestras estudiadas.

Emulsiones de partida D4,3 (m) Estabilidad emulsión % retención polvos

20% p/p T 0,5% p/p NaCas 0,76 Inestable (cremado) 26,8

20% p/p T 2,0% p/p NaCas 0,47 Inestable (cremado + floculación) 41,0

20% p/p T 5,0% p/p NaCas 0,34 Estable 79,4

30% p/p T 0,5% p/p NaCas 0,63 Inestable (cremado) 1,0

30% p/p T 2,0% p/p NaCas 0,44 Inestable (cremado + floculación) 11,5

30% p/p T 5,0% p/p NaCas 0,30 Estable 18,8

197

Otro de los parámetros relacionados con la eficiencia de encapsulación es la

estabilidad de la emulsión de partida, que a su vez ha demostrado una íntima

correlación con el tamaño de partícula. Por otra parte, hemos encontrado en

nuestros sistemas que cuando la emulsión no es estable por al menos 72 horas el

porcentaje de retención es siempre bajo (Álvarez Cerimedo et al., 2008; Álvarez

Cerimedo et al., 2012). En un trabajo anterior en el laboratorio se obtuvo el mismo

resultado estudiando polvos deshidratados a partir de emulsiones cuya fase lipídica

estaba constituida por fracciones de grasa de leche y aceite de girasol (Cerdeira et

al., 2007). Dicho de otra forma, las emulsiones deben ser estables por periodos

mucho más largos que el tiempo que transcurre entre la preparación y el congelado

de la muestra (aproximadamente 1 h). Esta necesidad de un mayor tiempo sin que se

detecten fenómenos de cremado o floculación se produce porque la estabilidad de la

emulsión y las interacciones entre los componentes de la misma afectan el proceso

de producción del polvo. En el caso de la encapsulación por secado por pulverización

o spray (spray drying en inglés), se ha descripto que la estabilidad de la emulsión

afecta directamente las condiciones de secado, que es, a su vez, uno de los

parámetros más importantes para obtener la máxima eficiencia (Jafari et al., 2008).

Los polvos liofilizados a partir de emulsiones con 20% y 30% p/p de trehalosa

presentaron una clara tendencia que vincula el aumento de la estabilidad de las

dispersiones con el grado de retención: para un contenido de trehalosa fijo, se

observa un aumento en la eficiencia de retención a medida que las emulsiones de

partida se hacen más estables.

En función de estas observaciones, hubiera sido esperable que los polvos

preparados a partir de dispersiones con 30% p/p de trehalosa mostraran eficiencias

de retención superiores a los polvos generados a partir de dispersiones con 20% p/p:

a igual contenido de emulsificante, las primeras presentaron menor tamaño de

partícula y mayor estabilidad. Sin embargo, los resultados muestran una tendencia

198

absolutamente contraria a la esperada. El factor que determina este resultado es el

proceso de encapsulación: las dispersiones con 30% p/p de trehalosa tienen una alta

proporción de sólidos que afectan la eficiencia de liofilización. No existe en la

literatura un consenso entre autores sobre cuál es el contenido de sólidos que

garantiza la mejor eficiencia de retención en materiales microencapsulados. Este

contenido óptimo varía en forma apreciable con la técnica seleccionada para

preparar los polvos. Algunos estudios en encapsulación de aceites esenciales y flavors

por secado por pulverización utilizando goma arábiga y/o maltodextrinas como

matrices, ponderan que un mayor contenido de sólidos aumenta la eficiencia de

retención hasta llegar a un valor óptimo ( 50%), a partir del cual la eficiencia

decrece (Bhandari et al., 1992; Fernandes et al., 2008). En el caso del proceso de

liofilización, hay autores que sostienen que los mejores resultados se obtienen

cuando el contenido de sólidos no supera el 10% p/p (Franks, 1998) o el 15% p/p

(Tang y Li, 2012); sin embargo, la mayoría de los autores sostiene que el contenido

ideal sería 20%. Por lo informado en la literatura este parámetro no parece obedecer

a una generalidad sino más bien es un valor a determinar para cada sistema en

particular.

El proceso modelo que tiene lugar en la obtención de materiales vítreos a

partir de soluciones congeladas implica la cristalización de las moléculas de agua (a

medida que baja la temperatura), lo que produce un aumento en la concentración de

la solución original. Este mecanismo continúa hasta llegar al punto eutéctico, en el

que la composición de la solución remanente alcanza el valor de saturación del

soluto, donde éste comenzará a cristalizar. Sin embargo, puede ocurrir una

sobresaturación del sistema si el congelamiento ocurre rápidamente, llegando a un

estado de no equilibrio. En estos casos, la viscosidad del sistema puede ser lo

suficientemente elevada para prevenir la nucleación, generando un estado vítreo. La

temperatura de transición vítrea del sistema resultante y el contenido de agua

199

residual (se refiere como agua residual a la proporción de agua que no cristaliza) no

son fijos y dependen de la historia del sistema, como por ejemplo de la

concentración inicial del soluto y la velocidad de congelación (Walstra, 2003d).

La cantidad de sólidos presente en el momento de la liofilización es

determinante en la calidad de los productos obtenidos. A medida que avanza la

primera etapa de secado, la sublimación del hielo genera un aumento en la

concentración de la solución remanente, que se opone a la difusión de las moléculas

de agua. Esto provoca una disminución en la velocidad de sublimación que –a

temperatura constante- puede generar un sobrecalentamiento del producto (Franks,

1998), provocando su cristalización.

A partir de los resultados obtenidos por DSC y DRX, puede verse que todos los

polvos deshidratados a partir de dispersiones con 30% p/p presentan un alto grado de

cristalinidad, incluso aquellos formulados a partir de emulsiones con 5,0% p/p de

caseinato, las cuales presentaron un tamaño de gota pequeño y una gran estabilidad.

El polvo preparado a partir de la emulsión con 10% p/p de concentrado de

aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y 5,0% p/p de NaCas fue el único que

permaneció en estado amorfo. El mismo presentó una alta retención, muy superior al

resto de las formulaciones. Existe entonces una evidente correlación entre el estado

de la matriz y el grado de retención en los polvos microencapsulados.

El estado de la matriz ha sido y continúa siendo objeto de estudio debido a la

creciente cantidad de aplicaciones que poseen los materiales encapsulados, aunque

existe un consenso general que indica que en los sistemas que contienen lípidos

encapsulados, la acción protectora de la matriz sólida se pierde cuando se produce la

cristalización (Buera et al., 2005). Este fenómeno, además de poseer un impacto

negativo en la manipulación de los polvos, puede conducir a la liberación de las

sustancias encapsuladas (Drusch et al., 2006).

