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AGRONOMA MESOAMERICANA 20(2):319-325. 2009ISSN: 1021-7444

1 Recibido: 10 de diciembre, 2008. Aceptado: 16 de noviembre, 2009. Proyecto de investigacin No. 5401-1701-6004 de Vicerrectora deInvestigacin y extensin del Instituto Tecnolgico de Costa Rica (ITCR).

2 Instituto Tecnolgico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica. [email protected], [email protected]; [email protected]

CULTIVO DE TEJIDOS ENFicus carica CON MINIESTACAS1

Dora Mara Flores-Mora2, Vilma Jimnez-Bonilla2, Randall Chacn-Cerdas2

RESUMEN

Cultivo de tejidos en Ficus carica con miniestacas.Este ensayo se llev a cabo en el Centro de Investigacinen Biotecnologa, del Instituto Tecnolgico de Costa Rica,

Cartago, Costa Rica, entre los aos 2006-2008. Tuvo comoobjetivo evaluar el cultivoin vitrodel higo. Para el estableci-miento del material vegetal in vitrose utilizaron miniestacasde 3 cm, de longitud provenientes de material propagadovegetativamente. Para su desinfeccin se lavaron y se su-mergieron en una solucin de 6 g/l de benomilo (50 % i.a.),6 g/l de sulfato de gentamicina (2 % i.a.) y de clorhidrato deoxitetraciclina (6 % i.a.) y 3,5 g/l de dimetiltiocarbamato (76% i.a.) durante 90 minutos. Luego se realiz una segundadesinfeccin con hipoclorito de calcio al 3,5 % p/v durante 10minutos. Se inocularon en un medio M&S (1962) completo,ms 1mg/l de BAP, 300 mg/l de acido ascrbico y 175 mg/l de

ciprooxacina. En la etapa de multiplicacin se separaron losbrotes desarrollados, se inocularon y se emple como mediobase M&S (1962) completo, suplementado con 1,0; 0,5 y 0mg/l de BAP. Para la etapa de enraizamiento, se implementa-ron dos tratamientos, M&S (1962) completo con 0,5 y 0 mg/lde AIB. Se obtuvo un 31,67 % de supervivencia y asepsia delmaterial en la etapa de introduccin y un promedio de tresbrotes por explante al mes de incubacin. El mayor promediode brotes por explante se logr en el tratamiento con 1,0 mg/lde BAP y el mayor porcentaje de enraizamiento se obtuvo enel tratamiento sin regulador. Durante la fase de aclimatacin,se logr un 100 % de supervivencia.

Palabras claves: Higo, micropropagacin, cultivo invitro, brotacin, benzilaminopurina.

ABSTRACT

Tissue culture of g (Ficus carica) whith minicuttings.

This investigation took place at the Biotechnology ResearchCenter of the Costa Rica Institute of Technology between the

years 2006 and 2008. Its main objective was to implementthe in vitro production of gs. For the in-vitro process, 3-centimeter long ministalks taken from vegetatively propagatedmaterial were used. These stalks were washed and immersedin a 6 g/l benomil solution (50 % a.i), 6 g/l gentamicin sulfate(2 % a.i) and oxitetracycline hydrochloride (6 % a.i), and 3.5g/l dimethyldithiocarbamate (76 % a.i) for 90 minutes. Then,a second disinfection took place with Calcium Hipocloriteat 3,5 % p/v for 10 minutes. The stalks were inoculated in acomplete M&S (1962) with 1 mg/l of Ascorbic Acid and 175mg/l of Ciprooxacin. During the multiplication stage, the

larger shoots were separated and inoculated with three diffe-

rent treatments, using as the basic medium a complete M&S(1962), supplemented with 1.0; 0.5, and 0 mg/l of BAP. Forthe rooting stage, two different treatments were implemented--a complete M&S (1962) with 0.5 and 0 mg/l of IBA. 31.67 %of survival and asepsis of the material during the introductorystage and an average of three shoots per explant were achievedafter a month of incubation. The highest average of shoots perexplant was obtained with the 1.0 mg/l of BAP treatment, andthe highest percentage of average roots was achieved with thetreatment without a regulator. During the acclimatation stage,we reached 100 % survival.

Palabras claves:Fig, micropropagation,in vitrocultu-

re, bud induction, benzilaminopurine.

