INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA

Karina Trono

Instituto de Virologia

INTA Castelar

APROCAL 19 / 09 /2019 Rafaela

Estrategia de control de la LeucosisBovina a través de la vacunación

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA

Leucosis Bovina: No todo está perdido

Karina Trono

Instituto de Virologia

INTA Castelar

APROCAL 23 / 09 /2010 Rafaela

Infectada de por vidaAnticuerpos/ Provirus / Sin detección de virus

Linfocito B Provirus integrado

Linfocito B

BLV

Sana / Susceptible

EL BLV GENERA UNA INFECCIÓN PERSISTENTE

ASINTOMATICASSerología / PCR

Semen

LINFOSARCOMAS

INFECTADAS

EL BLV CAUSA LA LEUCOSIS BOVINA

0,5-1 %

33.9%

45%

40.6%

30-70 %

26 %

37 %1

36.5%

54.6 %2

35.6 %

29%

45%

32.85 %

34.7 %

25 %

Argentina Trono y col. 2001

Alejo y col. 2000

Maradei com. Per.

Bolivia Lopez y col. 2010

Brasil Fernandez y col. 2009

Camargos y col. 2002

Molnár y col. 1999

Moraes y col. 1996

Andrade y col. 1991

Alencar Filho y col. 1979

Chile Grau y Monti, 2010

Colombia Hernandez-Herrera, 2011

Ecuador World animal Health, 2004

Paraguay Rodriguez y col. 2010

Perú Guinnet, 2010

S. Ortiz com.per.

Uruguay Rama y col. 2012

Venezuela Nava y col. 2011

≥ 30 %

EL BLV es de distribución mundial

EN 40 AÑOS EL BLV SE EXPANDIO EN ARGENTINA

1970 19901980 2000 2010

Primer Reporte1973

5% Rodeos10-28% Individual

80-90% Rodeos25-32% Individual

100% Rodeos90% Individual

Año En Argentina

1973 Primer hallazgo, linfosarcoma por VLB

1987 5 % rodeos lecheros infectados – 10-28 % animales infectados

2001 80-86 % rodeos lecheros infectados – 25-32 % animales infectados

Actualidad 100 % rodeos lecheros infectados - 90 % animales infectados

1. Conocer la progresión desde el nacimiento para identificar puntos de control

2. Evaluar infección natural para identificar fuentes de transmisión

3. Avanzar con una estrategia para interrumpir el ciclo de transmisión

Manejo preventivo

Selección genética

Cepa viral atenuada

Que podemos hacer ?

APROCAL 23 / 09 /2010

cría recría preñez lactanciaparto

IA semen

calostroLeche

Contacto con animales

infectados

Contacto con vacas secas

adultas

8Prevalencia de animales infectados con virus de la leucosis bovina en tambos de la zona de Rafaela, provincia de Santa Fe. Datos 2010-2016.

Alta carga proviral

Baja carga proviral

100ul

1ml

infectados

infectados

8/8

7/7

Transmisión por sangre asociadoAl nivel de infección

Gutiérrez y col. 2017

Donante Receptor

Mad

res

Leches

indiv

idual

es

Leches

de

tanque

Terner

os

0

20

40

60

80

100

90%96% 100% 95%

Prevalencia de anticuerposa)

Fre

cu

en

cia

Mad

res

Leches

indiv

idual

es

Leches

de

tanque

Terner

os

0

20

40

60

80

100

82% 59% 90% 13%

Prevalencia de provirusb)

Fre

cu

en

cia

Calostro 67,8%Jaworski y col. 2015, Porta y col. 2019Lomonao y col, 2019

Gutiérrez et al., 2011

El nivel de infección circulante es heterogéneo

Leche y calostro tienen anticuerpos y virus

La reactivación viral puede ser espontánea

Spontaneous virus reactivation during chronic BLV infection in cattle. The BLV proviral load (black), BLV pol RNA expression (red), level of BLV-sp antibodies (blue dotted line) and the absolute counts of lymphocytes (blue solid line) were followed-up in a single Holstein cow chronically infected with BLV. BLV DNA and RNA levels are expressed as Log10 of copies per μg of total DNA and per ml of plasma, respectively (left axis).

