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Estructuración genética en tres poblaciones marginales de Prumnopitys andina, una especie

amenazada

Paulina Hernandez a , Cristian Echeverría a , Rodrigo Hasbún ab

a Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Forestales, Concepción, Chile. b Centro de Biotecnología de la Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

RESUMEN

Prumnopitys andina es una conífera amenazada, endémica de Chile y Argentina, de una distribución

geográfica restringida. El objetivo de este trabajo fue determinar la estructura genética de tres

poblaciones marginales de la especie mediante la técnica AFLP. Se probaron 99 combinaciones AFLP

y se eligieron las tres combinaciones más informativas, las cuales generaron 150 loci y solo nueve

polimórficos. Los resultados de este estudio indicaron que la especie posee bajos niveles de diversidad

(He = 0,011), en contraste con otras coníferas chilenas. La población con mayor porcentaje polimórfico

fue la población de más al norte (3,95%) y con tres alelos únicos. El análisis de varianza molecular

(AMOVA) reveló que el 42% de la variación genética total encontrada ocurre entre los grupos, un 18%

entre poblaciones y un 39% dentro de las poblaciones. El grado de diferenciación genética entre

poblaciones fue significativo (Fst = 0, 608). Mediante el programa STRUCTURE, se agruparon las

poblaciones de Angol y Conguillío en un cluster y Colbún en otro. La técnica utilizada en este estudio

fue útil para estimar la estructuración genética de P. andina, lo cual aporte al desarrollo de estrategias

de conservación para la especie y para la propuesta de sitios prioritarios de conservación.

Palabras claves: variabilidad genética, conífera, endémica, AFLP

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INTRODUCCION

Es ampliamente sabido que el cambio de uso del suelo (CUS) impacta negativamente la biodiversidad

a nivel mundial (Pimm y Raven 2000, Sala et al. 2000). El CUS se asocia a procesos de fragmentación,

destrucción y degradación de los hábitats, los cuales son reconocidas como procesos antrópicos que

generan las mayores amenazas para los ecosistemas en el mundo (UICN 2004). Este proceso tienen un

efecto negativo sobre la biodiversidad al incrementar el aislamiento de hábitats (Debinski y Holt 2000),

afectar la riqueza de especies (Gigord et al. 1999), modificar la dinámica de las poblaciones, poner en

peligro de extinción a las especies (Watson et al. 2004). Como resultado de la fragmentación de los

hábitats, se espera una disminución de la capacidad de los bosques nativos para responder a los efectos

del cambio climático (Holderegger y Wagner 2008). En particular, se espera un aumento en la

susceptibilidad a los incendios, invasión de especies exóticas, una reducción en la polinización y una

restricción en la dispersión de semillas (Forman y Godron 1986).

Esto origina poblaciones con tamaños pequeños demográficamente inestables. Estas poblaciones son

más propensas a la extinción, ya que los factores estocásticos, tanto genéticos como demográficos,

aceleran su disminución, reduciendo aún más el tamaño poblacional, y así hasta llegar a la extinción

(Primack 2001).

Análisis genéticos permiten estudiar el efecto de la fragmentación y la reducción del flujo génico en

poblaciones estructuradas. Por otro lado, se puede dar solución a problemas genéticos, identificando

especies prioritarias para la conservación, y creando mejores manejos, para idealmente, poder proteger

los procesos evolutivos que mantienen la diversidad biológica (Moritz 2002). Lo anterior es relevante

para la conservación de la diversidad genética la cual es la materia prima para la evolución (Hedrick

2001).

Es urgente desarrollar estudios de variabilidad genética especialmente en especies amenazadas. Con

esta información se pueden realizar valiosos aportes para el desarrollo de prácticas efectivas de

conservación tendientes a proteger sus acervos genéticos (Premoli 1994).

Los bosques templados de Chile son reconocidos como hotspots de diversidad y han perdido al menos

un 70% de su hábitat original (Myers et al. 2000). A pesar de la importancia ecológica que tienen estos

bosques, la zona centro-sur de Chile se ha visto altamente fragmentada, sufriendo una fuerte

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deforestación en las últimas décadas (Aguayo et al. 2009, Altamirano y Lara 2010, Echeverría et al.

2006).

Una de las especies amenazadas sometidas actualmente a diversos procesos de degradación de su

hábitat es Prumnopitys andina (Poepp. ex Endl.) de Laub. Esta especie es una de las pocas coníferas

endémica de Chile y actualmente se encuentra catalogada como "Vulnerable", por el "Libro Rojo de la

Flora Terrestre de Chile" (Benoit 1989) y la "UICN Red List of Threatened Plants" (UICN 2010).

Prumnopitys andina se encuentra principalmente distribuida en la Cordillera de los Andes de Chile

desde la Región del Maule (Provincia de Linares, 35º52’S) hasta la Región de la Araucanía (Provincia

de Cautín, 39º30’S). Sólo se conoce una sub-población ubicada en la ladera este de la Cordillera de

Nahuelbuta, Región de la Araucanía (Hechenleitner et al. 2005). Prumnopitys andina es un árbol

siempreverde, dioico y rara vez monoico (Donoso 2006 ). Posee conos masculinos en espigas, conos

femeninos con un fruto carnoso, 2-3 cm de largo, amarillos cuando maduros, de sabor dulce, su

floración es en noviembre. Las semillas son ovoides y recalcitrantes; y su maduración entre enero y

marzo (Hechenleitner et al. 2005). Según antecedentes recopilados en el año 2005, su número total de

sub-poblaciones es menor a 10, teniendo un área de ocupación aproximadamente de 50 km2. Las sub-

poblaciones pequeñas varían aproximadamente entre 100 y 1000 individuos (Hechenleitner et al.

2005).

Pocos estudios revelan el estado actual de las poblaciones de esta especie , (Donoso 2006 ,

Hechenleitner et al. 2005). La mayoría de estas poblaciones están siendo sometidas a procesos de

fragmentación y degradación de hábitat. No existen mayores antecedentes acerca del tamaño de

poblaciones marginales, los tipos y grado de alteración que posee el hábitat, ni la viabilidad de la

población a través de la regeneración.