NOTA TCNICA


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ISSN: 1021-7444 AGRONOMA MESOAMERICANA 20(2):319-325. 2009

320 FLORES et al.:CULTIVODETEJIDOSENFicus carica

INTRODUCCIN

El higo (F. carica) tradicionalmente ha sido pro-pagado por acodos areos y estacas, en pases como

Espaa, Turqua, Portugal y Brasil, donde miles dehectreas son destinadas al cultivo de esta planta(Melgarejo 1999). A pesar de que estos sistemas handemostrado ser ecientes, una de las principales limi-taciones es la incapacidad de realizar multiplicacionesmasivas en corto tiempo, ya que cada estaca o acodoregenerar una nica planta, que en muchos de los ca-sos no cumple con las exigencias del mercado, ademspara la aplicacin de estas tcnicas se requiere que lasplantas se encuentren en la etapa vegetativa.

Con la aplicacin de la tcnica de micropropagacinde plantas, se amplian las perspectivas de obtencin de

material vegetal con mejor calidad agronmica y encualquier poca del ao (Alberti et al. 1992). Para eldesarrollo de esta tcnica, deben considerarse aspectosfundamentales, como la procedencia, seleccin ydesinfeccin del explante, as como la composicinde los medios de cultivo a utilizar en cada una de lasetapas y las condiciones de crecimiento (Navarro yPerea 1996).

Cada sistema de cultivo in vitro presenta carac-tersticas particulares que permiten producir plantascompletas a partir de explantes. Estas caractersticastienen que ver con el genotipo, el tipo de explante, lasnormas de asepsia, los medios de cultivo y las condi-ciones ambientales de incubacin. La interaccin deestos factores es lo que determina la respuesta del ex-plante al cultivo in vitro(Roca y Ramrez 2000). Unode los mayores usos del cultivo de tejidos es la propa-gacin vegetativa de plantas con el n de disponer de

gran cantidad de material vegetal tosanitariamente

sano (Pasqual y Ferreira 2007).

Estudios realizados por Ferreira et al. (2007) enembriognesis somtica de higo usando los reguladoresde crecimiento 2,4-D y kinetina, demostraron la factibi-lidad de esta tcnica para la produccin de callo y en al-gunos casos, el inicio de la regeneracin de explantes.

La fase de establecimiento in vitro tiene comoobjetivo obtener material axnico y viable para iniciarel proceso de micropropagacin, por lo que es indis-pensable contar con material vegetal pretratado encondiciones de invernadero, ya que el material tomadodirectamente de campo posee en su supercie una

variedad de microorganismos que deben ser reducidospara facilitar los procedimientos de desinfeccin.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar y eva-luar las diferentes etapas de la micropropagacin delhigo.

MATERIALES Y MTODOS

Localizacin de la investigacin

La investigacin se realiz en el Centro de Inves-tigacin en Biotecnologa del Instituto Tecnolgico deCosta Rica, Cartago, Costa Rica, durante el perodo2006-2008.

Seleccin del material vegetal y preparacin de las

estacas

Con el n de disponer de material vegetal, se

seleccionaron 25 estacas con una longitud entre 20 y25 cm, provenientes de ramas rectas y lignicadas de

rboles con ms de 25 aos de edad, ubicados en lazona de Tierra Blanca en Cartago.

Para favorecer el enraizamiento, la parte basalde las estacas se sumergi en una solucin acuosa decido Indol Butrico (AIB) (600 ppm AIB) durante15 minutos. Posteriormente se plantaron en bolsas depolietileno negras, que contenan un sustrato a base detierra con carbn vegetal, en una proporcin 3:1, y seubicaron en el invernadero del Centro de Investigacinen Biotecnologa, del Instituto Tecnolgico de CostaRica, en donde se les aplic riego dos veces por semanay se realiz una fertilizacin foliar cada 10 das a partirde la brotacin. Adems se aplic una solucin de be-nomilo (50 % i.a.) (3 g/l) y de sulfato de gentamicina(2 % i.a.) y de clorhidrato de oxitetraciclina (6 % i.a.)cada ocho das, como pretratamiento, para mantener elmaterial en adecuado estado tosanitario.

Establecimiento in vitro

Procedencia y seleccin de los explantes

Del material ubicado en el invernadero, se colec-taron estacas de 8 cm de longitud, poco lignicadas.

