Estudi de les influències genètiques en els trastorns psiquiàtrics Marta Ribases 

 

Malalties complexes La identificació dels gens associats a malalties està revolucionant el camp de la Medicina, permetent un millor pronòstic, diagnòstic i potencials eines terapèutiques. Tot i que el model clàssic d’herència mendeliana1 ha permès la identificació de gens implicats en malalties monogèniques, on alteracions en un únic gen causatiu determinen el fenotip2 concret, actualment es desconeixen les bases moleculars de la majoria de malalties, el fenotip2 de les quals no s’explica per mutacions en un únic gen o locus3. Encara que els factors genètics tenen un paper destacat en la seva etiologia, les malalties complexes es caracteritzen per no seguir un patró d’herència mendelià1. Majoritàriament són malalties poligèniques i multifactorials on diferents gens de predisposició i factors ambientals interaccionen per donar lloc al fenotip2 complex. A més, aquest component genètic consisteix en diferents gens de susceptibilitat que poden participar de forma additiva o multiplicativa, fet que els diferencia clarament dels gens causatius implicats en la majoria de malalties mendelianes1. Alguns exemples de malalties complexes inclouen Alzheimer, diabetis, malalties psiquiàtriques i parkinson.

Mapatge genètic de les malalties complexes La identificació dels components genètics implicats en les malalties complexes presenta grans dificultats. A més dels factors de confusió que participen en les malalties monogèniques, com l’heterogeneïtat genètica4, la variabilitat en la penetrància5 i la presència de fenocòpies6, les interaccions gen-gen i gen-ambient també s’han de tenir en compte en la dissecció genètica d’aquests fenotips2 complexes. A més, els models d’herència no són coneguts ni els tipus d’alteracions a identificar mutacions puntuals, sinó combinació de polimorfismes comuns amb efectes reduïts que de forma conjunta determinen un increment o reducció del risc a desenvolupar la malaltia.

El mapatge genètic de les malalties complexes es duu a terme mitjançant diferents aproximacions moleculars i estadístiques que permeten la identificació de les variants genètiques implicades en la seva etiologia (Fig1). El primer pas requereix la definició del fenotip2 a estudiar, punt on els mètodes diagnòstics són de gran importància i fonamentals per a l’èxit de l’estudi. Seguidament s’ha de buscar evidencies de la participació de components genètics mitjançant diferents estratègies que inclouen estudis de parelles de bessons, familiars i d’adopció:

Figura 1. Dissecció genètica dels fenotips2 complexos

definir fenotip

component genètic

• estudis de bessons

recollir mostres

• parelles de germans

• nuclis familiars

estudis de lligament

• paramètrics o de lod score

determinar regions cromosòmiques d’interés

anàlisi de gens candidats anàlisi de regions candidates

estudis d’associació

• cas-control

GENÈTICA REVERSA

• Models transgènics

Identificació de gens implicats en el fenotip

mapatge genètic de QTLs

estudis de lligament

GENÈTICA DIRECTA

identificació de fenotips anòmals en ratolí

regions de sintènia humà-ratolí

a. Estudis de parelles de bessons Aquesta aproximació considera que les parelles de bessons monozigòtics comparteixen el 100% del genoma7, mentre que les parelles de bessons dizigòtics per mitjana, al igual que qualsevol parella de germans, comparteixen un 50% del material genètic. L’estimació del rati de concordança entre bessons monozigòtics i dizigòtics dona una idea del paper dels factors genètics implicats en la etiologia de la malaltia. Quan major sigui aquest rati, major és la contribució dels factors genètics en el fenotip2 estudiat, mentre que nivells de concordança reduïts en parelles de bessons monozigòtics o igual concordances entre bessons monozigòtics i dizigòtics suggereixen un important paper ambiental en el desenvolupament de la malaltia.

b. Estudis d’adopció Els estudis d’adopció són de gran utilitat per l’anàlisi d’aquelles malalties amb un fort component ambiental. Es basen en la comparació dels individus adoptats amb els familiars que els adopten. Així, s’assumeix que les semblances entre els individus adoptats i els seus pares biològics es deuen a factors genètics, mentre que entre els individus adoptats i els seus familiars adoptius són degudes a factors ambientals. Per tant, cal esperar que el risc de desenvolupar una malaltia amb un fort component genètic serà major en familiars biològics que en adoptius.

c. Estudis familiars Els estudis familiars es basen en determinar la freqüència de la malaltia en familiars d’individus afecte i familiars d’individus no afectats. A partir d’aquests estudis s’estima el risc relatiu de desenvolupar la malaltia en familiars de primer grau d’individus afectats.