200

Zhou y Roos (2012) estudiaron la encapsulación de aceite de oliva con -

tocoferol, utilizando proteínas de leche o de soja como estabilizantes en matrices de

lactosa y trehalosa, en proporciones muy similares a las utilizadas en esta tesis. De

acuerdo con los resultados obtenidos en ese trabajo, encontraron que la pérdida del

-tocoferol coincidió con la cristalización de las matrices de azúcar.

El análisis del tamaño de partícula de las emulsiones iniciales, de las

emulsiones congeladas y descongeladas y de los polvos reconstituidos muestra que en

los sistemas con menor retención, la cristalización de la matriz genera un drástico

aumento del tamaño de gota en los polvos reconstituídos. Estos sistemas sufren

modificaciones de su distribución espacial durante la liofilización. Esta observación

puede corresponderse con la baja retención de la fase dispersa en la matriz,

provocada por la cristalización del azúcar: las gotas de aceite microencapsulado son

expulsadas y coalescen, aumentando su tamaño y dando como resultado una baja

eficiencia de encapsulación.

5.2. Análisis del grado de oxidación del aceite por métodos tradicionales

5.2.1. Concentrado de aceite de pescado inicial

La determinación del Índice de Peróxido (PV), a través del método

espectrofotométrico con naranja de xilenol para el concentrado de aceite de pescado

inicial (sin ningún tratamiento), arrojó un valor de 3,9 0,9 miliequivalentes de

oxígeno activo por kilogramo de muestra. Este valor está en el límite inferior de lo

informado por Young et al. (1993), quienes sostienen que el PV de aceite de pescado

puro (no oxidado) arroja valores en un rango de 3 a 20 meq/kg de aceite.

El Código Alimentario Argentino (CAA), en tanto, establece PV máximos para

los aceites comestibles, dependiendo del tipo de aceite. Mientras que para el aceite

de girasol el Índice de Peróxido máximo no puede superar los 10,0 meq/kg; el PV

máximo para el aceite de oliva extra virgen es de 20,0 meq/kg. Los valores límites de

201

PV legislados contemplan la susceptibilidad oxidativa de los distintos aceites,

directamente relacionada con el grado de insaturación de los ácidos grasos

constituyentes. Aunque el CAA no especifica la descripción de ningún tipo de aceite

de pescado, el valor inicial de Índice de Peróxido determinado para el concentrado

de aceite de pescado utilizado en este trabajo está muy por debajo de los máximos

de todos los aceites, lo que indica que es apto para su consumo en relación a su nivel

de oxidación.

5.2.2. Aceites no encapsulados contenidos en los polvos deshidratados

La Tabla 5.6 muestra los valores de Índice de Peróxido (PV), obtenidos para el

aceite extraído de los polvos deshidratados por lavado con hexano.

Como se puede observar en la tabla el grado de oxidación es menor a medida

que aumenta el contenido de NaCas. Una explicación posible para este

comportamiento es que si bien esta grasa es extraíble se encuentra igualmente

protegida por la matriz especialmente a mayores concentraciones de NaCas. No se

encontraron diferencias significativas entre las formulaciones con 20% y 30% p/p de

trehalosa.

De cualquier modo, todos los aceites no encapsulados presentan un bajo grado

de oxidación comparado con la legislación del CAA para los aceites susceptibles como

el aceite de oliva. Heinzelmann y Franke (1999) han evaluado la oxidación en aceite

de pescado y han sugerido como límite superior para los mismos un PV de 20 meq O

kg-1. Si bien este aceite no está encapsulado, los valores hallados para estas muestras

son esperables dado que los polvos liofilizados se almacenaron en caja seca, bajo

atmósfera de nitrógeno y en ningún momento fueron expuestos al oxígeno o a la

humedad ambiente.

202

Tabla 5.6.Valores de Índice de Peróxido (PV) del concentrado de aceite de pescado extraíble con hexano (no encapsulado), contenido en polvos deshidratados preparados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p del mismo y diferentes proporciones (% p/p) de trehalosa (T) y caseinato de sodio (NaCas).

0,5% NaCas 2,0% NaCas 5,0% NaCas

20% T 16,3 1,9 10,0 1,7 3,5 0,9

30% T 16,0 0,8 10,5 0,4 4,6 1,0

Teniendo en cuenta que en la actualidad existen diversos envases para

alimentos que permiten conservar el producto al vacío y en atmósfera de nitrógeno,

estos polvos podrían mantenerse sin deterioro oxidativo apreciable por un tiempo

prolongado. Por otra parte, el aceite de pescado posee un olor muy fuerte que no

sería fácil de enmascarar empleándolo en forma líquida en una formulación. Los

polvos no poseen aromas desagradables lo que los hace más apropiados para emplear

como ingrediente en la industria de alimentos.

5.2.3. Aceites encapsulados contenidos en los polvos deshidratados

La Tabla 5.7 muestra los valores de Índice de Peróxido registrados para el

concentrado de aceite de pescado microencapsulado, extraído a partir de los polvos

lavados (es decir, libres de aceite no encapsulado).

Habría sido esperable que el aceite encapsulado arrojara valores de PV iguales

o menores que el aceite no encapsulado. Sorprendentemente, se encontró un alto

grado de oxidación para todos los aceites encapsulados, incluso mayor que los

obtenidos para los no encapsulados (Tabla 5.6). En el caso particular de los aceites

encapsulados contenidos en polvos liofilizados a partir de emulsiones con los menores

y mayores contenidos de proteína (0,5% y 5,0% p/p), los valores de PV superan los

límites publicados en bibliografía para aceites de pescado no oxidado.

203

Tabla 5.7. Valores de Índice de Peróxido (PV) del concentrado de aceite de pescado microencapsulado, contenido en polvos deshidratados preparados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p del mismo y diferentes proporciones (% p/p) de trehalosa (T) y caseinato de sodio (NaCas).

Muestra 0,5% NaCas 2,0% NaCas 5,0% NaCas

20% T 27,8 8,1 9,2 4,7 *

30% T 55,0 9,9 6,0 3,2 *

(*) valores excesivamente altos.

