Estudio de la expresión de plásmidos de ADN y su respuesta inmune en un modelo murino

Trabajo de Grado presentado para optar al título de Magíster en

Biología

Por: Lina María Ruiz Hincapié

Asesores:

Sergio Orduz Peralta1 Biólogo, PhD

Gemma Armengol Rosell1 Bióloga, PhD

Unidad de Biotecnología y Control Biológico

Corporación para Investigaciones Biológicas1

Instituto de Biología - Posgrado

Universidad de Antioquia2

Medellín, Noviembre de 2003

Unidad de Biotecnología y

Control Biológico

• Desarrollo de tecnología para el control de plagas de la agricultura por medio de la bacteria Bacillus thuringiensis y del hongo Trichoderma.

• Además trabaja en la búsqueda de estrategias para el control biológico de mosquitos transmisores de enfermedades como el dengue y el paludismo con el uso de Bacillus thuringiensis y de insectos de la familia Notonectidae.

• Con el objeto de ampliar el enfoque biotecnológico la Unidad se interesa en el control de garrapatas mediante vacunación genética.

Justificación

Producción

Pérdidas económicas

Enfermedades

hemoparasitarias

Resistencia químicos

Contaminación

-carne y leche

-fuentes de agua

Boophilus microplus

• Intestino glicoproteína Bm86

• Bm86 confiere una inmunidad diferente a

la adquirida en forma natural.

• Anticuerpos anti-Bm86 actúan

directamente sobre la garrapata afectando

principalmente el intestino en las formas

adultas, su peso, número de huevos puestos,

así como la supervivencia de los huevos,

larvas y adultos.

Inmunización Bm86 recombinante

• Altamente eficaz en el control de la infestación por B. microplus.

• Reducción del uso de acaricidas y la transmisión de babebiosis.

• Estos beneficios podrían aumentarse al disminuir los costos de producción y distribución, con una vacuna estable a temperatura ambiente.

• Es de gran interés para la UBCB, estudiar nuevas alternativas de inmunización contra B. microplus.

Vacunación Genética

-Ventajas-

• Control de numerosas enfermedades infecciosas, alergias y cáncer, entre otras.

• Inducción de respuesta inmune humoral y celular.

• Eliminación de los riesgos asociados a la generación de epidemias.

• Fácil produción y gran estabilidad a temperatura ambiente, lo que facilita su distribución y disminuye los costos.

Plásmidos como VECTORES para

vacunas: Nueva era en la vaccinología.

2475

Pst1 Sal1 Pml1 Bcl1 EcoRV Not1 Xba1 BstN1 Nar1 BamH1 Bgl2

CMV IE 5 ́ UT

MCS

pUC18

VR1012

4915 bp

CMV Promotor/

potenciador250

TXT Sitio de

inicio 919

2475

Pst1 Sal1 Pml1 Bcl1 EcoRV Not1 Xba1 BstN1 Nar1 BamH1 Bgl2

CMV IE 5 ́ UT

MCS

Term BGH pUC18

VR1012

4915 bp

Resistencia Kanamicina

Plásmido ADN

núcleo

Tejido muscular

Inoculado

péptidos

proteína

ARNm

Ag. LB

Citoquinas Th2

TCR CMH II

CPA

local

LTA R. I. Humoral

LB LB

Anticuerpos

LB activado

Citoquinas Th1

LTA

CMH I

R. I. Celular

Memoria

LTC

LTC

LTC LTC

LTC

Receptor citoquinas

LTC activadas

Aún se requieren estudios que

permitan aclarar: ¿...?

• Cómo es el transporte del plásmido?

• Persistencia del plásmido en los

tejidos?

• Distribución del plásmido en los tejidos?

• Por cuánto tiempo se mantienen los

altos títulos de anticuerpos?

Primera Parte

Objetivos

• Evaluar la presencia y el tiempo de vida media del plásmido pSO2C1, que codifica para el gen cry11Bb, en tejido muscular de ratones inmunizados con pSO2C1, mediante hibridización in situ y PCR.

• Analizar la expresión del gen cry11Bb y la respuesta inmune humoral en los ratones inmunizados con pSO2C1, por medio de inmunohistoquímica y ELISA, respectivamente.

