estudio ballica bajo distintas condiciones de stress quimico
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EFECTO DEL MANGANESO EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CONCETRACIÓN DE COMPUESTOS
FENÓLICOS EN LOLIUM PERENNE CV.NUI Y BANQUET
Aviles, J. 1, Godoy, R. 1, Hernández, S. 1, Jara, C. 1, Moore, F. 1, Pérez, A. 1*
1Departamento de Ciencias Químicas y Recursos Naturales, Universidad de La Frontera, Temuco. Chile.
*Contacto autor: [email protected]
Resumen
La comúnmente llamada ballica o césped inglés (Lolium perenne) es una especie nativa de Europa y norte de África. Esta forma vegetal habita en céspedes, jardines y pastos húmedos que estén en zonas templadas. En esta investigación se realizó un estudio comparativo entre dos variedades de lolium perenne, Banquet y Nui estresadas con diferentes concentraciones de manganeso (Mn), para determinar la velocidad de crecimiento relativo, actividad antioxidante y su contenido de fenoles totales. Para la obtención de los cultivares se promovió la germinación
con abundante agua, luego los cultivares fueron sometidos a estrés con diferentes concentraciones de Mn. Este tratamiento se llevó a cabo durante cuatro días en solución nutritiva. Se tomaron muestras de la parte aérea y de la raíz al inicio y final del tratamiento, para determinar la velocidad de crecimiento relativo. La medición de la actividad antioxidante se realiza por el método DPPH y la concentración de polifenoles se determina siguiendo el método de Folin-Ciocalteu. Se obtuvo una disminución no significativa de la velocidad de crecimiento relativo de la raíz de los cultivares. En cuanto a la parte aérea se pudo observar una inhibición del crecimiento. Respecto al contenido de fenoles totales, el cultivar Nui presentó mayor cantidad comparado con Banquet. El aumento del contenido de fenoles, aumenta la actividad antioxidante de las plantas, promoviendo la defensa frente a radicales libres tóxicos. En conclusión en poco tiempo de administrado el tratamiento provoco que no se lograran observar cambios significativos en los
Palabras claves:
Crecimiento relativo
Actividad Antioxidante
Compuestos fenólicos
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cultivares y que a grandes rasgos el cultivar Nui presentó mayor resistencia a estrés con Mn.
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1. Introducción
La ballica (Lolium perenne) se emplea en praderas sembradas destinadas a la producción animal en la mayoría de los Andisoles del sur de Chile. La ballica es una especie que se caracteriza por presentar rápido establecimiento, alta producción y excelente calidad de forraje. Se generan sola, o asociada a cereales de grano pequeño (Demanet, 2013).
Entre las características de las ballicas perennes se encuentran su buena adaptación a condiciones edafoclimáticas poseen un potencial de producción elevado y generan un producto de alto valor nutritivo en condiciones adecuadas de manejo (Demanet, 2014). Su desarrollo es en forma de macollos Se establece en los meses de febrero y octubre, en sistemas de labranza convencional, mínima labor, cero labranza y regeneración (Demanet, 2014).
Los cultivares de lolium perenne pueden ser clasificadas según su diploidia. La variedad Nui pertenece a los cultivares diploides (2n) y se caracterizan por tener hojas finas y delgadas, mayor número de macollos, además presenta mayor tolerancia a periodos secos. La variedad Banquet pertenece a los cultivares tetraploides (4n) y se caracterizan por presentar hojas largas y gruesas, mayor tamaños de macollos, mayor producción en periodo primaveral y mayor producción de proteína bacteriana (Demanet, 2013). Las ballicas en estado natural son diploides, sin embargo al duplicar el número cromosomático cambian las características externas (fenotípicas) y las características internas (genotípicas) (Demanet, 2014).
Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias químicas, con diferentes estructuras, propiedades químicas y actividad biológica. Químicamente, los compuestos fenólicos son sustancias que poseen un anillo aromático, con uno o más grupos hidroxilo (-OH). Como antioxidantes, los polifenoles pueden proteger las células contra el daño oxidativo y por lo tanto limitar el riesgo de varias enfermedades degenerativas asociadas al estrés oxidativo causado por los radicales libres. El estrés oxidativo se define comúnmente como el desequilibrio entre las especies oxidantes y reductoras a nivel celular en un organismo (Gutiérrez et al, 2008).
Los métodos usados comúnmente para determinar y cuantificar fenoles totales en alimentos y vegetales son el ensayo de la vainillina y el de Folin-Ciocalteu. El método de Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico. La transferencia de electrones a pH básico reduce los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, cromógenos de color azul intenso, de tungsteno y molibdeno, siendo proporcional este color al número de grupos hidroxilo de la molécula (Gutiérrez et al, 2008).
Los Antioxidantes son compuestos los cuales pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhibiendo la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres. Muchos antioxidantes naturales, en especial los flavonoides, muestran un amplio rango de efectos biológicos
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incluyendo funciones antibacterianas, antivirales, antiinflamatorias, antialergénicas, antitrombóticas y vasodilatadores (Muñoz et al, 2008).
Existen muchos métodos para medir la capacidad antioxidante de una especie o sustancia. Un método muy usado se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), la cual se atribuye a la deslocalización del electrón desapareado, esta deslocalización también le otorga una coloración violeta caracterizada por una banda de absorción, en solución etanólica, centrada alrededor de 520 nm. Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que puede donar una átomo de hidrógeno o con otra especie radical (R) se produce la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R con la consecuente pérdida del color y por lo tanto la pérdida de la absorbancia (Muñoz et al, 2008).
El manganeso (Mn) es un micronutriente esencial para las plantas, pero puede llegar a ser fitotóxico bajo ciertas condiciones del suelo. Comúnmente, la toxicidad de Mn puede ocurrir en las plantas cultivadas en suelos con la reducción de las condiciones creadas por la acumulación de materia orgánica, la compactación, y/o inundaciones. Además, en algunos suelos ácidos, el exceso de Mn en forma de Mn2+ intercambiable es uno de los factores más importantes que limitan el crecimiento del cultivo (Rivera et al, 2013).
En la literatura se encuentra que el Mn es clave en la función de aparatos fotosintéticos asociadas con funciones en el fotosistema II (FSII). Este metal es un componente esencial del centro catalítico del FSII hidrolizando moléculas de agua, alimentando de electrones a la cadena transportadora de electrones, guiando la generación del poder reductor y ATP (Rivera et al, 2013).
2. Metodología
2.1 Condiciones de germinación y crecimiento.
Los dos cultivares de Ballica cv. Banquet y Nui fueron elegidos para este estudio comprados en Agrícola Nacional S.A.C (ANASAC). Las semillas fueron germinadas de acuerdo al método propuesto por Rosas et al., (2007) y Taylor y Foy (1985) con algunas modificaciones La germinación se realizó durante 8 días en condiciones controladas (20°C, humedad relativa del 70% y fotoperiodo 16/8 horas (luz/oscuridad)) en papel absorbente con agua desionizada. Posteriormente las plantas fueron transferidas a un cultivo hidropónico el cual se encontraba a un pH 4.8 con solución nutritiva de forma vertical para evitar que las raíces penetraran en el medio de cultivo (Vargas, 2007). Las plantas fueron oxigenadas una vez al día durante todo el proceso (Mora et al., 2009). La solución con las plantas se mantuvo durante 7 días y fue removida posteriormente con una nueva solución nutritiva en adición con el tratamiento a 25 muestras con 5 concentraciones distintas de Mn (50 mM, 150 mM, 350 mM, 750 mM) la cual se mantuvo durante 4 días.
