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ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD E INTERACCIÓN BIOLÓGICA DE LA MEZCLA DE EMULSIÓN DE PFOB CON SANGRE PARA SU APLICACIÓN COMO TRANSPORTADORA DE OXÍGENO Yissel Luengas Carrillo Proyecto Especial Maestría Ingeniería Biomédica, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia Juan Carlos Briceño Asesor, Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia Oscar Álvarez Co-asesor, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia RESUMEN La deficiencia en la cantidad de unidades disponibles al momento de requerir una transfusión de sangre y las patologías que pueden estar asociadas con éstas, fueron hechos que llevaron a la creación de los hemosustitutos, sustancias que pretenden suplir la función de la hemoglobina de transportar oxígeno. Existen principalmente dos tipos, los de interés para este estudio son las emulsiones perfluorocarbonadas, específicamente las de perfluoro-octilbromuro (PFOB). En este proyecto, se estudió la estabilidad e interacción biológica de la mezcla de emulsión de PFOB con sangre para su aplicación como transportadora de oxígeno, dividiendo la metodología en 3 fases: la primera, consistió en el análisis de la interacción biológica (biocompatibilidad y hemocompatibilidad); en la segunda se evaluó el transporte de oxígeno por medio de la medición de la presión parcial de oxígeno (pO2); y en la última fase, se evaluó un producto liofilizado de la emulsión de PFOB para estudiar su estabilidad en el tiempo por medio del seguimiento de sus propiedades fisicoquímicas. Como resultados, en la primera fase se encontró que la emulsión de PFOB no es citotóxica, ni hemolítica y tampoco genera alteraciones en el proceso de coagulación. En cuando a la segunda fase, se comprobó que la emulsión de PFOB tiene una mayor capacidad captación de oxígeno en comparación con la hemoglobina presente en la sangre, dado que después de 60 minutos de burbujeo de oxígeno se obtuvo una mayor pO2. Por último, en cuanto al producto liofilizado es necesario mejorar su formulación agregando crioprotectores, con el fin de tener una mayor estabilidad de sus propiedades macroscópicas, microscópicas y moleculares. En conclusión, la emulsión de PFOB puede ser suministrada vía intravenosa debido a que no se evidenció que pueda generar coagulopatía, no tiene efecto en la lisis de los glóbulos rojos y no va producir necrosis ni apoptosis de las células con las cuales interactúe; además cumple su función de transportar eficientemente el oxígeno y para mejorar su estabilidad en el tiempo es necesario que, al liofilizarla se empleen crioprotectores para mejorar sus propiedades fisicoquímicas. Palabras claves: Hemosustitutos, emulsión de PFOB, citotoxicidad, hemólisis, hemocompatibilidad, pO2, liofilización. 1. INTRODUCCIÓN El choque hipovolémico se presenta cuando el volumen sanguíneo del cuerpo disminuye en más del 20% y el corazón pierde la capacidad de bombear suficiente sangre, haciendo que se reduzca la presión arterial media de llenado del corazón, por una disminución del retorno venoso. Además, las células se vuelven incapaces de cumplir a cabalidad todas sus funciones, generando falla en múltiples órganos. El daño celular induce a un aporte insuficiente de oxígeno y de diversos sustratos, ocasionando que se reduzca la perfusión por los cambios tanto
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ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD E INTERACCIÓN BIOLÓGICA DE LA MEZCLA DE EMULSIÓN DE PFOB
CON SANGRE PARA SU APLICACIÓN COMO TRANSPORTADORA DE OXÍGENO
Yissel Luengas Carrillo Proyecto Especial Maestría Ingeniería Biomédica, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
Juan Carlos Briceño Asesor, Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
Oscar Álvarez Co-asesor, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
RESUMEN
La deficiencia en la cantidad de unidades disponibles al momento de requerir una transfusión de sangre y las
patologías que pueden estar asociadas con éstas, fueron hechos que llevaron a la creación de los
hemosustitutos, sustancias que pretenden suplir la función de la hemoglobina de transportar oxígeno. Existen
principalmente dos tipos, los de interés para este estudio son las emulsiones perfluorocarbonadas,
específicamente las de perfluoro-octilbromuro (PFOB). En este proyecto, se estudió la estabilidad e
interacción biológica de la mezcla de emulsión de PFOB con sangre para su aplicación como transportadora
de oxígeno, dividiendo la metodología en 3 fases: la primera, consistió en el análisis de la interacción biológica
(biocompatibilidad y hemocompatibilidad); en la segunda se evaluó el transporte de oxígeno por medio de la
medición de la presión parcial de oxígeno (pO2); y en la última fase, se evaluó un producto liofilizado de la
emulsión de PFOB para estudiar su estabilidad en el tiempo por medio del seguimiento de sus propiedades
fisicoquímicas. Como resultados, en la primera fase se encontró que la emulsión de PFOB no es citotóxica, ni
hemolítica y tampoco genera alteraciones en el proceso de coagulación. En cuando a la segunda fase, se
comprobó que la emulsión de PFOB tiene una mayor capacidad captación de oxígeno en comparación con la
hemoglobina presente en la sangre, dado que después de 60 minutos de burbujeo de oxígeno se obtuvo una
mayor pO2. Por último, en cuanto al producto liofilizado es necesario mejorar su formulación agregando
crioprotectores, con el fin de tener una mayor estabilidad de sus propiedades macroscópicas, microscópicas
y moleculares. En conclusión, la emulsión de PFOB puede ser suministrada vía intravenosa debido a que no se
evidenció que pueda generar coagulopatía, no tiene efecto en la lisis de los glóbulos rojos y no va producir
necrosis ni apoptosis de las células con las cuales interactúe; además cumple su función de transportar
eficientemente el oxígeno y para mejorar su estabilidad en el tiempo es necesario que, al liofilizarla se
empleen crioprotectores para mejorar sus propiedades fisicoquímicas.
Palabras claves: Hemosustitutos, emulsión de PFOB, citotoxicidad, hemólisis, hemocompatibilidad, pO2, liofilización.
1. INTRODUCCIÓN
El choque hipovolémico se presenta cuando el
volumen sanguíneo del cuerpo disminuye en más
del 20% y el corazón pierde la capacidad de
bombear suficiente sangre, haciendo que se
reduzca la presión arterial media de llenado del
corazón, por una disminución del retorno venoso.
Además, las células se vuelven incapaces de
cumplir a cabalidad todas sus funciones,
generando falla en múltiples órganos. El daño
celular induce a un aporte insuficiente de oxígeno
y de diversos sustratos, ocasionando que se
reduzca la perfusión por los cambios tanto
funcionales, como estructurales que empieza a
sufrir la microvasculatura. Cuando no es posible
controlar rápidamente la insuficiencia de oxígeno
se pueden presentar daños irreversibles [1].
Por lo tanto, se hace necesario reestablecer en el
menor tiempo posible la perfusión, es decir,
restituir el volumen sanguíneo. Según el manual
ATLS (Advanced Trauma Life Support),
generalmente, en una primera instancia se
emplean fluidos acelulares para restaurar la
presión arterial y mantener la perfusión
microvascular, éstos pueden ser cristaloides o
coloides, los cuales permiten mantener un
volumen intravascular adecuado. Este tipo de
soluciones permiten una expansión intravascular
transitoria. Cuando el uso de expansores
plasmáticos no es suficiente, se procede a hacer
uso de transfusiones sanguíneas con el fin de
mejorar el transporte de oxígeno del volumen
intravascular [2].
El problema de las transfusiones de sangre
consiste en que, en países como Colombia, los
bancos de sangre presentan un déficit en la
cantidad de unidades que tienen disponibles,
haciendo que ésta sea escaza, de difícil acceso en
caso de emergencia y de alto costo por la
recolección y el análisis. Lo anterior se refleja en
una oferta de 15.4 unidades sanguíneas por cada
mil habitantes para una demanda de
aproximadamente 24 donantes por cada mil
habitantes en el país [3]. Adicionalmente, datos
reportados por agencias norteamericanas indican
que se ocasionan entre 30 y 40 muertes en el año
por cada 10 millones de unidades de sangre que
son transfundidas en Estados Unidos, es decir,
por cada 300.000 transfusiones, una persona
muere. Esto se debe en gran medida por la
incompatibilidad entre los tipos de sangre,
resultando en fiebre, problemas renales y en
casos extremos la muerte. Aproximadamente 1
por cada 700.000 unidades de sangre
transfundidas son distribuidas incorrectamente
[4].