Preparacin y desinfeccin de los explantes

Para el proceso de desinfeccin de los explantesse utiliz el protocolo base de De Faria (2003). Las


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estacas se lavaron con agua y jabn lquido, luego sesumergieron en una solucin de 6 g/l de benomilo (50% i.a.), 6 g/l de sulfato de gentamicina (2 % i.a.) y declorhidrato de oxitetraciclina (6 % i.a.) y 3,5 g/l de

dimetiltiocarbamato (76 % i.a.) por un perodo de 90minutos. Posteriormente se realizaron tres enjuaguescon agua destilada estril y una segunda desinfeccincon hipoclorito de calcio al 4 % (3,5 % i.a.) por unperodo de 10 minutos en la cmara de ujo laminar.

Se realizaron nuevamente tres enjuagues con aguadestilada estril y los explantes se mantuvieron en unasolucin de cido ascrbico (600 mg/l), con el n de

evitar la oxidacin del material.En total se realizaron cuatro ensayos de introduc-

cin de material para el establecimientoin vitro, cadauno con 13, 18, 13 y 16 explantes, respectivamente.

Inoculacin del material

Previo a la inoculacin de los explantes, stos seredujeron a 3 cm de longitud y se elimin el tejidodaado durante el proceso de desinfeccin. El mediode cultivo utilizado fue Murashige y Skoog (1962) ala mitad de sales minerales, 30 g/l de azcar, Bencila-minopurina (BAP) 1 mg/l, cido ascrbico 300 mg/l,ciprooxacina 175 mg/l y phytagel 3,5 g/l y de pH 5,7,

a una temperatura de 25 C y un fotoperodo de 16 ho-ras de luz, durante un perodo de doce das. Posterior-mente, durante un mes, los explantes se subcultivaronen el medio de inoculacin eliminando el antibiticoy el antioxidante, bajo las mismas condiciones deincubacin.

Se logr el establecimiento de 48 explantes entotal, cada uno inoculado en un frasco de cultivo. Seevalu el tipo y porcentaje de contaminacin pre-sentado, as como el porcentaje de supervivencia delmaterial vegetal.

Etapa de micropropagacin

Para desarrollar la etapa de multiplicacin, se

utilizaron los brotes obtenidos a partir del materialestablecido aspticamente. Se realizaron tres ensayoscon base en un medio Murashige y Skoog (1962) com-pleto, se adicion BAP a 1,0, 0,5 y 0 mg/l. La muestrafue de 48 explantes por tratamiento y se mantuvieronlas mismas condiciones ambientales empleadas en elestablecimiento in vitro. Se evalu el nmero de brotespromedio por explante a la cuarta semana de cultivo.

Etapa de enraizamiento

Para evaluar la induccin de races, los brotesobtenidos durante la etapa de multiplicacin fueron

inoculados en un Murashige y Skoog (1962), peroenriquecido con 0 0,5 mg/l de AIB.

La muestra fue de 48 explantes por tratamiento yse mantuvieron las mismas condiciones ambientalesque en las etapas anteriores. La evaluacin se realiz alas seis semanas de cultivo, anotando el porcentaje devitroplantas enraizadas.

Endurecimiento y aclimatacin de plntulas en

invernadero

Una vez que las vitroplantas presentaron un buen

desarrollo radicular fueron trasladadas al invernaderoen donde se sembraron en pequeos cilindro de tur-ba prensada en una malla, los cuales se expanden alcontacto con el agua y se le aplic a las plantas unbioestimulante que ayudara a controlar la transpira-cin. Permanecieron durante una semana en una lumi-nosidad de 1.210,33 lux; una temperatura promedio de24,20 C y una humedad relativa promedio de 82,80%. Luego se cambiaron las condiciones ambientales(1.538,11 lux; 23,40 C; 72,00 % HR) por otra sema-na. En esta condicin se aplicaron fertilizantes foliarescada cuatro das.

Una vez que las plantas alcanzaron 15 cm de lon-gitud aproximadamente, se transplantaron a bolsas depolietileno negras que contenan un sustrato a base detierra y trozos de carbn, desinfectado con carboxn(20 % i.a.) y thiram (20 % i.a) (3,5 g/l) y se mantuvie-ron en las siguientes condiciones: 4.752,33 lux; 22,70C; 69,00 % HR. En esta fase se inici un protocolode fertilizacin granulada empleando una formulacin(10-30-10), con el n de estimular su crecimiento y

desarrollo hasta su traslado a campo.