Dentro de las gama de marcadores moleculares, los AFLP son una herramienta altamente recomendada

para la detección de la estructura genética, en el análisis de la evaluación de la biodiversidad (Ovesna et

al. 2007). Esta técnica está basada en la amplificación selectiva de fragmentos de ADN genómico (Vos

et al. 1995), la cual consiste en la digestión de ADN genómico por enzimas de restricción, generando

fragmentos, los cuales son amplificados por PCR y posteriormente separados por electroforesis

determinando fragmentos polimórficos característicos, esto es debido a que la técnica AFLP (Vos et al.

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1995) es considerada como un marcador de alta eficacia, altamente reproducible y permite un análisis

de un elevado número de loci por experimento sin requerir información previa sobre su secuencia. Son

marcadores dominantes y abarcan gran parte del genoma, como también una mayor tasa de

polimorfismo, que los marcadores dominantes RAPD (Random amplification of polymorphic DNA),

los cuales se han utilizados en otros estudios de especies chilenas amenazadas como, Pilgerodenreon

uviferum (D. Don) Florin. (Allnutt et al. 2003) y Araucaria araucana (Molina) K.Koch. (Bekessy et al.

2002) los cuales reportan los estados de los recursos genéticos de las especies, patrones de distribución

y creación de estrategias de conservación para cada especie.

El objetivo de esta investigación fue analizar la estructura genética de tres poblaciones de P. andina

para proponer estrategias de conservación para la especie. Los objetivos específicos son: i) caracterizar

tres poblaciones de P. andina en términos de tamaño poblacional y el estado actual de su hábitat, ii)

examinar la diversidad genética entre y dentro de las poblaciones, y iii) proponer acciones de

conservación en base a los resultados de los objetivos anteriores.

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METODOS

Área de estudio y material vegetal. El material vegetal fue seleccionado al azar, a partir de 10

individuos por población de P. andina procedentes de las siguientes tres poblaciones distantes entre

ellas: Colbún, Angol y Parque Nacional Conguillío (Fig. 1). Se seleccionaron las tres poblaciones

marginales de su distribución geográfica, es decir, la población ubicada más al norte y más al sur por la

Cordillera de los Andes y la única población en la Cordillera de la Costa. Se extrajo muestras de hojas,

ramas vivas en buenas condiciones, verdes y frescas de 5 a 7 hojas de una altura de 10cm

aproximadamente. Los análisis se realizaron en el Centro de Biotecnología de la Universidad de

Concepción.

Figura 1. Ubicación de las poblaciones estudiadas de P. andina

Caracterización de las poblaciones y de hábitat. La caracterización de las poblaciones se hizo a partir

de variables observables como tipo matriz, vegetación, amenazas entre otras (Tabla 1).

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Tabla 1: Variables de medición para la descripción de cada sitio de recolección de hojas de P. andina.

Variables Descripción

Matriz Usos y coberturas del suelo adyacentes a la población estudiada. Por

ej.: bosque secundario de Nothofagus, plantación forestal de Pinus

radiata, etc.

Estado del suelo superficial Evaluación visual del estado general del suelo en términos de grado

de compactación (alto, medio o bajo), afloramiento rocoso (% del

hábitat ocupado por roca), grado de erosión: alto (sin horizonte

orgánico), medio (partes con suelo mineral expuesto, bajo (con

horizonte orgánico).

Vegetación

acompañante

Especies acompañantes presentes en el hábitat

Amenazas Tipo de amenazas que posee la especie en su hábitat (ramoneo,

explotación maderera, cambio de uso del suelo, incendio) y su grado

de alteración: alto, medio o bajo (% del hábitat afectado: >75%, 50-

75%, <50%).

Protección Si la población se encuentra dentro del Sistema de Áreas Protegidas

del Estado (SNASPE).

Clima Descripción del clima en términos de la humedad relativa (baja:

<40%, media 40-70%, alta >70%) y temperatura del aire promedio

del año

Tamaño de la Población Número de individuos maduros de cada población

Área de Ocupación Según los criterios de la UICN, este se define como el área más

pequeña esencial para la supervivencia de las poblaciones de P.

andina.

Extensión de la presencia Según los Criterios de la UICN, este se define como el área

contenida dentro de los límites imaginarios continuos más cortos

que pueden dibujarse para incluir todos los sitios con presencia de P.

andina.

Regeneración Ausencia o presencia de plántulas de P. andina < 1,3 m de altura

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AFLP. La técnica de AFLP se efectuó según el protocolo descrito por Hasbún et al. (2011). Este está

basado en el método descrito inicialmente por Vos et al. (1995), pero utilizando fluoróforos adheridos a

los partidores de la amplificación selectiva, con el fin de ser separados y reconocidos por electroforesis

capilar en un secuenciador automático.

La digestión se realizó utilizando 10 ng/µL de ADN con enzimas EcoRI y MseI, luego se ligaron los

adaptadores de doble cadena específicos para dichas enzimas. En la amplificación preselectiva se

utilizaron partidores del tipo EcoRI +0 y MseI +0 y posteriormente el producto de PCR fueron

visualizados en gel de agarosa 1%, con marcador de peso molecular 1 Kb Plus ADN Ladder generando

bandas de tamaño cercano a las 500 pb. Finalmente en la amplificación selectiva se probaron 99

combinaciones (Tabla 2) en ocho individuos aleatoriamente elegidos, de las cuales se eligieron las tres

más informativas para el posterior análisis genético de todos los individuos.

Los productos de PCR se cargaron en el secuenciador automático ABI PRISM 3130xl Genetic

Analyzer (Applied Biosystems). Posteriormente, el análisis de los perfiles de AFLP en bruto fueron

analizados utilizando el software GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems). La selección de

combinaciones se basó en un perfil homogéneo entre 50 y 500 pb, la calidad de la asignación del

estándar de tamaño LIZ-500 y la buena forma de las bandas que facilite el posterior análisis. Utilizando

30 individuos (10 por población), se utilizaron las tres mejores combinaciones seleccionadas según los

criterios ya señalados. Las bandas consideradas en el análisis deben cumplir las siguientes condiciones;

i) valor mínimo del umbral de fluorescencia de 200, ii) ausencia de superposición con otra banda, iii) y

buena forma (gaussiana). Cada banda generada fue interpretada como un locus genético independiente,

se consideraron como polimórficos aquellos que al menos presentaban dos presencias o dos ausencias,

es decir, que si todos los individuos poseían la banda para ese locus por lo menos deben existir dos que

no la tengan para que se considere polimórfico., o viceversa. A partir de lo señalado anteriormente, se

generó la matriz binaria (0/1).