Debido a los riesgos intrínsecos de las
transfusiones de sangre y de la poca eficiencia de
los expansores plasmáticos, se crean los
hemosustitutos, sustancias que pretenden suplir
la función de la sangre de transportar gases
respiratorios, evitando así riesgos relacionados
con la patogénesis de las transfusiones (hepatitis,
VIH, incompatibilidad de grupos sanguíneos,
entre otros). Además, se evita el inconveniente de
las condiciones de almacenamiento de la sangre,
ya que a medida que transcurre el tiempo, la
hemoglobina puede cambiar su afinidad por el
oxígeno [5]. En la actualidad, se conocen tres
principales tipos de hemosustitutos: soluciones
de hemoglobinas (Hb), hemoglobina encapsulada
en liposomas (LEH) y los de interés que son las
emulsiones perfluorocarbonadas (PFC). Las
emulsiones de PFC están basadas en
componentes sintéticos, químicamente inertes y
que actúan como solventes de oxígeno, nitrógeno
y dióxido de carbono [6], [7]. El PFC no imita a la
hemoglobina, químicamente no interactúa igual
con los gases respiratorios y biológicamente
tampoco cumple las funciones de dicha proteína,
puede permanecer en los tejidos vivos durante
años o de manera transitoria, sin causar
reacciones de inflamación o rechazo [8], [9]. La
cantidad de oxígeno disuelto en PFC está
linealmente relacionada con la presión parcial de
oxígeno (PO2) local [6], ya que obedece a la ley de
Henry [8]. El componente fluorocarbonado tiene
la capacidad de disolver de 40% a 50% volúmenes
de oxígeno a una presión parcial de 160 mmHg a
37°C (temperatura corporal) [10]. La solubilidad
del oxígeno en PFC es típicamente 20 veces mayor
que la del plasma sanguíneo [11].
Uno de los perfluorocarbonos más estudiados en
el transporte de gases, es el perfluoro-
octilbromuro (PFOB), aceite que es evaluado y
analizado en la Universidad de los Andes por el
Grupo de Hemosustitutos. Al ser un componente
sintético y oleoso, es necesario garantizar que no
vaya a causar ningún tipo de patología en el
organismo al ser suministrado vía intravenosa y
que no vaya a perder sus características en el
tiempo, mientras es almacenado. Por tal motivo,
en este proyecto, se estudió la estabilidad e
interacción biológica de la mezcla de emulsión de
PFOB con sangre para su aplicación como
transportadora de oxígeno. A continuación, se
presenta la metodología y los resultados
obtenidos.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Para llevar a cabo este proyecto, se plantean tres
fases; la primera, corresponde a la evaluación de
la interacción biológica de la emulsión de PFOB. La
segunda, consiste en verificar cómo se lleva a cabo
el proceso de transporte de oxígeno en el interior
de la emulsión. Por último, la tercera es la
evaluación de la liofilización como mecanismo
final de almacenamiento para mejorar la
estabilidad de la emulsión de PFOB.
Para las tres fases del proyecto, la emulsión de
PFOB a emplear es la descrita en el protocolo PRO-
PPH-32-02 del Grupo de Hemosustitutos de la
Universidad de los Andes en convenio con la
Fundación Cardioinfantil, Instituto de Cardiología.
A continuación, se muestran las propiedades a
medir en cada una de las fases anteriormente
mencionadas.
1 PBS: Buffer fosfato salino, por sus siglas en inglés, Phosphate Buffered Saline. Es una solución acuosa y
2.1 Fase 1: Interacción biológica de la emulsión
de PFOB
Para evaluar las propiedades biológicas de la
emulsión de PFOB cuando entre en contacto con
la sangre, se analizaron diferentes aspectos los
cuales son mostrados a continuación:
2.1.1 Prueba de hemólisis
Para determinar in vitro la biocompatibilidad de la
emulsión de PFOB, como sustancia transportadora
de oxígeno, se estudió la interacción de ésta
cuando entra en contacto con la sangre,
determinando la hemocompatibilidad por medio
de una prueba de hemólisis, con el fin de verificar
el porcentaje de lisis de glóbulos rojos (eritrocitos)
al medio y realizando la cuantificación
espectrofotométrica de hemoglobina libre [12].
Teniendo en cuenta estudios previos [13], [14],
[15], se desarrolló el protocolo PRO-PPH-40-00, en
el cual se estableció que para la realización de la
prueba de hemólisis se debe tomar una muestra
de sangre, separar de ésta los glóbulos rojos y
diluirlos en PBS1 (1X); solución que fue mezclada
con la emulsión a diferentes concentraciones (Ver
Tabla 1) e incubada durante una hora a 37°C.
Para la cuantificación del porcentaje de hemólisis,
se centrifugaron las muestras, se tomó el
sobrenadante y la muestra resultante se leyó en un
espectrofotómetro a 398 nm [15].
Tabla 1: Composición de las muestras analizadas en la prueba de citotoxicidad
Muestra Contenido
Control positivo 50 µl solución de eritrocitos + 1000 µl de agua destilada
Control negativo 50 µl solución de eritrocitos
+ 1000 µl de PBS 1X
salina que es similar al líquido extracelular de los mamíferos. [16]
Tratamiento 1 (PFOB 21%)
50 µl solución de eritrocitos + 700 µl de emulsión + 300
µl de PBS 1X
Tratamiento 2 (PFOB 18%)
50 µl solución de eritrocitos + 600 µl de emulsión + 400
µl de PBS 1X
Tratamiento 3 (PFOB 15%)
50 µl solución de eritrocitos + 500 µl de emulsión + 500
µl de PBS 1X
Tratamiento 4 (PFOB 12%)
50 µl solución de eritrocitos + 400 µl de emulsión + 600
µl de PBS 1X
Tratamiento 5 (PFOB 9%)
50 µl solución de eritrocitos + 300 µl de emulsión + 700
µl de PBS 1X
Tratamiento 5 (PFOB 6%)
50 µl solución de eritrocitos + 200 µl de emulsión + 800
µl de PBS 1X
Teniendo en cuenta las regulaciones, se debe
cumplir que para el uso clínico, la emulsión debe
generar un máximo porcentaje de hemólisis del 5%
para que sea considerado como no hemolítico
[12], ya que este porcentaje puede estar asociado
al daño basal que se genera al extraer las
muestras.
2.1.2 Coagulación – Estabilidad del coágulo
Debido a que la emulsión de PFOB va a entrar en
contacto con el flujo sanguíneo es necesario
conocer si ésta activa o no la cascada de
coagulación (vía intrínseca) generando algún tipo
de coagulopatía que pueda llegar a alterar el
metabolismo del paciente, ocasionando
inconvenientes en las intervenciones quirúrgicas
[17]. Por lo tanto, se desea conocer si el contacto
de sangre y emulsión, alteran el tiempo de
coagulación normal que debe mantener un
paciente durante la restitución de la volemia.
Para esto, se estudió el proceso de gelificación de
la fibrina durante la coagulación de la sangre, se
hizo uso de la metodología empleada por P. Evans
en su investigación [17] junto con otros estudios
[18]. De esta manera, se evaluó la transición de
líquido a sólido de una muestra de 2 mL de sangre
humana con 0.85 mL de mezcla de emulsión de
PFOB con lactato de Ringer (80:20). Se utilizó el
reómetro AR-G2 de TA Instrument®, en el cual se
realizó un barrido de tiempo haciendo uso de una
geometría de platos paralelos y usando como
parámetros una frecuencia fija de 0.1 Hz y una
deformación de 0.082 rad [17] y un GAP de 1000
µm; la prueba se realizó durante 30 minutos.
La muestra de sangre fue obtenida justo antes de
realizar la prueba, para evitar que se empezara a
coagular antes de realizar el procedimiento,
debido a que no se utilizó ningún tipo de
anticoagulante.
El procedimiento anteriormente mencionado, se
estableció en el protocolo PRO-PPH-44-00, el cual
emplea una técnica similar a la del
tromboelastógrafo, equipo empleado a nivel
clínico. El valor que se reporta corresponde al
valor R, tiempo de reacción. Este resultado refleja
la acción de los factores de coagulación,
específicamente XIII y XIIIa [19]–[21].
La tromboelastografía es la técnica utilizada en
medicina para medir la viscoelasticidad del
coágulo de una manera dinámica y global [20], ya
que cambios significativos en la viscosidad de la
sangre pueden generar infarto de miocardio,
enfermedad vascular periférica y diabetes. Las
propiedades viscoelásticas están entre las
medidas más sensibles de la polimerización de la
fibrina y la estructura del coágulo. Para esto hacen
uso del tromboelastografo (TEG), el cual es un
equipo conformado por dos cilindros coaxiales, en
el cilindro exterior se coloca la muestra de sangre,
siendo sometida a una serie de oscilaciones cada
10 segundos en un ángulo de 4°45’’[19]. Con este
aparato se obtiene una gráfica denominada
tromboelastograma, la cual es mostrada en la
Figura 1.
Figura 1: Tromboelastograma normal [15]
Las variables que se pueden analizar en un
tromboelastograma son múltiples, tal como se
indican en la Figura 1. Pero el parámetro de interés
para este proyecto es R, el cual corresponde al
tiempo de reacción, es decir, es el intervalo de
tiempo necesario para iniciar la formación de la
red de fibrina [19]. En este tiempo se inicia la
coagulación, su valor normal se encuentra en 4 y 8
minutos [20].