Anlisis estadstico

Los brotes por explante y el nmero de plantasenraizadas se analizaron mediante un anlisis de va-rianza ANOVA One Way. Se emple el programaestadstico StatSoft Inc. (2004) STATISTICA versin7.0. Adems se realiz un anlisis comparativo delas medias de cada muestra con la prueba de Tuckey,considerando un nivel de conanza de 99 % y para el

enraizamiento de un 95 %.


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RESULTADOS

Establecimiento in vitro

El mayor problema durante el establecimiento invitrodel higo fue la contaminacin fngica y bacteria-na (Figura 1). El promedio obtenido a partir de las cua-tro introducciones mostr un 45 % de contaminacinfngica, 23,33 % contaminacin bacteriana y un 31,67% de explantes limpios.

De los explantes limpios se observ 21,05% debrotacin con un promedio de tres brotes por explanteal mes de la incubacin (Figura 2 A).

Etapa de micropropagacin

El mayor nmero de brotes por explante se obtuvocuando se adicion al medio de cultivo 1 mg/l de BAP(Figuras 2B y 3). En ausencia del regulador de crecimien-

to se observ un bajo porcentaje de brotacin a la cuartasemana de evaluacin, pero una considerable emergencia

de races al nal del periodo (Figuras 2C y 3).

El anlisis estadstico mostr diferencias signi-cativas entre los tratamientos, con 1 mg/l de BAP

se obtuvo un promedio de seis brotes por explante, el

tratamiento con 0,5 mg/l BAP produjo cuatro brotespor explante, y el tratamiento sin regulador presentdos brotes por explante.

Figura 2. Ficus carica. A) Microestacasin vitro, B) Brotacin de microes-tacas, C) Vitroplantas en la etapa de enraizamiento, D) Vitro-plantas aclimatadas. Centro de Investigacin en Biotecnologa,Instituto Tecnolgico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica. 2007.

Figura 1. Porcentajes de contaminacin fngica, bacterianay explantes limpios obtenidos a partir de cuatro

introducciones. Laboratorio de Cultivo de Tejidos.Centro de Investigacin en Biotecnologa, Insti-tuto Tecnolgico de Costa Rica. Cartago, CostaRica. 2006.


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Enraizamiento in vitro

En los ensayos de enraizamiento se observaron di-ferencias signicativas entre los tratamientos (Cuadro

1). El mayor porcentaje de enraizamiento se obtuvo enausencia de reguladores del crecimiento (81,24 %), ala cuarta semana de cultivo (Figura 2C).

Para el tratamiento con 0,5 mg/l de AIB se ob-serv la formacin de un callo y los porcentajes deenraizamiento fueron inferiores (47,91 %).

Otro aspecto importante de mencionar es que alno utilizarse un regulador del crecimiento en el mediode cultivo, el porcentaje de enraizamiento no solofue superior al tratamiento con 0,5 mg/l de AIB, sinoque a partir de la cuarta semana se obtuvo el mximo

porcentaje de emergencia radical y de ah en adelantese mantuvo constante, mientras que al aplicar 0,5 mg/lde AIB la emergencia radical fue menor y el porcentajemximo se alcanz hasta la sexta semana.

Aclimatacin en invernadero

En invernadero se obtuvo un 100 % de plantasaclimatadas (Figura 2D), bajo las condiciones que se

preestablecieron.

DISCUSIN

El empleo de fungicidas de amplio espectro, mez-clado con fungicidas de contacto y bactericidas previo

al cultivo in vitro, mostraron resultados positivos parael control de un amplio rango de microorganismos yno se observ toxicidad ni dao al material vegetal(Pasqual y Ferreira 2007). Sin embargo, el hipoclorito

de calcio se utiliza en el establecimiento in vitroporla accin germicida del cloro, ya que forma cidohipocloroso cuando se mezcla con el agua, el oxgenoliberado en esta reaccin es un agente oxidante muyfuerte y los microorganismos son destruidos por suaccin sobre los componentes celulares. Adems, elcloro puede combinarse con enzimas y otras protenasde la membrana celular inactivndolas (Garca 1995).De Faria (2003) recomend para la desinfeccin de

explantes de higo la utilizacin de hipoclorito decalcio a concentraciones de 8 y 10 %, sin embargoel autor seala la presencia de un dao considerabledespus de este tratamiento; por lo que se decididiminuir la concentracin de hipoclorito de calcio eneste ensayo.