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Tabla 2. Partidores utilizados en las etapas amplificación selectiva de la técnica de AFLP ensayadas en P. andina.

Eco Mse

Partidor amplificación selectiva AC*

CC*

TC*

GC*

ACA*

ACG*

ACT*

ACC*

CC

AG

AA

AC

AG

AT

CA

GA

CCG

CAT

CTG

*Los partidores Eco+2 y Eco+3 bases selectivas se encuentran marcados con distintos fluoróforos.

Análisis de datos. Mediante el programa ARLEQUIN versión 3.5 (Excoffier y Lischer 2010), se

identificaron los loci outlier en el conjunto de datos AFLP y según lo propuesto por Excoffier et al.

(2009). Estos loci outlier corresponden a locus que presentan valores de Fst observados,

significativamente diferentes (P <0,05) al resto, es decir puntos que se escapa de la norma de valores.

Se realizaron dos análisis de varianza molecular (AMOVA; P< 0,05) (Excoffier y Lischer 2010). El

primero fue un análisis a priori con dos niveles jerárquicos, entre y dentro de poblaciones. El segundo

análisis a posteriori incluyó un análisis previo con el programa Structure (Pritchard et al. 2000), en el

cual se determinó el número de grupos o clusters (K), con tres niveles jerárquicos: dentro de la

población, entre poblaciones, y entre cada grupo o clusters. Mediante el programa STRUCTURE

2.3.1, se construyó un modelo de agrupamiento bayesiano para las bandas generadas por los

marcadores AFLP (Pritchard et al. 2000).

Se determinó el número total de bandas que generó (N), número de alelos únicos (Na), número alelos

efectivos (Ne), el índice de información de Shannon(I) (Shannon y Weaver 1949), la heterocigosidad

esperada (He) o la diversidad genética (D) según Nei (1973), el porcentaje de loci polimorficos con el

programa Genalex (Peakall y Smouse 2006). Además se obtuvo, mediante Arlequin 3.5, una matriz de

valores Fst entre pares de poblaciones.

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RESULTADOS

Caracterización de las poblaciones y hábitat. Dos de las poblaciones estudiadas están insertas en un

fragmento de bosque nativo, dominado por especies del género Nothofagus y por especies del bosque

esclerófilo (Tabla 3). En el caso de Angol, la mayor parte de la población de P. andina estaba inserta en

una matriz de plantaciones comerciales de Pinus radiata (aprox 70%), en cambio otra parte, se

encontraba en un bosque secundario de Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst. La población que presenta

mayor amenazas es Angol, principalmente por encontrarse dentro de una matriz forestal y esta

susceptible a incendios y tala. Por el contrario, la población de Conguillío estaba más inaccesible y

actualmente protegida por el SNASPE, por ende las amenazas son menores. Además en la población de

Conguillío, los individuos se encontraban agrupados, sin individuos aislados por lo cual se pudo

estimar el área de ocupación, por otro lado en las dos poblaciones restantes no se pudo determinar el

área de ocupación, pero sí la extensión de la presencia la cual viene siendo similar. La especie presentó

una extensión de la presencia de 7000 km², presentando una distribución restringida.

Tabla 3. Descripción de las poblaciones y hábitat de P. andina.

Angol Colbún P.N. Conguillío

Matriz Plantación privada de P.

radiata y bosque secundario

de N. obliqua.

Bosque nativo secundario

de N. obliqua.

Bosque nativo público

secundario de N. obliqua

y N. dombeyi.

Estado del suelo

superficial

Grado de compactación

ALTO

Afloramiento rocoso 70%.

Grado de erosión ALTO

Grado de compactación

MEDIO

Afloramiento rocoso 40%.

Grado de erosión MEDIO

Grado de compactación BAJO

Afloramiento rocoso 40%.

Grado de erosión BAJO

Vegetación

acompañante

Nothofagus dombeyi,

Nothofagus obliqua,

Berberis empretrifolia,

Berberis microphylla

Austrocedrus chilensis,

Cryptocarya alba, Quillajas

saponaria y otras especies

que forman parte de la

vegetación esclerófila

Nothofagus obliqua,

Austrocedrus chilensis,

Aristotelia chilensis,

Orites myrtoidea,

Nothofagus dombeyi

Amenazas Sustitución a plantaciones de

especies exóticas, incendios,

consumo de frutos por

animales domésticos,

herbívoros menores.

Grado de alteración ALTO

Cambio de uso de suelo,

incendio, tala de

individuos. Grado de

alteración: ALTO

Extracción de frutos o de

rebrotes.

Grado de alteración:

MEDIO

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Angol Colbún P.N. Conguillío

Protegido por

SNASPE

No No Sí

Clima

(Temperatura/Hu

medad relativa)

13ºC / Baja 17°C/ Baja. 11°C/ Baja

Tamaño

poblacional (Nº

individuos

adultos)

32 40 80

Área de

ocupación

No muestreable No muestreable 3.000m2

Extensión de la

presencia

1300m2

1700m2 Idem a área de ocupación

Regeneración No se observa No se observa Sí existe

Análisis mediante AFLP. Se realizó la digestión de los fragmentos de ADN mediante las enzimas

EcoRI y MseI, para una posterior adhesión de los adaptadores y partidores. Los nuevos fragmentos de

ADN fueron visualizados por medio de un gel de agarosa (Figura 3).

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 1% de etapa preselectiva E(00)+M(00) para 30 individuos de P. andina (A1-A9: Angol, PN1-

PN10: Conguillío y C1-C10: Colbún). 1kb: marcador de peso molecular.