Según el artículo Rheometry and associated
techniques for blood coagulation studies [17] es
posible relacionar la reología de la sangre con los
resultados obtenidos con el tromboelastografo,
para esto es necesario realizar un barrido de
tiempo en el reómetro para así poder obtener el
módulo de almacenamiento (G’) y el módulo de
pérdida (G’’) con el fin de conocer las propiedades
elásticas y viscosas, respectivamente, con dichos
valores es posible calcular la tangente de pérdida,
la cual está dada por la siguiente expresión
matemática:
𝑇𝑎𝑛 (𝛿) =𝐺′′
𝐺′ (𝐸𝑐. 1)
La forma en la cual se relaciona la reología de la
sangre en cuanto a las propiedades elásticas y
viscosas con el TEG se muestra en la Figura 2,
donde se demarca con una línea roja, los
resultados que se obtienen a nivel clínico.
Figura 2: Relación entre los resultados obtenidos en el TEG (línea roja) y en el reómetro a diferentes frecuencias con
sangre bovina [15]
De esta manera, fue como se obtuvieron los
resultados que son mostrados en la Sección 3.
2.1.3 Citotoxicidad en Células Vero y
Macrófagos
El estudio de la viabilidad celular in vitro es una
herramienta importante para el análisis citotóxico
de ciertas sustancias o agentes externos sobre una
población celular dada. Estas variables (viabilidad
celular y citotoxicidad) se determinan a partir del
porcentaje de células metabólicamente activas al
entrar en contacto con el material o extracto en
estudio. Cuando se presenta un efecto citotóxico
las células pueden entrar en apoptosis o necrosis
debido al efecto tóxico ejercido por cierta
sustancia química presente en el medio [22].
Dentro de los métodos aceptados por la norma
ISO10993 (que rige los ensayos de evaluación
biológica de dispositivos médicos) para cuantificar
in vitro la viabilidad celular se encuentra la
reducción de sales de tetrazolio. Dentro de estas,
el MTT o bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-
difeniltetrazolio, es una sal que puede ser reducida
por enzimas deshidrogenasas presentes en la
mitocondria de células metabólicamente activas,
para producir equivalentes de NADH y NADPH,
durante la respiración celular. El producto
resultante, genera cristales de azul de formazán,
los cuales pueden ser solubilizados y
posteriormente cuantificados por métodos
espectrofotométricos [23]. Dichos cristales se
disuelven utilizando Dimetil Sulfóxido o DMSO,
una sustancia que reacciona con el azul de
formazán y forma un producto cuyo espectro es
cuantificable [24].
Según la norma ISO10993, es necesario obtener
una viabilidad celular mayor al 80% [23] y por el
tipo de sustancia de estudio de este proyecto,
exige que se realice la prueba en una línea celular
y en células sanguíneas, por tal motivo se evaluó
en células Vero y en macrófagos, debido a que la
emulsión entra en contacto directo con la sangre.
Por tal motivo, se planteó el protocolo para la
obtención de dichas células sanguíneas por medio
de un cultivo primario, el cual corresponde al PRO-
PPH-41-00.
Haciendo uso de estudios anteriormente
reportados [25], [26], [27], se plantearon los
protocolos PRO-PPH-42-00 y PRO-PPH-43-00, los
cuales corresponden al ensayo de citotoxicidad
con macrófagos y con células vero,
respectivamente. En estos se indica que la
densidad celular empleada para células Vero fue
de 100.000 células y de macrófagos 40.000.
Además, la exposición de las células con la
emulsión fue de 24 horas en una incubadora a
37°C y 5% de CO2, la cuantificación se realizó
haciendo uso de un lector de microplacas a 595
nm [28], [29].
2.2 Fase 2: Transporte de oxígeno en el interior
de la emulsión de PFOB
Para la cuantificación del transporte de oxígeno en
la emulsión, se empleó un método indirecto, con
el cual se quería verificar que la emulsión de PFOB
se cargara de oxígeno, cuando entraba en
contacto con dicho gas.
Para esto, se hizo uso del RapidLab 348EX de
Siemens®, el cual emplea potenciometría,
amperometría y conductimetría para medir la
concentración del componente que se desea
analizar de la muestra sanguínea. La respuesta
electroquímica entre el componente analizado y el
sensor es el indicativo de la cantidad de cada uno
de los componentes [30]. La presión parcial de
oxígeno (pO2), es el componente de mayor interés
para esta fase del estudio, es calculado por el
método de amperometría, éste implica aplicar un
voltaje a un electrodo y medir la corriente
generada [31].
Figura 3: Montaje empleado para la medición de la presión
parcial de oxígeno
La pO2 es un elemento de medida que sirve para
evaluar la eficiencia del intercambio de gases
pulmonares, es por tal motivo, que se seleccionó
este parámetro para evaluar la capacidad de carga
de oxígeno por parte de la muestra. Para esto, se
empleó el montaje de la Figura 3 haciendo uso de
un burbujeo con oxígeno medicinal a un flujo de
250 mL/min, equivalente al consumo de O2 de una
persona en condiciones fisiológicas normales y en
estado de reposo [32]. Cada 10 minutos se tomó
una muestra de la solución de estudio (Ver Tabla
2) durante una hora y se analizaron sus
componentes en el RapidLab 348X.
Tabla 2: Composición de las muestras analizadas en la prueba de transporte de oxígeno
Muestra Composición
Muestra 1 Sangre
Muestra 2 Sangre:Emulsión (90:10)
Muestra 3 Sangre:Emulsión (80:20)
Muestra 4 Sangre:Emulsión (70:30)
2.3 Fase 3: Forma de almacenamiento de la
emulsión de PFOB
Una forma de almacenamiento que se planteó
para la emulsión de PFOB, fue transformar su
forma farmacéutica en liofilizado para garantizar
una mayor estabilidad del producto. Para esto, se
llevó a cabo el procedimiento planteado en el
protocolo PRO-PPH-33-00 [33], siendo la
temperatura de congelamiento -45°C y la presión
de sublimación 0.140 mBar . Se aprovechó el vacío
generado por el liofilizador Labconco, para realizar
el sellamiento de los viales. Posteriormente, se
agrafaron y se almacenaron a dos temperaturas
diferentes (4°C y 17°C).
Para verificar la calidad del producto liofilizado
obtenido y el cumplimiento de las propiedades
tanto a nivel macroscópico como molecular de los
parámetros fisiológicos humanos; se realizaron las
pruebas que son descritas a continuación.
2.3.1. Propiedades macroscópicas
A nivel macroscópico, es importante que la
solución reconstituida del producto liofilizado no
vaya a alterar el comportamiento normal de la
sangre cuando sea incorporado vía intravenosa.
Por tal motivo, se hizo control de pérdida de peso
de los viales liofilizados para garantizar estabilidad
del producto en el tiempo. Además, se estudió la
viscosidad de la solución reconstituida con
diferentes soluciones de reanimación y su
comportamiento en el tiempo.
I. Pérdida de peso
Para la prueba de pérdida de peso, se tuvieron en
cuenta los parámetros establecidos por la USP,
Farmacopea de Estados Unidos, en la cual es
necesario que el producto liofilizado no pierda
masa a través del tiempo, permitiendo un máximo
de cambio en el peso de 2,5% por vial, esto con el
fin de garantizar siempre la misma dosis al
paciente, en este caso, el principio activo
correspondería al PFOB [34]. Teniendo en cuenta
lo anterior, se planteó una prueba de pérdida de
peso dependiente de la temperatura de
almacenamiento (17°C y 4°C); para esto se
numeraron 10 viales y semanalmente se registró
su peso.
II. Viscosidad
La viscosidad es un factor importante debido a que
es aquella propiedad fisicoquímica que regula en
cierta medida la presión arterial, ya que, si la
viscosidad es muy alta, la sangre se opone a su
movimiento habitual porque aumenta su
resistencia, causando vasoconstricción [35].
Para esta propiedad fisicoquímica se empleó el
reómetro AR-G2 de TA Instrument® con una
geometría de cilindros concéntricos a 37°C y un
GAP de 5920 µm, al cual se le incorporaron 20 mL
del reconstituido para realizar una prueba de flujo
en estado estacionario desde una velocidad de
cizalla de 0.1 s-1 hasta 300 s-1. Se reportó la
viscosidad encontrada a 100 s-1, debido a que en
este valor, la sangre empieza a tener un
comportamiento newtoniano [36].
Con esta propiedad se verifica que el producto
genera el cizallamiento requerido para que no se
presente vasoconstricción en los casos de grandes
pérdidas de sangre, ya que puede garantizar que
los vasos sanguíneos siempre se encontrarán
abiertos o dilatados [37].
