2003 A - 2008 A 395081088

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES

ESTANDARIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE

LEVADURAS AISLADAS DE LA FERMENTACIÓN DE MEZCAL

TRABAJO DE TITULACIÓN EN LA MODALIDAD DE TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA

PRESENTA PATRICIA BERENICE RAMÍREZ RODRÍGUEZ

Las Agujas, Zapopan, Jal., de Abril 2009

o

Universidad de Guadalajara Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias

Coordinación de Titulación y Carrera de Licenciatura en Biología

1256/ C. e.BIOLOGÍA C. Patricia Berenice Ramírez Rodríguez

PRESENTE

Manifestamos a usted que con esta fecha ha sido aprobado su tema de titulación en la modalidad de: Tesis e Informes, opción Informe de Práctica Profesional: con el titulo: "Estandarización de una técnica molecular de identificación de levaduras aisladas de la fermentación de mezcal" para obtener la Licenciatura en Biología.

Al mismo tiempo le informamos que ha sido aceptado como Director I a de dicho trabajo el/la: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis y como asesor el /la Dr. Liberato Portillo.

Sin más por e! momento, le envío un afectuoso saludo.

ATENTAMENTE "PIENSA Y TRAB

Las Agujas,

DR. FRANCISCO ARTÍN HUERTA MARTÍNEZ PRESIDENT EL COMITÉ DE TITULACIÓN

M en C. GLORIA PARADA BARRERA SECRETARIO DEL COMITÉ DE TITULACIÓN

Dr. Feo. Martín Huerta Martínez. Presidente del Comité de Titulación. Licenciatura en Biología. CUCBA

Presente

Nos permitimos informar a usted que habiendo revisado el trabajo de titulación, modalidad tesis, opción tesis con el titulo: "ESTANDARIZACIÓN DE UNA TECNICA DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS AISLADAS DE LA FERMENTACIÓN DE MEZCAL" que realizó la pasante PATRICIA BERENICE RAMiREZ RODRÍGUEZ con número de código 395081088 consideramos que ha quedado debidamente concluido. por lo que ponemos a su consideración el escrito final para autorizar su impresión.

Sin otro particular quedamos de usted con un cordial saludo.

" ' ) Aten.tam921te •) , r:

C(1\l ,(1.c\ t..?, LCl•"'1·.;; 'Y Patricia Berenice Ramírez Rodríguez

Las Agujas, Zapopan .. 24 de marzo de 2009

Dra. Anne Christir;ie Gschaedler Mathis Directora del trabajo

~,,.¿ /(;;r:tt(i DR. Liberato Portillo Martínez

Ll .... -c .· O.F.B. Luis Eduardo Segura Garcia

Asesores

Nombre completo de los Sinodales asignados por el Comité Finna de aprobado de Titulación

Dra. Ofelia Vargas Ponce

Dra. Olivia Rodríguez Alcantar

Dra. Anne Marguerite Helene Santerre

Supl. Dra. Ana Lilia Vigueras Guzmán

· Fecha de aprobación

Tesis realizada en el Laboratorio de Biología Molecular del Área de Biotecnología del

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

Guadalajara, Jalisco, México.

Dirigida por: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis

(CIATEJ)

Asesorada por:

Dr. Liberato Portillo Martinez (CUCBA-UDG)

Q.F.B. Luis Eduardo Segura Garcia (CIATEJ)

1

DEDICATORIA

Por ser !o más preciado en mi vida a mi madre, hennana, Jesse,

Grace, Nena y Lex

1

AGRADECIMIENTOS

A CIATEJ por darme la oportunidad de realizar mi tesis en esta institución, lo cual contribuye en mi formación profesional. A CONACYT por el apoyo económico que recibí como estudiante de la tesis.

A la Dra. Anne Gschaedler por aceptarme en su proyecto como estudiante, y por enseñarme que hay momentos donde uno debe de resolver los problemas que se presentan solo. Por ser tan generosa, digna de ser un ejemplo de constancia y dedicación al trabajo en la investigación.

A mis sinodales por haber aceptado serlo. Y por todas las aportaciones que tan generosamente me sugirieron hacer al documento para el enriquecimiento del mismo.

A mi mejor amiga Sarai por estar siempre en !os mejores momentos de mi vida, a Luis Segura por todos los coscorrones que me dio, y por los que me perdonó, a Manuel Kirchmayr. por compartir los momentos donde parecía que no podría estandarizar !a técnica, a Alma por ser amiga a parte de compañera y a Memo por ser tan idealista y compartir sus ideas conmigo.

Al Dr. Rodolfo Hemández por todos sus consejos para mi formación como profesionista, a la Dra. Érika Flores Berrios por ser tan sincera y a veces dura, al Dr. Abe] por su buen humor siempre. al Dr. Ortuño por ser tan generoso y al Mtro. Melchor.

A mi queridísimo asesor Liberato por enseñarme que todos somos parte de este gran todo, a la Dra. Lilia por hacer lo difícil más fácil. a mis profesores Miguel Magaña, Miguel Vazquez, Héctor Romero. Sergio Guerrero, Miguel Carvajal y Arie! por ser tan buenos docentes y por confiar siempre en mí.

A Montse. Gaby. José 1nóvil, Pedro, Juve. Sergio. Gris. Alonso. Octavio y a mi querido amigo Julio.

2

RESUMEN

ABREVIATURAS

ÍNDICE DE FIGURAS

ÍNDICE DE CUADROS

l. INTRODUCCIÓN

2. ANTECEDENTES

2.1 Agaves.

ÍNDICE

2.1.1 Generalidades del agave mezcalero.

2.1.2 Clasificación taxonómica de Agave salmiana Otto ex Salm.

2.1.3 Distribución.

2.1.4 Usos del Agave.

2.2 Producción de mezcal.

2.2.1 El mezca!.

2.2.2 Denominación de Origen y Nonna Oficial Mexicana.

2.3 Proceso de producción del mezcal.

2.3.1 Extracción de las piñas o cabezas de agave.

2.3.2 Cocción de las piñas.

2.3.3 Molienda.

2.3.4 Preparación de inóculo.

2.3.5 Fermentación.

2.3.6 Destilación.

2.4

2.4.1

2.4.2

2.5

Fermentación alcohólica.

Definición.

Microorganismos implicados.

Levaduras.

2.5. l Características generales y de interés económico.

2.5.2 Levaduras en la fermentación de bebidas alcohólicas.

2.5.2.1 Levaduras en vinos de uva.

2.5.2.2 Levaduras en la elaboración de la cerveza.

IV

V

VII

XI

3

3

3

3

4

5

6

6

6

8

8

8

9

9

10

10

10

10

11

11

11

13

13

17

2.5.2.3 Levaduras en bebidas destiladas del tequila y mezcal.

2.6 Métodos de identificación de especies de levaduras.

2.6.1 Importancia de la identificación.

2.6.2 Métodos tradicionales.

2.6.3 Métodos moleculares.

2.6.3.l Métodos basados en el análisis del genoma ribosomal.

2.6.3.2 Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

4. JUSTIFICACIÓN

5. HIPÓTESIS

6. OBJETIVOS

6.1 Objetivo genera!.

6.2 Objetivos específicos.

7. MATERIAL Y MÉTODOS

7.1 Método general.

7.2 Levaduras y medios de cultivo.

7 .2.1 Levaduras de colección de Italia.

7.2.2 Levaduras de inóculo de San Luis Potosí.

7 .2.3 Medios de cultivo.

7.3 Muestreo.

7.4 Identificación bioquímica.

7 .5 Identificación molecular.

7 .5.1 Extracción de ADN genómico.

7.5.2 Electroforesis en gel de agarosa.

7.5.3 Espectrofotometría a A= 260nm.

7.5.4 Amplificación de la región 5.8S ribosomal con iniciadores ITS.

7.5.5 Digestión enzimática.

8. RESULTADOS

18

19

19

19

21

21

24

27

28

29

30

30

30

31

31

32

32

33

34

35

36

37

37

38

38

39

41

42

11

8.1 Descripción morfológica de las cepas de levaduras en cultivo en placa. 42

8.2 Caracterización bioquímica. 44

8.3 Análisis molecular. 47

8.3.1 Extracción de ADN genómico. 47

8.3.2 Concentración y pureza de ADN.

8.3.3 Amplificación de la región ITSM5.8MITS2.

8.3.3.1 Amplificación de ADN.

8.3.3.2 Amplificación directa de las colonias.

48

51

51

52

8.4 Digestión enzimática. 53

8.4.1 Resultados de cepas SLP091007 aisladas de inóculo de San Luis Potosí. 58

9. DISCUSIÓN 61

10. CONCLUSIONES 64

11. LITERATURA CITADA 65

"'

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue identificar levaduras aisladas del proceso

fennentativo del mezcal a nivel de especie, de una zona de San Luis Potosí (mezcalera

··La Perla .. ), mediante el empleo de una técnica molecular basada en el análisis del

polimorfismo de longitud de !os fragmentos de restricción (RFLP) del gen que codifica

para el ARN ribosomal 5.8s. Además, contribuir al conocimiento sobre las levaduras

que intervienen en la fermentación del mezcal e, implementar el análisis molecular

como un método confiable para la identificación de los microorganismos participantes.

Una vez realizada la amplificación del fragmento de! gen ITS l-5.8-ITS2. se realizó

la digestión con las enzimas de restricción Hha !, Hae 111 y Hin/ l. Se obtuvieron los

siguientes perfiles: siete grupos de levaduras diferentes. de !as cuales las siguientes

cinco se identificaron a nivel de especie: Kluyveromyces lactis. Pichia fi:rmentan,s.

Rhodo1orufa n1ucilaginosa. Saccharomyces cerevisiae y Hansen1'aspora guil!iermondii

y dos a nivel de género que fueron: Pichia e Issatchenkia.

El método de RFLP permitió identificar levaduras hasta nivel de especie con

95.455o/() y con 4.455o/() a nivel de género con los patrones de polimorfismo reportados

hasta el momento, y se consiguió establecer y estandarizar un protocolo corto para la

identificación de levaduras presentes en el inóculo muestreado.

IV

ATP

AFLP

APD

ARA

ADO

APIC

A

ADN

ADN~

CEL

C02

e •e DI

Dl

EDTA

ETS

GLJ

GL>

G

GAL

\:"O

ITS

JA

kb

LAC

_\<IDG

MAL

MLZ

mtDNA

·" NAG

nM

J\"TS

nAD;>;

02

PCR

PM

Pb

DGGE

PBS

RARP

RFLP

RAF

•pm

ABREVIATURAS

Adenosin tnti:;islato

Pohmortismo de la longitud de los fragmentos amph!icados

Agar papa dextrosa

L-Arabmosa

AOOmlOI

Prueba de 1dent1flcac10n automat1ca

Adenma

Ac1do desox1mbonucle1co

Ac1do desox1mbonucle1co nbos6m1co

D-celobiosa

D16x1do de carbono

C.tosma

Centigrados

l)om1mo 1

Dom1mo ~

Ac1do et1leno d1am1no tetraceuco

bpac1ador transcnb1ble externo

U-UIL1cosa

lilicerol

Guanina

D-Galacto>a

HorJ

lnosnol

l:spac1ador lrnnscnbcblc mterno

Agar Jugo de agave

Kilo bases

[)-Lactosa

:vtd1l-aU-<.ilucop1ranosKla

[)-Maltosa

D-Mclernosa

AON m1tocondnal

Molar

N-Acet1 l-Glucosam1na

Nanómetro

Espaciador no transcflb1ble

AüN nuclear

Oxigeno

Reacc•ón en cadena de la pollmerasa

Peso molecular

Pares de bases

Electrot0res1s en gel por gradiente desnaturahzante

Solución arnon1guadora de ti:lsfatos

Ampliticac1ón de secuencias repetidas aleatoriamente

Pollmortismos en la longitud de los fragmentos de restncc1ón

0-Rafinosa

Revoluciones por mmuto

V

AR.J-.:r

SLP

SAC

SOR

SDS

'PP TRE

TBE

T

TE

TAE

l'V

ufc/mL

WL

XYL

XLT

YPD

2KG

Ac1do desox1mbonucle1co nbosomal

San Luis Potosi

O-Sacarosa

D-Sorb1tol

D<;dec1I Sulfato de Sodio

Sin especies espect!icas

1)-Trehalosa

Tns-Borato-EDTA

Tris-EDTA

rns acetato- COTA

Ultravioleta

Unidades !Orrnadoras de colonia por m1illnro

Agar Walerstcm laboratono

0-Xylosa

Xylttol

Agar extracto de levadura peptona y dextrosa

2-ceio-Uluconato de calcio

VI

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura l. Especies de agaves utilizados para la elaboración de mezca\: Izq. Agave. 3

sa/miana Otto ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trel.) Gentry (maguey verde o

mezcalero). Der. Agave angustifolia Haw. (maguey espadín).

Figura 2. Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trel.) Gentry en 4

hábitat natural en San Luis Potosí, México. Foto Ran1írez-Rodríguez.

Figura 3. Número de especies de Agavaceae que se encuentran en cada Estado de 5

la República Mexicana (García-Mendoza. 1998).

Figura 4. Especies más utilizadas para la elaboración de mezcal: Agave 5

angusllfolia, A .. \·a/miana. A. tequilana. A. cupreata, A. karwinskii (CONABIO.

2005).

Figura 5. Estados de la República \!lexicana con denominación de origen Mezcal: 6

1) Durango. 2) Tan1aulipas. 3) Zacatecas. 4) San Luis PotosL 5) Guanajuato. 6)

Ciuerrero y 7) Oaxaca.