Análisis de datos. Las tres combinaciones de AFLP seleccionadas que resultaron polimórficas (EcoRI-

CC/MseI-CCG, EcoRI-ACT/MseI-CCG y EcoRI-ACG/MseI-CTG), generaron 150 loci, que fluctuaron

entre 50 y 600 pb de las cuales sólo nueve presentaron polimorfismo. Sólo se detectó un loci outlier, el

cual se eliminó de la matriz.

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Parámetros de variación genética. La heterocigosidad promedio para las tres poblaciones fue 0,011,

mientras que el índice de riqueza genética, expresado en (I), fue de 0,016 (Tabla 4). Según los

resultados encontrados, I y He indicaron que la población con mayor diversidad genética es Colbún (He

= 0,013; I = 0,019), mientras que la menos diversa fue Angol (He = 0,08; I = 0,012).

Consistentemente, los porcentajes de polimorfismo también fueron superiores en Colbún con un 3,95%

(P = 3,95), mientras que se registraron los menores valores en Angol con un 1,97%.

Tabla 4. Parámetros de variación genética: Número de alelos únicos (Na), Número de alelos efectivos (Ne), Porcentaje de polimorfismos

(%P), Índice de Shannon-Weaver (I), Heterocigosidad esperada (He) o Diversidad genética de Nei (1978) y alelos únicos presentes (Au).

Error estándar (ES) para las poblaciones de P. andina.

Nombre

población

P% Na ± ES Ne± ES I± ES He± ES Valor P Au

P.N

Conguillío

3,29 1,013 ±

0,019

1,023±

0,011

0,018±

0,009

0,013±

0,006

* 1

Angol 1.97 0,993±

0,017

1,013±

0,008

0,012±

0,007

0,008±

0,005

* 0

Colbún 3,95 1,026±

0,019

1,021±

0,010

0,019±

0,008

0,013±

0,006

* 3

Promedio

Total 3, 07 1,011±

0,011

1,019±

0,006

0,016±

0,005

0,011±

0,003

*

* P < 0,05

Análisis de varianza molecular a priori. El análisis AMOVA se realizó asumiendo a priori que existen

tres poblaciones independientes a partir de los rangos de distribución. El 54.4% de la variación total

está dada por la variabilidad existente entre las poblaciones mientras que un 45.5% debido a las

diferencias dentro de las poblaciones (Tabla 5). Sin embargo, el grado de diferenciación entre

poblaciones fue significativo.

Tabla 5. Análisis de varianza molecular a priori con dos niveles jerárquicos con el programa Arlequin. Fuente de variación g.l Componentes de varianza Porcentaje de variación %

Entre poblaciones 2 1,01815 54,4

Dentro poblaciones 27 0,85185 45,5

Fst 0,5445***

***P <0,001

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Determinación del K óptimo. Las tres poblaciones fueron agrupadas en dos cluster (k óptimo= 2)

(Figura 5). Conguillío y Angol en Cluster 1 y Colbún en Cluster 2 (Tabla 4). El valor de Fst del cluster

1 fue de 0,6486, mientras que para el cluster 2 fue de 0,420. Este índice indica el grado de

estructuración de ambos clusters, es decir, el grado de diferenciación entre las poblaciones que se

concentraron en cada cluster. Tabla 6. Porcentaje de pertenencia de las poblaciones para cada cluster

Figura 6. Análisis bayesiano de asignación (Structure) para las tres

poblaciones de Prumnopitys andina estudiadas. (Cluster 1: Parque

Nacional Conguillío y Angol. Cluster 2: Colbún)

Análisis de varianza molecular a posteriori. Basado en la frecuencia alélicas de los individuos, estos

fueron asignados en dos clusters (Tabla 6, Figura 6). La Distribución en estos dos grupos resultó en

42,2 % de la varianza total debido a las diferencias entre estos dos grupos, un 18,6% debido a las

diferencias entre las muestras de población dentro de los grupos y el 39,1% debido a las diferencias

dentro de las poblaciones (Tabla 7). Estos valores de Fst y las estimaciones de Fsc son de 0,322 y

0,608, estadísticamente significativo. El valor de Fct 0,422 no resultó ser estadísticamente

significativo. Tabla 7. Análisis de varianza molecular a posteriori con tres niveles jerárquicos definidos en Structure 2.3.3.

Fuente de variación g.l Componentes de

varianza

Porcentaje de

variación %

Entre grupos 1 0.92000 42.2

Entre poblaciones 1 0.40481 18.6

Dentro de poblaciones 27 0.85185 39.1

FCT 0.422 n.s.

FST 0.608 ***

FSC 0.322 ***

***P< 0,001

Estructura genética. Se obtuvo una matriz de valores Fst entre pares de poblaciones (Tabla 8), donde

las poblaciones del Parque Nacional Conguillío y Colbún resultaron ser las más estructuradas entre sí.

(Fst = 0,627).

Poblaciones Cluster1 Cluster2

Parque Nacional

Conguillío

7% 99,3%

Angol 1% 99,0%

Colbún 89,5% 10,5%

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Tabla 8. Matriz de valores entre pares de poblaciones. Arriba de la diagonal distancias geográficas (Km), debajo de la diagonal valores de

Fst.