La mayoría de los autores en la literatura encapsulan materiales sensibles

para brindarles protección ante factores que pudieran causar su deterioro (Anwar et

al., 2010), y en particular para impedir reacciones oxidativas (Heinzelmann et al.,

2000). Sin embargo, en nuestros sistemas empleando los procedimientos de

extracción clásicos pareceríamos obtener la conclusión contraria. La encapsulación

no sería un medio para proteger materiales fácilmente oxidables. Más aún, dado que

los sistemas deshidratados fueron almacenados a muy baja presión de oxígeno y baja

humedad en caja seca (es decir, en condiciones no oxidantes), los valores obtenidos

no serían los esperables. Una posible explicación es que la oxidación se produjera

durante la extracción y estuviera relacionada con la técnica utilizada para

desencapsular y separar el aceite de la matriz.

La extracción del aceite se realizó a partir de protocolos estándar publicados

en literatura (Sankarikutty et al., 1988; Velasco et al., 2009b), que involucran el

calentamiento y agitación de la muestra en agua durante tiempos relativamente

largos y pueden ser los responsables de la oxidación. Para corroborar esta hipótesis

se decidió evaluar el grado de protección del material encapsulado a través de la

espectrometría de masa de desorción/ionización láser asistida por matriz, acoplada a

un detector de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Esta técnica fue recientemente

utilizada para el análisis de lípidos (Picariello et al., 2009; Saraiva et al., 2009)

pero no se aplicó al estudio de aceites complejos (como los de pescado, que

204

contienen una gran cantidad de ácidos grasos distintos) ni al análisis de polvos

encapsulados. Como se desprende de los datos que se presentan a continuación, la

metodología empleada no causó deterioro oxidativo en la fase lipídica.

5.3. Análisis del grado de oxidación del aceite por MALDI-TOF

5.3.1. Concentrado de aceite de pescado inicial

El concentrado de aceite de pescado sin ningún tipo de tratamiento se analizó

por MALDI-TOF siguiendo el método de Picariello et al. (2009). El espectro obtenido

se muestra en la figura 5.9, mientras que la asignación de los picos principales se

lista en la Tabla 5.7.

El pico mayoritario, atribuido al triglicérido formado por una molécula de

glicerol unida por tres uniones éster a una molécula de ácido mirístico, una molécula

de ácido gadoleico y una molécula de ácido eicosapentaenoico, coincide con los

Figura 5.9. Espectro obtenido por espectrometría MALDI-TOF del concentrado de aceite de pescado sin tratamiento. Se señalan las masas de los picos máximos más representativos.

205

resultados de abundancia de los ácidos grasos individuales obtenidos por CG-masa

(Tabla 4.2).El resto de los máximos también guarda una relación estrecha con la

abundancia relativa encontrada por cromatografía gaseosa.

Tabla 5.7. Asignación de los picos máximos detectados en el espectro MALDI-TOF del concentrado de aceite de pescado sin ningún tratamiento.

Masa molar Asignación

551 Matriz DHB

576 DAG: MEi+

578 DAG: MGa+

606 DAG: MCe+

615 DAG: MEi

635 DAG: MDha

665 DAG: EEpa

691 DAG: EpaGa

706 DAG: CeDha+

745 DAG: CeDha

763 TAG: MEM

827 TAG: MGaM

853 Escisión del TAG MGaDha

881 TAG: EMEi

901 TAG: MEpaGa

927 TAG: MGaDha

947 Escisión del TAG EpaGaDha

975 TAG: EpaGaEpa

993 TAG: CeGaM

1001 TAG: EpaGaDha

1011 TAG: CeEpaGa o CeDhaE o CeGaDha

1021 TAG: CeECe

1051 TAG: DpaDpaDpa

1075 TAG: CeCeCe

DAG=diacilglicerol, TAG=triacilglicerol, M=ácido mirístico (C 14:0), Ei=ácido eicosadienoico (C 20:2),Ga=ácido gadoleico (C 20:1), Ce= ácido cetoleico (C 22:1), Dha=ácido docosahexaenoico (C 22:6), E=ácido esteárico (C 18:0), Epa=ácido eicosapentaenoico (C 20:5), Dpa=ácido docosapentaenoico (C 22:5).

206

El espectro obtenido por MALDI-TOF muestra muy poca fragmentación de los

triglicéridos originales (sólo se encontraron dos fragmentos de corte por escisión ,

de m/z 853 y 947) y ausencia de dímeros (alrededor de m/z = 2000), lo que indica un

bajo grado de oxidación del aceite original. Estos resultados coinciden con el Índice

de Peróxido obtenido mediante la técnica espectrofotométrica tradicional.

5.3.2. Aceites no encapsulados contenidos en los polvos deshidratados

Los aceites no encapsulados, obtenidos por lavado de los polvos liofilizados

con hexano, se analizaron por MALDI-TOF. La figura 5.10 muestra los espectros

obtenidos para los polvos preparados a partir de emulsiones con 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y 0,5% p/p (a), 2,0% p/p (b)

y 5,0% p/p (c) de NaCas. La figura 5.11 presenta los resultados obtenidos para los

polvos preparados a partir emulsiones con 30% p/p de trehalosa.

No se encontraron diferencias significativas en la cantidad, tipo y abundancia

relativa de los picos entre los espectros de la figuras 5.10 y 5.11 y el espectro del

aceite original, indicando que se trata de muestras con bajo grado de oxidación.

Estos resultados coinciden con los obtenidos por la técnica del naranja de xilenol,

dado que aunque se trata de aceite que no se encuentra protegido por la matriz de

azúcar, fue almacenado en caja seca, es decir, aislado de condiciones oxidantes.

207

Figura 5.10. Espectros obtenidos por espectrometría MALDI-TOF del aceite extraído por lavado con hexano (aceite no encapsulado) de los polvos liofilizados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y a) 0,5% p/p de caseinato de sodio; b) 2,0% p/p de caseinato de sodio; c) 5,0% p/p de caseinato de sodio.

208

Figura 5.11. Espectros obtenidos por espectrometría MALDI-TOF del aceite extraído por lavado con hexano (aceite no encapsulado) de los polvos liofilizados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 30% p/p de trehalosa y a) 0,5% p/p de caseinato de sodio; b) 2,0% p/p de caseinato de sodio; c) 5,0% p/p de caseinato de sodio.

209

5.3.3. Aceites encapsulados contenidos en los polvos deshidratados

La figura 5.12 muestra a modo de ejemplo los espectros obtenidos por MALDI-

TOF para los aceites encapsulados contenidos en los polvos deshidratados formulados

a partir de 20% p/p de trehalosa, extraídos según el protocolo tradicional empleado

por la mayoría de los autores (Álvarez Cerimedo et al., 2008).