Figura 6. Piñas del Agave salnliana Ono ex Sa!in-Dyck ssp crassispinu (Tre!.) 8

Gentry utilizadas para la producción de 1nezcal.

Figura 7. Horno de mampera en el cual se cocen las piñas para el proceso del 8

mezcal en San Luis Potosí.

Figura 8. Molino de piedra para la trituración del agave cocido. 9

Figura 9. Tinas con inóculo para !a fermentación del mezca\ en San Luis Potosí. 9

Figura 10. Tina de fermentación para proceso del mezcal de San Luis Potosí. 11

Figura 11. Levaduras aisladas del proceso fermentativo de San Luis Potosí: Izq. 11

Rhodotorula mucilaginosa. Der. Saccharomyces cerevisiae.

VII

Figura 12. Esquema de la estructura nuclear de AONr. 21

Figura 13. Galería APJ 20 C AUX (bioMérieux) con 20 cúpulas con sustratos 36

deshidratados: O-glucosa. gliceroL 2-ceto-gluconato cálcio, L-arabinosa, D-Xylosa.

Adonitol, Xylitol, O-galactosa, Inositol, 0-sorbito!, Metil-a:D-Glucopiranosida. N

Acetil-Glucosamida, 0-celobiosa. O-lactosa, D-ma!tosa, O-sacarosa, D-trehalosa.

0-melezitosa y D-rafinosa.

Figura 14. Aspecto de las colonias de !evaduras cultivadas en medio WL. 1: 42

levaduras del grupo 1: 2: levaduras del grupo 11; 3: levaduras del grupo lll; 4:

levaduras de! grupo IV: 5: levaduras del grupo V; 6 lcvaduras antes del aislamiento

por grupos.

Figura 15. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción del 47

ADN de las cepas aisladas del proceso fennentativo de 1nezcal de San Luis Potosí.

Carriles 1-20: (A, B. CD. E. F. G. H. L J_ K. M. N, O. P, R, S. T y U).

Figura 16. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción del 47

ADN de las cepas aisladas del proceso fermentativo de mezcal de San Luis Potosí

y colección de Italia. Carriles 1-20: (V, \V. X. Y. Z. A!. B l. C L O l. El, l. 2. 3. 4.

6.9. I0, 12y 13).

Figura 17. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción de 47

ADN de cepas de colección de Italia. Carriles 1-11: (15. 17.18, 19. 20. 21. 25, 26.

28. 29 y 33).

Figura 18. Gel de electroforesis para visualizar la amplificación de la región ITSl- 51

5.8S-ITS2 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19:(Al, E, F, K, L, R, S, CI,

G, H, O, V, Z DI, El, I, J y M). Carriles M indican: marcador de peso molecular

de 100 pares de bases.

Figura 19. Ge! de electroforesis para visualizar la amplificación de la región ITSl- 52

VIII

5.8S-JTS2 de las cepas de San Luis Potosí. Carrilesl-9: (N, P, U, X, Y, T, W, A y

B 1 ). Carril M indica: marcador de peso molecular de l 00 pares de bases (MPM).

Figura 20. Gel de electroforesis para visualizar amplificación a partir de colonias 52

de cepas representativas de cada grupo de San Luis Potosí. Carriles 2-6: (E, Cl, !,

W y U). Carriles l y 7 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases

(MPM).

Figura 21. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha l, Hae III y HinfI 53

de cepas de San Luis Potosí. Carriles 1-19: (A l. E, F, K, L y B). Carriles 4 y 20

indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

Figura 22. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha 1, Hae JI! y Hinfl de 53

las cepas de San Luis Potosí. Carriles 1-19: (R, S, SLP2, SLP5. SLP8 y SLP15).

Carriles 4 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

Figura 23. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha l. Hae 111 y !iinfl de 54

cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-13: (CL G. H y Z). Carril l indica: marcador

de peso molecular de 100 pares de bases (MP.M). E! recuadro marcado con rojo

señala la banda que diferencia las cepas de la posible especie Pichia

men1branaefanciens y las cepas de Pichiafermentans.

Figura 24. Ge! de electroforesis de digestión con enzimas Hha l. Hae 111 y Hinfl 55

de las cepas de San Luis Potosí. Carriles J-6 y 9-26: A, DI, V, O, SLPl. SLP4.

SLPJ J y SLP12. Carriles 7, 8 y 27 indican: marcador de peso molecular de 100

pares de bases (MPM).

Figura 25. Gel de electroforesis con digestión con enzimas Hha I, Hae 111 y Hinfl 55

de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-10: El, SLP14 y V./. Carril !indican:

marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

Figura 26. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha I, Hae III y Hifl de 56

las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19: N, J, C, Y, T y SLP6. Carriles l y 20

IX

indican: marcador de peso molecular de l 00 pares de bases (MPM).

Figura 27. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha 1, Hae III y Hinf I 56

de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: SLP9 y SLP13 y carriles

13,14,15, 16, 17 y 18: I y M. Carriles 1, 9 y 19 indican: marcador de peso

molecular de l 00 pares de bases (MPM).

Figura 28. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha I, Hae IJI y Hinfl 57

de cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19: P, U, X, D, SLP7yB1. Carril 1 indica:

marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

Figura 29. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hhaf, Haelll y Hinfl con 58

!a cepa de San Luis Potosí. Carriles 1-3: SLP3

X

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro l. Levaduras presentes en las etapas de fennentación del jugo de uva. 14

(Tomado de Romano y col., 2006).

Cuadro 2. Papel bioquímico y efecto causado por levaduras en vino. (Tomado de 14

Romano y col., 2006).

Cuadro 3. Levaduras presentes en la fermentación de la cerveza. (Tomado de 17

Romano y col., 2006).

Cuadro 4. Levaduras de bebidas destiladas elaboradas con agave. (Tomado de 18

Lappe y col.. 2008; Esca!ante-Minakata y col.. 2008; Romano y col., 2006).

Cuadro 5. Técnicas moleculares para la identificación y caracterización en 22

levaduras. (Tomado de Fernández-Espinar y col., 2001 ).

Cuadro 6. Trabajos que utilizan métodos moleculares de identificación y 23

caracterización en levaduras.

Cuadro 7. Levaduras aisladas identificadas por técnica de análisis de restricción de 25

los fragmentos.

Cuadro 8. Colección de Italia, de cepas utilizadas como control positivo para la 32

identificación.

Cuadro 9. Levaduras de mezcalera La Perla (inóculo) 040907SLP, 091007SLP y 33

SLP091007.

Cuadro 10. Reactivos para medios de cultivo. 34

Cuadro 11. Cajas petri con diluciones de jugo de agave con agua fisiológica. 35

Cuadro 12. Procedimiento para inocular galería API 20 C. 36

XI

Cuadro 13. Equipo y reactivos para la extracción de ADN. 37

Cuadro 14. Descripción morfológica de los grupos de las levaduras de SLP en 43

medio WL.

Cuadro 15. Perfiles bioquímicos de las colonias por galerías API 20 C 44

(bioMérieux).

Cuadro 16. Levaduras identificadas por prueba bioquímica (galerías API 20 C). 45

Cuadro 17. Espectrofotometría de levaduras de la colección de Italia y San Luis 48

Potosí, los números indican las muestras de la colección de Italia y las letras las

cepas de San Luis Potosí.

Cuadro 18. Tamaño del amp!icón y de Jos fragmentos de digestión de [as cepas del 54

Grupo 1: AL E, F, K. L, B, R. S. SLP2. SLP5. SLP8 y SLP15.

Cuadro 19. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 54

Grupo 11 a: CI, G, H y Z.

Cuadro 20. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 55

Grupo 11 b: cepas A, DI, V, O, SLPI, SLP4, SLPI 1 y SLP12.

Cuadro 21. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 56

Grupo lll: El, W y 14.

Cuadro 22. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 57

Grupo IV: N, J, C, Y, T, 1, M, 6, 9 y 13.

Cuadro 23. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 57

Grupo V: P, U, X, D, 7 y Bl.

XII

Cuadro 24. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 58

Grupo Grupo VI: cepas SLP3.

Cuadro 25. Referencia de los articulos publicados con los que se compararon las 59

cepas para la identificación de levaduras.

Cuadro 26. Tamaño de pares de bases (pb) de los productos de PCR y fragmentos 60

de restricción.

XIII

INTRODUCCIÓN

En México existe una amplia gama de bebidas alcohólicas que se obtienen por

medio de la fermentación de maíz y de algunas especies de agaves. Entre éstas y

dependiendo de la región, las de mayor tradición, son el pulque, mezcal, tepache,

tejuino y curados; muchas de ellas, han sido consumidas desde la época prehispánica

(García-Mendoza, 1998).

En los últimos años, las bebidas destiladas de agave se han revalorado como bebidas

tradicionales de importancia cultural y económica. Éstas son obtenidas a partir de

mostos fermentados de diferentes especies de agaves. Las presentaciones más comunes

son el tequila, mezcal, bacanora y raicilla (Lachenmeier y col.. 2006).

En generaL el proceso de elaboración de estas bebidas es muy similar. Se basa en la

cocción de las piñas de agave para hidro!izar los fructanos y generar azúcares simples

como fructosa y glucosa: y en !a molienda de las piñas cocidas para obtener el jugo

(mosto). El mosto es sometido a fermentación (los azúcares son convertidos a etanol y a

otros compuestos organolépticos como ésteres. ácidos orgánicos. alcoholes superiores y

otros metabolitos) y finalmente a destilación. En algunos casos la bebida resultante se

añeja o reposa.

La fermentación es un proceso bioquímico donde participan microorganismos que

emplean el mosto como sustrato para sus necesidades metabólicas. La calidad del

mezcal está relacionada con la microbiota involucrada (levaduras y bacterias). que

determinan !as características del producto final. Las levaduras tienen importancia

económica dado el papel que cumplen en la producción de esas bebidas alcohólicas.

Para detenninar las características particulares de una bebida, es necesario reconocer

que microorganismos intervienen en el proceso. Para este reconocimiento se han

empleado técnicas clásicas que se basan en la descripción morfofisiológica de especies

y géneros, éstas dependen de las condiciones de cultivo de las cepas lo que puede

ocasionar errores en la determinación taxonómica, tales como dualidad en la

nomenclatura.

1

Se ha demostrado que las técnicas moleculares son eficaces para llevar a cabo

identificaciones confiables y contribuyen a la solución de este problema. Esteve­

Zarzoso y col. (1999) utilizaron la técnica molecular del análisis de polimorfismo de

longitud de los fragmentos (RFLP) para identificación de levaduras en vino

reconociendo obtuvo 132 especies.

El objetivo de este trabajo fue identificar levaduras aisladas del proceso

fermentativo del mezcal, de una zona de San Luis Potosí. Mediante el empleo de una

técnica molecular basada en el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos

de restricción (RFLP), Así como, contribuir al conocimiento de levaduras que

intervienen en la fermentación del mezcal e, implementar el análisis molecular como un

método confiable para la identificación de los microorganismos participantes.

Este estudio fue realizado dentro del proyecto de .. Diversidad y Actividad de las

Comunidades Microbianas Asociadas al Proceso Fermentativo del Mezcar. Financiado

por el fondo SEP-CONACYT.

2

2. ANTECEDENTES

2.1. Agaves

2.1.1. Generalidades del agave mezcalero

Los agaves mezcaleros son aquellos magueyes utilizados para la producción de

bebidas alcohólicas destiladas (Blomberg, 2000). Junto con las yucas o izotes y amoles

pertenecen a la familia Agavaceae. Son plantas suculentas típicas de las zonas

semiáridas de México con gran importancia biológica, ecológica y económica para el

país (García-Mendoza y Galván, 1995) (Figura 1 ).

f igura l. Especies de agaves uti lizados para la elaboración de mezcal: Izq. Agal'es salmiana Ouo e:-. Salm-Dyck ssp crassispisna (Trel.) Gentry (maguey verde o mezcalero) Der. Agave angustifolia lla\\ . (maguey espadín).

2.1.2. Clasificación taxonómica del Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck

Gentry ( 1982) reconoce dos subgéneros Agave y Liuaea. El subgénero Agave

está dividido en doce grupos con 83 especies. Agave. salmiana ha sido clasificado

dentro del grupo Salmianae.

Del A. salmiana, se producen varias bebidas alcohólicas, entre ellas el

mezcal, y el pulque que es obtenido a partir de la fermentación del aguamiel. Sin

embargo, en la actualidad tienen mayor consumo las bebidas obtenidas de la destilación

de los fermentos (Figura 2) (García-Mendoza, 1998).

3

Figura 2. Agave salmiana Ono ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trel.) Gentry en hábitat natural en San Luis Potosí. México. Foto Ramirez-Rodriguez.

2.1.3. Distribución del género Agave

Maguey verde ó mezcalero

Agave salmiana Clasificación cientifica

Reino: Subreino: División: Clase: Orden: Familia: Género: Especie:

Plan tac Embryobionta Magnoliophyta Liliopsida Liliales Agavaceae Agave salmiana Ono Ex Salm ssp crassispina (Trel) Gentry.

El género Agave está constituido por aproximadamente 200 especies de las

cuales 150 existen en México, con una amplia distribución ya que se encuentra en más

de 75% del territorio (Figura 3). En México hay regiones que poseen más especies que

otras; tienen mayor presencia en las provincias áridas y semiáridas del centro y norte.