Poblacion Angol Colbún Conguillío

Angol *** 298 230

Colbún 0,584 *** 500

P. N Conguillío 0,321 0,627 ***

***P < 0,001

DISCUSION

Evaluación del hábitat de las poblaciones estudiadas. Las tres poblaciones de P. andina presentaron

diferentes niveles de degradación del hábitat y variaron en sus tamaños poblacionales. Algunas de ellas

han estado sometidas a constantes amenazas antrópicas tales como el CUS, sobreexplotación maderera

e incendios. La población que registró mayor degradación de su hábitat fue Angol, ubicada en el

margen occidental de su distribución. En esta poblacional se observó: i) una reducida extensión de la

presencia de 1300 m2, ii) a los individuos insertos en una matriz de plantación forestal que favorecía el

aislamiento de la población, iii) la ausencia de horizonte superficial orgánico del suelo y iv) la ausencia

de regeneración de P. andina. En el caso de la población de Angol, el tamaño poblacional no superó los

32 individuos maduros. Estas características concuerdan con los atributos definidos para una población

marginal (Lesica y Allendorf 1995, Vecutich y Waite 2003), cuyo hábitat no presentan las condiciones

bióticas y abióticas óptimas para el desarrollo de la especie. En contraste, la población de Colbún,

ubicada en el extremo norte, no registró una degradación de su hábitat, a pesar de encontrarse en un

área sometida a fragmentación del bosque nativo (Altamirano et al. 2010). Por otra parte, en

comparación con las otras dos poblaciones anteriormente mencionadas, Conguillío, que es la población

de más al sur, es la que presentó mejores condiciones de hábitat. Esta población estaba inserta en un

bosque nativo secundario, fue la única población que registró regeneración, presentó la mayor cantidad

de individuos maduros y está protegida por el SNASPE. La degradación permanente de hábitat de una

población, debido al CUS reduce la capacidad, de poder mantener su biodiversidad y procesos

ecológicos (Aravena et al. 2002, Echeverría et al. 2007). La población de Angol fue la que registró

mayor degradación del hábitat y poseía los atributos de una población marginal. De continuar una

degradación del hábitat y reducción de su población, es altamente probable que se tienda a una

extinción local de la población de Angol. A diferencia de las otras poblaciones de los extremos, la

población de Conguillío está en un área protegida y su hábitat se mantiene intacto.

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En Chile, diversas especies amenazadas presentan actualmente una degradación y fragmentación de sus

hábitats (Hechenleitner et al. 2005). En particular, el hábitat de Legrandia concinna (Philippi) Kausel

se ha visto altamente fragmentado, cuya área de ocupación de la mayoría de sus poblaciones no supera

una hectárea (Altamirano et al. 2007). Poblaciones de Fitzroya cupressoides (Mol.) Johnston ubicadas

en la Depresión Intermedia de la Región de los Lagos presentan una extensión de la presencia que no

supera las tres hectáreas y existe un alto grado de alteración del hábitat debido a la acción de talas e

incendios. La degradación y fragmentación del hábitat pueden influir negativamente en la persistencia

de las poblaciones, tales como los cambios en la disponibilidad de los recursos, reducción en el número

de poblaciones, y pérdida de conectividad que llevan al aislamiento de la población (Provan et al.

2008). Impidiendo el flujo entre poblaciones (Bacles et al. 2004).

Diversidad genética. Los resultados del presente estudio revelaron bajos índices de diversidad genética

para las tres poblaciones de P. andina, dado por un polimorfismo de 3,07% y una heterocigosidad

esperada de 0,011. Los índices más bajos se registraron en Angol, con un polimorfismo de 1,97% y una

heterocigosidad esperada de 0,008. Mayores niveles de diversidad genética se han observado para tres

subpoblaciones de P. andina en el área de Conguillío (Quiroga 2009). Estos resultados pueden ser

producto de diversos factores. La fragmentación histórica que presenta la zona centro sur del país desde

1550, posiblemente redujo las poblaciones naturales de los bosques valdivianos lluviosos, en donde se

encuentra la especie (Lara et al. 2012).

En la zona andina de la Región del Maule, donde se encuentra la población de Colbún, ocurrieron

evidentes cambios en el uso de suelos (CUS), principalmente conversión a terrenos agrícolas (Lara et

al. 2012) donde actualmente se localiza una reducida población a los pies de la Cordillera de los

Andes. En la región de la Araucanía, la población de la Cordillera de la Costa se ha visto altamente

fragmentada por plantaciones forestales (Lara et al. 2012, Zamorano et al. 2008). En general, las

especies que poseen una distribución geográfica restringida y tamaños poblacionales pequeños, son

afectadas por la deriva génica, altos niveles de endogamia y fuerte selección unidireccional que podría

producir uniformidad genética debido al ambiente específico que habitan (Karron et al. 1988). Además,

las especies raras como P. andina tienden a tener considerablemente más baja variabilidad genética que

sus congéneres de amplia distribución (Frankham 1995, Karron 1987). Los bajos valores de diversidad

genética en P. andina revelaron un acervo genético empobrecido, lo cual además de los factores

anteriormente explicados, puede atribuirse a las últimas glaciaciones. P. andina fue afectada

indirectamente por este evento, debido a que las poblaciones presentaron movimientos altitudinales

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(Villagrán 2001, Villagrán y Armesto 2005). Estas bajaron hacia los valles en el periodo de las

glaciaciones y en el periodo interglaciar subieron a la cima de cerros, donde actualmente se presenta la

especie (Villagrán 2001, Villagrán y Armesto 2005).

Cabe destacar que el sistema reproductivo y la dispersión de semillas de una especie pueden influir en

los niveles de diversidad genética y en la distribución de sus poblaciones (Hamrick y Godt 1989). P.

andina posee polinización anemófila como la mayoría de las coníferas (Koski 2000). Especies con este

tipo de polinización tienden a mostrar un patrón genético más homogéneo entre sus poblaciones

(Hamrick y Godt 1996). La dispersión de semillas de P andina es gravitatoria (Quiroga 2009) y además

puede ser facilitada por aves y mamíferos pequeños que consumen el arilo carnoso (Soblechero et al.

2005). Sin embargo, diversos autores revelan problemas en la germinación de las semillas de P.

andina, la cual puede tardar hasta 3 años en germinar (Donoso 2006 , Hechenleitner et al. 2005). Esto

evidencia que la especie puede presentar variadas oportunidades de dispersión, sin embargo la

recalcitrancia de sus semillas puede ser un factor limitante para el establecimiento de la especie.

Pilgerodendron uviferum también presenta bajos valores de diversidad genética (Premoli et al. 2001).

Estas especies al igual que P. andina, han sufrido eventos de reducción de sus poblaciones y /o

degradación de su hábitat, lo cual puede explicar sus bajos valores de diversidad (Young et al. 1996).