Aquestes tres aproximacions permeten determinar la contribució dels factors genètics, o l’heretabilitat, i dels factors ambientals en el fenotip2 analitzat.

Una vegada es tenen evidències de la participació de components genètics en la etiologia de la malaltia es procedeix al disseny de l’experiment i la recollida de mostres per tal d’identificar-los. Aquestes mostres poden ser de tipus familiar, com parelles de germans afectats, nuclis familiars i famílies extenses, o casos no relacionats i afectats per la malaltia a estudiar. La mida de la mostra és important per l’obtenció de suficient poder estadístic que permeti detectar l’efecte d’un gen específic en el fenotip2 complex. La identificació dels factors genètics implicats en la malaltia es pot dur a terme mitjançant dos tipus d’aproximacions estadístiques que inclouen els (1) estudis de lligament i els (2) estudis d’associació. A més, (3) l’anàlisi de models animals també contribueixen al coneixement del component genètic de les malalties complexes.

1. Estudis de lligament El lligament genètic es refereix a la tendència dels al·lels8 de dos loci3 a segregar conjuntament de forma proporcional a la distancia que els separa en el cromosoma. Així, si el locus3 de susceptibilitat i el locus3 marcador estan situats a prop tendeixen a ser cotransmessos en un major nombre de vegades que les que esperaríem per atzar. Aquesta aproximació és la majorment utilitzada quan no tenim informació de quins i

quants gens poden estar implicats en la malaltia estudiada. Es basa en l’estudi de famílies amb, com a mínim, dos membres afectats i s’analitzen marcadors genètics (polimorfismes) distribuïts per tot el genoma7 per tal de determinar si algun d’aquests marcadors es transmeten a través de les generacions junt amb la malaltia. Aquest tipus d’aproximació permet identificar les regions cromosòmiques implicades en el fenotip2 estudiat i no requereix coneixement previ de la patogènesis de la malaltia, ja que permet fer estudis de lligament amb marcadors al llarg de tot el genoma7 i no focalitzar-se en gens o regions candidates. Els estudis de lligament principals es subdivideixen en el mètode paramètrics (lod-score9), que ha permès l’estudi d’algunes malalties complexes com el càncer de mama i Alzheimer, i els mètodes no paramètrics (estudi de parelles de germans).

Tot i els èxits obtinguts en la localització genòmica de loci3 de susceptibilitat per algunes malalties complexes, els estudis de lligament no tenen suficient poder estadístic per assignar gens de susceptibilitat a regions crítiques i necessiten complementar-se amb l’anàlisi de gens candidats per tal d’identificar els loci3 directament implicats. Aquesta aproximació es basa en l’existència d’evidències genètiques, fisiològiques, bioquímiques o farmacològiques que suggereixen la participació d’un determinat gen en el fenotip2 estudiat. Així, mutacions o polimorfismes que afecten l’estructura, funció o el patró d’expressió de la proteïna que codifiquen són de gran interès i l’anàlisi de la seva contribució en els fenotips2 complexos es duu a terme mitjançant els estudis d’associació o la generació de models animals.

2. Estudis d’associació Aquest segon tipus d’aproximació en el mapatge genètic de les malalties complexes permeten la identificació dels locus3 malaltia o de gens de susceptibilitat implicats. Tenen un poder estadístic major que els estudis de lligament per a detectar gens amb un baix efecte en el fenotip2 i s’utilitzen per l’anàlisi de variants o polimorfismes en gens candidats. Aquest tipus d’estratègies es basen en la comparació mitjançant taules de contingència de les freqüències al·lèliques10 o genotípiques11 d’un determinat polimorfisme entre un grup d’individus afectats i un grup d’individus sense malaltia que s’utilitzen com a controls. El fet de que un determinat al.lel es trobi en major freqüència en el grup d’individus afectes que en controls suggereix la seva participació en la malaltia. Aquest al·lel8 pot determinar conseqüències funcionals directament implicades en el fenotip2 estudiat o, alternativament, pot no participar-hi i estar en desequilibri de lligament12 amb un segon polimorfisme responsable d’aquest associació.