Su número disminuye drásticamente hacia las provincias húmedas y cálidas del sur, por

lo que su ausencia es notoria en estados como Tabasco, Campeche y Quintana Roo. Son

abundantes en las provincias tlorísticas de las Serranías Meridionales del centro de

México y Sierra Madre Oriental (García-Mendoza, 2002).

En lo que se refiere a la especie de interés para este trabajo (A. salmiana) se

presenta en las tierras altas del centro de México. Generalmente en elevaciones entre

5,000 y 8,000 pies ( l ,520-2,460 msnm) (Gentry, 1982).

4

Fig ura 3. Número de especies de de la familia Agavaceae que se encuentran en cada estado de la República Mexicana (García-Mendoza 1998).

2.1.4. Usos del Agave

En la actualidad en México aún se señalan más de 70 fo rmas de empleo en los

magueyes. entre ellas la elaboración de fibras textiles, papel, forraje, delimitación de

terrenos y parcelas, med icinal, re ligioso. plantas ornamentales y bebidas fermentadas

(como el pulque), bebidas destiladas (Figura 4) (como el tequi la y el mezcal) (García­

Mendoza, 1998; Gallardo y col., 2008) .

• Figu ra 4. Especies de Agave más utilizadas para la elaboración de mezcal: A. angusrifolia, A. salmiana, A. tequilana, A. cupreata, A . korwinskii (CONABIO, 2005).

5

2.2. Producción de mezcal

2.2.1. El mezcal

La palabra mezcal proviene del náhuatl mexcalli, que significa maguey cocido.

El mezcal es una bebida alcohólica destilada que se obtiene de la fermentación de las

cabezas o piñas de la planta de agave (Aguirre-Rivera y col., 2001 ). Para su elaboración

pueden utilizarse las diferentes especies de Agave, que se encuentran en los estados de

la República Mexicana. Las diferencias organolépticas entre los mezcales radican en las

especies utilizadas para su elaboración y en la forma artesanal o semi-industrial de

obtención del producto.

2.2.2. Denominación de Origen Mezcal y Norma Oficial Mexicana

La Denominación de Origen Mezcal fue publicada el 28 de noviembre de 1994,

en el Diario Oficial de la Federación (D.O.F.). En el que se estableció como región

geográfica la comprendida por los estados de Oaxaca, Guerrero. Durango, San Luis

Potosí y Zacatecas. En 2001 se incorporaron algunos municipios de Guanajuato y en

2003 otros de Tamaulipas (Figura 5). La denominación ind ica el lugar geográfico de un

país para designar un producto originario, cuyas características se deben exclusivamente

a ese med io geográfico, resultado de factores naturales y humanos.

Figura S. Estados de la República Mexicana con Denominación de Origen Mezcal: 1) Durango. 2) Tamaulipas, 3) Zacatecas. 4) San Luis Potosi, 5) Guanajuato, 6) Guerrero y 7) Oaxaca.

6

La Norma Oficial Mexicana aplicable y vigente (NOM-070-SCFI-1994),

publicada en el D.0.F. el 17 de agosto de 1994, establece las características y

especificaciones que deben cumplir los usuarios autorizados para producir y/o

comercializar mezcal, donde especifica las principales especies utilizadas para la

elaboración:

> Agave angustifolia Haw.

> Agave esperrima Jacobi

> Agave weberi Cels ex Poisson

> Agave potatorum Zucc

;;.. Agave salmiana Otto ex Salm ssp crassispina (Trel.) Gentry

También se pueden utilizar otras especies de agave. siempre y cuando no sean

utilizadas como materia prima para otras bebidas con denominaciones de origen dentro

del mismo estado. Además. se protege a los productores de bebidas elaboradas mediante

la destilación de magueyes de las especies mencionadas. La norn1a tainbién establece el

porcentaje de los carbohidratos provenientes del agave que deben utilizarse en !a

elaboración de! mezcaL !os cuales se clasifican en:

Tipo 1.- Mezcal 1 OOo/o agave es aquel producto que se obtiene de la destilación y

rectificación de mostos preparados directa y originalmente con los azúcares de las

cabezas maduras de los agaves. previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas a

fermentación alcohólica con levaduras. cultivadas o no. Este tipo de mezcal puede ser

joven, reposado o añejo y susceptible de ser abocado (procedimiento para suavizar e!

sabor).

Tipo IJ.- Mezcal es aquel producto que se obtiene de la destilación y rectificación de

mostos en cuya formulación se han adicionado hasta un 20o/o de otros carbohidratos

permitidos, este tipo de mezcal puede ser joven, reposado o añejo y susceptible de ser

abocado.

7

2.3. Proceso de producción del mezcal en el estado de San Luis Potosí

El proceso de producción de esta bebida consta de varios pasos básicos, cuyos

detalles pueden variar de una mezcalera a otra, o de un estado o región a otra. El

procedimiento general es el siguiente:

2.3.1. Extracción de la piña: Como materia prima se emplean tallos de plantas

maduras (6-1 O años), desprovistos de sus hojas y raíces, a los que se les

llama piñas o cabezas (Figura 6).

Figura 6. Piñas del Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trcl.) Gentry utilizadas para la producción de mezcal.

2.3.2. Cocción de las piñas: Se realiza durante un día en hornos de piedra

calentados con leña. En esta etapa es donde se hidrolizan los azúcares de

los agaves principalmente a fructosa (Figura 7).

Figura 7. Homo de mampera en el cual se cocen las pin:is para el proceso del mezcal en San Luis Potosí.

8

2.3.3. Molienda: Las cabezas se desmenuzan en pedazos con una hacha y se

pasan a l molino llamado tahona (molino chileno), usando una rueda,

movida por un animal de carga. Esta trituración permite que los

monosacáridos obtenidos de la cocción sean disponibles a la acción

microbiana. El agave molido o pulpa se coloca en tinas de fermentación

(Figura 8).

Figura 8. Molino de piedra para la trituración del agave cocido.

2.3.4. Preparación de inóculo: El j ugo de agave es colocado en contenedores

para que se inicie el proceso de fermentación (Figura 9).

Figura 9. Tinas con inóculo para la fermentac ión del mezcal en San Luis Potosí.

9

2.3.5. Fermentación: Es el proceso de transfonnación de los azúcares en

alcohol etílico. Se deposita el inóculo en las tinas de fennentación, dura

alrededor de 17 h para el caso de San Luis Potosí (Figura 1 O).

Figura 1 O. Tina de fermentación del proceso del mezcal de San Luis Potosi.

2.3.6. Destilación: Concluida la fermentación se pasan los jugos a destiladores,

de cobre o de barro llamado alambique que consta de tres partes: la olla o

la caldera, donde se deposita el mosto para su calentamiento; la columna,

que recoge y conduce los vapores, y e l serpentín de enfriamiento, en donde

de condensan los vapores. Aquí se efectúa la separación del alcohol del

agua por medio de sus diferentes puntos de ebullición. Debido a su

estructura molecular el etanol, tiene un punto de ebullición más bajo que el

agua (78.5° Ca nivel del mar).

2.4. Fermentación alcohólica

2.4.1. Definición

Es un proceso biológico originado por la actividad de algunos microorganismos

que procesan los hidratos de carbono (glucosa, fructosa, sacarosa o almidón), para

obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (CH3-CH2-0H), dióxido

de carbono (C0 2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios

microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El etanol resultante

se emplea en la elaboración de bebidas alcohólicas.

10

2.4.2. Microorganismos implicados

La fermentación alcohólica es realizada por microorganismos como levaduras y

algunas clases de bacterias. Las levaduras son el grupo más importante que se explota

para los propósitos comerciales; se han utilizado por milenios en la fabricación de pan y

en la producción de bebidas alcohólicas. La d iversidad de las bebidas fermentadas que

se producen a través del mundo, varía según su área geográfica y cultural. Sus

características individuales y pecul iares determinadas por la expresión de la

biodiversidad de los microorganismos que están presentes en el mosto, de los cuales se

van se leccionando aquellos que son más competitivos en cada fase de la fermentación

(Pretorius, 2000).

2.5. Levaduras

2.5.1. Características generales y de interés económico

Las levaduras son hongos microscópicos unicelulares, se clasifican dentro el

reino Fungi. Una levadura se define como un hongo basidiomiceto o ascomiceto que se

multiplica de manera vegetativa, principalmente por gemación o fisión y que no

presenta durante su fase sexual cuerpos fructíferos internos o externos (Kurtzman y

Ronen, 1998) (Figura 11 ).

Figura 1 J. Levaduras aisladas del proceso fermentativo muci/a inosa. Der. Saccharom ces cerevisiae.

11

La taxonomía de levaduras ha transitado por dos períodos. El primero

caracterizado por estudios de morfología comparativa, fisiología y genética

convencional. El segundo, que se extiende hasta la actualidad, identificada por una

ampliación en los estudios de morfología a nivel ultramicroscópico, la aplicación de

criterios bioquímicos e introducción de los estudios de la biología molecular.

Las levaduras han colonizado una gran parte del planeta, se pueden aislar del

aire, agua y tierra. Dependen de la presencia de una forma orgánica de fuente de

carbono, por ejemplo: azúcares simples, ácidos orgánicos y grasos, alcoholes alifáticos,

etcétera. No poseen capacidad de desplazamiento por sus propios medios, por lo que

dependen de vectores como el viento, los animales (principalmente los insectos) o la

misma actividad humana (Frazier y Westhoff, 1993). En el caso de la elaboración de

bebidas alcohólicas, provienen de dos hábitats diferentes: las materias primas

(principalmente vegetales) y las fábricas donde éstas se procesan.

Los dos principales géneros de levaduras de interés comercial son C'andida y

Saccharomyces. Especialmente S. cerevisiae y especies cercanas han sido empleadas en

la panadería y producción de alcohol (Cavazzan. 1985).

El impacto de las levaduras en e! alimento y la producción de la bebida se

extienden más allá de las nociones originales de las fermentaciones del pan, cerveza y

vino con S. cerevisiae. En un contexto positivo, contribuyen a la fermentación de una

amplia gama de otras materias, donde varía la especie de levadura que puede trabajar en

conjunto con bacterias y hongos filamentosos.

La importancia comercia! de la comunidad de las levaduras en la producción de

bebidas y alimentos es: la elaboración de fermentos, fabricación de ingredientes y

aditivos para la industria alimenticia, desperdicio de productos de aliment.ación y

bebidas, fuente de levaduras oportunistas patógenas, probióticos y agentes terapéuticos

(Fleet, 2006).

12

2.5.2. Levaduras en la fermentación de bebidas alcohólicas

La implicación de las levaduras en la fennentación alcohólica es fundamental,

ya que este proceso es realizado y completado por un número limitado de cepas

dominantes asociadas a un número variable de cepas secundarias, donde va

aconteciendo una sustitución secuencial de cepas durante la fennentación. En la medida

que ésta va progresando, los niveles de alcohol aumentan, centrándose en Ja especie

dominante y su efecto sobre la calidad del producto (Capello y col., 2004).

En este contexto, resulta necesario conocer las relaciones ecológicas que se

establecen en cada fase, tomando en consideración que existe un gran número de

especies de levaduras que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus modos de

reproducción y por !a forma en Ja que transforman el azúcar.

2.5.2.1. Levaduras en vinos de uva

Las levaduras del vino pertenecen a una docena de géneros, que incluyen varias

especies como: Saccharon1yces ellipsoideus. K!oeckera apicu!a1a y Hanseniaspora

11varun1. las cuales representan el 90o/o de las levaduras utilizadas para la fermentación

de! vino, que se encuentran en su etapa inicial en bayas maduras de la uva. Los cuadros

1 y 2 muestran las levaduras que se encuentran implicadas en la fermentación del jugo

de uva y sus efectos al producto.

13

Cuadro l. Levaduras presentes en las etapas de fennentación del jugo de uva (Tomado de Romano y

col.. 2006).

Levaduras más abundantes en la primera etapa

de la fermentación

Saccharomyces ef/ipsoideus, Kloeckera apiculata,

Hanseniaspora uvarum en 90o/o de las bayas

maduras

Levaduras más abundantes en la etapa

intermedia de la fermentación

Hanseniasporu. l\./oeckera. Candida. Pichiu.

l\.h(vrerontvces: /'vlelschnikowia

Levaduras más abundantes en la etapa final de

la fermentación

Saccharomyces sensu stricto (S cerevisiae, S.

paradoxus, S. bayanus y S. pastorianus)

Levaduras menos abundantes en la primera

etapa de la fermentación

Candida spp. Brettanomyces spp. Cryptococcus,

Kfuyveromyces. Metschnikowia spp. Pichia spp,

Hansenu/a spp. Rhodotorula spp

En bayas inmaduras predominado

Rhodotorula, Cryptococcusy Candida con la

levadura-como hongo Aureobasidium pullu!ans

Las poblaciones de S. cerevisiae son bajas al

inicio de las fermentaciones

Levaduras menos abundantes en la etapa

intermedia de la fermentación

//anseniaspora. l\.loeckera. Candida. Piclua,

Kfuyreromyce.1· J . .\1etschnikowia. comienzan a

disminuir cuando la producción de etanol excede

de 5-7%

Levaduras menos abundantes en la etapa final

de la fermentación

Breuanomyces, Kluyveromyces.