2.2 Preparación de la muestra.
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Las plantas fueron extraídas de la solución y se les cortó las raíces y hojas, las cuales fueron posteriormente divididas de acuerdo a las concentraciones de Mn a las que habían sido expuestas. Se guardaron en nitrógeno líquido y otras se llevaron a una estufa por 2 días a 65 °C como está descrito en el método (Sadzawka et al., 2004) para la determinación del crecimiento relativo.
Posteriormente, se sacó muestra del nitrógeno líquido y se sigue una relación de 0.1 g: 1 mL de metanol al 80% a temperatura controlada, para ser centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos y 4ºC. Posteriormente se recogió el sobrenadante el cual sirvió para las mediciones de actividad antioxidante y cuantificación de fenoles.
2.3 Medición de actividad antioxidante.
Inicialmente se tomaron 200 µL del extracto anterior, se añadieron 100 µL de metanol al 80% y 1mL del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) mediante el ensayo descrito por Chyau et al,
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(2006) con menores modificaciones. Se realizó una curva de calibrado, utilizando Trolox como patrón. La longitud de onda utilizada fue 515 nm para la medición, a los tiempos de 0 y 8 minutos. La solución de DPPH 80 µM sin ninguna cantidad de extracto sirvió como medición blanco.
2.4 Determinación total de fenoles.
La cantidad total de fenoles en el extracto fue medida por espectrofotometría usando el método de Folin-Ciocalteu extraído y modificado desde Slinkard y Singleton (1997) utilizando ácido gálico como estándar.
2.5 Análisis estadístico
Los cálculos de estadística descriptiva correspondiente a medias y desviaciones estándar se realizaron ocupando Excel 2013. El análisis estadístico de datos se realizó utilizando el software IBM SPSS versión 20.0 para el análisis de normalidad, comparación de promedio de Tukey (p<0.05) y significación de Shapiro-Wilk.
3. Resultados
3.1 Velocidad de crecimiento relativo
Según Evans et al., (1972) el concepto de la velocidad de crecimiento relativo (también conocida por las siglas MRGR, del inglés “mean relative growth rate”), se define como el incremento de biomasa por unidad de biomasa y tiempo. De acuerdo a esto, se muestra en las Figuras 1 y 2, los valores de crecimiento de los tejidos raíz y hoja respectivamente, en ambos cultivares. Estos valores fueron obtenidos luego de cuatro días de tratamiento a las distintas concentraciones de Mn.
En la Figura 1, podemos observar una leve diminución del crecimiento de la raíz, mientras que en la Figura 2, se muestra una inhibición del crecimiento de la hoja en los dos cultivares.
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Control 50mM 150mM 350mM 750mM
Media raíz banquet 0.39 0.35 0.33 0.31 0.33
Media raíz Nui 0.14 0.12 0.09 0.11 0.08
0.030.080.130.180.230.280.330.380.430.48
Tratamiento
MRG
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Figura 1 Velocidad media de crecimiento relativo en raíz para cada cultivar. Las letras iguales indican que no existe diferencias significativas estadísticamente (p < 0.05) entre los tratamientos y el control de acuerdo a la prueba de comparación de promedios de Tukey.
Control 50mM 150mM 350mM 750mM
Media hoja banquet 0.27 0.24 0.25 0.27 0.25
Media hoja Nui 0.19 0.26 0.19 0.18 0.16
0.030.080.130.180.230.280.330.380.430.48
Tratamiento
MRG
R g/
d PS
Figura 2 Velocidad media de crecimiento relativo en hojas para ambos cultivares. Las letras iguales indican que no existe diferencias significativas estadísticamente (p < 0.05) entre los tratamientos y el control de acuerdo a la prueba de comparación de promedios de Tukey.
Los síntomas de toxicidad por Mn son diversos, y en muchos casos la toxicidad se manifiesta como la inhibición del crecimiento (Horiguchi, 1988). Estos podría explicar la inhibición y más aún la diminución del crecimiento en los tejidos de ambos cultivares.