ELISA

Ratón BALB/c entre 6

y 10 semanas.

Inyectados en los

quadríceps (i.m.) con

10 g de pSO2C1, a

las 0, 2 y 4 semanas.

Metodología

E. coli +

pSO2C1

Sangrado de la

cola. Sacrificados, disección de

quadríceps, mantenidos a -70oC

hasta su uso.

Hibridación in situ

Inmunohistoquímica

Aislación DNA

PCR

Secciones de 5 m en criostato

kan

CMV

promotor

EcoRV

cry11Bb

BamHI BGHpA

pSO2C1

pUC18

Detección de pSO2C1 en músculo de

ratón por hibridación in situ

*Sonda “pSO2C1” biotinilado por Nick translation *Detección fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina *Sustrato alcalino NBT/BCIP.

Ctr + Ctr -

Células HeLa infectadas

con el adenovirus tipo 2,

aprox. 10% son positivas

(azul-purpura).

Placas de tejido muscular

sin pSO2C1.

Distribución del plásmido pSO2C1

inyectado en el tejido muscular de ratón

70%

Distribución del plásmido pSO2C1

inyectado en el tejido muscular de ratón

20%

30%

Persistencia de pSO2C1 en el tejido muscular

después de 2 años de inoculación

PCR

Primers

específicos

cry11A y cry11B

Perfil térmico

94o, 5 min./ 94o,

45 seg

45o, 45 seg/ 72o,

1 min.

34 ciclos

72o, 6 min/ 4o,

16h

305

1500

1000

900

800

700

600

500

400

300

ADN músculo

ratón inoculado

con pSO2C1

1 ratón por fecha Extracción del ADN

muscular por la técnica

del fenol-cloroformo

pSO2C1 i.m. expresa la proteína Cry11Bb Inmunohistoquímica: Anticuerpo policlonal anti Cry11Bb (Ac. 1rio.),

anti IgG conjugado con peroxidasa (Ac. 2rio.). Revelado DAB.

40%

0% 4-40%

pSO2C1 i.m. expresa la proteína Cry11Bb

6%

6%

Respuesta inmune humoral de larga duración contra

la Cry11Bb expresada por pSO2C1 (n=7)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 3 5 7 14 22 30 38 47 56 65 73 81 90 104 119Tiempo después de la primera inmunización (semanas)

Tít

ulo

an

ti-C

ry1

1B

b

Grupo B Grupo C

103

102

ANOVA (F=90.06, p<0.05)

Duncan p<0.05

Grupo A

Conclusiones

• Mediante hibridación in situ y PCR se detectó

la presencia del plásmido pSO2C1 hasta dos

años después de la inoculación.

• La persistencia de la expresión del gen

cry11Bb en músculo es debida a la

estabilidad del plásmido pSO2C1.

• La ruta de inoculación intramuscular es

eficiente para obtener una fuerte respuesta

inmune humoral.

Hilleman: DNA Vectors. 1995. ANNALS of the NEW YORK ACADEMY of SCIENCE

CONTROVERSIAS GENERADAS

ENTORNO A LAS VACUNAS DE ADN

Segunda Parte

Objetivo

• Evaluar el nivel de anticuerpos, la clase de

inmunoglobulinas y el patrón de citoquinas

que predominan en la respuesta inmune de

ratones inmunizados con el plásmido pBMC2

que codifica para Bm86 mediante ensayos

inmunoenzimáticos.

Introducción

Boophilus microplus

línea colombiana

Hace parte del proyecto “Desarrollo de dos estrategias para el control de la garrapata Boophilus microplus”, financiado por COLCIENCIAS.

ARNm ADNc

bm86

10000

6000

4000

3000

2000

1000

MWM pVAX1 pBMC2 pSO2C1

pBMC2

XbaI BGHpA

Kan

pMB1 ori

CMV

promotor

bm86

E. coli +

pBMC2

pT7Blue

Cuantificaión

DNA

Fluorometría

Esquema de inmunización de ratones BALB/c,

hembras entre 6 y 8 semanas

Grupo Tratamiento

# 1 (n=9) PBS

# 2 (n=9) 10 µg pBMC2 i.m

# 3 (n=9) 10 µg pBMC2 i.d.

# 4 (n=9) 50 µg pBMC2 i.m

# 5 (n=9) 50 µg pBMC2 i.d

# 6 (n=6) GAVAC

# 7 (n=3) 100 µg pBMC2 i.m.

3 dosis 0, 2 y 4 semanas.