Schi:osaccharomyces, Torulaspora y

Zygosaccharomyces

Son más tolerantes al etanol y más competitivas Pocas veces se ha informado su presencia ya que

para el crecimiento en medios con e! alto contenido su crecimiento es más lento en comparación con la

del azúcar. se convierten en predominantes y de otras levaduras o por la producción inhibitoria

complementan la fermentación de otros factores de levaduras

14

Cuadro 2. Papel bioquímico y efecto causado por levaduras en vino. (Tomado de Romano y col., 2006).

Levaduras

Hanseniaspora-Candida

S cerevisiae. S. paradoxus. S. bayanus y S

pastorianus

Brertanomyces, K!uyveromyces.

Schi::osaccharomyces. Torulaspora, y

Z;-gosaccharomyces

C. apiculato

S. cererisiae

;.:_ apiculata:: H uvarum ·H_ pu/cherrimo. A

apicu/ura y /i 111·ar11111

Cepas Kiiler de S cerevisiae

Cepas Killer Candida, Pichia y Hanseniaspora

Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora,

Kloeckera, Hansenu!a, Metschnikowia, Pichia.

Schi::osaccharomyces, T onilaspora y

Zygosaccharomyces

Efectos y papel bioquimico

Contribución al sabor del vino

Complementan la fermentación. Características

enológicas

Afectan !a cinética de levaduras no-Saccharomyces

así como e! metabolismo de Saccharomyces

Influyen negativamente en la calidad sensorial

Produce glicerol. ésteres y acetona.

\1ejora el aroma en el vino

Producción de etanol

Afecta el crecimiento de levaduras no

.\'aa·hm·on1y,·es

U etanol determina b viscosidad del vino:: lH;túa

como fijador de aroma

Produce tiamina )' sustancia~ nutritivas.

Actividad proteolitica. Provoca crecimiento

deficiente de S cerevisiae. además generan

aminoácidos útiles para S. cerevisiae

Secreción de toxinas polipeptídicas. reprimen la

microflora indígena de no-Saccharomyces y S

cerevisiae dominando la fermentación

Ejercen acción inhibitoria contra cepas de vino de

S cerevisíae

Pectinasa, proteasas, glicosidasas, esterasas.

Contribución a la formación del color, aroma y

sabor

15

Candida, Debaryomyces,

Hanseniaspora Kloeckera, Kluyveromyces,

Afetschnikowia. Pichia. Saccharomycodes,

Schi=osaccharomyces y Zygosaccharomyces

K. apicufata y H. gui!/iermondii

Actividad ~glicosidasa

Características y sabor del vino

Glicerol, ácido acético, alcoholes, alcoholes

superiores, acetaldehído, acetona y acetato de eti!ío,

otorgan características enológicas siendo el glicerol

el que contribuye al dulzor, cuerpo y plenitud del

vino

16

2.5.2.2. Levaduras en la elaboración de la cerveza

Como en el vino, las levaduras de la cerveza están involucradas en la

fennentación del mosto en el cual las cepas cerveceras son las que varían las

propiedades tecnológicas de la bebida, incluyendo producción de aroma, velocidad,

grado de atenuación, floculación y requerimiento de oxígeno (Cuadro 3).

Cuadro 3. Levaduras presentes en la fermentación de la cerveza. (Tomado de Romano y coL, 2006).

En la fcnnentación de la cerveza están implicadas dos tipos de levaduras Saccharomyces lager y Sale,

ambas especies pertenecen Saccharomyces sensu stricto

S. ale

S. !oger

Saccharomyces y no-Saccharomyces (levaduras

salvajes)

Breffanomyces. Candida, DebOl}'omyces.

Fi!obasidium. Hanseniaspora. K!uy;eromyces.

Torulaspora y Z..vgosaccharomyces, Pichia

membranifaciens y P. anoma!a

Las levaduras P. membramfanfciem

Los géneros Pichia. Hansenula y Debaryomyces

En la superficie de la fermentación

Crecimiento a 37 ºC

F crmentadoras del fondo

Fermenta melibiosa

Crecimiento a -37 ºC

Se C()noccn como S car/sbergensis. S uvarum y S

Ci!/"i!l'/.\/01!

Recientemenk se clasilican como S pus1orian11s

Contaminantes en el proceso de elaboración.

Causantes de malos gustos feno!icos al tinal de la

fermentación idcscarboxilan diversos ácido~

fenolicos)

Producen etanol y carbohidratos

Produce desperdicios. la película. la calina y malos

gustos tales como fenoles. esteres y notas ácidas

Son asociadas con condiciones aerobias. aunque

son capaces de crecimiento anaerobio

17

2.5.2.3. Levaduras en bebidas destiladas del tequila y mezcal

Las levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces aisladas de la uva y del

agave, han revelado una correlación entre la aptitud tecnológica de las cepas y el origen,

explicados como condiciones especificas a las adaptaciones de Ja fermentación, que

determinan probablemente diversas características enológicas y fisiológicas. El cuadro 4

muestra levaduras involucradas en la fermentación de bebidas destiladas del agave.

Cuadro 4. Levaduras de bebidas destiladas elaboradas del agave. (Tomado de Lappe y col.. 2008:

Escalante-Minakata y col., 2008 y Romano y col.. 2006).

Levaduras

·Vo-Saccharomyces: (Candida spp., C magnolia. C

parapsilosis. C krusei. Hanseniaspora guillermondii. H

uvarum, f/. vinae K/uyveromices marxianus. Pichia

membranifaciens. Torulaspora de!brueckii,

/Jebaryomyces hansenii. C/avispora /usitaniae)

Pichiafermen/as )) Klr~Vl'eromyces marxion11s

Candida krusei Cundida magnolia. K/11yveromy(:e.'

l!fricamrs

Soccharomyces. S. cerevisiae

Productos y efectos

Etanol. ácidos orgánicos. esteres, terpenos.

furanos. compuestos nitrogenados. aceite

combustible. hidrocarburos y cetonas

Desempeñan un papel importante en las

primeras etapas de la fermentación. en la

generacion de compuestos volátiles que

participan en el perfil arom:ltico del

producto !inal

Resistencia al etanol y sulfato lo cual

permite una fermentación más eficiente

Producen alcohol

18

2.6. Métodos de identificación de especies para levaduras

2.6.1 Importancia de la identificación

La identificación de levaduras hasta nivel de especie es necesaria para generar

conocimiento sobre la biodiversidad, y por su aplicación industrial, así como por el

interés económico y cultural. Estos organismos forman parte de la microflora natural

presente en los alimentos y bebidas fermentadas y/o participan en los respectivos

procesos de la obtención de estos.

Respecto a las bebidas alcohólicas, es de fundamental relevancia la presencia de

tantas especies en la fennentación para !a elaboración, en este caso específico del

mezcal. que deja entrever la complejidad del proceso, ya que cada levadura tiene

necesidades diferentes y sobre todo es susceptible de producir diversos compuestos.

algunos de ellos importantes en el aroma y sabor fina! de bebidas.

2.6.2 Métodos tradicionales

Para !a identificación de microorganismos. las técnicas convencionales se

fundamentan con la descripción morfológica y fisiológica de especies y géneros, que se

basan en sus características y requiere de unas 100 pruebas. !o cual es laborioso.

complejo y requiere tiempo. Las principales desventajas que han mostrado estas pruebas

morfológicas se manifestaron con el descubrimiento del estadio sexual de reproducción

de la clase [evaduriforme de los ascomicetes y basidiomicetes. lo cual ha generado !a

!!amada dualidad de nomenclatura, que no es más que una misma especie sea nombrada

de una forma en el estado vegetativo (anamorfo) y de otra en el estado sexual

(teleomorfo) (Orberá-Ratón, 2004).

Las principales pruebas morfológicas y fisiológicas utilizadas en la

identificación son:

Morfológicas.- reproducción vegetativa (gemación o bipartición), reproducción

sexual (cigoto, esporas), morfología celular en medios sólido y líquido, aspecto de la

colonia, fonnación de pseudomicelio, fonnación de velo.

19

Fisiológicos.- fennentación y asimilación de azúcares, desarrollo en presencia de

etanol, poder fermentativo, asimilación de ácidos orgánicos, escisión de arbutina,

necesidades en vitaminas, crecimiento a diferentes temperaturas, fenotipo ki!!er;

asimilación de compuestos nitrogenados. requerimientos vitamínicos, resistencia a

cicloheximida y termoto!erancia. Pero éstas no siempre son estables ni reproducibles,

debido a que las fuentes de carbono y nitrógeno pueden metabolizarse por rutas

comunes y en ocasiones su metabolismo es controlado por varios genes. La prueba de

fermentación de azúcares no es muy exacta debido a que las levaduras de fermentación

lenta no liberan el C02 de fonna tan inmediata para que sea atrapado en tubo Durham.

lo cual ha provocado que especies consideradas durante mucho tiempo fermentativas,

hayan tenido que reclasificarse. Estos métodos en genera!, producen ambigüedades y

resultados incorrectos, debido a que las características 1norfológicas y fisiológicas están

fuerte1nente influenciadas por las condiciones de cultivo (Orberá-Ratón, 2004).

20

2.6.3 Métodos moleculares

2.6.3.l Métodos basados en el análisis del genoma ribosomal

Las regiones ribosomales poseen una característica especial, éstas muestran un

bajo polimorfismo intraespecífico y una alta variabilidad interespecífica. Por ello, el

análisis de la región ribosomal de los genes 5.8s, l 8s y 26s, es una herramienta útil para

establecer las relaciones filogenéticas e identificar especies de levaduras. (Fernández­

Espinar y col., 2006) (Figura. 12).

:;·~!5.8S rDN1\l ITS2

Ll ___ 2_,,_-,_"2_8_S_cD_N_/\ __ ~f- 3·

Figura 12. Esquema de b estructura nucleai· de AD~r.

El más amplio uso que se le ha dado a la técnica de RFLP ha sido en estudios de

identificación y filogenia de levaduras de interés industriaL utilizando la región del

rDNA 5.8S y los espaciadores transcritos internos JTS 1 e ITS 2 (5.8S - ITS). Además

esta 1nisma región ha sido utilizada por Esteve-Zarzoso (1999) para identificar una serie

de levaduras involucradas en la fennentación del vino.

Algunas de las técnicas 1nás utilizadas parn !a identificación y caracterización de

levaduras en alimentos y bebidas. se 1nencionan en el cuadro 5. De las cuales existen las

que son dependientes de cultivo (que es necesario tener las colonias aisladas). e

independientes de cultivo. (es decir, que el aislamiento no es necesario. ya que se parte

de la muestra original).

21

Cuadro S. Técnicas moleculares para la identificación y caracterización en levaduras. (Tomado de

F ernández-Espinar y col., 2006 ).

Identificación de especies Diferenciación a nivel cepa

Dependientes de cultivo Dependientes de cultivo

Secuenciación de la región ribosomal Cariotipo por electroforesis de campo pulsado

*Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de Análisis de la restricción del ADN mitocondrial

restricción (RFLP)

Amplificación de secuencias repetidas

aleatoriamente (RARP)

PCR de las regionc~ repetidoras del genoma

(Microsatélites;. :vlinisaklitcs)

i>olimorti~mo de la longitud di;- los lfagm.:ntu.\

amrlificados (AFl,l'J ~~~~~~~~~~,~~~~

No dependientes de cultivo No dependientes de cultivo

l".lectrnl(1rc~ís en gel pur gradientc 1.k~naturo.li1an!c PCR en tiempo real

(PCR-DGGE¡

*Técnica empkw.fa en el presente trabajo

22

Las técnicas moleculares mencionadas antes han sido utilizadas para la identificación y

caracterización de levaduras en alimentos, vino y mezcal desde 1999 hasta 2005

(Cuadro 6).

Cuadro 6. Trabajos que utilizan métodos moleculares de identiticación y caracterización en levaduras.

Técnica

PCR-RFLP 5.8s ITS

PCR-Rl·LP -DGGI·: 5.8 JTS

RFLll-mtlJNi\

PCR-DUGE

Géneros y especies 132 especies de diferentes géneros 27 cepas Hanseniaspora

Hanseniaspora) Kloeckera.

Saccharomyces y /1!0-Saccharom.vces

8 Candida y Saccharom_vce.1·

Sacdwromyces cereri1·i11e

Srn:charomyci:.1

Cl<11· ispo1·a. Pidlio A."l11_1·rerom)'L"l!.1·

.\'acdwromy,·es _1 ( "0111/Jda

Saccharomyces cere1·i.1iue

,\acdmrrimyces )- \o­,\'accharomyces

Fuente Vino

Cepario español

Alimentos. bebidas. suelo : otros l\"aranja y jugo de naranja

Jnfccciones en humano>.

Vino

Vino

Vino

Vinu

Autores Esteve-Zarzoso) col. (19991 Esteve-Zarzoso y col. (200]) Cadcz y col. (2002)

Las Heras-VazqueL y col. {2003)

Trost y col. (2004)

Carel lo: c,11. (20041

Ariturio1 l<:..c. > col. { 2005 J

1-.~cal;inLc-IVlinak~\\a: cPI (2008J

DiHil) cul. {20061

Martíne1) c::ol. (20041

Cm,;olin: Milis. {20031

23

2.6.3.2 Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

De los métodos moleculares anteriormente mencionados, la técnica de análisis

de la región ITSI-5.8s rRNA-lTS2 por polimorfismo de la longitud de los fragmentos

de restricción (RFLP). es !a que se seleccionó para la identificación de levaduras en el

inóculo de San Luis Potosí.