2.3.2 Propiedades microscópicas
A nivel microscópico, se debe garantizar que el
producto liofilizado y la solución reconstituida,
sean estables en el tiempo y cumplan con
parámetros fisiológicos. Para esto, se realizó un
análisis de la estructura del liofilizado y se midió el
tamaño de partícula del reconstituido a diferentes
condiciones de almacenamiento, de proceso y
para diferentes soluciones reconstituyentes. Los
procedimientos son detallados a continuación.
I. Estructura del liofilizado
Se hizo uso de un Microscopio Electrónico de
Barrido de alto vacío, JEOL JSM-6490LV, SEM por
sus siglas en inglés, el cual enfoca sobre la muestra
un haz de electrones acelerado con energías de
excitación desde 0.1 kV hasta 30 kV y de esta
manera logra obtener información morfológica,
topográfica y composicional de las muestras
produciendo imágenes de alta resolución (de
hasta 3 nm) [38].
Previo a la visualización, las muestras fueron
sometidas a un recubrimiento con oro, por medio
de un metalizador Dentom Vacuum Desk IV, para
garantizar la conductividad del haz de electrones
sobre la muestra, la cual no tiene ningún
componente conductor, esto se realiza con el fin
de evitar que las muestras se carguen y desvíen el
rayo de electrones que emite el equipo. El
metalizador Desk® IV provee una película fina de
oro sobre la muestra a condiciones de baja presión
(10-4 Torr) [39].
II. Tamaño de gota
Se hizo uso del analizador de tamaño de partícula,
Zetasizer Nano ZS, el cual por medio de la técnica
de dispersión de luz dinámica (DLS) mide la
difusión de partículas en movimiento Browniano y
convierte este valor a tamaño, generando su
respectiva distribución utilizando la relación de
Stokes-Einstein. De esta manera, es como el
equipo arroja el diámetro promedio de las gotas
en la solución analizada.
El tamaño de gota, es uno de los factores más
determinantes en el uso del producto vía
intravenoso, ya que se debe garantizar que la
solución infundida no sobrepase diámetros de 8
μm, los cuales corresponden a los diámetros de los
capilares (Ver Figura 4), evitando de esta manera
que se genere oclusión capilar y detección
inmunológica de las gotas de PFOB [8], [40]–[42].
Figura 4: Estructura de los vasos transportadores de sangre
[43]
El tamaño de gota se analizó con diferentes
expansores plasmáticos (soluciones
reconstituyentes) y con diferentes tipos de
agitación, una manual y otra mecánica, la primera
consistió simplemente en agitar vigorosamente el
vial con la mano; mientras que, en la segunda, se
hizo uso de un vortex a 1500 rpm durante 10
minutos, excepto a los viales que se encontraban
almacenados a 17°C, donde la agitación se realizó
por 16 minutos. Además, se analizó el
reconstituido de un producto liofilizado que
durante su proceso de emulsificación no fue
sometido a microfluidización (llevar la emulsión a
una presión de 18.000 psi, 5 veces).
2.3.3 Propiedades moleculares
Las mediciones de las propiedades moleculares
dan una noción sobre el comportamiento químico
y físico que ocurre al interior de los átomos que
componen el producto liofilizado de la emulsión.
Las propiedades moleculares analizadas fueron el
pH, la humedad y el contenido de PFOB. Las
metodologías que se emplearon para sus
mediciones se describen a continuación.
I. pH
Se tomaron aproximadamente 8 mL del
reconstituido para la medición en el
potenciómetro Mettler Toledo. Es importante
tener control de esta propiedad para evitar
complicaciones homeostáticas como acidosis o
alcalosis metabólica en los pacientes, eventos que
empeorarían la condición inicial del paciente [44],
[45].
II. Humedad
Los productos liofilizados deben ser envasados al
vacío con el fin de garantizar que no vuelvan a
adquirir humedad y de esta manera también
conservar su esterilidad. Para la medición de esta
propiedad se empleó la valoración culombimétrica
o volumétrica para determinar trazas de agua en
la muestra, empleando el Coulómetro de Mettler
Toledo [46].
III. Contenido de PFOB en el liofilizado
Para verificar que en el producto final liofilizado
había presencia de PFOB, se realizaron pruebas de
iones fluoruro, de espectrofotometría y de análisis
elemental (EDS), con el fin de comprobar que,
durante el proceso de liofilización, este
componente no se haya sublimado. A
continuación, se menciona cómo se llevó a cabo
cada uno de los procedimientos.
A. Prueba de iones fluoruro
La técnica utilizada consistió en determinar los
fluoruros potenciométricamente haciendo uso de
un electrodo de ion específico para F-, en conjunto
con un electrodo de referencia de calomel. El
electrodo de fluoruro tiene una membrana
cristalina de fluoruro de lantano, (LaF3) [47].
El único ion que interfiere directamente con las
medidas de fluoruro es el ion hidroxilo y esta
interferencia empieza a ser importante a valores
de pH superiores a ocho. A pH menores a cinco, los
iones hidrógeno también interfieren en las
determinaciones de fluoruro total; en este caso se
forma fluoruro de hidrógeno no disociado frente
al cual el electrodo no tiene respuesta [47].
Debido a que las muestras deben cumplir con el
pH fisiológico de la sangre, entonces no debe verse
afectada la medición por este método.
B. Prueba de espectrofotometría UV-VIS
Para la prueba de espectrofotometría, se pesó
0,05 g del polvo liofilizado, luego se disolvió en el
buffer de fase acuosa de la emulsión; se agitó en
vortex a 1500 rpm durante 10 min. Se tomó una
alícuota de la solución y se agregó en una celda de
cuarzo para realizar la medición en el
espectrofotómetro, en el cual se envía un haz de
luz en los rangos visible, ultravioleta e infrarrojo
cercano, obteniendo un espectro de las
transiciones electrónicas de las moléculas de la
muestra analizada [48].
El valor de la absorbancia que se reporta es a una
longitud de onda de 254 nm, correspondiente al
PFOB [49].
C. Análisis elemental (EDS) - Microanálisis
Otra de las metodologías empleada para verificar
la presencia de PFOB en el producto liofilizado fue
mediante el sistema de microanálisis por
espectroscopía de dispersión de energía de rayos
X, EDS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopia);
modelo Inca Energy 250 EDS System LK-IE250 de
Oxford. Accesorio adaptado al microscopio
electrónico de barrido (SEM) [50].
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS
A continuación, se mostrarán los resultados
obtenidos en cada una de las etapas del proyecto
descritas en la Sección 2.
3.1 Fase 1: Interacción biológica de la emulsión
de PFOB
3.1.1 Prueba de hemólisis
Para visualizar el comportamiento de los glóbulos
rojos (eritrocitos) diluidos en PBS (1X) con
emulsión, se hizo uso de un microscopio óptico a
100X, obteniendo la imagen que se muestra en la
Figura 4.A. En éstas se evidencia que la acción de
la emulsión de PFOB y la agregación de sales,
provenientes del PBS, no altera la forma regular de
los eritrocitos (Ver Figura 4.B), de esta manera ya
se sabe de manera cualitativa que no se va a
presentar hemólisis al momento de suministrar vía
intravenosa la emulsión.
Para conocer de manera cuantitativa el porcentaje
de hemólisis, se realizó una medición
espectrofotométrica del sobrenadante de cada
una de las muestras analizadas (Ver Figura 5), tal
como se mencionó en la Sección 2.1.1. Fue
necesario diluir la emulsión de PFOB con el fin de
obtener la cantidad suficiente de sobrenadante
para realizar la medición.
Figura 5: Visualización en microscopio óptico a 100 X. A. Mezcla de dilución de glóbulos rojos y emulsión de PFOB
(70:30). B. Dilución de glóbulos rojos en PBS (0.1:10)
Figura 6: Muestras obtenidas para la evaluación de
hemólisis por medio de espectrometría. A. Control positivo: 100% hemolítico. B. Control negativo: 0% hemolítico. C. Interacción de los eritrocitos con la emulsión de PFOB.
Al cuantificar los sobrenadantes de todas las
muestras se obtienen los resultados que se
muestran en la Figura 6; donde ninguna de las
soluciones de emulsión de PFOB, supera el 5% de
hemólisis, por lo cual no se tiene un producto
hemolítico, haciendo que no altere el
comportamiento regular de los eritrocitos.
Figura 7: Porcentaje de hemólisis en eritrocitos para
diferentes concentraciones de emulsión de PFOB
3.1.2 Coagulación – Estabilidad del coágulo
Para el estudio de la estabilidad del coágulo fue
necesario comparar los resultados obtenidos de la
reología de la sangre con la mezcla
Emulsión+Lactato con los parámetros que arroja el
tromboelastógrafo y con los resultados obtenidos
por P. Evans en su estudio [17].