Cuadro 1. Evaluacin del porcentaje de enraizamiento de vitroplantas de higoen dos tratamientos durante un perodo de seis semanas. Centro deInvestigacin en Biotecnologa, Instituto Tecnolgico de Costa Rica.Cartago, Costa Rica. 2007.

Tratamiento % enraizamiento

E1 (0,5 mg/l AIB *) 0 0 0 16,67 31,24 47,91

E2 (Sin reguladores) 0 16,67 25,0 81,24 81,24 81,24

Semana 1 2 3 4 5 6

* AIB: cido Indol Butrico.

Figura 3. Brotes promedio por explante por semana paracada tratamiento. Centro de Investigacin en Bio-tecnologa, Instituto Tecnolgico de Costa Rica.

Cartago, Costa Rica. 2006.


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La aplicacin de los reguladores del crecimientoal medio de cultivo va a depender del tipo de diferen-ciacin que se desea obtener. En el higo para la esti-mulacin de las yemas axilares en la etapa de micro-

propagacin se emple la Benzilaminopurina (BAP).Esta citoquinina, aplicada en bajas concentraciones,promueve no solo la divisin celular sino la brotacinde yemas (Hurtado y Merino 1987). En este estudio semostr que al agregar al medio de cultivo 1 mg/l deBAP, se obtuvo la mayor cantidad de brotes, sin embar-go esta concentracin en esta especie fue alta, debido aque se obtuvo una brotacin aglomerada lo que impidirealizar una ptima separacin de los brotes sin maltra-tar el tejido, es por esta razn que la concentracin de0,5 mg/l de BAP fue ms favorable, ya que a pesar deque se obtuvo un menor nmero de brotes por explan-

te, stos se formaron ms separados, lo que facilit suaislamiento sin provocarles ningn dao.El papel de las auxinas en la iniciacin y creci-

miento radical es bien conocido (Salisbury y Ross1994), por lo que se recomienda su empleo en lamayora de los medios de enraizamiento. En estainvestigacin la auxina empleada fue el AIB, ya quesegn Salisbury y Ross (1994), es la ms utilizada enla induccin radical. El AIB es activo pese a que semetaboliza con rapidez en AIB-aspartato y al menosotro compuesto conjugado con un pptido. Se sugiereque la formacin de un conjugado almacena al AIB yque su liberacin gradual mantiene la concentracin deeste regulador en un nivel adecuado, especialmente enlos estados nales de la formacin de la raz.

Contrario a lo esperado, en esta investigacin laemergencia radical de las vitroplantas de higo expues-tas a un medio con AIB fue menor comparada con eldesarrollo radical obtenido en las vitroplantas expues-tas a un medio sin auxina. De acuerdo a Salisbury yRoss (1994) se ha observado que en muchas especieslas races crecen durante das y semanas in vitrosin ne-cesidad de agregar auxina, lo que indica que cualquiernecesidad de esta hormona que pueda tener una planta,es suplida por su capacidad de sntesis.

Una de las ventajas de no aplicar ningn reguladordel crecimiento al medio de cultivo es la disminucinde los costos de produccin durante esta etapa.

Las plantas en cultivo in vitrose comportan comohetertrofas o mixotrcas, por lo que en la fase de

aclimatacin son forzadas a ser autotrcas lo que

causa un cambio en la morfologa de las mismas que

las hace muy susceptibles a varios tipos de estrs(Pospisilova 1999).

Se han observado importantes cambios en lamorfologa y la anatoma de la hoja despus de pasar

las vitroplantas al invernadero, sobretodo en el grosorde la hoja, la diferenciacin del meslo y en el n-mero y estructura de los cloroplastos. Por ejemplo enestudios realizados enRubus idaeus, se observ que elnmero de tricomas era menor en las plantas in vitroalcompararlas con las plantas que fueron trasladadas alinvernadero. Tambin se observ que en plntulas dePrunus serotina, la densidad estomtica y la longituddel estoma decrecieron despus de que fueron trasla-dadas al invernadero (Pospisilova 1999). Estas modi-caciones en la estructura de las hojas tienen su efecto

en las relaciones hdricas y los procesos fotosintticos

de las mismas, lo que inuye directamente en la sobre-vivencia de las plntulas cuando stas son trasladadasde condiciones invitro a condiciones ex vitro.