BALB/c

ELISAS: sueros, sobrenadante esplenocitos

Sangre

Bazo

esplenocitos

Quadriceps

Expresión

Bm86

SDS-PAGE Western-

blot

BD Pharmingen OptEIA

Nunc C8 StarWell Maxisorp

Bm86

HRP

OPD suero

IgG anti

raton HRP

anti-

isotipos

suero

detección

anti-

IL

suero

detección

20000 eventos por tratamiento

excitación

488 nm (FITC) a 514 nm

(IP) a 600 nm

Citometría de flujo

Proliferación celular

Incorporación BrdU

Anti-Bm86 Isotipos Ig

Interleuquinas

29

45

66

205

116

97

El análisis de los músculos de los ratones inmunizados con

pBMC2 permitió observar la expresión in vivo de Bm86

SDS-PAGE Solubilizado quadriceps Western Blot Inmunodetección de

Bm86 mediante antipéptidos de Bm86

Solubilizado quadriceps kDa

kDa

205

116

97

66

45

Bm86 (89 kDa)

Detección de anticuerpos anti-Bm86 inducidos por

pBMC2 (ELISA)

2 meses post-inóculo Antígeno de captura larvas de B. microplus homogenizadas Bm86

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

PBS 10 ug

pBMC2 id

50 ug

pBMC2 id

10 ug

pBMC2

im

50 ug

pBMC2

im

Tratamiento

Ab

sorb

an

cia

(49

0 n

m) *

*

ANOVA (F=8.75, *p=0.0001)

Dilución

Suero 1:10

Detección de anticuerpos anti-Bm86 inducidos

por pBMC2 (ELISA)

2 meses post-inóculo Antígeno de captura Bm86 acetona de GAVAC

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

PBS im 10 ug pBMC2

i.d.

50 ug pBMC2

i.d.

10 ug pBMC2

i.m.

50 ug pBMC2

i.m.

GAVAC

Tratamiento

Ab

so

rban

cia

(490 n

m)

Dilución 1:50

*

Tipificación de los isotipos totales de inmunoglobulinas en

suero (1:5000) de raton (n6) inmunizado con pBMC2 (2

meses post-inmunización).

2 meses post-inóculo

Absorbancia (490 nm) isotipos inmunoglobulinasa

Tratamiento IgG1

IgG2a

IgG2b

IgG3

IgM

IgA

Ig

Ig

PBS i.m.

1,599

0,889a

1,599

0,555a1

1,405

0,564a1

2,136

0,336a

1,143

0,421a

0,819

0,398a

1,206

0,569a1

0,399

0,253a

10 ug pBMC2 i.d.

2,273

0,046a

2,297

0,089b1

1,988

0,255a2b

2,394

0,013a

1,279

0,193a

0,729

0,088a

1,783

0,268a2b

0,395

0,089a

50 ug pBMC2 i.d.

2,015

0,280a

1,801

0,046a2b

1,806

0,092a3b

2,265

0,123a

1,057

0,132a

0,646

0,199 a

1,292

0,150a3b

0,298

0,102a

10 ug pBMC2 i.m.

2,079

0,301a

1,768

0,367a3b

1,691

0,244a4b

2,196

0,158a

1,338

0,357a

0,700

0,226a

1,401

0,322a4b

0,273

0,123a

50 ug pBMC2 i.m.

2,255

0,034a

2,311

0,100b2

2,302

0,046b

2,130

0,357a

1,642

0,373a

0,884

0,203a

1,890

0,264b

0,648

0,260a

id, vía intradermica; im, vía intramuscular. aValores medios dentro de cada columna con diferentes letras son significativamente

diferentes Duncan ( 0.05).