En el caso de las muestras extraídas a partir de polvos preparados con 0,5% y

2,0% p/p de caseinato (Figura 5.12 a y b) es posible detectar la presencia de los picos

característicos del concentrado de aceite de pescado, contenidos en la zona m/z =

800-1000, pero en una intensidad relativa mucho menor que la encontrada para el

aceite inicial y los no encapsulados. La muestra con 5,0% p/p de proteína (Figura

5.12 c), presenta, en cambio, la ausencia total de máximos en esta zona.

La disminución de las señales características se muestra, para todos los casos,

acompañada por la aparición de otros picos de alta intensidad, inexistentes en el

aceite de partida. Este tipo de patrón, donde los máximos originales desaparecen y

se encuentran picos aislados y agudos de menor intensidad y baja masa, es

característico de productos de oxidación, donde los diglicéridos y triglicéridos

iniciales sufren reacciones que generan como producto moléculas con pocos átomos

de carbono. El concentrado de aceite de pescado estudiado en este trabajo posee

una gran cantidad de insaturaciones, lo que lo hace especialmente lábil ante

reacciones oxidativas y plantea una infinidad de productos de reacción posibles.

210

Figura 5.12. Espectros obtenidos por espectrometría MALDI-TOF del aceite encapsulado contenido en los polvos liofilizados (extraidos por técnicas convencionales) a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio (NaCas): a) 0,5% p/p deNaCas; b) 2,0% p/p de NaCas; c) 5,0% p/p de NaCas .

211

Aunque no puede asignarse de forma unívoca ninguno de los picos oxidados, es

probable que el máximo con intensidad relativa de 100% (m/z = 699) encontrado en

todos los espectros correspondientes a la figura 5.12 se trate de una escisión del

triglicérido mayoritario, ubicado en un m/z = 901 (mirístico – gadoleico -

eicosapentaenoico). La figura 5.13 plantea un mecanismo de reacción posible para la

generación de dicho pico.

Picariello et al. (2009), en un estudio pionero en el tema, encontraron el

mismo tipo de comportamiento al analizar aceites de girasol y de oliva oxidados.

Figura 5.13. Mecanismo de reacción propuesto para la obtención del pico mayoritario en los aceites encapsulados oxidados. Se parte desde el triglicérido (TAG) más abundante contenido en el concentrado de aceite de pescado (m/z = 901), correspondiente a mirístico-gadoleico-eicosapentaenoico. El TAG sufre la adición de oxígeno en el alqueno más cercano al esqueleto del glicerol y genera una escisión .

212

Si bien no es posible encontrar la identidad de todos los picos que aparecen en

los espectros de muestras oxidadas para el caso de aceites complejos, es evidente la

diferencia entre dichos espectros y los obtenidos al analizar la muestra sin oxidar.

Estos resultados complementan y concuerdan con los obtenidos por mediciones

tradicionales.

Sin embargo, si el aceite contenido en el interior de las cápsulas posee un

grado de oxidación mayor que el no encapsulado, el proceso de microencapsulación

pierde sentido. Muchos autores se encontraron con esta complicación cuando

analizaron la protección de materiales de interés y aunque no dejaron de sostener las

ventajas del proceso de encapsulación, no pudieron explicar por qué los aceites

microencapsulados aparecen más deteriorados que los no encapsulados (Kolanowski

et al., 2006, Polavarapu et al., 2011).

La hipótesis de la que partimos en este trabajo sostiene que el aceite

encapsulado sí está protegido de reacciones indeseadas (en particular de la

oxidación). Sin embargo, las etapas involucradas en la técnica de extracción de la

muestra, ampliamente difundida en la literatura, involucran procesos que producen

la oxidación del material encapsulado. Probar esta premisa implica o bien encontrar

un protocolo que evite calentamientos de la muestra, exposición al oxígeno o a la

humedad, etc., o hallar la forma de analizar el aceite sin extraerlo de la matriz.

Encontramos que es posible estudiar el material encapsulado sin separarlo de la

matriz, a través de espectrometría de masa MALDI-TOF.

5.3.4. Análisis del aceite encapsulado en los polvos lavados

Los espectros MALDI-TOF obtenidos para los polvos libres de aceite no

encapsulado (lavados con hexano) formulados a partir de emulsiones con 10% p/p de

concentrado de aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y distintas concentraciones

de emulsificante se muestran en la figura 5.14.

213

Figura 5.14. Espectros obtenidos por espectrometría MALDI-TOF del aceite encapsulado contenido en los polvos liofilizados a partir de emulsiones formuladas con 10% p/p de concentrado de aceite de pescado, 20% p/p de trehalosa y diferentes concentraciones de caseinato de sodio: a) 0,5% p/p de NaCas; b) 2,0% p/p de NaCas; c) 5,0% p/p de NaCas.

214

Los espectros resultantes al analizar de forma directa los polvos lavados en la

zona m/z 500 – 2500 no presentan diferencias significativas con los hallados al

analizar el aceite sin tratamiento. Las señales que pudieran producir la trehalosa o el

caseinato de sodio no interfieren con las del aceite porque su masa no está incluida

en el rango en el que aparecen las señales de este último. Estos resultados prueban

que el aceite encapsulado no se oxida durante la liofilización ni durante el

almacenamiento en condiciones de baja humedad y/o similares a las encontradas en

los envases para productos de alto valor agregado. Este es el primer trabajo en el

que se estudia el material contenido en las cápsulas por un método que no somete a

las muestras a reacciones de oxidación.

Muchos trabajos publicados en bibliografía describen pobremente el método

utilizado para separar el material encapsulado del no encapsulado contenido en

polvos deshidratados (Kolanowski et al., 2006; Anwar et al., 2010; Anwar y Kunz,

2011), y la gran mayoría analiza la estabilidad oxidativa de los materiales de interés

sin extraer los lípidos no encapsulados. De esta forma, la fase lipídica es descripta en

conjunto (lípidos encapsulados y no encapsulados) sin ningún tipo de distinción

(Carneiro et al., 2012; Partanen et al., 2008). Los resultados obtenidos suelen ser

contrarios a los esperados: Kolanowski et al. (2006), analizaron la estabilidad

oxidativa de aceite de pescado microencapsulado por secado spray en matrices de

celulosa modificada y maltodextrinas, estabilizadas con lecitina de soja. Informaron

valores de PV mayores en el aceite de las cápsulas que en el de partida, analizando

directamente los polvos liofilizados –esto es, sin distinguir entre aceite encapsulado y

no encapsulado- y concluyeron que la microencapsulación por secado por

pulverización no protege a los aceites de pescado. Polavarapu et al. (2011)

realizaron un análisis similar en aceite de oliva y de pescado microencapsulado en

pectina de remolacha azucarera y jarabe de glucosa. Obtuvieron una mejor

estabilidad oxidativa en los lípidos de partida que en los microencapsulados (ambos

215

sometidos a condiciones de oxidación aceleradas), y argumentaron que el origen de

estos resultados se explica por la menor área interfacial que poseen los aceites

originales, en comparación con los contenidos en los polvos.