Con el fin de conocer si la emulsión de PFOB iba a
alterar el proceso normal de coagulación, se
realizó un estudio reológico de la sangre con la
mezcla Emulsión + Lactato de Ringer, utilizando los
parámetros descritos en la Sección 2.1.2,
obteniendo los resultados que se muestran en la
Figura 7. La forma de obtención del parámetro R
es ilustrada en la Figura 8.
Figura 8: Tiempo de polimerización de la fibrina obtenido al
mezclar la emulsión de PFOB con sangre
Figura 9: Representación gráfica de la obtención del parámetro R (tiempo de polimerización de la fibrina)
En la Figura 7, se reporta el tiempo de reacción, el
cual corresponde al valor R que reporta el
tromboelastógrafo, cuyo equivalente reológico es
el punto de corte entre el módulo de
almacenamiento y la tangente de pérdida (Ver
Figura 8). Todos los datos presentan un
comportamiento similar al de la muestra de
sangre utilizada. Se realizó un estudio en el tiempo
del proceso de coagulación para saber si el
almacenamiento de la emulsión a través de los
días generaría alguna alteración en dicho proceso
fisiológico, lo cual no se presentó. Además, es
importante observar que para ninguna de las
mediciones se obtuvo un valor por debajo o
superior al valor R especificado a nivel clínico (4-8
min). De esta manera se puede afirmar que la
emulsión no va a generar ningún tipo de
coagulopatía.
3.1.3 Citotoxicidad en Células Vero y
Macrófagos
Debido a que la prueba se realizó con dos tipos
celulares diferentes, primero se muestran los
resultados obtenidos con las células Vero y luego
con los macrófagos.
Para garantizar que en cada pozo se depositaran
100.000 células Vero, la cuantificación de éstas, se
hizo por medio de la Cámara de Neubauer o
hemocitómetro, instrumento de vidrio óptico [51].
Después de someter las células a los diferentes
tratamientos, a las 24 horas se visualizaron en un
microscopio invertido con el fin de observar si se
habían presentado cambios en su morfología, tal y
como se muestra en la Figura 11, la forma de las
células no varía respecto a la referencia de la ATCC
(Ver Figura 10).
Figura 10: Morfología descrita por la ATCC de las células
Vero. Imagen de la izquierda con baja densidad celular y la de la derecha con alta densidad [52]
Figura 11: Visualización en un microscopio invertido a 20X
A. Control negativo del ensayo de citotoxicidad para células Vero. B. Tratamiento de las células Vero con emulsión de
PFOB
El cambio en la tonalidad de la Figura 11.A
respecto a la Figura 11.B se debe a que el PBS 1X,
solución empleada en el control negativo, por no
causar ningún tipo de daño en la célula, es
transparente y permite mejor el paso de luz del
microscopio; mientras que la emulsión es blanca y
no translúcida, razón por la cual genera un
ambiente turbio y cambio en el tono de la
reflexión de la luz. Además, en la Figura 10.B se
puede apreciar que las células se encuentran
adheridas y en monocapa, indicando que la
emulsión de PFOB no causó ningún efecto en su
morfología ni en su metabolismo.
En la Figura 12 se puede apreciar la microplaca que
se obtuvo al finalizar la prueba de MTT con células
Vero, hay que tener en cuenta que ésta se hizo 3
veces por ensayo y además se realizaron 3
réplicas. El control negativo indica que no va a
generar muerte celular; mientras que el control
positivo, provoca la muerte celular.
Figura 12: Prueba de MTT en células Vero para la
evaluación de citotoxicidad de la emulsión de PFOB. C+: Control positivo, C-: Control negativo, E: Emulsión de PFOB.
FA: Fase acuosa de la emulsión, es decir, sin PFOB.
Para conocer la viabilidad celular de cada uno de
los tratamientos, se procedió a calcularla teniendo
en cuenta las absorbancias obtenidas de la lectura
de la microplaca. Para esto se empleó la siguiente
relación:
𝑉𝐶 =𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙×100 (𝐸𝑐. 2)
Siendo, 𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 la absorbancia obtenida de la
muestra y 𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 la absorbancia del control
negativo, en la cual no se murió ninguna célula. De
esta manera se obtuvo los resultados reportados
en la Tabla 3.
Tabla 3: Resultados de la prueba de citotoxicidad en células Vero para la emulsión de PFOB
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3
Viabilidad celular
93.06% +/- 0.27
94.68 +/- 0.18
92.74% +/- 0.09
En la Tabla 3, se puede apreciar que se cumple con
la norma ISO10993, ya que en ninguno de los casos
se obtuvo una viabilidad celular menor al 80%,
indicando que ninguno de los componentes de la
emulsión de PFOB es citotóxico, por lo cual no
generó muerte celular.
Los macrófagos fueron extraídos directamente de
una muestra de sangre humana, estas células son
monocitos (tipo de glóbulos blancos) y hacen parte
del sistema inmunológico del organismo [53].
Debido a que se trató de un cultivo primario, se
adicionaron 40.000 células en cada uno de los
pozos de la microplaca, esto se garantizó haciendo
uso de la Cámara de Neubauer o hemocitómetro
[51]. Para cuantificar la viabilidad celular se midió
la intensidad del color morado, entre más intenso
sea el color, mayor cantidad de células
metabólicamente activas habían (Ver Figura 13).
Figura 13: Prueba de MTT en macrófagos para la evaluación
de citotoxicidad de la emulsión de PFOB
Hay que tener en cuenta que, al tener menor
cantidad de células por pozos, se van a formar
menor cantidad de cristales morados, debido a
que esto es proporcional a la cantidad de
mitocondrias activas que hayan, por tal motivo la
intensidad del morado en este tipo de células es
menor que en la prueba realizada con células
Vero. Esto no indica que la emulsión sea citotóxica,
ya que los controles también registraron una
tonalidad más clara. Los resultados cuantitativos
son reportados en la Tabla 4, los cuales fueron
calculados teniendo en cuenta la Ec.2.
Tabla 4: Resultados prueba de citotoxicidad en macrófagos para la emulsión de PFOB
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3
Viabilidad celular
89.96% +/- 0.005
93.08 +/- 0.08
92.55% +/- 0.01
En la Tabla 4, se puede apreciar que se cumple con
la norma ISO10993, ya que en ninguno de los casos
se obtuvo una viabilidad celular menor al 80%,
indicando que ninguno de los componentes de la
emulsión de PFOB es citotóxico, por lo cual no
generó muerte celular.
3.2 Fase 2: Transporte de oxígeno en el interior
de la emulsión de PFOB
El oxígeno (O2) es un elemento esencial para el
metabolismo celular y tisular del organismo. A
nivel clínico, la medida de la pO2 indica la tensión
de oxígeno en la sangre arterial, refleja la presión
o fuerza de conducción para transportar el
oxígeno de un lugar al siguiente, debido a
diferencias en la presión [31].
Hay que tener en cuenta que, por el método
empleado, la base de las mediciones es la
hemoglobina, la cual es una proteína tetramérica
contenida en los glóbulos rojos, conformada por
dos pares de cadenas de polipéptidos, donde cada
cadena tiene un grupo hemo que contiene un
átomo de hierro, elemento encargado de hacer
enlace con el oxígeno. Cada molécula de
hemoglobina puede enlazar cuatro moléculas de
O2, una en cada grupo hemo. La hemoglobina
desempeña el papel principal en el transporte de
oxígeno desde los pulmones hacia los tejidos y en
el transporte del dióxido de carbono desde los
tejidos hacia los pulmones [31]. La capacidad de la
hemoglobina para enlazar y soltar oxígeno
depende de varios factores: pH, pCO2, pO2,
concentración de 2, 3-difosfoglicerato y
temperatura [54]. Debido a que se empezó a
burbujear oxígeno, a través del tiempo la pCO2
disminuyó hasta 0, debido al desplazamiento que
hacen las moléculas de O2, por tal motivo, éste no
fue un factor que incidió en la capacidad de la
hemoglobina. El pH por su parte, varió a través del
tiempo y de la mezcla analizada, dichos valores
son mostrados en la Figura 14.
En la Figura 14 se puede observar que a mayor
cantidad de emulsión de PFOB que se agregue
menor va a ser el pH, tomando un valor cercano al
pH fisiológico deseado, el cual se encuentra en un
rango entre 7.35 y 7.45 [55], indicando que el
buffer de fosfatos que compone la fase acuosa de
la emulsión puede servir como sustancia
amortiguadora del pH de toda la solución, razón
por la cual la sangre, al estar aislada de todo el
ambiente fisiológico, no tiene ningún mecanismo
para regular esta propiedad, además que se está
desplazando todo el CO2 existente por la acción
del burbujeo con O2.