En condiciones ácidas (pH bajo 5,5) existe un incremento en las concentraciones de protones y de manganeso (además de otros iones como el aluminio). Causando en la planta inhibición en el crecimiento radical, lo cual tiene consecuencia con la reducción en la toma de agua y nutrientes por parte de la planta (Casierra y Aguilar, 2007). Lo que reafirma los resultados obtenidos transcurridos los cuatro días de tratamiento con manganeso, en donde no hubo incremento en la biomasa de ambos cultivares.
3.2 Actividad antioxidante
Además del crecimiento, la toxicidad por Mn induce la formación de un exceso de radicales libres y especies reactivas de oxígeno, lo que resulta en estrés oxidativo (González et al., 1998; Shi et al., 2006; Yu y Rengel, 1999). Los radicales libres se forman generalmente como productos de las reacciones biológicas normales y su difusión en el espacio celular es controlada por el sistema antioxidante de las células, que incluye a los sistemas enzimáticos tales como superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasas (Shi et al., 2006).
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En la figura 3 se indican los valores obtenidos para la actividad antioxidante junto con sus estadísticos para cada cultivar de ballica mostrando un rango de 27.8 a 48.8 μg/g PF y 42.9 a 77.1 μg/g PF en Banquet y Nui respectivamente para los distintos tratamientos aplicados. En contraste
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con el control, los tratamientos vieron aumentada su actividad antioxidante siendo estadísticamente significativa para Banquet. No así para Nui, donde no presenta datos estadísticamente significativos. Además, el tratamiento 50 mM para ambos cultivares se comportó de manera elevada a diferencias de los demás tratamientos.
Control 50 mM 150 mM 350 mM 750 mM
Banquet 30.2167631619621
40.3634823479322
27.8494309282262
32.466121619378
48.7793382217705
Nui 23.2437275985663
68.4587813620072
42.8934157559788
77.1440339923691
53.5155815808899
5.015.025.035.045.055.065.075.085.0
Tratamiento
μg/g
PF
Figura 3 Actividad antioxidante según los cultivares de ballica. Las letras iguales indican que no existe diferencias significativas estadísticamente (p < 0.05) y letras diferentes indican que existe diferencia significativa entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de comparación de promedios de Tukey.
3.3 Fenoles totales
Los valores y estadísticos de fenoles obtenidos para cada cultivar de ballica se indican en la Figura x. La cantidad de fenoles varió de 27.8 a 48.8 µg/g PF y 42.9 a 77.1 µg/g PF para los distintos tratamientos en Banquet y Nui respectivamente. Ambos cultivares mostraron un aumento en la cantidad de fenoles comparados con el control, siendo Nui quien presentó una concentración mayor de estos compuestos. Además se obtuvo un aumento en la concentración fenoles para ambos cultivares en el tratamiento 50 mM, comportándose de manera diferente a los demás tratamiento que fueron en aumento desde la concentración 150 mM.
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a
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Control 50 mM 150 mM 350 mM 750 mM
Banquet 30.2167631619621
40.3634823479322
27.8494309282262
32.466121619378
48.7793382217705
Nui 23.2437275985663
68.4587813620072
42.8934157559788
77.1440339923691
53.5155815808899
5.015.025.035.045.055.065.075.085.0
Tratamiento
μg/g
PF
Figura 4 Contenido de fenoles según los cultivares de ballica Las letras iguales indican que no existe diferencias significativas estadísticamente (p < 0.05) entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de comparación de promedios de Tukey.
4. Discusión
En condiciones ácidas (pH bajo 5,5) existe un incremento en las concentraciones de protones y de manganeso (además de otros iones como el aluminio). Causando en la planta inhibición en el crecimiento radical, lo cual tiene consecuencia con la reducción en la toma de agua y nutrientes por parte de la planta (Casierra y Aguilar, 2007). Lo que reafirma los resultados obtenidos transcurridos los cuatro días de tratamiento con manganeso, en donde no hubo incremento en la biomasa de ambos cultivares.