Las vitroplantas de higo tienden a deshidratarserpidamente, razn por la cual las primeras dos sema-nas son criticas para lograr la aclimatacin. Esta des-hidratacin estuvo relacionada con el lento desarrollode la cutcula, de las ceras epiticulares y la indispo-nibilidad de un sistema estomtico funcional duranteel cultivo in vitro, lo cual causa altas tazas de trans-piracin, una vez que las plntulas han sido extradasde los frascos, para su aclimatacin en invernadero(Pospisilova 1999).

CONCLUSIONES

A pesar de que los porcentajes de contaminacinbacteriana y fngica fueron altos, en el cultivo in vitrodeFicus carica, se obtuvo un porcentaje de explanteslimpios y brotados que permitieron continuar con lassiguientes etapas del cultivo in vitro.

El protocolo para la multiplicacin in vitro fuedesarrollado exitosamente.

Para la etapa del enraizamiento in vitrodel higo

no se necesit adicionar auxinas al medio, lo quesugiere la presencia de altos niveles endgenos deauxinas en esta especie.

En la etapa de aclimatacin se sugiere manteneraltos porcentajes de humedad relativa y baja lumi-nosidad, debido a las altas tazas de transpiracin quepresentan las vitroplantas de higo.


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AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Vicerrectora de Inves-tigacin y Extensin del Instituto Tecnolgico de Cos-

ta Rica, a CONARE y a los productores por el apoyonanciero y la disponibilidad de material vegetal que

brindaron para realizar esta investigacin.

LITERATURA CITADA

Alberti, GI; Barbosa, SL; Guiorgio, PJ. 1992. La micro-propagacin: estrategias y posibilidades. Barcelona,Espaa. 315 p.

De Faria, F. 2003. Validacin del protocolo de propagacin

por estacas y acodos de Ficus caricay su estableci-

miento in vitro. Tesis Bach. Cartago, CR. InstitutoTecnolgico de Costa Rica. 46 p.Ferreira, E; Pasqual, M; Rezende, J. 2007. 2,4-D and kinetin

in callogenesis of Ficus caricaL. Acta Horticulturae(ISHS) 738:433-436.

Garca, V. 1995. Introduccin a la microbiologa. Editorialde la Universidad Estatal a Distancia. San Jos, CostaRica. 268 p.

Hurtado, D; Merino, M. 1987. Cultivo de tejidos vegetales.(reimp 2000). Mxico, Trillas. 232 p.

Melgarejo, P. 1999. El cultivo de la higuera (Ficus carica L).Madrid, Espaa. A. Madrid Vicente, ediciones. 100 p.

Murashige, T; y Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid

growth and bioassays with tocacco tissue cultures.

Physiology Plant 15:473-497.Navarro, W; Perea, M. 1996. Tcnica in vitropara la produc-

cin y mejoramiento de plantas. 2 ed. Heredia, CR.Editorial de la Universidad Nacional. 105 p.

Pasqual, M; Ferreira, ED. 2007. Protocols for micropropa-gation of wood trees and fruits, Chapter 37. Micro-propagation of g tree (Ficus carica). S.M. Jain; H.Hggman. eds. Brazil. 409-416.

Posposilova, J; Tich, I; Kadlecek, P; Haisel, D; Plzkov, S.1999. Aclimatization of micropropagated plants to exvitroconditions. Biologa Plantarum 42(4):481-497.

Roca, W; Ramrez, H. 2000. Introduccin a la Biotecnologa

Vegetal. Centro para el Desarrollo Agropecuarioy Forestal, Inc. CEDAF, Universidad Nacional de

Colombia. Vicente Zapata S., Serie Proyecto GORA.Ed D., Cali Colombia. 156 p.

Salisbury, F; Ross, C. 1994. Fisiologa vegetal. Cap. 17: Hor-monas y reguladores del crecimiento. Gonzlez, V (trad).

Grupo editorial Iberoamericana, Mxico. p. 395-411.StatSoft, Inc.US. 2004. STATISTICA (Data analyses software

system) (Programa de Cmputo) Versin 7.0 (CD-ROM). Tulsa, Oklahoma. 1 disco compacto, 8mm.


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