Estructuración genética. El agrupamiento realizado por el programa STRUCTURE reveló dos

probables grupos genéticamente homogéneos entre las poblaciones. La diferenciación genética entre

poblaciones fue significativa (Fst=0,608), lo que indicaría un alto grado de diferenciación entre sus

poblaciones. Consistente con los resultados obtenidos del presente estudio, Quiroga (2009) revela en

tres subpoblaciones de P. andina un grado de diferenciación genética (Fst= 0,140) a pesar de ser muy

próximas geográficamente. Por otra parte, los índices Fst entre pares de poblaciones de P. andina

indicaron que entre todas ellas existen niveles significativos de estructuración. Colbún se encontró

mayormente diferenciada de las poblaciones de Angol (Fst=0,584) y Conguillío (Fst=0,627). Además,

presentó tres alelos únicos que la distinguen de las poblaciones ubicadas a mayor latitud.

En diversos estudios de coníferas amenazadas de Chile se evidencian diferentes grados de

estructuración entre poblaciones. En particular, Podocarpus salignus D. Don, con una distribución

geográfica total similar a la de P. andina, se observa un significativo grado de estructuración

(Fst=0.44; Allnutt et al. (2001). Pilgerodendron uviferum (D. Don.) Florin, pese a que posee una

16

distribución más amplia que P. andina, también presenta grados de estructuración (Fst=0,159; Allnutt

et al. (2003) aunque menores que P. andina, al igual que Austrocedrus chilensis (D. Don.) Pic.Serm. et

Biz (0.120; Souto et al. (2011 ). Estas poblaciones, anteriormente mencionadas, han estado sometidas a

diferentes eventos de fragmentación y degradación de sus hábitat al igual que P. andina (Hechenleitner

et al. 2005).

Las tres poblaciones de P. andina registraron altos índices de diferenciación genética y bajos índices de

diversidad dentro de sus poblaciones, las cuales son las características de la mayoría de poblaciones

geográficamente marginales (Eckert et al. 2008). La significativa diferenciación de P. andina y su baja

variabilidad dentro de las poblaciones podría ser explicada por una reducción en su tamaño

poblacional. En general, cuando las poblaciones son sometidas a cuellos de botella estas son

vulnerables a: i) la pérdida de alelos de baja frecuencia (Nei et al. 1975), ii) tendencia a la endogamia

(Keller y Waller 2002) y pérdida de la conectividad debido al flujo genético restringido (Couvet 2002,

Schaal y Leverich 1996). Probablemente las presiones selectivas locales pudieron llevar a las

poblaciones a estructurarse a partir de las condiciones de hábitat diferenciado, lo que ha permitido la

sobrevivencia de cada población

A partir de lo anterior, existe una urgencia de realizar estudios, que generen información sobre los

parámetros de variación genética de las poblaciones de P. andina que aún no han sido estudiadas. De

esta manera se conocería la variación genética total de la especie, lo que permitiría identificar aquellas

poblaciones que requieran un urgente esfuerzo de manejo y conservación.

Implicancias para la conservación. En general, se recomienda la creación de áreas protegidas para

preservar la diversidad de especies que posean grados de estructuración (Eguiarte y Piñero 1990). Por

otra parte, Britten y Baker (2001) agregan que se debe conservar las características genéticas y

ecológicas de las poblaciones marginales que se encuentran más aisladas y en los extremos de su

distribución. Esto debido a que estas poblaciones marginales poseen características genéticas únicas,

posibles adaptaciones a situaciones extremas y estructuraciones genéticas peculiares (por distintas

presiones selectivas o por deriva genética), especialmente si soportan cierto grado de estrés ambiental

(Ellstrand y Elam 1993, Lesica y Allendorf 1995). De las tres poblaciones muestreadas en el presente

estudio, sólo la población de Conguillío se encuentra protegida bajo el actual Sistema Nacional de

Áreas Protegidas del Estado (SNASPE). Para la cual se recomienda que ese remanente de bosque

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nativo en donde está inserta la población de P. andina, se conserve de manera ex situ. Esta población

está en los faldeos del Volcán Llaima y frente a la eventualidad que este hiciera erupción se perdería la

población. Sin embargo, se deberían priorizar las realizar acciones de conservación para la población

de Colbún que involucre de diferentes actores y sectores de la sociedad. Esta población se caracteriza

por: i) encontrarse en los márgenes nortes de la distribución de la especie, ii) presenta los niveles de

polimorfismo más altos con respecto a las otras poblaciones, iii) posee tres alelos únicos, iv) se

diferencia genéticamente de Angol y Conguillío y v) se encuentra en un área privada. De acuerdo con

lo previamente expuesto, se deben desarrollar programas de educación ambiental y restauración, en los

que participen los propietarios de los terrenos, la entidad ambiental regional e instituciones de

educación formal, ya que el mecanismo más efectivo y eficiente para la conservación, es la protección

de los hábitats (Ashton 1987, Conway 1988). La protección del hábitat debe implicar la conservación

in situ del germoplasma y la recuperación y/o mantención de la integridad del ecosistema.

Para la población de Angol, se propone con urgencia un programa de restauración activa y un

monitoreo continuo de sus individuos y de su hábitat. Dado el alto grado de estructuración y

diferenciación entre las poblaciones del norte y del sur, se sugiere evitar la transferencia de

germoplasma entre estos dos grupos, ya que el material genético estaría adaptado a las condiciones

locales (Amos y Balmford 2001, Ennos 1998).

Aunque los resultados del presente estudio proporcionan una evidencia de baja diversidad genética, es

necesario investigar las poblaciones centrales que se ubican en la Cordillera de los Andes, es decir,

entre Colbún y Conguillío. Esto con el fin de comprender de mejor forma los patrones genéticos y

ecológicos, de P. andina su biología reproductiva y su estructura genética a lo largo de la distribución

completa de la especie.

18

BIBLIOGRAFIA

Aguayo M, A Pauchard, G Azócar, O Parra. 2009. Cambio del uso del suelo en el centro sur de Chile a

fines del siglo XX. Entendiendo la dinámica espacial y temporal del paisaje. Revista Chilena de

Historia Natural 82:361-374.