Es muy probable que en todos estos casos la presencia de aceite no

encapsulado (contenido en los sistemas dado que no se extrae previamente), que se

halla muy poco protegido contra las condiciones de deterioro y los métodos

empleados para la determinación del grado de oxidación, generen este tipo de

resultados contradictorios.

En tanto, la aplicación de la tecnología MALDI-TOF sobre los polvos libres de

grasa no encapsulada permite visualizar en forma directa la estabilidad oxidativa de

los materiales encapsulados. El concepto de técnica directa se utiliza aquí en dos

sentidos: para señalar que se trata de un método que no precisa de la extracción del

aceite a partir de los polvos y también en relación a que el grado de oxidación de la

fase dispersa no se evalúa a través de la detección de productos secundarios de

oxidación (como ocurre con la mayoría de las técnicas actuales: TBARS, análisis

cromatográficos de compuestos volátiles, ensayos espectrofotométricos, índice de p-

anisidina, OSI, etc.) sino que pueden identificarse directamente las escisiones de los

triglicéridos originales.

La técnica MALDI-TOF no involucra etapas de calentamiento ni extracciones

trabajosas y con baja eficiencia. Los resultados obtenidos por esta metodología –

aplicada tanto al aceite sin tratamiento como a los polvos deshidratados- ofrecen una

descripción detallada de la composición y abundancia de todas las especies presentes

en el aceite de interés y en los productos de oxidación generados. Se trata de una

herramienta única en el análisis de lípidos, que demuestra complementar y ampliar

los resultados obtenidos mediante técnicas tradicionales, y que por primera vez

permite el estudio directo de materiales microencapsulados.

216

Por último, la aplicación de MALDI-TOF MS sobre los polvos lavados prueba

que el proceso de encapsulación no provoca la oxidación de aceites con alto

contenido de ácidos grasos insaturados, y que los productos de oxidación encontrados

al principio se produjeron al utilizar técnicas extractivas tradicionales.

Conclusiones

218

6. Conclusiones

Si no me creen, vayan a ver.

Lautréamont

En función de los resultados obtenidos en este trabajo y de otros publicados

en la literatura, puede afirmarse que la estabilidad de emulsiones preparadas con

caseinato de sodio se ve significativamente afectada no sólo por la relación

proteína/aceite sino también por las condiciones de procesamiento y la composición

de la fase acuosa.

Con respecto al procesamiento, se estableció que el comportamiento de las

dispersiones en el tiempo es dependiente del proceso de homogenización. Se

encontró un menor tamaño de partícula y una mayor estabilidad en aquellas

emulsiones preparadas mediante Ultraturrax y ultrasonido que en aquellas

preparadas sólo por Ultraturrax. Más aún, se observaron cambios en el mecanismo de

desestabilización de las emulsiones en función del proceso de homogenización

utilizado.

El agregado de trehalosa a la fase acuosa aumentó la estabilidad de las

emulsiones disminuyendo la velocidad de cremado o floculación y ampliando

considerablemente el rango de estabilidad. El efecto observado fue consecuencia no

sólo del aumento en la viscosidad del sistema sino de la presencia de interacciones

proteína/trehalosa, que modificaron la microestructura de las emulsiones y

consecuentemente su estabilidad. Este análisis hubiera sido imposible de realizar por

observación directa ya que los sistemas permanecieron opacos y líquidos durante una

semana, lo que resalta la utilidad del Turbiscan en el estudio del comportamiento de

emulsiones concentradas.

219

Estos resultados pueden analizarse en el marco de la teoría de polímeros

descripta por Hiemenz y Rajagopalan (1997), que predice, entre otros fenómenos, la

aparición de un rango de concentraciones de proteína en las que se produce una

estabilización por agotamiento, y que no había sido inequívocamente documentada

hasta ahora.

Los estudios realizados en los polvos deshidratados mostraron, en tanto, que

existe una estrecha dependencia entre la estabilidad de una emulsión y la eficiencia

de retención del aceite en una matriz. Para que el porcentaje de encapsulación fuera

elevado, las emulsiones debieron ser estables no sólo por unas pocas horas sino por al

menos una semana. Los polvos liofilizados que permanecieron amorfos luego del

proceso de deshidratación, y que no presentaron cambios en el tamaño de gota

cuando se congelaron y liofilizaron, fueron los únicos que mostraron una alta

retención. El resto de las formulaciones tuvieron pobres propiedades encapsulantes.

Este resultado pone de manifiesto la influencia del estado de la matriz en la

eficiencia de retención.

En cuanto a la estabilidad química del material contenido en la matriz, los

ensayos habituales para medir oxidación arrojaron valores muy altos de Índice

Peróxido (PV) al separar el aceite encapsulado de los polvos mediante técnicas de

uso común. Esto indica que los métodos extractivos tradicionales someten a los

aceites microencapsulados a una oxidación significativa, y que no son representativos

del grado de protección real de las matrices. En este sentido, el presente trabajo

introduce por primera vez una técnica apropiada para la medición del grado de

oxidación de aceite de pescado encapsulado, a través de la espectroscopía de masas

MALDI-TOF. Se encontró que este método permite la evaluación directa de los polvos

lavados, sin pasos de calentamiento ni extracción del aceite. Más aún, la utilización

de MALDI-TOF en el análisis de lípidos facilita la observación directa y la

identificación de las especies que componen el aceite microencapsulado. Los

220

resultados mostraron que el proceso de encapsulación no genera deterioro oxidativo

en el material de interés, dado que no se encontraron diferencias entre los espectros

del aceite original y los del aceite contenido en los polvos deshidratados.