Cuantificación de citoquinas en sueros de ratones

sin diluir inmunizados con pBMC2

3 meses post-inóculo

0

100

200

300

400

500

600

700

IL-4 IL-5 IL-12 (p40) IFN-gamma

Co

nc

en

tra

ció

n (

pg

/mL

)

10 ug pBMC2 id

50 ug pBMC2 id

10 ug pBMC2 im

50 ug pBMC2 im

PBS

* *

*

Cuantificación de citoquinas a partir de

sobrenandantes de cultivos de esplenocitos

3 meses post-inóculo

0

100

200

300

400

500

600

10 ug

pBMC2

id

10 ug

pBMC2

id +

Bm86

50 ug

pBMC2

id

50 ug

pBMC2

id +

Bm86

10 ug

pBMC2

im

10 ug

pBMC2

im +

Bm86

50 ug

pBMC2

im

50 ug

pBMC2

im +

Bm86

Co

nc

en

tra

ció

n (

pg

/mL

)

IL-4

IL-5

IL-12 (p40)

IFN-gamma

*

Análisis de proliferación celular de esplenocitos

de ratones inmunizados con pBMC2

3 meses post-inóculo

Tratamiento

Porcentaje de

incorporación de

BrdU ***

10 g de pBMC2 i.d. 1.1

10 g de pBMC2 i.d. + Bm86 4.1

50 g de pBMC2 i.d. 8.4

50 g de pBMC2 i.d. +Bm86 39.7

10 g de pBMC2 i.m. 20.6

10 g de pBMC2 i.m. + Bm86 22.4

50 g de pBMC2 i.m. 9.9

50 g de pBMC2 i.m. + Bm86 63.9

*** Citometría de flujo

Conclusiones

• Los sueros de los ratones inoculados con el

plásmido pBMC2 a una concentración de 50

g por vía i.m. presentaron una densidad

óptica significativamente mayor a los sueros

de los ratones inoculados con PBS.

• En los ratones inoculados con el plásmido

pBMC2 no se encontró una respuesta inmune

polarizada, ya que presentó algunos rasgos de

Th1 y otros de Th2.

Conclusiones

• Estos resultados sugieren el potencial de la

inmunización genética para inducir una

respuesta inmune contra la garrapata bovina,

B. microplus.

• Los niveles de anticuerpos anti-Bm86 fueron

significativamente menores en los sueros de

ratones inmunizados con pBMC2 que los

inmunizados con GAVAC

• Experimentos en el modelo murino

pueden proveer información valiosa; sin

embargo, es muy importante utilizar un

modelo animal mas relevante.

Conclusiones

Tercera Parte

• Adaptación de codones para optimizar

una vacuna de ADN contra garrapatas

Introducción

• Las vacunas de ADN utilizan la maquinaria

del hospedero para la transcripción de genes

y la traducción de proteínas.

• La diferencia interespecífica del uso de

codones es uno de los principales obstáculos

en la inducción de una respuesta inmune

efectiva en la inmunización genética.

Objetivo

• Analizar la relación entre el uso de

codones en el gen bm86 de la

garrapata Boophilus microplus y su

expresión potencial en células de

bovinos.

Análisis estadístico

ni

1j

Xijni

1

XijRSCUij

Uso relativo de codones sinónimos

Gen bm86 649 codones

Frecuencia (Xij)= Nro. de codones aaij

total 649

ni codones alternativos 1 a 6

Por ejemplo, ni Phe = 2

Xij TTT Phe = 6 / 649 = 0.0092

Xij TTC Phe = 8 / 649 = 0.0122

RSCUTTT = 0.0092 = 0.859

(0.0092 + 0.0122)/2

RSCUTTC = 0.0122 = 1.140

(0.0122 + 0.0122)/2

Análisis estadístico

El índice de adaptación de codones (CAI) para un

gen es calculado como la media geométrica de los

valores del RSCU correspondiente a cada codon

usado en el gen.