Jaworski et al 2018, Alvarez et al 2019

Time point

10998 11218 11226 10189 11181 11265 11266

Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol

5BD + - - - - - - - - - - - - -

D - - + + - - - - + - ND ND - -

5AD ND ND + - - - - - - - - - - -

2M - - - - - - - - - - - - - -

4M + - - + - - - - - - - - - -

6M - - - - - - - - - - - - - -

8M - - + + - - ND ND - - - - - -

10M - - - - - - ND ND - - - - - -

5BD2 - - - - ND ND ND ND - - - - ND ND

D2 + - + - + + ND ND - - - - ND ND

BLV RNA detection by RT-nested PCR in bloodsamples of naturally infected animals. tax and pol genes were used.

La carga proviral correlaciona con el recuento total de glóbulos blancos y es reflejada por el nivel de anticuerpos circulantes

Gutiérrez et al., 2012, Alvarez et al., 2013

BLV ES DETECTABLE EN SEMEN

In the period 2005-2006, 685 frozen semen samples from seropositive bulls were remited to the laboratory by Artificial Insemination Centers.They were analyzed by gag-PCR. The BLV status of the bulls was determinated by two diferent ELISAs (VMRD and an assay using p24 asantigen, developed in our laboratory) and by PCR from whole blood. It was possible to detect BLV genome in 22 out of 23 bulls and 55 out of685 samples.Pinksquares: BLV positive (PCR), Blue squares: BLV negative (PCR)

El patrón de detección es intermitente Rossich y col 2007

Lucro cesante por animal (USD) por

muerte por linfosarcomaValores de referencia (promedio)

1. Leche no producida 2940 Prevalencia individual 40 %

2. Reposición post-muerte 1800 Mortalidad 5 %

3. Ausencia de ingresos por

comercialización en matadero

al fin del ciclo de lactancia

520 Lactancias (n.º ciclos) 3,7

4. Falta de nacimientos de

nuevos terneros120

Producción de leche por ciclo

(litros/año)5000

Total 5380 Tasa de reposición 27 %

Impacto económico directo x linfosarcoma

Castellano y Goyzueta, 2014

13

Impacto económico en la comercialización

Intervenir lo antes posible = reducir el contagio

Un gran desafío para terneros jóvenes

Vacas adultas

Rec

ién n

acid

os

Prim

er p

arto

Vac

as a

dultas

0

20

40

60

80

100

10%

50%

90%

Pre

vale

ncia

(%

)

• Índices de infección extremos

• No hay políticas de control interno

• Estrategia de prevención de iatrogenia que parece no funcionar

• Necesidad de sanear los rodeos para impedir las pérdidas

- Segregación por carga proviral

- Selección genética de animales

-Vacuna / Premunición

LAS ESTRATEGIAS CLÁSICAS NO SON SUSTENTABLES EN NUESTRO CONTEXTO PRODUCTIVO

- Eliminación de positivos

- Segregación de positivos

- Modificación de maniobras zootécnicas

INTERRUMPIR EL CICLO DE TRANSMISION

Virus naturalVirus atenuado

COMPETENCIA

VACUNA O PREMUNICION: INFECTAR PARA PROTEGER

‐ Cepa atenuada de BLV

‐ Competencia con la cepa de campo

‐ Generar infecciones de CPV baja

‐ Interrumpir el ciclo de transmisión

‐ Sin modificaciones extra manejo, infraestructura, reproductores

CEPA BLV DX6073

PCR

Serología

Ensayo 1 Expediente506979/07 ResoluciónSAGyP 151/08.