El término se refiere a secuencias específicas de nuc!eótidos en el ADN que son

reconocidas y cortadas por enzimas de restricción y que varían entre organismos. Las

secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia diferentes en el

ADN de varios individuos de una población. Esto muestra que la población es

polimórfica, para estos fragmentos de restricción.

De esta fonna. en un gel de electroforesis aparece un patrón de bandas

polimórficas correspondientes a los fragmentos de diferentes tamaños. que se generan

con el corte de cada endonucleasa. La similitud de los patrones generados permite

establecer correlaciones entre especies y cepas. y la existencia de patrones únicos. que

permite Ja identificación (Orberá-Ratón. 2004).

Esteve-Zarzoso y col. ( 1999). encontraron que las formas ana1nórficas y

tc!eoinórficas de !as 1nis1nas especies de levaduras generan el inisino patrón. Esto

debido a que las regiones riboso1nales tienen la característica de exhibir un bajo

polimorfismo intraespecífico y una a!ta variabilidad interespecífica. Con los resultados

presentados por Esteve-Zarzoso y col.. 1999. es posible constituir una base de datos

inicial. que puede complementarse con más especies reportadas o nuevas especies que

no han sido analizadas por esta técnica. Que deberán probarse bajo las mismas

condiciones, como se menciona más adelante, en algunas publicaciones de trabajos

realizados para la identificación con el análisis de restricción de los fragmentos (RFLP)

(Cuadro 7).

24

Cuadro 7. Levaduras aisladas identificadas por la técnica de análisis de restricción de los fragmentos.

Técnica-RFLP

Fuente

Vino

Vino

Cepario español

l\m

.1\lirncntns. bchiJas. suclu;

.Jugo de naranja

Naranja y jugo de naranja

lníecciones en humanos

Vino

Vino

Vino

Algunos géneros de levaduras

identificados

Hanseniaspora. Candida, Saccharomyces. 1\1erschnikowia

Candida, Debaromyces. Dekkera. Hansenula, lssatchenkia. Kluy,,eron1yces, lodderomyces. 1V/e1schnikowia. Pie hia. Saccharomyces, Schi=osaccharomyces. Torulaspora, VVickerhamiel!a. farrowia. Zygoascus. Zygosaccharomyces. /lanseniaspora. C1yptococc11s. Filobasidium. Rhodo/ol"///a, Sporidiobolw. Sporobolomyces y Trichosporon ( 132 especies)

Hc111se11iaspora ( 27 ccpiisJ

( "undidu /.1·.1'111d11!11ki11;. .\'aé .,. haron~i ·cr: s / !ansenias¡)(11·0: f.."/occkr;:r(I

Referencia

Guillamón y col. ( 1998)

Estevc-Zarzoso y col. (1999)

l·:stcvc-Zarzoso y col. ( 2001)

l'uh·in.::nti : col. (2001 J

CaJc;; col. (2002J

Cfarispora. Pichio. Arias;. col. (2002) S(lccharomycopsis (~eo11·ich11m) !!anseniaspora

Saccharom.i·ces '.'-JaumO\'a;. col. (2003)

Candido. Clal'i~pora 1-!anseniaspora. Pichia, Rhodotonda, Saccharomyccs y Tricho.1poron (9 especies)

Las I-leras-VaLqueL y col. (2003)

Candida y Saccharomyc·es Trost y col. (2004)

Saccharomyces Capello y col. (2004)

Candida. Hanseniaspora. Clemente-Jimenez (2004) !ssatchenkia. A1etschnikowia, Pichia y Saccharomyces

Saccharomyces Antunovics y col. (2005)

25

Sidra Candida. Citeromyces. Coton y col. (2006) Debaryomyces, Dekkera. Hanseniaspora, Kluyveromyces, Lachancea, Merschnikowia. Pichia, Saccharomyces, Saccharomycopsis y Zygoascus (27 especies)

Vino Candida, Hanseniaspora, Hierro y col. (2006) Jssatchenkia, Zygoascus y Zygosaccharomyces (11 especies)

Vino Brettanomyces, Candida Renoufy col. (2006) Debaryomyces y Saccharomyces

Vino Aureobasidium. Candida. Nisiotou y col. (2007) Metschnikowia, Pichia Hanseniaspora, Jssarchenkia) Zygosaccharomyces

Mezcal Cf(n·ispora. Pichia Escalante-Minakata y col. Kluyveromyces

(2008)

26

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

De manera tradicional, la identificación de levaduras se realizaba con base en la

descripción morfológica y fisiológica de especies y géneros. Estas requieren de la

realización de unas l 00 pruebas, lo que resulta muy laborioso, complejo y consume

mucho tiempo (Guillamón y col., 1998). Además, estas pruebas son dependientes de las

condiciones de cultivo de cepas, y pueden ocasionar errores en la determinación

taxonómica, que conlleva también a la dualidad en la nomenclatura.

La aplicación de técnicas moleculares contribuye a la solución de este problema.

y se consideran como una alternativa más precisa a los métodos tradicionales, puesto

que analizan el genoma independientemente del estado fisiológico de !a célula. Se han

desarrollado técnicas usando las herramientas ofrecidas por la biología molecular y

algunas de ellas son úti!es para identificar y caracterizar las levaduras a nivel molecular.

Sin embargo, la mayoría de los trabajos realizados para la identificación de levaduras

involucradas en los procesos de fermentación. se han realizado en vinos y otras bebidas.

En el mezcal sólo se han realizado dos trabajos de identificación de especies, Lachance

{ 1995) con catorce especies reconocidas y tres por Escalante~Minakata y col. {2008).

27

4. JUSTIFICACIÓN

El mezcal es una bebida tradicional de importancia cultural y económica, que

presenta diversidad en aroma, sabor y otras propiedades organolépticas que dependen de

varios factores. Uno de estos tiene relación directa con las levaduras específicas que

participan en la fermentación debido a que ellas forman parte de la microflora natural

involucrada, como parte del proceso de producción y que repercuten directamente en las

características del producto final. La identificación de dichas levaduras hasta nivel de

especie, es necesaria para caracterizar a los mezcales producidos.

Se requiere disponer de métodos rápidos y precisos, que puedan ser aplicados a

la identificación de las especies de levaduras implicadas en la fermentación del mezcal,

con e! fin de realizar un control del proceso y, asegurar que los organismos presentes

sean los mismos para garantizar la calidad del producto final.

Los métodos de identificación de levaduras que emplean criterios morfológicos,

fisiológicos y bioquímicos, tienen limitaciones que pueden ser solucionadas por

aquellos que emplean técnicas de biología molecular. Estos últimos no han sido

empleados para identificar las levaduras que participan en la producción de! mezcal, con

excepción del trabajo de Escalante-Minakata y col. (2008) que identificó tres especies,

por lo que se hace necesario estandarizar estos procedimientos para verificar si son

útiles para este caso.

28

5. HIPÓTESIS

El análisis del polimorfismo del gen que codifica para el ARN ribosomal 5.8s

pennitirá identificar las levaduras que participan en la fermentación del mezcal.

29

6. OBJETIVOS

6.1 Objetivo General

Identificar levaduras aisladas del proceso fermentativo del mezcal a nivel de especie,

mediante el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

del gen que codifica para el ARN ribosomal 5.8s.

6.2 Objetivos específicos

:;... Seleccionar y estandarizar una técnica de extracción de ADN en

levaduras de diferentes especies que intervienen en el proceso de

producción del mezca\.

~ Estandarizar un método para el análisis RFLP's del gen que codifica para

e! ARN 5.8s de levaduras en mezcal.

,.. Identificar las levaduras aisladas de la fennentación de! mezcal con la

1nisma técnica.

30

7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1.Método General.

Identificación bioquímica

por API 20 C

Galerías API C

Muestreo mezcalera ··1a

Perla·· SLP

Siembra en placa y

descripción

Obtención de cultivos puros

Identificación molecular

Amplificación directa de las colonias por

PCR de ADNr 5.Ss

Digestión enzimática

Extracción de ADN

Amplificación por PCR de ADNr 5.Ss

Digestión enzimática

31

7.2 Levaduras y medios de cultivo

7.2.1 Levaduras de colección de Italia

Cuadro 8. Colección de Italia, de cepas utilizadas como control positivo para la identificación.

l. Saccharomyces cerevisiae DBVPG 6173 22. Candida srellata

3. Saccharomyces bayanus CBS 380 24. Candida sake

9. Sacharomyces exiguus DBVPG 6252 25. Candida saitoana

10. Zygosaccharomycesjlorentinus DBVPG 6186 26. Kfuyi·eromyces loe/is

12. Zygosacharomyces jermentai DBVPG 6297 28. Schi:osaccharomyces pombe

15. Debaromyces hansenii CBS 767 29. Schi:osaccharomyces japonicus

17. f!anseniaspora osmophila CBS 106 30. Torulaspora de!brueckíi

18. Hanseniaspora gui/fiermondii 31. Saccharomycodes /udw1gii CBS 2591

19. Hanseniaspora vineae CBS 8031 32. ,11/etschnikowia pulcherrima

20. Candida lypofitica CBS 612..t 33. Pichia anómala

21. ("andidu boidinii DBVPG 6799 3..t. Pichia membrani/aciens

DBYPG 6714

DVPG 6154

DBVPG 6916

DBVPG 6075

DBVPG 6280

DBVPG 6274

DBYPG 6168

DBYPG 6721

DBVPG 6184

DBVPG 6781

CBS 107

32

7.2.2 Levaduras aisladas del inóculo de San Luis Potosí (Cuadro 9).

Cuadro 9. Levaduras de la mezcalera ··La Perla·· (inóculo) 040907SLP, 091007SLP y SLP091007. A 040907SLP P 091007SLP SLP1091007

B 040907SLP R 091007SLP SLP2091007

C 040907SLP S 091007SLP SLP3091007

D 040907SLP T 091007SLP SLP4091007

E 040907SLP U 091007SLP SLP5091007

F 091007SLP V 091007SLP SLP6091007

G 091007SLP W 091007SLP SLP7091007

H 09I007SLP X 091007SLP SLP809!007

! 091007SLP Y 091007SLP SLP9091007

J 091007SLP Z 091007SLP SLP10091007

K 091007SLP Al 091007SLP SLPl 1091007

L 091007SLP Bl 09!007SLP SLP12091007

M 091007SLP C! 091007SLP SLP13091007

N 091007SLP Dl 091007SLP SLP14091007

0091007SLP El 091007SLP SLP15091007

Nota: Se utilizó el abecedario y la !'echa. para otorgar una da\C o bs ci.:pas aisladas del muestreó de San Luis Potosí.

33

7 .2.3 Medios de cultivo

Se utilizaron cuatro medios de cultivo, agar extracto de levadura peptona y dextrosa

(YPD) sólido y líquido, agar papa dextrosa (APD), Wallerstein agar laboratorio (WL). y

jugo de agave (JA). Los últimos tres en sólido, (Cuadro 10). A todos los medios se les

adicionó O.O 1 o/o de cloranfenicol.

Cuadro 10. Reactivos utilizados para preparar medios de cultivo. Caldo YPD Peptona Glucosa Extracto de pH

20g!L 20g/L levadura 4.5 \Og/L

Agar YPD Peptona Glucosa Extracto de pH Agar 20g/L 20g/L levadura 4.5 20g/L

10 L

AgarWL Hidrolizado Extracto de Fosfato de Dextrosa Cloruro de enzimático de levadura monopotasio

50g/L potasio

caseína 4g/L 0.55g 0.425g 5g!L Cloruro de Cloruro Sulfato de Verde de Agar calcio férrico magnesio bromocresol 20g 0.125 0.0025g 0.0025 0.022g

Agar APD Almidón de Dextrosa Agar pll papa 20g/L 15g/L

4.5 4Q/L

Agar JA Sulfato de i\gar pll amonio 35g/L 4.5 1' L

34

7 .3 Muestreo

Se tomó una muestra de inóculo del fondo de una tina de fermentación. Se

determinó la concentración de azúcares y la temperatura. A continuación, se realizaron

diluciones seriadas 1 :50 y 1: l 00 en solución salina fisiológica (0.9%) según se indica el

cuadro 11. Para cada muestra. En cada caja petri se tomaron cuatro cajas petri por cada

medio de cultivo, se sembró una alícuota de lOOµL por dispersión con varilla acodada y

se incubo a 30 ºC por 48-72 h.

Cuadro 11. Cajas petri con diluciones de jugo de agave con a ua fisioló ica.

\1edio Cloranfenicol Dilución

YPD ,; 1/50

YPD si lf\00

J.A. .si \!50 J.:\. si 1/100

WL 00 l/50

APD ,; 1150

.l.t\. 00 1/100

En cada medio de cultivo se hizo el conteo de las unidades formadoras de

colonias (ufc/mL). así como la descripción morfológica de las colonias.

De cada tipo de levaduras aisladas en los medios de cultivo se tomó una 1nuestra

por picadura para inocular en tubos de ensayo con YPD y cloranfenicol al O.O 1 % en

agitador orbital a 30ºC y 125 rpm por 48 á 72 h.

Después de obtener crecimiento de los microorganismos se sembró en cajas Petri

por duplicado con medio YPD y WL con cloranfenicol a! 0.0lo/o, para la obtención de

cultivos puros.

En un criovial se depositaron 500µL de glicerol y 500µL de la levadura diluida

en agua estéril, y se conservaron a -70ºC, estas muestras se utilizaron como reserva de

cultivos puros para el cepario de CIATEJ.