Figura 14: Valores registrados para el pH de cada una de las
muestras analizadas a través del tiempo
Este cambio de pH en la sangre puede modificar
ligeramente la estructura de la hemoglobina,
incidiendo, en su capacidad de transportar
oxígeno. En 1904, el científico danés Christian
Bohr notó que la hemoglobina enlaza el oxígeno
más fuertemente a pH alto que a pH bajo. Este
fenómeno se llama efecto Bohr, y tiene que ver
con la capacidad de la hemoglobina para recoger
o donar iones de hidrógeno. A medida que el pH
aumenta, la hemoglobina pierde iones de
hidrógeno de aminoácidos específicos en sitios
clave de su estructura, y esto genera un cambio
sutil en su conformación, aumentando su
capacidad para unir oxígeno. Cuando el pH cae,
sucede lo contrario: la hemoglobina recoge los
iones de hidrógeno y su afinidad por el oxígeno
disminuye [56]–[58].
Lo anterior indica que, a los valores de pH
obtenidos para la sangre, ésta va a poder capturar
mayor cantidad de oxígeno, generando enlaces
más fuertes, dificultando su entrega a las
diferentes células del organismo, ya que para
liberarlo necesita de pH más bajos. Además, hay
que tener en cuenta que el enlace que se forma
entre el átomo de Fe de la hemoglobina y el O2, es
un enlace covalente, una de las interacciones
químicas más fuertes, por lo cual el cuerpo
requiere de un gasto energético mayor.
Debido a que se espera que la emulsión de PFOB
sea útil en momentos en los que la sangre ya no
sea capaz de suministrar adecuadamente oxígeno
a los tejidos, como en el caso de un infarto de
miocardio o un accidente cerebrovascular; se
realizó la medición de la presión parcial de oxígeno
(pO2) para verificar si la emulsión ayudaba a
mejorar el transporte de este gas, esto puede ser
visto en la Figura 15.
Figura 15: Presión parcial de oxígeno obtenida durante 60
minutos de burbujeo de oxígeno
En la Figura 15, se puede evidenciar que a pesar
que la sangre tuvo un mayor pH, lo cual mejora su
capacidad de captación de oxígeno, no logró tener
un mejor rendimiento que las mezclas con
emulsión, que como era de esperarse, a mayor
cantidad de emulsión de PFOB, mayor pO2 se
obtuvo; comprobando que sí es un buen captador
y transportador de oxígeno.
Hay que tener en cuenta que el PFOB es un
transportador pasivo del oxígeno, es decir, no
imita la funcionalidad de la hemoglobina, ya que
este componente no genera enlaces covalentes
con el gas, sino que forma fuerzas electrostáticas
de Van der Waals, las cuales son un orden de
magnitud más débiles que el enlace covalente
entre el O2-Fe de la hemoglobina. Además, la
disolución obedece a la ley de Henry, es decir, que
es directamente proporcional a la presión parcial
del oxígeno, por lo tanto, a mayor presión va a
entregar más fácil el oxígeno a las diferentes
células, ya que no depende de ningún cambio
conformacional o de la ayuda de un efector
alostérico, tampoco depende del pH o de la
temperatura [8].
Cuando hay hemoglobina y PFOB presentes
simultáneamente en la circulación, el PFOB
liberará primero su carga de oxígeno, conservando
así el O2 unido a la proteína, esto se debe a que el
organismo necesita de un menor esfuerzo para
poder restablecer sus condiciones normales, ya
que no necesita invertir energía rompiendo los
enlaces fuertes de la hemoglobina con el oxígeno
para hacer el suministro de este gas y la puede
invertir en otros metabolismos; no hay que
olvidar, que la emulsión de PFOB se usa cuando el
cuerpo tiene un déficit de sangre y necesita de una
transfusión.
Otro parámetro que se empleó para conocer la
efectividad de la emulsión, fue calcular el
porcentaje de saturación de oxígeno, para esto se
hizo uso de las ecuaciones 3 y 4 [31]:
𝑆𝑂2 =𝑁4 − 15𝑁3 + 2045𝑁2 + 2000𝑁
𝑁4 − 15𝑁3 + 2400𝑁2 − 31100𝑁 + 2.4×106×100 (𝐸𝑐. 3)
Donde:
𝑁 = 𝑝𝑂2×10[0.48(𝑝𝐻(37)−7.4)−0.0013𝐵𝐸(𝐵)] (𝐸𝑐. 4)
Siendo BE(E), el exceso de las bases en la sangre in
vitro, este parámetro estima la cantidad de ácido
o de bases necesarias para titular un litro de
sangre a un pH normal de 7.40 [31]. Los valores
que se obtuvieron se muestran en la Figura 16, en
la cual es posible observar que las mezclas de
emulsión con sangre se saturan más rápido que la
sangre sola, indicando que la emulsión de PFOB va
a suministrarle oxígeno a la hemoglobina,
haciendo que se sature más rápido, hay que tener
en cuenta que el equipo se basa específicamente
en dicha proteína. Con sólo 10 minutos de
burbujeo de oxígeno, las mezclas de sangre con
emulsión ya están saturadas con el gas, mientras
que la sangre sola toma casi 40 minutos en
hacerlo.
Figura 16: Porcentaje de saturación de oxígeno en cada una
de las muestras estudiadas
Como se había mencionado anteriormente tanto
la captación como la liberación de oxígeno por
parte de la hemoglobina, se ve afectada por las
condiciones del entorno, esto puede ser
observado en la Figura 17, donde se evidencia un
comportamiento sigmoideo de la curva de
disociación, esto también fue visible a nivel
experimental (Ver Figura 18).
En la Figura 18 es evidente que la sangre tiene el
mismo comportamiento que se evidencia en la
literatura, indicando que a menores presiones se
satura mucho rápido que la emulsión, es decir, que
no tiene la capacidad para seguir atrayendo
moléculas de oxígeno; lo cual no sucede con la
emulsión de PFOB, que al tener un
comportamiento lineal puede seguir atrayendo
más moléculas del gas de interés.
Figura 17: Curva de disociación de oxígeno de la
hemoglobina, con su respectiva modificación según el pH del entorno [59]
Figura 18: Curva experimental de la disociación del oxígeno para las diferentes muestras analizadas.
Aunque se esperaba que la pendiente de la recta
que se forma antes de llegar a la saturación del
100% fuera mayor, a mayor cantidad de emulsión
en la mezcla, esto no fue posible obtenerlo
experimentalmente, pues tal como se muestra en
la Tabla 5, la mezcla que mayor pendiente obtuvo
fue la mezcla 80:20, aunque la mezcla 70:30 fue
con la que se obtuvo la mayor presión parcial de
oxígeno, llegando casi hasta 700 mmHg.
Tabla 5: Relación de la pendiente de la recta obtenida en la curva de disociación de oxígeno
Muestra Pendiente
Sangre:Emulsión (90:10) 0.2155
Sangre:Emulsión (80:20) 0.2676
Sangre:Emulsión (70:30) 0.2337
Lo anterior indica que la emulsión de PFOB si
mejora el transporte de oxígeno y lo más
importante es que no se ve afectada por las
condiciones de su entorno para realizar la
captación y/o entrega de las moléculas de
oxígeno.
Los datos de presión parcial de oxígeno fueron
sometidos a pruebas de análisis de varianza
(ANOVA) usando el software estadístico
GraphPad®. El nivel de significancia empleado fue
p ≤ 0.05, con éste se obtuvo los resultados que se
muestran en la Tabla 6.
Tabla 6: Resultados del análisis estadístico para el parámetro de presión parcial de oxígeno
Tiempo Tratamiento Significancia
0
Sangre Vs.90:10 No
Sangre Vs. 80:20 No
Sangre Vs. 70:30 No
10 20 30 40 50
Sangre Vs. 90:10 Si (****)
Sangre Vs. 80:20 Si (****)
Sangre Vs. 70:30 Si (****)
60
Sangre Vs. 90:10 No
Sangre Vs. 80:20 No
Sangre Vs. 70:30 Si (****)
De esta manera se puede concluir que la emulsión
si hace un aporte significativo en el transporte de
oxígeno y después de los 60 minutos la proporción
de sangre:emulsión que mayor aporte genera es la
de 70:30, cantidad que normalmente debería ser
usada en un caso de choque hemorrágico, donde
se pierde alrededor del 30% del volumen
sanguíneo.
3.3 Fase 3: Forma de almacenamiento de la
emulsión de PFOB
A continuación, se muestran los resultados las
propiedades físico químicas medidas en el
producto liofilizado.
3.3.1 Propiedades macroscópicas
Los resultados de las propiedades macroscópicas
que se nombraron en la Sección 2.3.1 son
mostrados a continuación.
I. Pérdida de peso
En la Figura 19 se muestran los 10 viales al inicio
del procedimiento, los cuales fueron almacenados
a 4°C y a 17°C (temperatura ambiente).