Ovinos y

Bovinos en

Box

Ensayo 2 Expediente227352/10 ResoluciónSAGyP 03/11

Bovinos

Campo

INTA

Ensayo 3 Expediente562943/2013,Resolución SAGYP83/2014

Bovinos

Campo

INTA

Demostrar la infectividad de la cepa modificada BLV DX-6073 en la especie bovina

Demostrar la capacidad de la cepa BLV DX-6073 de inducir respuesta inmune humoral

Analizar la carga proviral inducida por la infección con la cepa BLV DX-6073

Estimar la capacidad de transmisión por contacto a centinelas no infectados

Demostrar la resistencia al desafío experimental y natural

Financiacion: CONICET, FNRS, MINCYT, INTA, FUNDACION ARGENINTA, INTEA

ENSAYOS PREVIOS

La cepa atenuada replica a bajos nivelesN

um

be

r o

f p

rovi

ralc

op

ies

per

10

0

PB

MC

s

0,00

0,01

0,10

1,00

10,00

100,00

1000,00

0 50 100 150 200 250 300

WT 21

WT 23

WT 31

WT 492

WT 535

D 3

D 28

D 30

D 35

D 42

D 43

D 45

D 47

D 55

D 57

ArgWT 6

ArgWT 46

wild-type

attenuated

lymphocytotic

Time (days)

En presencia de anticuerpos con niveles comparables a la cepa WT

3 28 30 35 42

43 45 47 55 57

Vacunadas

21

23 31

492535

BLV natural Rodeo

(n = 78)

Protege frente al desafío natural y no se transmite

tumores: 0/10

3 28 30 35 42 43 45 47 55 57

84 87

98 102

21 23 31 492 535

88

100104

113 114109

257 259 261 269 263 262 270 268272

112

Año 1

Año 2

Año 3

Año 4

Año 5 294 288286300293292297291298

BLV natural Vacunadas

Ausencia de provirus en leche

No infectivas

Presencia de anticuerpos pasivos

infected

10ml de sangre no alcanzan para transmitir la infección vacunal

High proviral load

Low proviral load

INFECCION NATURAL

VACUNADA

100ul

1ml

10ml

infectados

infectados

No infectados

8/8

7/7

0/5

Desafío experimental1013 copias WT

4 años

vacunación PCR

Vacunados Controles- + NT1 NT2

Controles PCR

M

Wt 610 bpVacuna 230 bp

La cepa atenuada protege frente al desafio experimental

Wt 610 bpVacuna230 bp

La cepa atenuada no esta presente en carne de consumo

Ruiz y col., 2019

• es infecciosa

• replica a bajos niveles

• genera respuesta inmune similar a la natural

• protege frente al desafío experimental y natural

• es segura: no se transmite / no es patogénica

• provee inmunidad pasiva

LA CEPA ATENUADA CUMPLE CON LOS REQUISITOS

• es trazable

• los terneros y la leche no evidencian infectividad

• protege frente al desafío natural en contexto productivo

2008-2015

Ensayo 1 Expediente 506979/07Resolución SAGyP151/08.

Ovinos y

Bovinos en

Box

Ensayo 2 Expediente 227352/10Resolución SAGyP 03/11

Bovinos

Campo

INTA

Ensayo 3 Expediente562943/2013,Resolución SAGYP83/2014

Bovinos

Campo

INTA

Ensayo 4 Expediente 11591/14

Resolucion SAGYP

288/2015

Bovinos

Campo

INTA

Rafaela

Tambo

comercial

Objetivos

Demostrar la infectividad de la cepa modificada BLV DX-6073 en la especie bovina

Demostrar la capacidad de la cepa BLV DX-6073 de inducir respuesta inmune humoral

Analizar la carga proviral inducida por la infección con la cepa BLV DX-6073

Estimar la capacidad de transmisión por contacto a centinelas no infectados

Demostrar la resistencia al desafío experimental y natural

Demostrar la resistencia al desafío natural en condiciones productivas

EVALUACIÓN DE LA EFICACIA PARA

PREVENIR LA INFECCIÓN NATURAL EN UN

RODEO LECHERO

Expediente SENASA SO1-0011591/2014Resolución 288/2015 Ministerio de Agroindustria