Els estudis d’associació es subdivideixen en anàlisis poblacionals o (2.1) cas-control i (2.2) estudis familiars:

2.1. Estudis cas‐control Els estudis de tipus cas-control comparen una mostra d’individus afectats i amb un grup d’individus controls no relacionats. Degut a la possible estratificació poblacional, aquest tipus d’aproximació pot donar lloc a falses associacions i determinar diferències entre les poblacions comparades per causes independents al fenotip2 estudiat. Així, l’elecció de la població control, que ha d’estar aparellada per sexe, edat i ètnia amb el grup d’individus afectats, és fonamental i ha d’excloure aquells individus amb un historial previ de la malaltia que s’analitza. Un exemple d’estudi de cas-control en

malalties complexes és la identificació de l’al·lel8 APOE-4 com a factor de susceptibilitat en casos d’Alzheimer familiar i esporàdic.

2.2. Estudis familiars d’associació Una alternativa per evitar l’estratificació poblacional són els estudis d’associació basats en famílies on la informació genètica dels pares s’utilitza com control intern. El principi d’aquesta estratègia es basa en que els al·lels8 es transmeten a l’atzar de pares a fills en absència d’associació entre un marcador i la malaltia, mentre que els al·lels8 associats a la malaltia es transmetran més freqüentment als fills afectats. Aquesta aproximació ha estat útil per determinar, entre d’altres, l’associació entre el gen de la insulina i la Diabetis Mellitus dependent d’insulina.

3. Anàlisi de models animals Un altra aproximació per l’estudi genètic de les malalties complexes es basa en l’anàlisi de models animals que permet definir les vies moleculars subjacents a les malalties humanes. Entre els diferents organismes utilitzats per caracteritzar les bases genètiques dels fenotips2 complexes els models munires presenta algunes avantatges. Així, per exemple, l’estudi de ratolins permet obtenir un gran número de progènie, reduir l’efecte dels factors ambientals, reduir la presencia d’heterogeneïtat genètica4 mitjançant la utilització de soques consanguínies i manipular experimentalment el seu genoma7 mitjançant tecnologies de transgènesi13 o knock-out14. Aquest tipus d’aproximacions poden subdividir-se en dos estratègies clarament diferenciades que inclouen la genètica reversa i la genètica directa.

3.1. Genètica reversa: models murins transgènics i knock‐outs Diferents estratègies que inclouen models de sobreexpressió o transgènics13 i models de disrupció de gens o knock-out14 permeten estudiar “in vivo” el paper individual de gens candidats. En aquest tipus d’aproximacions, conegudes com genètica reversa, es parteix d’una particular hipòtesis sobre la funció del gen i s’estudia les conseqüències fenotípiques de la seva alteració. Els models transgènics13 permeten determinar la funció de gens que normalment no trobem en ratolí a través de la introducció d’una seqüència exògena dins del seu genoma7. Per altra banda, en els models knock-out14 es reemplaça el gen endogen per una forma truncada no funcional. Aquest mètode de generació de models knock-out14 resulta en fenotips2 estables i reproduïbles i permet establir una relació directe gen-fenotip2. No obstant, degut a la redundància en algunes de les vies moleculars estudiades, en ocasions els models knock-out14 no presenten un fenotip2 determinat. A més, els models knock-out14 es caracteritzen per absència del producte del gen candidat durant el desenvolupament embrionari i postnatal, fent de la potencial generació d’alteracions al llarg del desenvolupament una de les majors limitacions en la interpretació dels fenotips2. Actualment, la generació de knock-out14 amb especificitat cel·lular, en individus adults o seguint estratègies de reemplaçament posen a l’abast noves eines en la determinació dels factors genètics implicats en el fenotip2 d’interès.

3.2. Genètica directa: mutacions espontànies o induïdes  Alhora, en l’estudi de la contribució genètica en les malalties complexes és possible dur a terme estratègies de genètica directa (forward genetics), on partint d’un determinat fenotip2 es determinen els factors genètics implicats. Aquesta aproximació es basa en dos tipus estratègies que inclouen: (a) la identificació de loci3 de trets quantitatius (QTL) a partir de fenotips2 alterats per generació espontània o (b) la identificació de mutacions puntuals induïdes per mutàgens, com la N-etil-N-nitrosurea.