En la actualidad, el desarrollo de alimentos funcionales y de técnicas

apropiadas para su desarrollo y análisis es uno de los mayores desafíos que deben

resolver distintas ramas de la ciencia. Las técnicas tradicionales utilizadas en la

industria alimentaria resultan, en el nuevo milenio, insuficientes, y la aplicación de

conceptos desarrollados en especialidades como la ciencia de polímeros o la

fisicoquímica de dispersiones ha demostrado ser una herramienta muy útil a la hora

de diseñar alimentos de alto valor nutritivo y estabilidad que cubran las necesidades

de una población mundial creciente. En este sentido, nuestro trabajo no pretende

más que aportar un grano de arena, colaborando en el desarrollo de nuevos métodos

que permitan la incorporación de aceites de alto valor nutricional en la mesa de

todos los días.

Anexo

222

Anexo. MALDI-TOF

Son vanas y están plagadas de errores las ciencias que no

han nacido del experimento, madre de toda certidumbre.

Leonardo Da Vinci

1. Generalidades

Los lípidos tienen una importancia biológica innegable, por lo que el

desarrollo y la mejora de los métodos disponibles para el análisis integral de estas

biomoléculas son fundamentales en ámbitos tan disímiles como la industria

alimentaria, las preparaciones cosméticas, la salud, los lubricantes y los

biocombustibles, entre muchos otros. Sin embargo, los lípidos no son sustancias

sencillas para analizar ya que su polaridad puede variar notablemente de una especie

a otra, carecen de cromóforos que facilitarían su detección espectrofotométrica

(Carrasco-Pancorbo et al., 2009) y, fundamentalmente, aún en moléculas sencillas

como los triglicéridos, la composición en ácidos grasos puede ser muy distinta,

aumentando la complejidad en el análisis.

La mayoría de los lípidos contienen ácidos grasos unidos a un esqueleto de

glicerol o fosfoglicerol y el tipo de ácidos grasos que contenga cada una de dichas

moléculas se utiliza a menudo para clasificar o diferenciar los lípidos y para

determinar su origen (Lay et al., 2012). Los métodos habituales de análisis de lípidos

comprenden técnicas cromatográficas tales como la cromatografía líquida de alta

performance (HPLC) o de capa delgada (TLC); o espectroscópicas, como IR o RMN

(Teuber et al., 2010). La cromatografía gaseosa acoplada a detectores de masa (CG-

MS) ha sido durante muchos años el método estándar para la caracterización de

lípidos, pero implica la escisión de los ácidos grasos desde la molécula del triglicérido

223

original y luego una derivatización para su caracterización, perdiendo así toda la

información acerca de la estructura inicial del material (Lay et al., 2012).

En principio, el procedimiento analítico para la determinación de los distintos

compuestos lipídicos requiere tres pasos básicos: (i) extracción de la muestra, (ii)

separación analítica e (iii) identificación y cuantificación. Esto implica que, luego de

una extracción exitosa de los lípidos desde su fuente, debe realizarse un análisis para

la detección de compuestos específicos, e involucra un problema adicional, relativo a

la inestabilidad oxidativa de los ácidos grasos insaturados (Carrasco-Pancorbo et al.,

2009).

En este contexto, la espectrometría de masas (MS) se utiliza cada vez con más

frecuencia para el análisis de mezclas de lípidos complejos debido a sus ventajas con

respecto a otras técnicas. Aunque la ionización química a presión atmosférica (APCI)

o la ionización por electrospray (ESI) son los métodos más difundidos, existe

evidencia creciente de que la espectrometría de masa de desorción/ionización láser

asistida por matriz, acoplada a un detector de tiempo de vuelo (MALDI-TOF)

representa un método alternativo útil dado que hace posible la producción de una

fase gaseosa de iones de la mayoría de los lípidos (Fuchs y Schiller, 2009).

Constituye una técnica rápida, sensible, se pueden emplear solventes orgánicos para

la extracción de los lípidos de organismos vivos y no requiere derivatización previa de

la muestra (Lay et al., 2012). Más aún, no involucra condiciones de procesamiento

que pudieran favorecer reacciones oxidativas en los lípidos a analizar. Se trata de un

método de ionización suave que se utiliza generalmente para el análisis de proteínas

pero que en los últimos años se aplicó con éxito en el estudio de lípidos, debido a su

capacidad de detección de especies lipídicas polares y no polares de diversas fuentes

(Carrasco-Pancorbo et al., 2009), y su potencialidad en estudios de oxidación

(Schiller et al., 2002; van der Berg et al., 2004; Picariello et al., 2009).

224

2. Fundamentos

El principio general de una espectrometría de masas (MS) es producir, separar

y detectar iones en fase gaseosa (Jurinke et al., 2004). MALDI se refiere a la fuente

de iones (el método por el cual se generan iones a partir de un analito neutro) y TOF

indica el tipo de analizador de masa utilizado (Fuchs y Schiller, 2009). La Figura 1

muestra un esquema general de un equipo MALDI-TOF. La muestra a analizar se

integra típicamente en una estructura cristalina de compuestos orgánicos pequeños

(matriz) y se deposita en un portamuestras. Los cocristales se irradian luego con un

rayo láser, que puede ser un granate de itrio y aluminio dopado con neodimio,

Nd:YAG, (emisión = 355 o 266 nm), láseres de excímeros que utilizan una combinación

de un gas inerte como argón, xenón o kriptón con un gas reactivo, o láseres de CO2 y

N2. Los láseres de UV, cuya emisión = 337 nm son los más utilizados y la mayoría de los

equipos MALDI-TOF disponibles en el mercado poseen esta fuente (Fuchs et al.,

2010).

Figura A.1. Esquema básico de un equipo MALDI-TOF.

225

Cuando el haz de láser pulsado impacta la muesta (Figura 2) (cocristales de

matriz y analito) su energía es absorbida principalmente por la matriz, que está

presente en exceso. En consecuencia, la matriz se vaporiza, cargando moléculas

intactas del analito a la fase vapor. Durante el proceso de expansión de esta nube de

gas, los iones (H+ y Na+) se intercambian entre la matriz y el analito, conduciendo a

la formación de moléculas de analito cargadas. Estos iones se denominan aductos o

ionescuasimoleculares. También pueden generarse aniones por substracción de H+ o

Na+ (Fuchs et al., 2010). Los iones resultantes se someten a la aceleración de un

campo eléctrico de unos 20 kV que provoca la deriva de los mismos a través de un

camino libre (0,5 -3 metros) (Schiller et al., 2004) hasta que finalmente alcanzan el

detector. Es posible obtener espectros en modo positivo o negativo, aunque el

primero es el de uso más frecuente debido a que se cree que los espectrómetros de

masa que detectan iones negativos poseen menor sensibilidad (Fuchs et al., 2010).