CAI=CAIobs/CAImax donde

L1

IIRSCUCAIk

L

1k

obs

L1

IIRSCUCAImaxk

L

1k

max

Por ejemplo, los valores RSCU para el gen LLO91A en Listeria

RSCU1 -GGU (Gly)- =1.473 RSCU1max -GGU (Gly)- =1.473

RSCU2 -UAC (Tyr)- =0.596 RSCU2max -UAC (Tyr)- =1.404

RSCU3 -AAA (Gly)- =1.707 RSCU3max -AAA (Gly)- =1.707

RSCU4 -GAU (Gly)- =1.488 RSCU4max -GAU (Gly)- =1.488

RSCU5 -GGA (Gly)- =1.264 RSCU5max -GGA (Gly)- =1.473

RSCU6 -AAU (Gly)- =1.369 RSCU6max -AAU (Gly)- =1.369

RSCU7 -GAA (Gly)- =1.648 RSCU7max -GAA (Gly)- =1.648

RSCU8 -UAU (Gly)- =1.404 RSCU8max -UAU (Gly)- =1.404

RSCU9 -AUU (Gly)- =1.737 RSCU9max -AUU (Gly)- =1.737

CAIobs=raiz 9(1.473 x 0.596 x 1.707 x 1.488 x 1.264 x 1.369 x

1.648 x 1.404 x 1.737)

CAIobs=raiz 9 de 15.508 = 1.356

CAImax=raiz 9(1.473 x 1.404 x 1.707 x 1.488 x 1.473 x 1.369 x

1.648 x 1.404 x 1.737)

CAImax=raiz 9 de 42.573 = 1.517

CAI= CAIobs/ CAImax=1.356/1.517=0.894

Análisis estadístico La adaptabilidad relativa de un codon, Wij, es la frecuencia del

uso de ese codon comparada a la frecuencia del codon óptimo

para ese aminoácido.

Wij = RSCUij/RSCUmax

WTTT = RSCUTTT/RSCUmax= 0.859/1.140=0.753

WTTC= RSCUTTC/RSCUmax = 1.140 /1.140=1.000

L1

IIWCAIk

L

1k

L

1k

kWlnL

1expCAI

a

WW

e

)2ln()1ln(*

2

1

RESULTADOS

Valores del uso relativo de codones

sinónimos (RSCU) y la adaptabilidad

relativa de un codon (W) para los

codones de los genes bm86 de Boophilus

microplus y bsa de Bos taurus

RSCU > 1 el codon es usado mas

frecuentemente de lo esperado en un

organismo dado, y viceversa.