Una vegada definit el fenotip2 a estudiar es procedeix al mapatge genètic dels loci3 implicats i la posterior predicció de la seva localització en el genoma7 humà basada en les regions de sintènia15 ratolí-humà.

La genètica directa permet identificar possibles gens de susceptibilitat prèviament no caracteritzats o gens pels quals no s’havien establert correlacions fenotip2-genotip. No obstant, un dels majors inconvenients en l’estudi de mutants espontanis és la baixa freqüència en que apareixen i la dificultat de realitzar l’anàlisi de forma sistemàtica. Per aquest motiu la mutagènesi induïda amb productes químics és una bona alternativa. Un exemple d’aquest tipus d’aproximació ha estat la identificació de mutacions puntuals en el gen codificant per la leptina i els seus receptors com a causants obesitat en ratolins. Tot i que en estudis de lligament en famílies amb obesitat no s’ha determinat un efecte major d’aquests loci3 en el fenotip2, els estudis en models murins han premés determinar les bases fisiològiques i de regulació del pes corporal tant en humans com en ratolins.

Malalties complexes: trastorns psiquiàtrics Les malalties psiquiàtriques són un clar exemple de malaltia complexa. Tot i que les dades epidemiològiques suggereixen la participació d’un fort component genètic, no s’han identificat loci3 de susceptibilitat inequívocament implicats en la seva etiologia. A més de les dificultats intrínseques en els estudis de malalties complexes, com l’heterogeneïtat genètica4, l’epistasi16 o l’existència d’interaccions genètico-ambientals, l’anàlisi del component genètic en els trastorns psiquiàtrics presenta altres complicacions. Una qüestió crítica en aquest tipus d’estudi és la definició del fenotip2 a analitzar. Els diagnòstics psiquiàtrics no són entitats biològiques reals i determinen categories etiològica i patològicament heterogènies. Els criteris diagnòstics per aquest tipus de trastorns, recollits en els Manuals de Diagnòstic i Estadística (DSMs), es basen en entrevistes clíniques i manquen de marcadors biològics, fet que determina fenotips2 psiquiàtrics molt amplis sense etiologia genètica definida. L’existència de comorbiditat és un altre element que complica l’estudi de les malalties psiquiàtriques ja que molts d’aquests trastorns tenen lloc alhora, suggerint l’existència de sistemes biològics compartits (pleiotropia17). Així, donat que les categories diagnòstiques poden no reflectir les condicions genètiques subjacents, la dissecció dels fenotips2 complexes en diferents trets o endofenotips associats al risc de la malaltia són de gran utilitat en l’estudi de les malalties psiquiàtriques. Aquest endofenotips consisteixen en trets de distribució continua amb elevada heretabilitat que poden resultar de l’efecte d’un o pocs gens i que estableixen grups més homogenis que el diagnòstic clínic. Per exemple, els trets neuròtics s’han utilitzat en l’anàlisi genètic de la depressió i les alteracions en la interacció social, atenció i disfuncions olfactòries i cognitives s’han proposat com a possibles endofenotips per l’estudi de l’esquizofrènia. Així, l’èxit en l’estudi genètic dels trastorns psiquiàtrics està en funció de la definició de grups homogenis i fenotípicament delimitats.

Les estratègies més utilitzades per entendre la vulnerabilitat genètica als trastorns psiquiàtrics han estat els estudis de lligament i l’anàlisi de gens candidats mitjançant estudis d’associació.

Estudis de lligament en l’anàlisi genètic de les malalties psiquiàtriques Els estudis de lligament en les malalties psiquiàtriques s’han basat en mètodes clàssics de lod-score i no paramètrics amb parelles de germans, utilitzant grups poblacionals grans o poblacions aïllades que permeten reduir la presencia d’heterogeneïtat4 per un efecte fundador18. Entre els resultats més consistents existeixen evidències de lligament amb esquizofrènia a les regions cromosòmiques 6p24, 8p, 13q32, i 22q11 i amb trastorn bipolar a 4p16, 18p11.2, 21q21 i Xq26. No obstant, els estudis de lligament continuen donant resultats desesperançadors i, tot i que s’ha confirmat alguns loci3 de susceptibilitat, aquesta estratègia sembla no ser una clara aproximació per identificar gens implicats en la majoria de malalties psiquiàtriques.