Altamirano A, C Echeverría, A Lara. 2007. Efecto de la fragmentación forestal sobre la estructura

vegetacional de las poblaciones amenazadas de Legrandia concinna (Myrtaceae)del centro-sur

de Chile. Revista Chilena de Historia Natural 80:27-42.

Altamirano A, R Field, L Cayuela, P Aplin, A Lara, J María Rey-Benayas. 2010. Woody species

diversity in temperate Andean forests: The need for new conservation strategies. Biological

Conservation.143:2080-2091.

Altamirano A, A Lara. 2010. Deforestación en ecosistemas templados de la precordillera andina del

centro-sur de Chile. Bosque 31:53-64.

Allnutt T, J Courtis, M Gardner, A Newton. 2001. Genetic variation in wild Chilean and cultivated

British populations of Podocarpus salignus D. Don (Podocarpaceae). Edinburgh Journal of

Botany 58:459–473.

Allnutt T, A Newton, A Premoli, A Lara. 2003. Genetic variation in the threatened South American

conifer Pilgerodendron uviferum (Cupressaceae), detected using RAPD markers. Biological

Conservation 114 245–253.

Amos W, A Balmford. 2001. When does conservation genetics matter? Heredity 87:257–265.

Aravena J, M Carmona, C Pérez, J Armesto. 2002. Changes in tree species richness, stand structure and

soil properties in a successional chronosequence in northern Chiloé Island, Chile. Revista

Chilena de Historia Natural 75:339-360.

Ashton P. 1987. Biological considerations in in-situ versus ex-situ plant conservation. In Bramwell D,

O Hamann, V Heywood, H Synge eds. Botanic Gardens and the World Conservation Strategy.

London. Academic Press. p. 117-130.

Bacles C, A Lowe, R Ennos. 2004. Genetic effects of chronic habitat fragmentation on tree species: the

case of Sorbus aucuparia in a deforested Scottish landscape. Molecular Ecology 13:573–584.

Bekessy S, T Allnutt, A Premoli, A Lara, R Ennos, M Burgman, M Cortés, A Newton. 2002. Genetic

variation in the vulnerable and endemic Monkey Puzzle tree, detected using RAPDs. Heredity

88:243- 249.

Benoit I. 1989. Libro Rojo de la Flora Terrestre de Chile. Santiago, Chile. Corporación Nacional

Forestal

19

Britten H, R Baker. 2001. Landscape connections and genetic diversity. In Gutzwiller K ed. Applying

Landscape Ecology in Biological Conservation. Berlin. Springer verlag. p.

Conway W. 1988. Can technology aid species preservation? In Wilson E ed. Biodiversity. Washington,

DC. National

Academy Press. p. 263-268.

Couvet D. 2002. Deleterious Effects of Restricted Gene Flow in Fragmented Populations. Conservation

Biology 16:369-376.

Debinski DM, RD Holt. 2000. Reflections on landscape experiments and ecological theory: tools for

the study of habitat fragmentation. In Bradshaw GA, PA Marquet eds. How Landscapes

Change: Human Disturbance and Ecosystem Fragmentation in the Americas. Berlin. Springer-

Verlag. p. 201-223.

Donoso C. 2006 Las Especies arbóreas de los Bosques Templados de Chile y Argentina. Autoecología.

Valdivia, Chile. Marisa Cúneo Ediciones.

Eckert C, K Samis, S Lougheed. 2008. Genetic variation across species’ geographical ranges: the

central–marginal hypothesis and beyond. Molecular Ecology 17:1170–1188.

Echeverría C, D Coomes, J Salas, J María Rey-Benayas, A Lara, A Newton. 2006. Rapid deforestation

and fragmentation of Chilean Temperate Forests. Biological Conservation 130:481-494.

Echeverría C, A Newton, A Lara, J Rey-Benayas, D Coomes. 2007. Impacts of forest fragmentation on

species composition and forest structure in the temperate landscape of southern Chile. Global

Ecology and Biogeography 16:426–439.

Eguiarte L, D Piñero. 1990. Genética de la conservación: leones vemos, genes no sabemos. Ciencias

4:34-47.

Ellstrand N, D Elam. 1993. Population genetic consequiences of small population size: implications for

plant conservation. Annual Review of Ecology and Systematics 24:217-242

Ennos R. 1998. Genetic constraints on native woodland restoration. In Newton A, P Ashmole eds.

Native Woodland Restoration in Southern Scotland: Principles and Practice. . Ancrum,

Jedburgh. Borders Forest Trust. p. 27-34.

Excoffier L, T Hofer, M Foll. 2009. Detecting loci under selection in a hierarchically structured

population. Heredity 103:285-298.

Excoffier L, L Lischer. 2010. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population

genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources 10:564-567.

Forman R, M Godron. 1986. Landscape ecology. USA.

20

Frankham R. 1995. Inbreeding and Extinction - a Threshold Effect. Conservation Biology 9:99- 792.

Gigord L, F Picot, J Shycoff. 1999. Effects of habitat fragmentation on Dombeya acutangula

(Sterculiaceae), a native tree on La Réunion (Indian Ocean). . Biological Conservation 88:43-

51.

Hamrick J, M Godt. 1989. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species Biological

Sciences 351:1291-1298.

Hamrick J, M Godt. 1996. Conservation genetics of endemic plant species. In Avise J, J Hamrick eds.

Conservation Genetics: Case Histories from Nature. New York. Chapman & Hall. p. 281–304.

Hasbún R, C Iturra, P Moraga, P Wachtendorff, P Quiroga, S Valenzuela. 2011. An efficient and

reproducible protocol for production of AFLP markers in tree genomes using fluorescent

capillary detection. Tree Genetics & Genomes.

Hechenleitner P, M Gardner, P Thomas, C Echeverría, B Escobar, P Brownless, C Martínez. 2005.

Plantas Amenazadas del Centro-Sur de Chile. Distribución, Conservación y Propagación.

Valdivia y Cambridge. Universidad Austral de Chile y Real Jardín Botánico de Edimburgo

Hedrick PW. 2001. Conservation genetics: where are we now? . Trends in Ecology and Evolution

16:629-636.

Holderegger R, H Wagner. 2008. Landscape genetics. BioScience 58:199- 207.