Figura A.2. Esquema del camino que recorren los iones en un equipo MALDI-TOF.

226

La masa de los iones (relación masa/carga, m/z) se calcula midiendo su tiempo

de vuelo (TOF), más extenso para moléculas grandes y más reducido para moléculas

pequeñas (siempre que sus energías iniciales sean idénticas). Dado que se producen

predominantemente iones no fragmentados y con carga única, la masa de los iones

pueden determinarse con facilidad a partir del espectro resultante, sin necesidad de

un procesamiento complejo de datos (Jurinke et al., 2004).

El espectro TOF es un simple registro de la señal del detector en función del

tiempo (t). A partir de t, m/z se deriva de la Ec. 1:

2

2

2s

tE

z

mcin [1]

donde s es la longitud del tubo de vuelo, m es la masa, z la carga y Ecin la energía

cinética del ion. La resolución obtenida en el espectro de masas está determinada

por el camino libre que recorren los iones y puede ser mejorada aumentando el

camino libre o a través del denominado espejo electrostático, donde los iones se

reflejan en el extremo del tubo y alcanzan el detector de reflexión en la dirección

opuesta (Schiller et al., 2004).

3. La matriz

La matriz posee dos tareas fundamentales: (i) absorber la energía del láser y

(ii) separar las moléculas de analito unas de otras para evitar la formación de

agregados. Por tanto, la matriz y la muestra se mezclan con un exceso molar de

matriz aproximado de 100 a 1000 veces, que también ayuda a evitar el impacto

directo del láser sobre el analito (lo que podría generar fragmentaciones no

deseadas) (Schiller, 2007).

Por otra parte, la matriz debe presentar una alta absorción a la longitud de

onda de emisión del láser, y buenas propiedades de mezclado con la muestra, a fin

227

de proveer una cocristalización homogénea. Es altamente deseable que la matriz

genere señales muy pequeñas (para evitar interferencias), que proporcione un único

aducto del analito y que tenga baja tendencia a la generación de clusters con la

muestra (Fuchs et al., 2010).

Aunque existen muchas matrices diferentes para su utilización en el análisis

de MALDI-TOF de biopolímeros, en el caso particular de los lípidos –caracterizados

por pesos moleculares menores-, se requieren matrices con propiedades especiales.

El prerrequisito más importante es un bajo rendimiento de iones de la matriz que se

generan con reacciones fotoquímicas. Esta es la razón por la cual los compuestos que

tienden a sufrir polimerización (por ejemplo, las matrices derivadas de ácido

cinámico) deben ser evitados para no provocar la saturación del detector. La Tabla 1

muestra las matrices más comúnmente empleadas en diversos sistemas.

4. Preparación y sembrado de la muestra

Los mejores espectros se obtienen cuando los lípidos están disueltos en

solventes orgánicos, por lo que es conveniente extraer las muestras lipídicas de los

distintos materiales de interés a través de, por ejemplo, mezclas de metanol y

cloroformo. Luego de la separación entre las fases acuosa y orgánica, esta última

puede utilizarse sin ninguna otra purificación para el análisis por espectroscopía de

masa MALDI-TOF (Schiller, 2007).

Hasta el momento, el ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) ha resultado ser la

matriz más apropiada para el análisis de lípidos (Schiller et al., 2004). La Figura 3

muestra el espectro de masa del DHB obtenido en modo negativo y positivo.

228

Tabla A.1. Matrices más utilizadas en MALDI-TOF de lípidos y fosfolípidos. Adaptado de Schiller et al. (2004).

Estructura química Nombre común Observaciones

Ácido 2,5-dihidroxibenzoico

La matriz más utilizada para lípidos y fosfolípidos. Genera muy pocos picos de matriz, y puede utilizarse en modos positivo y negativo.

Ácido -ciano-hidroxi-cinámico

Interfiere fuertemente con los picos de interés

(oligomerización). Poco soluble en metanol.

Ácido sinapínico

Interfiere fuertemente con los picos de interés

(oligomerización). Poco soluble en metanol.

6,7-dihidroxi-cumarina Poco utilizado.

5-etil-2-mercaptotiazol Poco utilizado.

para-nitroanilina (PNA)

Útil en el análisis de mezclas complejas. Proporciona intensas

señales negativas de fosfatidilcolina y

fosfatidiletanolamina. Recientemente introducido.

Cx grafito Parece adecuado sólo para

compuestos muy apolares. Hasta ahora fue poco utilizado.

Los lípidos puros o una solución de los mismos se transfieren al porta-

muestras, seguido por la adición de aproximadamente el mismo volumen de solución

de matriz (por lo general la concentración de DHB es de 0,5 M, mucho más

concentrada que la muestra). Especialmente cuando se utiliza DHB como matriz, es

aconsejable evaporar con rapidez el solvente para obtener cocristales analito/matriz

más pequeños y homogéneos (Schiller, 2007).

229

Figura A3. Espectro de masas por desorción láser de la matriz DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico) pura. El espectro (a) representa el espectro de iones positivos y (b) el negativo. Los picos están señalados según su relación m/z y “M” representa la molécula de DHB neutra (154 g/mol). Tomado de Schiller et al. (2004), con modificaciones.

Cuando se requiere una información cuantitativa, es más apropiado realizar

una premezcla de la muestra y de una solución de la matriz antes de su siembra en el

porta-muestras. La premezcla permite minimizar las fluctuaciones derivadas de las

regiones ricas en matriz o ricas en analito en el cocristal. Estas regiones suelen

denominarse puntos fríos o puntos calientes, respectivamente (Schiller et al., 2004).

En cuanto a la cantidad, de 0,5 a 2 L de la mezcla analito/matriz es suficiente.

La homogeneidad de los cristales matriz/analito es la variable que más

impacta en la calidad y reproducibilidad de los espectros de MALDI-TOF, mientras

que la configuración experimental o la intensidad del láser aplicada constituyen

parámetros menos importantes. Dado que la cocristalización del compuesto de

interés y de la matriz depende del solvente, se trata siempre de seleccionar aquel en

el que ambos (analito y matriz) son fácilmente solubles. En solventes pobres, uno de

230

los componentes cristaliza con anterioridad, resultando en cocristales inhomogéneos.