Estudis d’associació en l’anàlisi genètic de les malalties psiquiàtriques

Per altra banda, els estudis d’associació de gens candidats en trastorns psiquiàtriques s’han centrat majoritàriament en variants de gens que codifiquen per proteïnes implicades en els sistemes de neurotransmissió. Quan s’ha identificat una variant genètica funcional en algun gen candidat, la seva participació s’ha analitzat al llarg de tot l’espectre de malalties psiquiàtriques i endofenotips. La Taula 1 es mostra alguns exemples d’estudis d’associació en trastorns psiquiàtrics.

Taula 1. Estudis d’associació amb gens candidats d’interès en l’anàlisi de les malalties psiquiàtriques

Gen Variant Trastorn psiquiàtric

Transportador de serotonina 5HTT

5HTT-LPR

5HTTVNTR

Trastorns bipolar, depressió, trastorn obsessiu-compulsiu, dependències de substàncies, esquizofrènia, ansietat, trastorns alimentaris, dèficit d’atenció i hiperactivitat i psicosis

Receptor de dopamina DRD2

Ser311Cys Depressió, Psicosis, alcoholisme i dèficit d’atenció i hiperactivitat

Catecol-o-metiltransferasa

158G/A Dèficit d’atenció i hiperactivitat, esquizofrènia, depressió, trastorn obsessiu-compulsiu i trastorn bipolar

Receptor opioide OPRM1

118A/G Alcoholisme

Tirosina hidroxilasa (TH)

VNTR Esquizofrènia, trastorn bipolar i dèficit d’atenció i hiperactivitat

Models  murins  en  l’estudi  de  les  malalties psiquiàtriques

Alhora, l’estudi de models murins també ha mostrat evidències de la participació d’alguns gens en el fenotip2 psiquiàtric. Tot i que existeixen clares diferències entre humans i ratolins que dificulten la replicació dels fenotips2 complexos característics de les malalties psiquiàtriques, aquests models són de gran utilitat perquè comparteixen característiques neuroanatòmiques amb els humans i presenten un major rang de conductes socials i emocionals en comparació amb altres organismes invertebrats. El ratolí colomba és un clar exemple de l’estudi de mutants espontanis per malalties psiquiàtriques. Presenta hiperactivitat, dimorfisme ocular i alteracions el la plasticitat hipocampal i en el neurodesenvolupament. El mapatge genètic ha associat aquest fenotip2 a delecions en regions del cromosoma 2 que contenen el gen codificant per la proteïna associada a sinaptosoma 25 (SNAP25). Estudis posteriors en pacients han determinat associacions positives entre diferents polimorfismes en el gen SNAP25 i el trastorn per dèficit d’atenció amb hiperactivitat (TDAH). A més dels estudis de mutants espontanis, la generació de models murins knock-out14 també ha premés determinar el paper de gens específics en alteracions del comportament. Alguns exemples estan exposats en la Taula 2.

Taula 2. Models murins per diferents malalties psiquiàtriques

Gen Estratègia Fenotip associat

Receptor d’estrògens β

KO ansietat

Receptor cannabinoide CB1

KO ansietat

Receptor tirosina cinasa (Trkb)

KO Dèficits en memòria i aprenentatge

Receptor tirosina cinasa (Trkb)

Tg Baixa ansietat i millora en l’aprenentatge

Receptors corticosteroide (GR i MR)

Tg Depressió

Receptor de serotonina 5HT1B

KO Agressivitat

Subunitat β3 del receptor GABAA

KO Dèficits en memòria i hiperactivitat

Receptor de serotonina 5HT1A

KO Estrès i ansietat

Prolina deshidrogenasa

KO Esquizofrènia

KO: model Knock-out; Tg: model transgènic

No obstant, els resultats obtinguts en la dissecció genètica dels trastorns psiquiàtrics no són concloents i en molts casos no han pogut ser replicats. El fracàs d’aquest tipus d’aproximacions ha estat associat, entre d’altres, a la tendència a considerar el criteri diagnòstic com a fenotip2, l’existència d’heterogeneïtat i comorbiditat, la mida reduïda de la mostra amb baix poder estadístic, l’estratificació poblacional i l’aplicació de múltiples tests que augmenten la possibilitat d’obtenir resultats falsos positius degut a l’atzar. No obstant, en un futur la identificació del component genètic implicat en les malalties psiquiàtriques contribuirà a una millor comprensió de la etiologia d’aquests trastorns i permetrà desenvolupar tests predictius i de diagnòstic i identificar possibles dianes terapèutiques.