35

7.4 Identificación bioquímica

La galería API 20 C AUX (bioMérieux) se compone de 20 cúpulas con sustratos

deshidratados que permiten realizar 19 pruebas de asimilación (Figura 13). Las cúpulas

se inoculan con un medio mínimo semisólido y las levaduras sólo se reproducen si son

capaces de utilizar el sustrato correspondiente. Lo que permite identificar un total de 34

especies diferentes.

La lectura de estas reacciones se hace por comparación con un control de

crecimiento, la identificación se obtiene a partir de un código numérico, mediante un

catálogo analítico o un programa informático.

·-----~----· ----· ----~----_..:........:--·-. :. ~ :

Figura 13. Galería API 20 C AUX (bioMérieux) con 20 cúpulas con sustratos deshidratados: O-glucosa. glicerol. 2-ceto-gluconato cálcio. L·arabinosa. D-Xylosa. AdonitoL X;litoL O-galactosa. lnositoL D·sorbitoL Metil-aD-Glucopiranosida. N Acetil-Glucosamida. D-celobiosa. D-lactosa. O-maltosa. D·sacarosa D·trehalosa. D· melezitosa y 0-rafinosa.

Cada una de las colonias aisladas se inoculó en una galería API 20 C

(bioMérieux), el procedimiento es indicado en el cuadro 12. Se incubó posteriormente a

29ºC y se observó a las 48 y 72 h. La presencia de cualquier grado de turbidez con

respecto a la cavidad de control. se consideró como un resultado positivo.

Cuadro 12. Procedimiento para inocular galería API 20 C.

:;.. Concentración de células en tubos de 1 mL c/u

;¡;. Preparación del medio de suspensión hasta Me Farland

:;.. Transferir IOOµL al medio API C

:;.. Llenar los alveolos con aproximadamente 5 ml de agua estéril

} Colocar la galería API en caja del kit

> Llenar cada pozo de la galería con e! medio API C inoculado aproximadamente 180 µL

36

7.5 Identificación molecular

7.5.1 Extracción de ADN genómico

La extracción de ADN se realizó de acuerdo al protocolo de Tapia-Tussell y col.

(2006), con el equipo y los reactivos mencionados en el cuadro 13.

Cuadro 13. Equipo y reactivos para la extracción de ADN.

Equipo

> Centrifuga

>- Baño María

> Agitador Vortex

';- Congelador

Reactivos

>- Cloroformo

;... Etanol 70°/o

;... lsopropanol frio

;... Buffer TE:

!OmM Tris-1-!Cl (pH8)

lm.\1 EIJTA (pH8)

1 Om1\.1 NaCI

Procedimiento:

> Buffer de lisis:

50mM Tris-base

250mM NaCI

50mM EDTA

(pH 8)

O.Jo/~ SDS (w/v)

50µ.L RNAsa: Se agrega por cada 10mL de buffer

antes de aplicar

Se tomaron colonias de levaduras de! medio de cultivo que fue aislado en YPD

sólido y/o medio WL, bajo las medidas asépticas en campana de flujo laminar, y se

utilizó guantes de látex y mechero. Se agregó agua destilada estéril a la caja petri y se

traspasó 1 mL del cultivo en tubos eppendorf por triplicado cada uno, después se

centrifugó y se resuspendió a 13,000 rpm por 5 min. Se adicionó 2 unidades ó 0.l5g de

perlas de vidrio estériles (Q. Biogene), se agitó en vortex a alta velocidad por un lapso de

3-5 min, y posteriormente congeló a -70ºC en un tiempo de 10 min. Se descongelaron las

muestras en baño María por 3 min, se agitó en vortex 3 min. Se transfirió 300 µL de la

suspensión celular a un tubo nuevo eppendorf de 2 mL, se adicionó 800 µL de buffer de

lisis con (50 µL RNAsa R4642) e incubó a 65ºC por 30 ruin, con inversión ocasional. Se

enfrió la mezcla a temperatura ambiente; se añadió 500 µL de cloroformo y centrifugó

por l O min a 13,000 rpm., se recuperó la capa superior acuosa en microtubo nuevo y se

37

añadieron 700 µL de Isopropanol frío. Se mezcló cuidadosamente por inversión y

posteriormente se incubó a -70ºC por de 1 O min. Después se llevó a centrifugar por 5 min

a 13,000 rpm a temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante, se lavó el botón con

500 µL de etanol al 70%, se centrifugó y se decantó el etanol dejando secar por una 1 h.

Se resuspendió el botón en 50 µL de buffer TE 0.1 K pH7. Se tomaron tres muestras de

cada cultivo y se visualizó por electroforesis en gel de agarosa al 1 %. (análisis

cualitativo).

7.5.2 Electroforesis en gel de agarosa

Se preparó solución con 0.5 g de agarosa y 50mL de buffer TAE 1 x. Se añadió

l.5µL de bromuro de etidio. La solución fue vaciada en un molde para su solidificación,

colocando previamente peinecillos. Se vertió el buffer TAE a la cámara de electroforesis

1 x y posteriormente se colocó en los pozos del gel 1 O µL de la extracción de ADN

mezclado con 2 µL de colorante de carga, y se corrió a 80v-l OOv aproximadamente

durante 1 h.

Procedimiento:

r Colocar 50 1nL de Buffer T AE IX en un matraz

r Agregar 0.5 g de agarosa

),.- Disolver la agarosa en el microondas (2 min)

J;. Agregar 1.5 µL de bromuro de etidio ( 1 O mg/ml)

? Vaciar en cámara de electroforesis

r Correr el gel a 80-l Oüv 1 h

7.5.3 Espectrofotometría a A= 260nm

La concentración y la pureza de ADN se detenninaron por espectrofotometría.

Ya que los ácidos nucleicos (ADN y ARN) absorben fuertemente en el intervalo de la luz

ultravioleta (UV) con un máximo de absorbancia a 260 nm (promedio de la longitud

máxima de absorción de las bases nitrogenadas), Jo cual permite su cuantificación en el

UV.

38

Procedimiento:

> Se hace una dilución 1: 100 con agua HPLC de las muestras a analizar

> Se determina la absorbancia del ADN

260 nm y 280 nm usando como blanco

agua HPLC

Se tomó de la extracción 35 µL ADN con micropipeta calculando 50:50 de ADN

con agua estéril. Se homogeneiza por pipeteo y se introduce la mezcla a la celda del

cuarzo del espectrofotómetro que anteriormente fue calibrado. El resultado de la

concentración de! ADN µL/mL y el grado de pureza de los ácidos nucleicos usando la

relación A260/A280, la otorgó directamente el equipo de espectrofotometría. Una buena

pureza de los ácidos nucleicos es de J .8 a 2.

7 .5.4 Amplificación de la región S.8S ribosomal con iniciadores ITS

Este método ha sido propuesto por Esteve-Zarzoso y col. (2001 ). La

amplificación de fragmentos de ADN se llevó a cabo por medio de reacción en cadena

de la polimerasa (PCR). El kit que se utilizó: illustra puReTaq Ready-To-Go PCR

Beads (GE Healthcare™) (BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2.5 unidades Taq

polimerasa para un volumen de 25 µl con una concentración de dNTP a 200µM en

IOmM Tris-HCI, pH 9.0, 50mM KCI y 1.5 mM MgCI). Se amplificó la región ITS 5.8s

rRNA ribosomal empleando los cebadores ITSI (5TCC GTA GGT GAA CCT GCG

G3') e ITS4 (5' TCC TCC GCT TATTGA TAT GC 3').

Reactivos:

> 2µL de ADN de cada muestra {aproximadamente 50 ng)

l> 1.25µL de ITSI (IOµM)

l> !.25µL de ITS4 (!OµM)

> 20.5µL de agua purificada

39

~ Tubo eppendorf del kit

Procedimiento:

Una vez añadidas las muestras por duplicado en tubos eppendorf con perla de

reactivos, se añadieron los iniciadores y posteriormente se colocaron en termociclador

programado con protocolo para incubar. bajo las siguientes condiciones de reacción:

>- Desnaturalización inicial a 95 ºC por l O min

> Desnaturalización a 94 ºC por 1 min

> Alineamiento a 55.5 ºC por 2 min

> Extensión a 72 ºC por l min

~ Repetir 35 ciclos

).... Extensión final a 72 ºC por 1 O m in

r Si es necesario, incubar a 4 ºC

'r Electroforesis en gel de agarosa al l .3o/o en TAE lx.

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al l .3o/o. Se tiñó con solución

acuosa de bromuro de etidio y se visualizó con luz UV para comprobar la amplificación.

Procedimiento:

Y Colocar 50 mL de Buffer T AE l x

>- Agregar 0.65 g de agarosa

>- Disolver la agarosa en el microondas (2 min)

>- Agregar 1.5 µL de bromuro de etidio (1 Omg/ml)

>- Vaciar en cámara de electroforesis

>- Correr el gel a 80-1 OOv l h

40

7.5.5 Digestión enzimática

Una vez comprobada la amplificación del fragmento de ADN deseado, se realizó

una digestión enzimática con tres enzimas de restricción diferentes Hha I, Hae III, Hin/

Procedimiento:

> En tres tubos estériles para PCR, colocar:

> 7µL del AON amplificado

> 1 µL de cada una de las enzimas en cada tubo (Hae III, Hha I Hinfl)

r 17 µL de amortiguador de cada enzima

Dependiendo de la concentración del ADN se tomó un volumen detenninado ya

sea ( 1 µL ó 2 µL) por duplicado. Fueron añadidas las enzimas a un tubo eppendorf con

todos los reactivos. La digestión enzimática se realizó por 2 ha 37 ° C en termociclador.

r Electroforesis en gel de agarosa a! 3o/t1 en TAE 1 x.

Visualizar !as bandas de los fragmentos de restricción con luz UY en un gel de

agarosa al 3º/o :' comparar !os tamaños con un 1narcador de PM de 1 00 pb (Tracklt™ ! 00

bp DNA Ladder, Invitrogcn).

Procedimiento:

'.r Colocar 120 mL de Buffer TAE 1 x

,_ Agregar 3.6 g de agarosa

;... Disolver la agarosa en el microondas (3 min)

> Agregar 1.5 µL debromurodeetidio(IOmg/mL)

> Vaciar en cámara de electroforesis

? Correr el gel a 120v 1 h

> Comparar los patrones de bandas encontrados con los patrones de cepas identificadas de estudios anteriores.

41

8. RESULTADOS

8.1 Descripción morfológica de las cepas de levaduras en cultivo en placa

De acuerdo a la morfología de las colonias observadas en las cajas de cultivo se

hicieron cinco grupos. A cada levadura diferente se le asignó una clave utilizando el

abecedario junto con la fecha del día del muestreo y las iniciales del estado de San Luis

Potosí. Además, se incluyeron cinco cepas {A040907, 81040907, Cl040907, 01040907

Y El 040907) que previamente habían sido recolectadas de esta misma mezcalera. La

figura 14 muestra las diferencias por morfología de las levaduras. El cuadro 14 muestra

cómo se agruparon las levaduras para su posterior identificación.

Figura 14. Aspecto de las colonias de levaduras cultivadas en medio WL. 1: levaduras del grupo I; 2: levaduras del grupo 11; 3: levaduras del grupo lll; 4: levaduras del grupo IV; 5: levaduras del grupo V; 6 levaduras antes de aislar por grupos.

42

Cuadro 14. Descripción morfológica de los grupos de las levaduras de SLP en medio WL.

Grupo

Grupo 1

Grupo 11

Grup-0 1!1

Grupo l\i

Grupo V

Descripción morfológica para

WL

Color verde con el centro más obscuro, 3-5mm, cremosa, forma circular, aplanada

Color blanco, 2-3mm. forma circular con superficie y bordes rugosos, irregular

Color rosa. 1-3mm. color cremoso brillante

Color verde obscuro, 1-2mm. cóncava. bordes regulares y lisos

Color verde pálido casi color blanco. 2mm. supcrticie lisa. bordes regulares

Cepas

E091007 SLP F091007 SLP K09!007 SLP L091007 SLP R091007 SLP

A 1040907 SLP 5091007 SLP G091007 SLP H091007 SLP 0091007 SLP A040907SLP V091007 SLP Z091007 SLP

CI040907 SLP D 1040907 SLP E1040907 SLP

1091007 SLP J091007 SLP M091007 SLP N091007 SLP P091007 SLP U091007 SLP X091007 SLP Y091007 SLP

B1040910SLP T091007 SLP 1N091007 SLP

43

8.2 Caracterización bioquímica

De los grupos fonnados, se seleccionaron cepas representativas de cada uno,

incluyendo algunas de la colección de Italia como control positivo para realizar la

prueba bioquímica API 20 C (bioMérieux). Los resultados obtenidos de las reacciones

de fermentación de los sustratos se presentan en el cuadro 15, en el que se observan los

distintos perfiles respecto a la asimilación de los sustratos probados.

Cuadro 15. Perfiles bioquímicos de las colonias por galerías API 20 C (bioMérieux).

G G 2 A X A X G 1 s M N e L M s T M L L K R y o L A N o o A E A A A R L u y G A L o T L o R G G L e L e E z

GRUPO E + + + + + + + + + + + + + +

B + + + + + + + + + + + + + + +

A + GRUPO

Cl + + + + + + + + 11

34 + + + + + + +

e + + + + + + + + +

GRUPO + + +

IV + +

9 + + +

D

GRUPO p + +

V 18 + + + + + + + + + + + +

19 + +

Se observó el crecimiento de las levaduras. Las cúpulas más turbias que el

testigo indican una reacción positiva, el resultado se anotó en una hoja que proporciona

el kit de la galería API 20 C. En esta hoja, los diferentes nutrientes están separados en

grupos de tres y se adjudica a cada uno, en caso de ser positivo, un valor diferente: una

para el primero, dos para el segundo y cuatro para el que ocupa el tercer lugar. Sumando

cada triplete se obtiene un número de siete cifras que constituye el perfil numérico. La

44

R A F

+

+

+

+

identificación se realizó mediante el Catálogo Analítico o el Programa Infonnático de

identificación suministrado por el fabricante de la galería API 20 C.