Figura 19: Viales de la prueba de pérdida de peso
Tras 90 días de seguimiento del peso de cada uno
de los viales, se pudo observar que no hay pérdida
de masa a través del tiempo, lo cual se puede
visualizar en la Figura 20, donde el día -2
corresponde al día de preparación de la emulsión,
y el día 0, la obtención del producto liofilizado;
luego continua su estudio de temporalidad.
A pesar de no registrar una pérdida de peso a
través del tiempo, el producto liofilizado presentó
cambios en su estructura, tanto los almacenados a
temperatura ambiente como a 4°C, esto puede ser
observado en la Figura 21.
Figura 20: Pérdida de peso a través del tiempo para
diferentes condiciones de almacenamiento
Figura 21: Estructura de los viales liofilizados, A. Recién liofilizado, B. Después de dos meses de almacenado a
temperatura ambiente y C. Liofilizado almacenado durante dos meses a 4°C
Debido a que no hubo pérdida de peso, ni
aumento en la humedad del producto (ver Figura
33); dicho cambio se asoció a un cambio
estructural termodinámico, aspecto que será
analizado en la Sección 3.2.2.
II. Viscosidad
En la Figura 22 se indica el comportamiento que
tuvo la viscosidad de la solución reconstituida en
solución salina (cloruro de sodio 0,9%) a través del
tiempo.
Figura 22: Relación entre la viscosidad de la solución reconstituida en solución salina 0.9% y el tiempo de
almacenamiento del producto liofilizado
En la Figura 22 es posible observar que la
viscosidad no se mantiene constante,
encontrándose por debajo del rango normal de la
sangre en todas los días medidos, aunque hay que
tener en cuenta que este tipo de soluciones se va
a utilizar cuando se ha presentado una pérdida
considerable de volumen de la sangre, haciendo
necesaria una transfusión, en este caso, la
disminución de glóbulos rojos también reduce la
viscosidad de la sangre a un promedio de 2 cP
haciendo que los reconstituidos puedan ser
suministrados cuando haya una disminución del
22% del nivel normal de dichas células [60].
También hay que tener cuenta que cuando no hay
recursos sanguíneos, se emplean solamente los
expansores plasmáticos, los cuales tienen una
viscosidad similar a la del agua (1 cP), como se
muestra en la Tabla 7, valores obtenidos
realizando una prueba de flujo y reportando el
valor de la viscosidad a 100/s.
Tabla 7: Valores obtenidos para la viscosidad de cada uno de los expansores plasmáticos
Expansor plasmático Viscosidad @100/s
[cP]
Cloruro de sodio (0,9%) 1,244
Dextrosa (10%) 1,467
Lactato de Ringer 1,223
HES (6%) 2,241
Teniendo en cuenta dichos valores de la viscosidad
de los expansores plasmáticos, fue importante
conocer cómo se iba a comportar la solución
reconstituida con diferentes expansores, los
resultados obtenidos, son mostrados en la Figura
23.
Figura 23: Viscosidad registrada a 100 (1/s) en una prueba
de flujo para la solución reconstituida con diferentes expansores plasmáticos
La solución reconstituida tuvo una mayor
viscosidad con el HES, debido a que éste por sí
solo, también reporta la mayor viscosidad,
característica que es otorgada por ser un polímero
formado por polisacáridos del almidón de maíz y
por su gran peso molecular, mientras que los otros
expansores son soluciones de electrolitos en agua
[61].
3.3.2 Propiedades microscópicas
A continuación, se muestran los resultados
obtenidos en cada una de las propiedades
microscópicas analizadas tanto para el producto
liofilizado como para su respectiva solución
reconstituida.
I. Estructura del liofilizado
Como se mostró en la Figura 21, el producto
liofilizado cambia su aspecto a través del tiempo y
según la temperatura de almacenamiento. Para
conocer que sucedía se procedió a observar a nivel
microscópico la estructura de las pastillas
liofilizadas. En la Figura 24, se muestran las
imágenes que se obtienen con un microscopio de
barrido electrónico.
Figura 24: Cambio estructural en el producto liofilizado a diferentes condiciones y tiempo de almacenamiento (A) Producto con 3 días de almacenamiento a 4°C, (B) Producto liofilizado con 90 días de almacenamiento a 4°C y (C) Producto liofilizado con 90 días de almacenamiento a 17°C
En la Figura 24.A se puede observar que aún se
conservan las gotas producto del proceso de
emulsificación, pero al ser este un sistema de
inestabilidad termodinámica [46], las gotas
empiezan a unirse cuando pasa el tiempo (ver
Figura 24.B), fenómeno que se ve favorecido con
la temperatura (ver Figura 24.C), ya que a
temperatura ambiente (17°C) a los 90 días, las
gotas están completamente fusionadas en una
sola gran gota. Al empezarse a unir las gotas, se
empezó a reducir el espacio y por ende el tamaño
de la pastilla liofilizada que se obtiene en un
comienzo.
Para que el proceso de liofilización brinde la
característica de estabilidad que se desea, es
necesario hacer uso de crioprotección o
lioprotección, los primeros son compuestos que
trabajan en conjunto con los fosfolípidos (lecitina
de huevo) que recubren la gota de aceite en el
proceso de congelación, mientras que los
segundos generan la protección en el proceso de
secado de la muestra [46], [62]. Esto es debido a
que no se conoce, en qué etapa del proceso de
liofilización se presenta la tensión y el estrés de la
bicapa lipídica, generando que se desestabilice el
sistema coloidal [63].
II. Tamaño de partícula
En la Figura 26 se puede apreciar que se obtienen
tamaños de partícula inferiores a 400 nm sin
importar el expansor plasmático que se emplee, ni
el tipo de agitación al cual se someta. La agitación
mecánica se realizó a 1500 rpm durante 10 min.
Con los datos de la Figura 26.C se puede observar
que no es necesario realizar el proceso de
microfluidización (gasto energético) para obtener
un tamaño de partícula de escala nanométrica, sin
requerir ni siquiera de agitación mecánica; en
otros estudios también se ha demostrado que la
liofilización genera tamaños de partícula
pequeños [64], [65].
Los resultados de las Figuras 26.A, 26.B y 26.C,
indican que la solución reconstituida en cualquier
expansor plasmático, podría realizar la difusión del
oxígeno y de los nutrientes desde la sangre hasta
los tejidos, al igual que de los productos de
desecho de los diferentes metabolismos, desde los
tejidos hacia la sangre [66].
Figura 25: Tamaño de partícula de la solución reconstituida
de un producto liofilizado. A. Con 30 días de almacenamiento a 4°C. B. Con 120 días de almacenamiento a
4°C. C. Con 5 días de almacenamiento a 4°C y sin microfluidizar.
Otra característica importante a evaluar es la
temperatura de almacenamiento, en la Figura 26
se mostró los tamaños de partícula obtenidos para
los viales almacenados a 4°C, en la Figura 27 se
encuentran los resultados obtenidos para los
viales conservados a temperatura ambiente
(aproximadamente 17°C) durante 120 días, en
estos no fue posible evaluar la opción de agitación
manual, debido a que el producto liofilizado no se
disolvió inmediatamente en la solución agregada
como reconstituyente. Además, la agitación
mecánica se realizó durante 16 minutos a 1500
rpm, esto se debe a la conformación compacta
que se puede observar en la Figura 21.B y 24.C,
generando que el medio acuoso incorporado no
pueda entrar en la estructura porosa que se tiene
en un comienzo.
Figura 26: Tamaño de partícula de la solución reconstituida de un producto liofilizado almacenado aproximadamente a
17°C durante 120 días
Aunque fue necesario agitar mecánicamente
durante más tiempo, reconstituir los viales
almacenados a temperatura ambiente también
generan un tamaño de partícula que cumple con
los parámetros fisiológicos. Se hace necesario
evaluar si el uso de crioprotectores o
lioprotectores mejorarían la solubilidad del
producto en los expansores plasmáticos.
Un tamaño de partícula del PFOB inferior a 0,5 𝜇𝑚
facilita el transporte de oxígeno en el interior del
cuerpo y evita la fagocitosis más fácilmente que las
partículas grandes, lo que resulta en mayor
persistencia intravascular y menores efectos
secundarios [8]; esto hace que nuestro producto
liofilizado cuente con buenas características para
ser usado como hemosustituto.
3.3.3 Propiedades moleculares
Es de gran importancia conocer el
comportamiento microscópico del producto
liofilizado, las interacciones atómicas que se están
presentando en su interior.
I. pH
Luego de liofilizar y reconstituir la solución en
solución salina (cloruro de sodio 0,9%), se
obtienen valores de pH en un rango de valores
entre 7.7 y 7.9 a largo del tiempo, como se observa
en la Figura 28.
En la Figura 28, se puede observar que los valores
obtenidos de pH son superiores al pH de la sangre.