PASO SIGUIENTE y NECESARIO

Estación Experimental Agropecuaria Rafaela

Guillermo SUAREZ ARCHILLA

1. Evaluar la protección contra la cepa de campo.

2. Confirmar que genera infecciones de carga proviral baja.

3. Comprobar que no se trasmite a otros animales.

4. Analizar la inocuidad de la leche.

OBJETIVOS DEL EXPERIMENTO

Establecimiento Lechero TAMBO INTA RAFAELA Prevalencia >80%

Grupo Vacunado y Grupo Control

Cohortes según disponibilidad

Seguimiento de la infección Anticuerpos y Provirus

DISEÑO DEL EXPERIMENTO

VACUNACIÓN

Terneras Vaquillonas VacasFin de Ciclo

Carne conserva

ANÁLISIS de los CONVIVIENTES

ANÁLISIS de los Animales del ENSAYO

ANALISIS de LECHE

ESQUEMA DEL EXPERIMENTO

RESULTADOS2015-2019

1 6 12 18 24 30 36 42

Vacunación

Tiempo de Vida(meses)

Pre

vale

nci

a (%

)

45

Parto

AnticuerposCalostrales

Prevalencia Vacas Totales

2015 2016 2017 2018 201995 % 88 % 92 % 84 % 91,5%

Existe una intensa DINÁMICA DE INFECCIÓN NATURAL

2015 2019

13 11 14 1722 25

33

45

55

69 71 717264

93 93

Cohorte 1 Cohorte 2 Cohorte 3 Cohorte 4 TOTAL

Fecha de Inicio Feb 2016 Sept 2016 Feb 2017 Jul 2017

Edad vacunación (meses)

5-7 6-8 5-9 8-15

Vacunadas 6 5 14 4 29Control 25 21 22 5 73Total 31 26 36 9 102

4 COHORTES EN ESTUDIO

LO VAMOS A VER EN DOS CONJUNTOS

Control no Infectado

Tratado no Infectado

Infección cepa WT

Vacunado

Control con cepa Vacunal

Vacunado WT

Cohortes 1 y 2

REACTIVIDAD SEROLOGICA SIMILAR

% d

e R

eac

tivi

dad

0 6 12 18 24 30 36 39

Vacunación

Tiempo post Vacunación (meses)

Parto

NINGUNA DE LAS VACUNADAS SE INFECTO CON LA CEPA DE CAMPO

% d

e R

eac

tivi

dad

120 6 18 24 27

Vacunación

Tiempo post Vacunación (meses)

Parto

Control no Infectado

Tratado no Infectado

Infección cepa WT

Vacunado

Control con cepa Vacunal

Vacunado WT

Cohortes 3 y 4

NINGUNA DE LAS VACUNADAS SE INFECTO CON LA CEPA DE CAMPO

REACTIVIDAD SEROLOGICA SIMILAR

Tiempo post Vacunación (meses)

CP

V (

cop

ias/

ugA

DN

)

120-6 18 24 306

0

1000

100000

10000000

>70%

Alta CPV

NINGUNA VACUNADA PRESENTA CARGA PROVIRAL ALTA

CPV de vacunadas e infecciones de campo

Infección cepa WT

Vacunado

Control con cepa Vacunal

Vacunado WT

Vacunación

Pre PostEGRESO

PCRNested Diferencial

Nº

de

An

imal

es

Serología ( + )Serología ( -- ) Serología ( + ) PCR( -- )