Glossari  1Malalties mendelianes: Sinònim de malaltia monogènica causada per l’alteració d’un únic gen. 2Fenotip: Conjunt de característiques visibles que presenta un individu com a resultat de la interacció entre els seus gens i el medi en el qual es desenvolupa. 3Locus/Loci: Posició ocupada per un gen en un cromosoma. 4Heterogeneïtat genètica: Terme per indicar que un mateix fenotip pot tenir causes genètiques diferents. 5Penetrància: Freqüència, expressada en tant per cent, amb què un gen present en un conjunt d'individus es manifesta fenotípicament. 6Fenocòpies: Característica determinada per l’ambient que presenta moltes similituds amb una característica determinada per un o varis gens. 7Genoma: Conjunt del total de material genètic de l’organisme que en l’esser humà correspon a 23 parelles de cromosomes. 8Al·lel: Cadascuna de les variants d’un polimorfisme o canvi genètic. 9Lod-score: Mesura de probabilitat de que existeixi lligament, és a dir, de que dos gens passin d’una generació a la següent com a grup únic. 10Freqüències al·lèliques: Proporció en una població concreta d’un determinat al·lel respecte a la resta d’al·lels del mateix locus.

Exemple: Suposem un polimorfisme A/B en un gen determinat. Com cada individu te dos cromosomes homòlegs i, per tant, dos al·lels, hi ha tres tipus de persones possibles:

Individus AA: presenten dos al·lels A

Individus AB: presenten un al·lel A i un al·lel B

Individus BB: presenten dos al·lels B

I, per tant, les freqüències al·lèliques pel polimorfisme A/B són:

- Freqüència al·lel A: Número d’al·lels A/Numero total d’al·lels (A+B)

- Freqüència al·lel B: Número d’al·lels B/Numero total d’al·lels (A+B)

11Freqüències genotípiques: Proporció en una població concreta d’un determinat genotip respecte al conjunt de tots els genotips possibles.

Exemple: Suposem un polimorfisme A/B en un gen determinat. Com cada individu te dos cromosomes homòlegs i, per tant, dos al·lels, els individus poden presentar tres genotips possibles: AA (un al·lel A en cadascú dels dos cromosomes), AB (un al·lel A en un cromosoma i un al·lel B en el cromosoma homòleg) i BB (un al·lel B en cada cromosoma). Les freqüències genotípiques pel polimorfisme A/B són:

- Freqüència genotip AA : Número d’individus AA/Número total d’individus (AA+AB+BB)

- Freqüència genotip AB : Número d’individus AB/Número total d’individus (AA+AB+BB)

- Freqüència genotip BB : Número d’individus BB/Número total d’individus (AA+AB+BB) 12Desequilibri de lligament: Existeix desequilibi de lligament en una regió cromosòmica quan hi ha grups de polimorfismes associats (coneguts com haplotips) que tendeixen a transmetres a la següent generació conjuntament i no de forma independent. 13Model animal transgènic: Organisme en el genoma del qual s’ha introduït un gen aliè mitjançant tècniques d’enginyeria genètica. 14Model animal Knock-out: Organisme en el qual s’ha anul·lat l’expressió d’un gen específic. 15Regions de sintènia: Localització conservada de gens en posicions cromosòmiques equivalents en diferents espècies. 16Epistasi: Interacció entre dos gens. Té lloc quan l’acció d’un gen es veu modificada per un altre o altres gens. 17Pleiotropia: Fenomen pel qual un únic gen és responsable de diferents fenotips no relacionats. 18Efecte fundador: Resultat del canvi de les freqüències de diferents polimorfismes produït per la formació d’una nova població a partir d’un nombre reduït d’individus.