Los resultados obtenidos de las galerías API 20 C (Cuadro 15) se ingresaron a la

base de datos de identificación apiweb™, de la cual se obtuvieron los siguientes perfiles

de posibles especies de levaduras (Cuadro 16).

Cuadro 16. Levaduras identificadas por prueba bioquímica (galerías API 20 C).

GRUPO 1

GRUPO 11

GRUPO IV

GRUPO V

Taxón significativo

E Candidafamata 82.3o/o

B Cryptococcus !aurenrii 98%

A C'andida glabra/a 47%

CI Pichiafermentans (no

proporcionó la base de

datos ningún porcentaje

para esta identificaciúni

34 C'andida gui!lermondii (no

proporcionó la base de

datos ningún porcentaje

para esta identificación)

e Candidafamata 53%

Saccharomyces cerevisiae

77%

Kloeckera spp (no

proporcionó la base de

datos ningún porcentaje

para esta identificación)

9 Rhodotoru!a glutinis 57%

D Candida glabrata 47%

Nota

Posibilidad de Candida tropica/is

Posibilidad de Candida !ambica ó Candida.

lipo!yrica

Para el caso de esta levadura la base de datos no

man,;:ió alguna otra posibilidad de especie

Posibilidad: Candida lropicalis

Posibilidad: Candida tropica!is

Posibilidad: Rhodotoru!a glutinis

Para el caso de esta levadura la base de datos no

manejó alguna otra posibilidad de especie

Posibilidad: Candida Collicu!osa

Posibilidad: Candida !ambica o Candida. lipolytic11

45

p Candida magno/iae 62o/o Posibilidad: Geotrichum candidum

18 Cryprococcus laurentii 8lo/o Para el caso de esta levadura la base de datos no

manejo alguna otra posibilidad de especie

19 Kloeckera spp (no Para el caso de esta levadura la base de datos no

proporcionó la base de manejo alguna otra posibilidad de especie

datos ningún porcentaje

para esta identificación)

46

8.3 Análisis molecular

8.3.1 Extracción de ADN

Todas las colonias identificadas (Cuadro 9) fueron aisladas y de cada una se extrajo

ADN. Posteriormente se hizo una electroforesis del ADN extraído para evaluar la

presencia y la calidad. En los resultados de electroforesis como se puede apreciar en las

figuras 15, 16 y 17 el ADN de las cepas fue integro. Sólo en tres muestras se el ADN un

poco degradado, lo cual nos indica que el protocolo que se utilizó fue apropiado para la

obtención de ADN de levaduras. Además, al observar la calidad del ADN obtenido nos

permitió manejar volúmenes que se deberían utilizar en la PCR, ya que dependiendo la

intensidad de la banda se determinó la cantidad de ADN que se colocó en la mezcla de

reacción la cual fue de 1 µL ó 2 µL.

·' ¡•

e.u =-. = - . . . - ---- -Figura 15. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción de ADN de cepas aisladas d..:l proceso fr:rmentativo de mezcal de San Luis Potosí. Carrile;; 1-20:(A. B. C. D. E F. G. H. L J. K. M. l\'. O. P. R. S. T y U).

.:51 _, =- =-·a - --~·- - - -~

Figura 16. Gel de electroforesis con e! perfil de migración de la extracción de ADN de las cepas aislaJas del proceso termentativo de mezcal de San Luis Potosí y colección de Italia. Carriles l-20:(V. W. X, Y. Z.Al.Bl.CJ,Dl,El. l.2.3,4,6,9, 10, 12y 13).

47

líl 11

.; . Q , ·- - . ;t. . -. ' . . .,__ .

(

Figura 17. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción de los ADN de cepas de colección de Italia. Carriles 1-11:(15, 17J8, 19, 20, 21. 25, 26, 28, 29 y 33).

8.3.2 Concentración y pureza de ADN

Para determinar la concentración del ADN así como su pureza, se realizó una

lectura espectrofotométrica del ADN de las levaduras de la colección de Italia y de las

aisladas de San Luis Potosí. Una relación ópti1na de absorbancia 260/280 nm de la

muestra de ADN es de 1.8 a 2.0. números más altos indican contaminación con ARN.

núineros más bajos. indican contaminación con proteínas.

Cuadro 17. Espectrofotometria de levaduras de la colección de Italia y San Luis Potosí. los números

indican las muestras de la colección de Italia y las letras indican las cepas de San Luis Potosí.

Muestra Concentración Relación Relación

Cepa (ng/µL) 260/280 260/230

l 149.2 1.75 0.66

2 35.0 l.42 2.46

3 25.9 1.81 0.29

4 144.0 l.82 0.71

6 6.6 I.80 0.07

9 24.8 1.57 o.so 10 35.3 1.95 0.25

12 84.1 1.81 0.46

13 102.6 ]. 77 0.47

15 31.7 1.85 0.18

17 123.8 1.76 0.83

18 71.2 2.01 J.59

19 42.8 1.58 1.08

20 20.8 1.56 0.16

21 72.9 I.63 0.93

48

25 31.3 1.51 0.80

26 68.9 1.54 0.94

28 58.4 1.81 0.21

29 53.5 1.72 0.71

30 28 1.60 0.26

32 164.7 1.56 0.91

33 13.9 1.82 0.20

34 64.6 1.72 1.12

Continuación del cuadro 17

Muestra Concentración Relación Relación

Cepa (ng/µL) 260/280 2601230

A 45.9 1.48 0.33

B 19.5 I.83 0.26

1 e 28.9 1.26 0.19

o 13.3 1.24 0.19

E 203.7 l.48 0.73

1 F 43.4 1.61 o.so 1

' e 141.9 1.62 0.73 '

H 419.0 l.74 1.18

1 27.3 1.56 0.30

J 290.3 1.52 O.SI

K 324.7 1. 70 1.07

L 1968.7 l.39 0.70

" 595.1 2.05 1.11

N 79.2 1.61 0.70

o 128.4 1.74 0.96

p 178.2 1.64 0.91

R 34.0 1.64 0.34

s 937.5 1.69 1.29

T 30.4 1.75 0.36

u 796.4 2.05 1.79

V 106.l 1.51 0.69

w 1017.6 1.61 1.18

X 840.0 1.58 1.56

y 160.6 1.55 0.67

z 435.I 1.86 J.46

Al 12.0 J.67 0.35

BI 390.4 1.67 0.35

BIBLIOTECA CUCBA 49

Ct 285.3 1.72 0.92

DI 172.8 1.48 0.59

El 1274.1 1.58 1.10

De la medición de espectrofotométrica realizada al ADN extraído de las cepas de

San Luis Potosí e italianas. Se obtuvo el 64. I 5%, con una concentración mayor a 50

ng/µ1. De la relación 260/280 se obtuvieron valores menores a 1.8 en el 75.47o/o de las

muestras lo cual indica una contaminación de proteínas. El 18.86% entre 1.8 y 2.0

siendo estas las que se encuentran en el rango óptimo y sólo el 5.6% fue mayor a 2.0

mostrando una contaminación con ARN.

so

8.3.3 Amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2

8.3.3.1 Amplificación de ADN

Una vez obtenido el ADN de las levaduras, se amplificó !a región ITSI-5.8S-ITS2

con el método propuesto por Esteve-Zarzoso y col. (2001 ), mediante la técnica de PCR

con el kit (i!lustra™ puReTaq Ready-To-Go). Los tamaños de los fragmentos fueron

arrojados de! programa Quantity one. En la figura 18 se muestran los resultados

obtenidos de !a amplificación de las cepas: las muestras A 1-S presentan un tamaño

uniforme de fragmento amplificado de 740-760 pares de bases (pb), de las cepas Cl-Z

el tamaño que se observa es de 420-450pb, la cepa Dl se muestra con un peso de 642pb,

de las cepas 1, N y E 1, el tamaño es de 848, 814 y 8 I 8pb respectivamente; las cepas de

la P-T presentan un peso molecular de 710-760pb, la cepa W su peso es de 566pb, la

cepa A es de 350pb y la cepa B 1 es de 664pb.

Figura 18. Gel de electroforesis para visualizar la amplificación de la región !TSI-5.8S-JTS2 de la~ C<..'r•i~ de San Luis Potosí. Carriles 2-19:(A 1, E. F. K. L. R. S. CL G, H, O, V, Z DI, EL 1, J y M). Carriks i\1 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases.

51

l 2 > ~ 5 ·=· , .. ·; r. 1

· ··::

P· P R

!.;, ' I' ( '~ •' •'

Figura 19. Gel de electroforesis para visualizar la amplificación de la región 1TS 1-5.8S-ITS2 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 1-9: (N, P, U, X, Y. T, W, A y B 1 ). Carril M indica: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

8.3.3.2 Amplificación directa de las colonias

Con la finalidad de acortar el tiempo y los costos que requieren una extracción

de ADN. se procedió a la estandarización de un protocolo que permitiera la

amplificación directa de las colonias. Tomando como referencia a Esteve-Zarzoso y col.

( 1999).

Por lo que se probó la amplificación directa de las colonias aisladas de San Luis

Potosí. Se seleccionó una cepa representativa de cada grupo (cepa E, cepa C 1, cepa 1,

cepa W y cepa U) para realizar la amplificación sin haberles real izado extracción de

ADN previamente (Figura 20).

Figura 20. Gel de electroforesis para visualizar amplificación a partir de colonias de cepas representativas de cada grupo de San Luis Potosí. Carriles 2-6: (E, Cl, 1, W y U). Carriles 1 y 7 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

52

8.4 Digestión

Una vez realizada la amplificación del fragmento del gen ITS 1-5.8S-ITS2, se

realizó la digestión enzimática con las enzimas de restricción Hha I, Hae III y Hinf I a

los productos de PCR de todas las cepas de San Luis Potosí citadas en el cuadro 9. Se

obtuvieron los siguientes perfiles que se muestran en las figuras 21 , 22, 23, 24, 25 y 26

y para su posterior identificación en los cuadros 18, 19, 20, 21 , 22 y 23.

4 ~ <• I X <t 1 O 1111 B "J.t 1 \ 1 b 1 / 1:.; 19 70

Figura 21. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha l. Hae 11 1 y Hinfl de las cepas de San Luis Potosí. Carriles l-1 9:(Al. E. F. K. L y B). Carriles 4 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

4 ~ h / X •t 10 1 1 111 1 141\ "lb 1/ 1X1't / O

Figura 22. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha 1, Hae lll y Hinfi de las cepas de San Luis Potosí. Carriles l -19:(R, S, SLP2, SLP5, SLP8 y SLP1 5). Carriles 4 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

53

Cuadro 18. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo 1: A 1, E, F, K, L. B, R, S, SLP2, SLP5, SLP8 ~ SLP15. Cepa Amplicón Hhal Hae 111 Hinfl

Al 742 286-180-175-77 661-79 245-191-120-80

E 747 287-184-180-88 669-81 246- 188- 11 7-80

F 774 276-180-173-88 611 -59 241-181-1 18-80

K 757 284-1 84- 180-89 646-89 243-182-118-80

L 762 275-181-175-86 641 -80 239-182- 11 4-80

B 750 295-193-171-90 635-76 252-188-120-80

R 723 274-180-171-80 639-67 228-17 1-106-80

s 728 281-182-180-8 1 636-72 243-177- 112-80

SLP2 738 281-178-85-178 632-76 241,183, 113,63

SLP5 740 296-188-85- 180 659-76 249-1 84-1 15-62

SLP8 745 289-181-85-181 648-58 247-1 83- 113-62

SLP15 740 296-189-87-180 675-60 255- 191-1 17-62

Figuro 23. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha l. Hae lll y Hin/ l de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-l 3:(C l, G, H y Z). Carril l indica: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM). El recuadro marcado con rojo señala la banda que diferencia las cepas de una especies posible de Pichia membranaefanciens y las cepas de Pichiafermentas.

C uadro 19. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo 11 a: C l. G. H z.

Cepa Amplicón Hita! Hae 111 Hinfl

Cl 455.27 150-98-80 286-157-86 243-201

G 438.65 160- 102-84 311-160-80 250-211

H 441.32 164-1 05-86 312-165-95 260-2 15

z 414.78 150- 107-80 282-170-70 231 - 186

54

~ 10 U 1l H 14 1} 1ó 17 1S n ! O Z1 ll 13 !4 .!!> !o ! 1

Figura 24. Gel de electroforesis de d igestión con enzimas Hha 1, Hae 111 y Hinf 1 de las cepas de San Luis Potosi. Carriles 1-6 y 9-26: A, DI , V, O, SLPI. SLP4, SLPI 1 y SLP l 2. Carriles 7, 8 y 27 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

Cuadro 20. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de d igestión de las cepas del Grupo 11 b: cepas A. DI. V, 0. SLPI , SLP4, SLPI! y SLPl2.