Lo cual, generaría una reacción negativa en el
organismo, debido a que el cuerpo humano no
tiene la capacidad efectiva de regulación celular
para un pH alto, ya que el organismo mantiene el
equilibrio ácido-base procedente de la dieta, el
metabolismo y los medicamentos, por medio de la
regulación a nivel celular. El metabolismo genera
iones de hidrógeno H+ y la concentración de estos
influye en diversos procesos enzimáticos del
organismo, es por tal motivo que el cuerpo solo
tolera una fluctuación de pH entre 6.8 y 7.8, siendo
el intervalo óptimo entre 7.35 y 7.45, que
corresponde al pH de la sangre [55].
Figura 27: Resultados obtenidos de la estabilidad en el
tiempo del pH de un vial reconstituido con solución salina
Hay que tener en cuenta que el uso de esta
solución reconstituida es para ser un soporte para
la hemoglobina en su función de transporte de
oxígeno en casos de transfusión, es por tal motivo
que los valores que se están obteniendo de pH no
son deseables, ya que esto puede generar una
cadena de reacciones inmunológicas si es
incorporado en el cuerpo humano, tales como:
sobrexcitación del sistema nervioso central y
periférico, hiperventilación, nerviosismo, espasmo
muscular, convulsiones, pérdida de conciencia y
en algunos casos puede llegar hasta la muerte
[44].
Cuando se presenta un pH alto, se atribuye a un
exceso de bicarbonato en la sangre, para esto el
cuerpo tiene mecanismos de control respiratorios,
debido a que se presenta un déficit de ácido
carbónico y una presión parcial de CO2 menor de
35 mmHg, efecto que no es favorable en una
intervención quirúrgica, la compensación
respiratoria consiste en una supresión para
retener CO2. Además, existe el control renal del
equilibrio ácido-base, el cual por medio de la orina
conserva el ion H+ y excreta el ion bicarbonato,
siendo el regulador más efectivo de pH, el
problema radica en que dura varias horas o días
tratando de corregir dicho desequilibrio en el
organismo [55].
También se analizó el comportamiento del pH
según el tipo de expansor plasmático que se
utilizara como reconstituyente, estos valores se
pueden apreciar en la Figura 29, en la cual se
observa que, para todas las soluciones, el pH se
encuentra por encima de 7 e inferior 8, dicho valor
no sufre variaciones sí durante el proceso de
emulsificación se microfluidiza o no la emulsión a
liofilizar.
Figura 28: pH registrado para la solución reconstituida con
diferentes expansores plasmáticos
II. Humedad
El contenido de humedad fue medido en el
Coulómetro, obteniendo un porcentaje de
contenido de agua de 0,01% (ver Figura 33). Valor
que se mantiene a través del tiempo de
almacenamiento del producto liofilizado. Lo
anterior garantiza que empacar al vacío y sellar los
viales, es una buena estrategia para conservar el
producto. Además, que el proceso de liofilización
es efectivo para retirar todo el contenido de agua
de la muestra.
Figura 29: Resultados obtenidos del contenido de humedad
en los viales del liofilizado a través del tiempo
III. Contenido de PFOB en el liofilizado
Para garantizar que el producto liofilizado va a
cumplir con su función de hemosustituto como
transportador de oxígeno, es necesario conocer sí
en su interior queda contenido el PFOB,
componente que presenta alta solubilidad de los
gases respiratorios [7], [8], [37].
A continuación, se muestran los resultados
obtenidos para cada una de las pruebas realizadas.
A. Prueba de iones fluoruro
La medición de iones fluoruro (F-) se realizó con el
fin de verificar la presencia de PFOB en la solución
reconstituida. Los resultados indican que la
emulsión de PFOB antes de liofilizar contiene 4.38
mg/L de F-, mientras que la solución reconstituida
en solución salina tiene 2.22 mg/L F-, lo cual puede
indicar que durante el proceso de liofilización se
sobrepasa el punto eutéctico del PFOB haciendo
que se evapore junto con el agua que es retirada,
por lo que la lecitina no está recubriendo
eficazmente las gotas del perfluorocarbono, razón
por la cual se hace necesario el estudio de
liofilización con crioprotectores y lioprotectores.
B. Prueba de espectrofotometría
La prueba espectrofotométrica se realizó por
duplicado para viales almacenados a 4°C durante
5 días, cuya diferencia radicó si durante el proceso
de emulsificación se microfluidizó o no. Los
resultados que se obtuvieron se muestran en la
Figura 34.
Figura 30: Cantidad de PFOB obtenido en el producto
liofilizado
Para calcular la cantidad de PFOB en el producto
liofilizado, primero fue necesario realizar una
curva de calibración con concentraciones (p/p)
conocidas de PFOB y haciendo uso de la ley de
Lambert-Beer se obtuvo una relación entre la
absorbancia y la concentración de emulsiones de
PFOB, obteniendo de esta manera los gramos de
perfluoro-octilbromuro que se muestran en la
Figura 34. Hay que tener en cuenta que los gramos
iniciales con los que se comenzó el proceso de
liofilización, fueron de 0,8685 g, los cuales fueron
calculados con la densidad del PFOB (1,93 g/ml
[67]) y el volumen agregado a cada vial (1,5 mL).
Con el dato anterior, se puede corroborar que hay
pérdida de PFOB durante el proceso de
liofilización, la eficiencia de dicha etapa es
mostrada en la Figura 35 y fue calculada como se
muestra en Ec.5
%𝐸𝑓 =𝑔 𝑃𝐹𝑂𝐵 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑙𝑖𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑟
𝑔 𝑃𝐹𝑂𝐵 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑙𝑖𝑜𝑓𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑟×100% (𝐸𝑐. 5)
La Figura 35 indica que el proceso de liofilización
no es una etapa eficiente, por tal motivo, es
necesario hacer uso de crioprotectores y
lioprotectores para evitar que se presente pérdida
de PFOB.
Figura 31: Eficiencia del proceso de liofilización para
productos sometidos a microfluidización y a los que no se microfluidizaron durante el proceso de emulsificación
C. Análisis elemental (EDS) - Microanálisis
Otra de las pruebas realizadas para verificar la
existencia de PFOB en la muestra liofilizada fue el
análisis cuantitativo elemental (EDS), para esto, se
tomó una sección de la pastilla que se observó en
SEM y se analizó sobre esa superficie, la cantidad
de elementos químicos que se encontraban allí, se
presentan en la Tabla 7.
Tabla 8: Resultados del análisis elemental realizado al producto liofilizado. Muestra A corresponde a una muestra liofilizada almacenada a 4°C durante 3 días. Muestra B corresponde a una muestra liofilizada almacenada a 17°C durante 90 días.
Elemento químico Cantidad del elemento (%)
Muestra A Muestra B
C 74.95 74.50
O 18.33 19.86
F 6.69 5.61
Na 0.02 0.02
K 0.01 0.01
La Tabla 7 indica que el análisis elemental no varía
con el tiempo ni con la temperatura de
almacenamiento, siendo despreciable la variación
que se obtiene de cada uno de los átomos.
Cabe resaltar que el carbono es el más abundante
debido a que es el elemento principal tanto del
PFOB como de la lecitina de huevo. El flúor es el
componente que nos indica la presencia del
perfluorocarbono, debido a que es el único átomo
presente en dicho compuesto. Los demás
elementos están presentes en la fase acuosa.
IV. CONCLUSIONES
La emulsión de PFOB puede ser suministrada vía
intravenosa debido a que no se evidenció que
pueda generar ningún tipo de coagulopatía, ya que
no altera el tiempo de reacción R. Además, no
tiene efecto de lisis de los glóbulos rojos,
indicando que no es hemolítico; características
que lo hacen un producto hemocompatible. Por
otro lado, también es biocompatible, ya que no
produjo necrosis ni apoptosis de las células Vero,
ni en los macrófagos, ya que se obtuvo para ambos
casos una viabilidad celular mayor al 90%.
Estadísticamente se pudo evidenciar la diferencia
significativa que genera en la presión parcial de
oxígeno, el complemento que hace la emulsión en
la sangre en un caso de choque hipovolémico,
pérdida del 30% del volumen sanguíneo.
Indicando que la emulsión cumple su función de
transportar eficientemente O2, llegando a una
saturación del 100% en menos tiempo en
comparación con la sangre, sin verse afectado por
las condiciones del ambiente en el cual se
encuentre, por ejemplo, el pH. Además, su
comportamiento lineal hace que tenga mayor
capacidad para transportar oxígeno y que no se
sature rápidamente.
La opción que se planteó para mejorar la
estabilidad en el tiempo de la emulsión de PFOB,
fue emplear la liofilización. Haciendo uso de dicha
técnica, no fue posible mantener sus propiedades
fisicoquímicas estables en el tiempo, por lo cual se
plantea el uso de crioprotectores o lioprotectores
que cumplan la función de proteger las gotas de
PFOB, para que no se sublime durante el proceso
de liofilización y se pueda conservar su estructura.
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