Karron J. 1987. A comparison of levels of genetic polymorphism and self-compatibility in

geographically restricted and widespread plant congeners. Evol. Ecol 1:47-58.

Karron J, Y Linhart, C Chaulk, C Robertson. 1988. Genetic structure of population of geographically

restricted and widespread species of Astragalus (Fabaceae). American Journal of Botany

75:1114-1119.

Keller L, D Waller. 2002. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology and Evolution

17:230-241.

Koski V. 2000. Red Europea de Conservación de Recursos Geneticos de Coníferas. Forest system

2:143-149.

Lara A, M Solari, M Prieto, M Peña. 2012. Reconstrucción de la cobertura de la vegetación y uso del

suelo hacia 1550 y sus cambios a 2007 en la ecorregión de los bosques valdivianos lluviosos de

Chile (35º – 43º 30´ S). Bosque 33:13-23.

Lesica P, F Allendorf. 1995. When Are Peripheral Populations Valuable for Conservation?

Conservation Biology 9:753-760.

21

Moritz C. 2002. Strategies to protect biological diversity and the evolutionary processes that sustain it.

Syst. Biol 51:238-254.

Myers N, RA Mittermeler, CG Mittermeler, GAB da Fonseca, J Kent. 2000. Biodiversity hotspots for

conservation priorities. Nature 403:853–858.

Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations Proceedings of the National

Academy of Sciences 70:3-3321.

Nei M, T Maruyama, R Charaborty. 1975. The bottleneck effect and genetic variability in populations.

Evolution 29:1-10.

Ovesna J, L Lucera, J Kralova, H Stavelikova, J Velisek. 2007. Genetic Diversity hmong garlic clones

as revealed by AFLP, phenotypic descriptors and S-aminoacid level. Vegetable Crop Res

66:105-116.

Peakall R, P Smouse. 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for

teaching and research. Molecular Ecology Notes 6:288-295.

Pimm S, P Raven. 2000. Extinction by numbers. Nature 403:843-845.

Premoli A, C Souto, T Allnutt, A Newton. 2001. Effects of population disjunction on isozyme variation

in the widespread Pilgerodendron uviferum. Heredity 87:337-343

Premoli AC. 1994. South American temperate conifer species: a larger list. Biodiversity and

Conservation 3:295-297.

Primack R. 2001. Problemas de las poblaciones pequeñas. In Primack R ed. Fundamentos de

conservación biológica. México. Fondo de Cultura Económica. p. 363-383.

Pritchard J, M Stephens, P Donnelly. 2000. Inference of Population Structure Using Multilocus

Genotype Data. Genetics 155:945–959.

Provan J, G Beatty, A Hunter, R McDonald, E McLaughlin, J Preston, S Wilson. 2008. Restricted gene

flow in fragmented populations of a wind-pollinated tree. Conserv Genet 9:1521–1532.

Quiroga P. 2009. Contribución para la conservación de podocarpaceae del sur de Sudamérica a partir

de patrones genéticos y biogeográficos. Tesis Grado doctor en ciencias biologicas Bariloche.

Centro regional Universitario Bariloche, Universidad Nacional del Comahue. 195 p.

Sala O, F Chapin, J Armesto, R Berlow, J Bloomfield, R Dirzo, E Huber-Sanwald, L Huenneke, R

Jackson, A Kinzig, R Leemans, D Lodge, H Mooney, M Oesterheld, N Poff, M Sykes, B

Walker, M Walker, D Wall. 2000. Global biodiversity scenarios for the year 2100. Science

287:1770-1774.

22

Schaal B, W Leverich. 1996. Molecular Variation in Isolated Plant Populations. Plant Species Biology

11:33-40.

Shannon C, W Weaver. 1949. The mathematical theory of communication. University of Illinois Press

Soblechero E, N Antón, A Hernanz, J Duran. 2005. La semilla y su morfología. Agricultura 877:612-

615.

Souto C, K Heinemann, T Kitzberger, A Newton, A Premoli. 2011 Genetic Diversity and Structure in

Austrocedrus chilensis Populations: Implications for Dryland Forest Restoration. Restoration

ecology.

UICN. 2004. The Many Causes of Threat. In Baillie JEM, C Hilton-Taylor, SN Stuart eds. 2004 IUCN

Red List of Threatened Species. A Global Species Assessment. . Gland, Switzerland and

Cambridge, UK. UICN. p. 85-104.

UICN. 2010. UICN Red List of Threatened Species.

Vecutich J, T Waite. 2003. Spatial patterns of demography and genetic processes across the species’

range: null hypotheses for landscape conservation genetics. Conservation genetics 4:639–645.

Villagrán C. 2001. Un modelo de la historia de la vegetación de la cordillera de la costa de Chile

central-sur: la hipotesis glacial de Darwin. Revista Chilena de Historia Natural 74:793-803.

Villagrán C, J Armesto. 2005. Fitogeografía historica de la cordillera de la costa de Chile. In Smith C,

J Armesto, C Valdovinos eds. Historia, biodiversidad y ecología de los bosques costeros de

Chile|. Santiago, Chile. Editorial Universitaria. p.

Vos P, R Hogers, M Bleeker, M Reijans, T Van de Lee, M Hornes, A Frijters, J Pot, J Peleman, M

Kuiper, M Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprint. Nucleic Acids Research

23:4407- 4414.

Watson R, A Kitchingman, A Gelchu, D Pauly. 2004. Mapping global fisheries: sharpening our focus.

Fish and Fisheries 5:168–177.

Young A, T Boyleb, T Browna. 1996. The population genetic consequences of habitat fragmentation

for plants. Trends in Ecology and Evolution 11.

Zamorano C, M Cortés, C Echeverría, P Hechenleitner, A Lara. 2008. Experiencias de restauración con

especies forestales amenazadas en Chile. In González-Espinosa M, J María Rey-Benayas, N

Ramírez-Marcial eds. RESTAURACIÓN DE BOSQUES en América Latina. Mexico.

Fundación Internacional para la Restauración de Ecosistemas (FIRE) y Editorial Mundi-Prensa

México. p. 17-37.