Cepa Amplicón Hiia! Hne 111 Hin[ ! A 360 155-1 05-90 309-81 254-201

DI 395 150-106-80 290-75 242-197

V 400 155-1 00-80 318-80 249-201

o 447 160- 101-84 320-93 256-211

SLP l 400 160-101-84 315-90 250-2 10

SLP4 410 165-100-80 315-78 245-200

SLPl 1 390 160-90-80 300-80 249-197

SLP12 390 151-90-75 303-80 248-200

Figura 25. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha 1, Hae 111 y Hin/ 1 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2- 10: E l , SLPl 4 y W. Carril l indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

55

Cuadro 21. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo 111: El, W y 14.

Cepa Amplicón Hltal Hae 111 Hin/!

El 642 293-225-97 405-220 342-216

w 566 293-224-11 o 406-200 342-211

SLP l4 630 299-222-99 496-209 330-205

.J 6 I :; •t 1 1) 1'1l l1?. H nl61/ 1!:!19 20

Figura 26. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hho l. Hoe 111 y Hif 1 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19: N. J. C. Y. T y SLP6. Carriles 1 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

X <t 10 11 'l/ '('. H 1\ lb 1 / l:l 1'1

Figura 27. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hho 1, Hoe lll y Hinf 1 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: SLP9 y SLP13 y carriles 13,14,15, 16, 17 y 18: 1 y M. Carriles 1, 9 y 19 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

56

Cuadro 22. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo IV: N, J, C, Y, T. l, M, 6, 9 13.

Cepa Amplicóo Hita ! Hae 111 Hin/!

N 814 380-365-1 40 32 1-243-183-136 380- 125

J 848 387-367-147 324-247-188-140 375-132

c 850 368-359-129 299-224- 167-1 03 357-117

y 786 380-369-143 320-239-183-136 392-130

T 760 382-360-141 322-24 1-1 84-141 392-123

813 381-360-140 311-236-175-131 371-131

M 782 380-362-1 42 340-250- 190-145 381- 127

SLP6 800 356-321-129 309-228-168-125 377-126

SLP9 810 363-338-133 315-236-175-125 368-120

SLPJ3 800 360-330-1 25 300-230-175-125 368- 120

Figura 28. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha l, Hae lll y Hin/ 1 de las cepas de San Luis Potosi. Carriles 2-19:P. U, X, D. SLP7 y BI. Carril 1 indica: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).

C uadro 23. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo V: P, U, X, D, SLP7 BI.

Cepa Amplicóo Hlta l Hae 111 Hinfl

p 735 320-236-95 735 345-228-158

u 735 319-289-95 735 354-234-164

X 710 314-290-98 710 353-234- 165

D 700 299-280-90 700 350-230-165

B l 700 291- 189-98 700 255-199-120

57

Figura 29. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hhaf, Hae!!! y Hú?fl con la cepa de San Luis Potosi. Carriles 1-3: SLP3.

8.4.1 Resultados de cepas SLP091007 aisladas de inóculo de San Luis Potosí.

Cuadro 24. Tamaño del amplicón y Gru o VI: cepas SLP3.

Cepa Amplicón

SLP3 400

de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo

Hhal Hae 111 Hinfl

160-103-79 303-89 258-210

58

En el cuadro 7 se presentan levaduras que han sido analizadas por RFLP. Este cuadro se

utilizó como referencia para comparar Jos patrones de bandas que se obtuvieron de las

levaduras de San Luis Potosí y así, poder identificar las especies encontradas.

Posteriormente se realizo el cuadro 25. En donde se presenta específicamente los

patrones de bandas para comparar los resultados de los análisis de RFLP de las cepas

de San Luis Potosí y las referencias que se tomaron.

Cuadro 25. Referencia de los articulos publicados con los que se compararon !as cepas para Ja identificación de levaduras.

Especie Amplicón Hlwl Hae 111 Hin/ 1 Autor

K!u.weromyces 740 285- ¡ 90-165-90 655-80 290-180- 120-80-65 Esteve-Zarzoso y

/acus col. ( 1999)

P1chia 460 l 60- l 00-90-75 315-90-55 270-195 Coton y col. (2006)

membranaefaciens

P1chw fermentans 450 170-110-80 340-85 260-210 Guillamón y col

( 1998)

Rhodozorula 640 320-240-80 415-215 340-225-75 Guillamón y col.

muci/a;;;mosa ( ! 998). Estcv.:-

ZarLOSO y col

( 1999). Carvalho:

col. (2005)

S(lc/111ro111v¡;·¿s 880 380-366-160 290-220-165-130 395-145 Coton y nil (20061

cereviswe

Hunse111aspor11 750 320-310-105 750 350-200-180 Estcvc-Zarloso:

g11illiermo11di1 col.(1999)

/s.w1chenkii1 460 160-100-90-75 315-90-55 270-195 Hierro y col. (2006)

lw11oiens10

59

De los cinco grupos que se formaron inicialmente de acuerdo a la morfología de

las levaduras de San Luis Potosí, una vez que fue realizado el análisis molecular, se

identificaron por especie cada uno_ de Jos cuales se obtuvieron dos grupos más. Para el

caso del grupo 11 se dividió en dos grupos: grupo II a y grupo ll b, el segundo grupo que

se agregó fue el VI que se muestran en e[ cuadro 26.

Cuadro 26. Tamaño en pares de bases (pb) de los productos de PCR y fragmentos de restricción

obtenidos de las levaduras de San Luis Potosí.

Grupo Especie Producto

DePCR Fragmentos de restricción

(pb) Hhal Haelll Hinfl

Grupo !\lun·i:rom; ·ces 742 286- 180-175-77 661-79 245-191-120-80

luc1is

Cirupo fJichiu 455 150-98-80 286-157-86 243-201

¡¡ b

(irurn !'1dri11 m 160- lDl-8-I 320-93 256-21 1

11 ~l /er111,,n1u11.1

(irn¡x1 R!111l/1,1or11/u 6-12 29.l-225-97 -105-220 3-12-21 (¡

111 m11cilo{'Íl10S(/

(lrupo Suc,·haron1yces 8'8 387-367-147 324-24 7-1 88-14() 375-132

1 \' Cl!/"1!1"i5ÍUI!

Grupo Ha11se11iuspora 735 319-289-95 735 354-234-164

\' guilliermondii

Grupo lssatchenkia 455 150-98-80 286- !57-86 243-201

VI

60

9. DISCUSIÓN

Para llevar a cabo este método mo!ecu!ar, primero se aislaron en placa las

colonias (Figura 13). De los medios de cultivos utilizados, el WL resultó e! más

apropiado para diferenciar mejor las cepas., debido a que entre sus componentes se

encuentra el verde de bromocresol y éste le confiere una tonalidad a cada colonia, lo

cual facilitó la identificación morfológica (ya que otorga más características con

respecto a !os otros medios). Este medio fue utilizado también por Pallmann y col.

(2001) para la identificación de flora nativa en fermentaciones logrando una

diferenciación morfológica eficiente.

En cuanto a la identificación de las levaduras aisladas por galerías APL los

resu!tados obtenidos de la base de datos apiweh™, inuestran notas como: perfil

inaceptable. dudoso o de baja discriminación. por lo que se observa que el 1nétodo. No

parece ser el adecuado para la identificación de levaduras aisladas del proceso de

elaboración del mczcal hasta nivel especie. ya que los resultados son confusos para una

identificación nccrtada. Algunos autores corno Guillan1ón) col. { 1998). Esteve-Zarzoso

)' col. ( 1999). Orberá-Ratón (2004 ), mencionan que estos métodos en general_ producen

arnbigüedades e incorrecciones en !os resultados. debido a que las características

111orfo!ógicas ) fisiológicas están fuerternente influenciadas por las condiciones de

cultivo. Nuestros resultados arrojan estas 1nismas a1nbigüedades. ya que dentro de los

1nisrnos grupos estamos obteniendo perfiles bioquímicos n1u) distintos entre sí. Las

técnicas basadas en la asimilación de nutrientes son 1nuy cuestionadas por los

investigadores que trabajan con identificación 1nolecular debido a la baja

reproducibilidad. co1no lo menciona Guillamón y col. ( 1998) y Esteve-Zarzoso y col.

(1999).

Para realizar la extracción de ADN se probó e! protocolo de Tapia-Tussel! y col.

(2006) que propone un método rápido y simple para extracción de ADN para levaduras

y hongos aislados del Agave. Este método implica dos pasos importantes: en primer

lugar, la ruptura de las paredes de las células por inedias mecánicos y la congelación, y

en segundo lugar. extracción. aislamiento. y precipitación del ADN genómico. Este

61

método pennite obtener un ADN de buena calidad, útil para llevar a cabo reacciones de

PCR.

En relación a la concentración y pureza del ADN, el 64.15% de las muestras

analizadas presentaron una concentración mayor a 50 ng/µL. Aunque en el cuadro 17 se

puede apreciar que no se obtuvo una concentración homogénea por lo que el método de

extracción es muy variable. Con relación a la pureza en la relación 260/280 tenemos que

el 75.4 7% es menor a 1.8, el I 8.86o/o es entre 1.8 y 2.0 y sólo el 5.66% fue mayor a 2.0.

Lo cual nos indica una contaminación con proteínas en la mayoría de las muestras, la

concentración de ADN obtenida está en el rango de 6.6-1968.7ng/µL y la pureza, de

1.24-2.05 (260/280). En contraste con los resultados de Tapia-Tussel! y col. (2006) ellos

obtienen una concentración entre 230-2620ng/µL y una pureza de 1.6-2.0 (260/280).

Sin embargo la calidad del ADN obtenido es suficiente para realizar la amplificación

para la técnica de RFLP. Estas muestras amplificaron en PCR. gracias a que la

concentración de ADN fue mayor a 50 ng/µL en la inayoría de los casos. Cuando se

obtuvieron concentraciones menores se colocó mayor volumen de muestra en las

reacciones de PCR.

En la figura 15 se puede observar un gel de electroforesis de la amplificación

realizada a partir de 1nuestras a las que se les realizó extracción de ADN y en la figura

16 se muestra un gel de electroforesis de la amplificación directa de cepas

representativas de cada grupo. Como se puede apreciar con las dos metodologías de

amplificación se obtuvieron los mismos resultados, ya que si hacemos primero

extracción de ADN o si ponemos directamente la colonia en la mezcla de reacción de

PCR, obtenemos e! mismo fragmento amplificado. Con la metodología donde ponemos

la colonia directa para amplificar tenemos la ventaja de que al no hacer la extracción de

ADN, reducimos tiempo y costos en el análisis. Esteve-Zarzoso y col. (1999) utilizaron

esta técnica de amplificación directa, obteniendo resultados similares.

De los resultados que se obtuvieron con la tecnica de RFLP mediante la

amplificacion directa de ADN de las colonias, se observó que los patrones resultantes de

la digestion en ambos casos son iguales. De las cuales el 95.455% de las cepas aisladas

se identificaron a nivel de especie por Ja técnica de RFLP, sólo el 4.545% de la

muestras se logró identificar a nivel género.

62

En el estudio que realizaron en la destiladora de tequila Herradura (Amatitan,

Jalisco) (Lachance, 1995) encontraron las siguientes especies: Clavispora lusitaniae,

Metschnikowia agaveae, Hanseniaspora spp., Pichia kluyverz~ Candida krusei,

Schizosaccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii,

Kluyveromyces marxianus, Hanseniaspora spp., Zygosaccharomyces bailii, Candida

milleri. Brettanomyces spp. y. Pichia membranaefaciens. Comparado con el trabajo que

aquí se presenta, se encontraron más especies de levaduras, lo que podría ser debido a

que en éste trabajo se hizo un muestreo de inócu!o y en el trabajo de Lachance se realizó

un muestreo más extenso en agave fresco y cocido, Drosóphila spp .. jugo de agave y en

el equipo que se utilizó para el proceso de la elaboración del tequila, dando como

resultado una gama más amplia de especies de levaduras. Además de que la especie de

agave que se utiliza para la producción de tequila es diferente a !a que se maneja en la

elaboración de mezcal en San Luis Potosí.

En otro trabajo realizado en la fermentación de mezcal de San Luis Potosí por

Escalante-\1inakata y col. (2008) sólo se encontraron C/avispora lusitaniae. Pichia

fi?rmentans y Kfuyveron1yces n1arxianus. El mayor número de levaduras encontradas en

este trabajo. podría ser debido a que e! muestreo se hizo en inóculo y el trabajo de

Escalante-Minakata (2008) se realizó durante la fermentación y algunas de las levaduras

presentes en e! inóculo no logran sobrevivir a la fermentación. También podría ser

debido a los medios de cultivos que utilizaron Escalante-Minakata y col. (2008).

quienes no utilizaron el medio WL (sólo APD. YPD y JA); que nos ayudó a

identificar más variedad en las cepas, ya que, confiere tonalidades a las diferentes

levaduras y facilita la diferenciación de las cepas para posteriormente poderles realizar

e! análisis molecular para su identificación.

63

10. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos permiten concluir que:

l. El método de RFLP permitió identificar levaduras hasta nivel de especie con un

95.455% y con un 4.455% a nivel de género con los patrones de polimorfismo

reportados hasta el momento.

2.- El presente trabajo permitió establecer y estandarizar un protocolo corto para la

identificación de levaduras presentes en el inóculo muestreado.

3.-El inócu[o utilizado para la producción de mezcal en la mezca!era ''La Perla,. está

constituido por una población heterogénea debido a que se encontraron siete grupos de

levaduras diferentes. de las cuales cinco se identificaron a nivel especies y dos a nivel

género.

64

11. LITERATURA CITADA

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