Las plantas han desarrollado mecanismos muy específicos para absorber, acumular y traslocar nutrientes (Lasat, 200). A pesar de esto, existen algunos metales que no son esenciales para la planta y son absorbidos. Esto por presentar un comportamiento electroquímico similar a los metales que si son requeridos por las plantas. El Manganeso (Mn) esencial para el crecimiento de las plantas, ya que es requerido para la activación de algunas enzimas y en la activación del fotosistema II (Mahler, 2003). A pesar de ser un nutriente esencial para las plantas, es reemplazado fácilmente por Magnesio.
La absorción y acumulación de nutrientes por la planta depende del movimiento de los nutrientes desde una solución a la raíz de la planta, el paso de metales por las membranas de las células corticales de la raíz, el transporte de nutrientes desde estas células corticales al xilema hacia los tallos y una posible movilización de metales desde las hojas hacia los tejidos de almacenamiento (semillas, frutos, tubérculos) por el floema. (Jorhem y Sundstrom, 1993). El Manganeso (Mn) esencial para el crecimiento de las plantas, ya que es requerido para la activación de algunas enzimas y en la
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activación del fotosistema II La toxicidad por manganeso tiene efectos visuales en hojas jóvenes, como manchas de color marrón (Mahler, 2003). Lo que por el poco tiempo bajo condiciones de estrés, no se logró identificar dichos efectos.
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Como bien se describía en un principio la especie de Lolium perenne pueden variar en el número de cromosomas que poseen. En forma natural esta especie es diploide (2n), pero mediante ingeniería genética se logró duplicar el número de cromosomas, lo que dio como resultado cultivares tetraploides. Este nuevo número de cromosomas le otorgó a estas plantas ciertas características distintas.
Esta modificación genética hizo que los cultivares tetraploides presentaran hojas más grandes y gruesas, macollos más grandes y una mayor relación entre el contenido celular y la pared celular, por tanto mayor producción de la parte digestible. Debido a esto, tienen mayor concentración de carbohidratos solubles por lo que los hace aptos para su aprovechamiento en corte. En resumen, son de mejor calidad sin embargo esta modificación genética es benéfica en el sentido en que tienen un mayor consumo voluntario debido a sus mejorados niveles de carbohidratos solubles y menos nivel de fibra. Por otra parte estos cultivares requieren mayores cuidados en su manejo, una mayor fertilidad y humedad en el suelo para poder expresar sus ventajas. Esto puede explicar en parte que el cultivar Nui sea más resistente que Banquet en las mismas condiciones de cultivo. (Lopetegui, 2009).
En la figura 3 se muestra la actividad antioxidante de los dos cultivares frente a los distintos tratamientos. La diferencia entre cada tratamiento para cada cultivar no es significativa, sin embargo al comparar esta actividad entre cultivares, Nui, presenta una mayor actividad antioxidante Se ha verificado que a mayor concentración de fenoles totales, mayor es la actividad antioxidante promoviendo la defensa frente a radicales libres tóxicos (Baderschneider et al, 1999).
5. Conclusión
Los cultivares utilizados presentaron en el corto periodo diferencias sustanciales en las actividades antioxidante, en el crecimiento de las hojas y raíces por separados. El cultivar que mostró una mayor actividad frente al estrés oxidativo fue banquet con una mayor cantidad de fenoles.
Sin embargo, el tratamiento impartido bajo el sometimiento de estrés a distintas concentración de manganeso (50 mM, 150 mM, 350 mM, 750 mM) fue solo de 4 días a diferencia de tratamientos hechos en otras investigaciones relacionados con el mismo tema, o que involucraban manganeso en el crecimiento de Banquet y Nui, los cuales eran de al menos 15 días para obtener resultados representativos los cuales se pueda observar el efecto del manganeso sobre estos cultivares.
6. Agradecimientos
Al Dr. Marcelo Panichini por su colaboración y disposición, a los ayudantes Jorge González y Elizabeth Ulloa y a la Dra. Marjorie Reyes Díaz.
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