Serología ( + ) PCR( + ) WT

Serología ( + ) PCR( + ) DM

37%34%

SeropositivosSeropositivos

87%

Análisis de los machos la recría

NO SE TRANSMITIO A LOS CONVIVIENTES

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 1310 12 50 vacasal azar

% d

e R

eac

tivi

dad

Meses post Parto

NO HAY DETECCIÓN DE PROVIRUS EN LECHE

Leche de Vacunadas

Leche de 50 vacas al

azar

ANTICUERPOS en LECHE similar a la infección natural Deteccion WT

Vacunada Sin PCR

Vacunada Sin deteccion de Provirus

Sin deteccion

20%

14 % Madre Madre

Ternero Ternero

Análisis de Filogenia

No Infectado

Infección cepa WT

Infección cepa Vacunal

Crías del rodeo general

Crías de las Vacunadas

NO SE TRANSMITIO A LA DESCENDENCIA

ANTICUERPOS en TERNEROS inferior a la infección natural

NO HAY LINFOSARCOMAS CONFIRMADOS

Presuntivos de Muerte y Descarte

-Sin diagnostico-Neumonía

-Ingreso a Lactancia

2

7

2

64

3

3

2

Total de Perdidas: 29

EN RESUMEN

Grupo C1 C2 C3 C4 Total

Fecha inicio ago-15 feb-16 feb-17 jul-17

Tiempo de experiencia transcurrido 4 años 3 años y medio 2 años y medio 2 años

Edad actual 33 meses 27 meses 24 meses 24 meses

Edad vacunación 0 y 6 mesesB 0 y 6 mesesB 6-8 mesesC 6-8 mesesC

Número total de animales (n)A 20 17 29 5 71

Vacunados (n)A 4 4 10 2 20Control (n)A 16 13 19 3 51

Prevalencia infección natural al inicio 11.7% 12,80% 2,80% 22.2% 12,37

Prevalencia infección natural (Junio 2019)

81.2% 92% 84.2% 100% 89,35%

Vacunados protegidos a la infección natural

4 4 10 2 20

Vacunados con carga proviral alta 0/4 0/4 0/10 0/2 0

EN RESUMEN

1. Protege contra la cepa de campo.

2. Genera infecciones de carga proviral baja e indetectable.

3. No se trasmitió a los convivientes ni a la descendencia.

4. No hay detección de provirus en leche.

Fin del ensayo 2021……….

Proyecto FONTAGRO APROBADO Junio 2019 = formulación PILOTO

Ensayos clínicos: etapas de investigación y desarrollo de vacunas (humanas)

Infectividad

Inmunogenicidad

Diagnostico

Carga proviral

Respuesta inmune

InmunogenicidadSeguridad

Prototipo

Piloto

Esquema previsto

N=100

Fase I Fase II Fase IIIPruebas de concepto

Fase IV

Seguridad

Prueba inicial en contexto real

EficaciaSeguridad

REGISTRO POSTREGISTRO

Ensayo piloto 2020• Propósito: disminuir la prevalencia de infección con la cepa de campo en rodeos lecheros

• Objetivo: Evaluar la eficacia de la vacunación en los establecimientos seleccionados

• Requisitos de los establecimientos para su inclusión en el estudio

– Que tengan una clara percepción de la enfermedad y los perjuicios que le ocasiona al rodeo lechero.

– Voluntad y compromiso de cooperación en las tareas que involucren las actividades del ensayo: muestreos de animales, vacunaciones.

– Cercanía a la EEA Rafaela. Los establecimientos no deberán estar en un radio superior a los 20 km de la misma

– Que el rodeo tenga una prevalencia de infección mayor o igual al 80% en las vacas en lactancia

– Que sea un tambo cerrado o con estricto control de movimientos

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA

GRACIAS!!!

Proyecto vacuna:GUILLERMO SUÁREZ ARCHILLA; GERÓNIMO GUTIÉRREZ, MARCOS PETERSEN, IRENE ALVAREZ, ROMINA POLITZKI, NATALIA PORTA, LUCIANA CAVIGLIA, CINTIA GONZALEZ, CECILIA MARTINEZ, VANESA RUIZ, HUGO CARIGNANO, LUIS CALVINHO, ALEJANDRO ABDALA, KARINA TRONO, DIEGO FRANCO, CLAUDIO FIORONI, LUCAS VAGNONI, VERONICA MALDONADO MAY, AGUSTIN VILOR, LAUTARO FRANCO, LUC WILLEMS, NICOLAS GILLET, SABRINA RODRIGUEZ, ALIX DE BROGNIEZ, ARNAUD FLORINS, FANNY BOULANGER, CLAIRE MUZYKA; SOPHIA TAJRIC