Esto debe evitarse ya que la calidad espectral resultaría dependiente de la posición

en la que el láser impacta la muestra (Schiller et al., 2004). La gran ventaja en el

análisis de lípidos es que tanto la matriz como la muestra se solubilizan en el mismo

solvente orgánico y, por tanto, puede obtenerse una mezcla muy homogénea (Benard

et al., 1999).

El espectro de lípidos se obtiene por lo general en el modo positivo de

detección, por lo que es usual el agregado de agentes cationizantes con el fin de

incrementar el rendimiento de los iones. En este sentido, suele utilizarse el ácido

trifluoroacético (TFA) como aditivo a la matriz en una concentración de

aproximadamente 0,1% vol. Se detectan entonces aductos de H+, de Na+ y –con menor

intensidad- de K+ (Schiller, 2007).

5. Patrones internos

La manera más sencilla de excluir la influencia de parámetros como la

proporción de matriz/analito, la dependencia por evaporación del solvente, los

cambios en la morfología de la muestra y otras condiciones que pueden variar

significativamente de experimento a experimento, consiste en utilizar estándares

internos (Benard et al., 1999). La incorporación de patrones internos al análisis por

MALDI-TOF, garantiza que la cantidad de ionización y de desorción, así como el grado

de fragmentación de las especies, se producen en el mismo rango.

Un patrón interno ideal debe poseer varias propiedades en común con el

analito, siendo la más significativa la similitud química y de masa (Wilkinson et al.,

1997). Sin embargo, si las masas del analito y del patrón son muy parecidas, puede

generarse una superposición espectral de ambas señales.

231

6. Límites de detección

Muchos autores sugieren que la espectroscopía MALDI-TOF es una técnica

analítica muy sensible dado que permite utilizar concentraciones de analito del

orden del picomol (El-Aneed, 2009) o incluso el femtomol (Fuchs y Schiller, 2009).

Esto último significa que menos de 1 L de una muestra lipídica de 1 g/mL es

absolutamente suficiente para detectar la especie de interés. Sin embargo, el límite

de detección del método ha demostrado ser altamente dependiente de la matriz

utilizada, del tipo de analito, del modo en el que se trabaje (positivo o negativo), de

la calidad y pureza de los reactivos, de la ausencia de sales, de la intensidad del

láser, etc (Li et al., 2005;Fuchs y Schiller, 2009; Fuchs et al., 2010; Teuber et al.,

2010).

En este contexto, y aunque se acepta que la técnica MALDI-TOF es más

sensible que otros método utilizados históricamente en el análisis de lípidos (Müller

et al., 2001; Schiller et al., 2004) el límite de detección debe definirse en función

de las condiciones experimentales particulares.

7. Cuantificación

Pueden encontrarse en la literatura algunos intentos de ampliar el uso de la

espectroscopía MALDI-TOF desde lo cuali hacia lo cuantitativo (El-Aneed, 2009),

aunque su éxito depende del cumplimiento de una serie de condiciones. El primer

requisito para la cuantificación de los espectros de masas de MALDI-TOF es una

preparación muy controlada de la muestra, y el segundo es la cristalización

homogénea de la matriz con el analito para generar aproximadamente la misma

cantidad de iones moleculares en cada disparo del láser(Schiller et al., 2004). Si la

reproducibilidad entre disparo y disparo es pobre –derivada de la variabilidad en la

distribución-, se limita la posibilidad de cuantificar los espectros (Li et al., 2005).

232

Existe una creciente evidencia de que los lípidos y otras moléculas más

pequeñas pueden ser cuantificadas por la técnica de MALDI-TOF a través de los

siguientes enfoques: (a) por incorporación de patrones internos; (b) utilizando la

relación señal/ruido; o (c) comparando la intensidad del pico de los lípidos de interés

con un pico conocido de matriz (Schiller et al., 2004).

Sin embargo, la cuantificación de esta técnica se considera todavía un

procedimiento muy poco fiable (Cohen y Gusev, 2002). Más aún, la espectroscopía

MALDI-TOF es un método muy conveniente para determinar la composición de ácidos

grasos de algunas clases de lípidos (Schiller et al., 2004), pero la determinación

cuantitativa de muchas especies en simultáneo es aún muy dificultosa.

8. Estudio de la oxidación lipídica a través de MALDI-TOF

Además de los estudios de caracterización de lípidos, existe otra aplicación

creciente e importante de la espectroscopía MALDI-TOF, que consiste en su

utilización en el análisis de procesos oxidativos. La mayoría de las investigaciones en

este campo se basan en el análisis de los productos de oxidación volátiles de los

triglicéridos, a través de técnicas como la cromatografía gaseosa acoplada a

detectores de masa (CG-MS): un método complejo, que implica la saponificación de

los TAGs y que conlleva a la pérdida de información sobre la composición en

triglicéridos inicial (Schiller et al., 2002).

En este sentido, el estudio de la oxidación lipídica a través de métodos de

ionización suave aparece como una herramienta invaluable a la hora de analizar

todos los productos generados, minimizando la manipulación de la muestra. Schiller

et al. (2002) demostraron que la adición de oxígeno al doble enlace de los residuos

acilo y la subsecuente escisión , que genera los compuestos carbonílicos, puede ser

estudiada con precisión por MALDI-TOF. Esta técnica ha permitido, además, el

estudio de los cambios en los espectros de masa de aceites comestibles (como girasol

233

y oliva) provocados por calentamiento, y la identificación de los productos de

oxidación de forma semicuantitativa (Calvano et al., 2007).

Aunque la detección de productos de oxidación primaria (como los

hidroperóxidos, especies altamente inestables) ha sido difícil de lograr a través de

MALDI (Fuchs y Schiller, 2009), se consiguió mejorar la descomposición de

compuestos lábiles a través de una separación cromatográfica entre componentes

polares y no polares previo a su análisis espectroscópico (Picariello et al., 2009).

A pesar de su gran relevancia, no existen muchos estudios en los que se utilice

la espectroscopía MALDI para investigar el comportamiento oxidativo de aceites

vegetales a temperaturas elevadas (Fuchs et al., 2011). En la actualidad, las

ciencias de la alimentación y nutrición están pasando de metodologías clásicas a

estrategias de análisis avanzadas, donde las técnicas basadas en MS poseen un papel

crucial, y para las cuales se ha definido el término en Inglés “foodomics” que

también se emplea en español (Herrero et al., 2012).

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