COD AA RSCU

bm86

W

bm86

RSCU

bsa

W

bsa

COD AA RSCU

bm86

W

bm86

RSCU

bsa

W

bsa

TTT Phe 0,856 0,753 1,467 1,000 GTG Val 1,095 0,821 1,587 1,000

TTC Phe 1,140 1,000 0,532 0,362 TCT Ser 1,403 1,000 0,942 0,499

TTA Leu 0,174 0,122 0,463 0,333 TCC Ser 0,422 0,300 1,126 0,597

TTG Leu 1,418 1,000 1,203 0,866 TCA Ser 1,266 0,902 1,885 1,000

CTT Leu 0,709 0,500 1,299 0,935 TCG Ser 0,697 0,496 0,183 0,097

CTC Leu 1,244 0,877 0,926 0,666 CCT Pro 1,289 0,902 1,008 0,638

CTA Leu 1,069 0,753 0,740 0,532 CCC Pro 0,280 0,195 1,298 0,822

CTG Leu 1,418 1,000 1,389 1,000 CCA Pro 1,429 1,000 1,578 1,000

ATT Ile 1,131 1,000 1,419 1,000 CCG Pro 1,000 0,699 0,140 0,088

ATC Ile 0,754 0,666 0,802 0,565 ACT Thr 0,784 0,693 1,532 0,866

ATA Ile 1,131 1,000 0,802 0,565 ACC Thr 1,130 1,000 0,705 0,398

ATG Met 1,000 1,000 1,000 1,000 ACA Thr 1,130 1,000 1,769 1,000

GTT Val 1,095 0,821 1,058 0,666 ACG Thr 0,954 0,844 0,000 0,000

GTC Val 1,333 1,000 0,419 0,264 GCT Ala 1,721 1,000 1,591 1,000

GTA Val 0,484 0,363 0,954 0,601 GCC Ala 0,406 0,235 1,255 0,788

COD AA RSCU

bm86

W

bm86

RSCU

bsa

W

bsa

COD AA RSCU

bm86

W

bm86

RSCU

bsa

W

bsa

GCA Ala 1,395 0,810 1,086 0,682 GAG Glu 0,888 0,799 0,916 0,550

GCG Ala 0,491 0,285 0,081 0,051 TGT Cys 0,615 0,444 0,842 0,842

TAT Tyr 0,841 0,726 1,430 1,000 TGC Cys 1,384 1,000 1,087 1,000

TAC Tyr 1,158 1,000 0,569 0,397 TGG Trp 1,000 1,000 0,004 1,000

CAT His 1,000 1,000 1,294 1,000 CGT Arg 1,718 1,000 0,462 0,248

CAC His 1,000 1,000 0,705 0,912 CGC Arg 1,295 0,753 0,150 0,080

CAA Gln 1,243 1,000 1,298 1,000 CGA Arg 1,070 0,622 0,150 0,080

CAG Gln 0,762 0,613 1,149 0,540 CGG Arg 0,422 0,245 0,462 0,248

AAT Asn 0,727 0,571 0,859 1,000 AGT Ser 1,266 0,902 0,747 0,396

AAC Asn 1,272 1,000 1,200 0,747 AGC Ser 0,981 0,699 1,126 0,597

AAA Lys 1,185 1,000 0,799 1,000 AGA Arg 0,211 0,122 1,858 1,000

AAG Lys 0,686 0,686 1,402 0,665 AGG Arg 1,295 0,753 0,924 0,497

GAT Asp 0,850 0,739 0,600 1,000 GGT Gly 0,818 0,662 1,420 0,748

GAC Asp 1,149 1,000 1,291 0,427 GGC Gly 1,234 1,000 0,710 0,374

GAA Glu 1,111 1,000 0,711 1,000 GGA Gly 0,926 0,750 1,898 1,000

RESULTADOS

• Los valores RSCU entre bm86 y bsa no

son significativamente diferentes.

• Algunos codones presentan valores

altos en bm86 y bajos en bsa, indicando

que codones frecuentemente usados en

bm86 son inusualmente usados en bsa,

y viceversa.

bm86 bsa bm86 en

bovino

CAIobs 1.045 1.034 1.045

CAImax 1.290 1.343 1.343

CAI 0.810 0.770 0.778

Valores del índice de adaptación de codones (CAI)

para los genes bm86 de Boophilus microplus y bsa

de Bos taurus

El CAI de bm86 en bovino fue menor, sugiriendo

de nuevo que algunos codones usados en bm86

son menos usados en bsa.

TTT Phe 16.5

TTC Phe 23.9

TTA Leu 5.8

TTG Leu I 11.6

TCT Ser 13.3

TCC Ser 17.0

TCA Ser 10.0

TCG Ser 4.5

TAT Tyr 12.1

TAC Tyr 18.9

TAA Ter 0.8

TAG Ter 0.6

TGT Cys 9.9

TGC Cys 13.9

TGA Ter 1.3

TGG Trp 14.2

CTT Leu 11.7

CTC Leu 20.8

CTA Leu 5.9

CTG Leu i 41.9

CCT Pro 15.3

CCC Pro 19.8

CCA Pro 14.3

CCG Pro 7.3

CAT His 8.5

CAC His 14.7

CAA Gln 10.4

CAG Gln 32.6

CGT Arg 4.4

CGC Arg 10.4

CGA Arg 5.9

CGG Arg 10.8

ATT Ile 15.8

ATC Ile 25.2

ATA Ile 6.9

ATG Met I 22.6

ACT Thr 12.0

ACC Thr 21.3

ACA Thr 13.9

ACG Thr 7.3

AAT Asn 16.0

AAC Asn 23.2

AAA Lys 22.0

AAG Lys 34.5

AGT Ser 10.5

AGC Ser 18.5

AGA Arg 10.8

AGG Arg 11.2

GTT Val 10.5

GTC Val 16.5

GTA Val 6.3

GTG Val 31.0

GCT Ala 18.0

GCC Ala 29.7

GCA Ala 13.8

GCG Ala 7.9

GAT Asp 21.2

GAC Asp 29.0

GAA Glu 26.9

GAG Glu 40.7

GGT Gly 11.0

GGC Gly 23.9

GGA Gly 16.6

GGG Gly 16.6

Frecuencia del uso de codones en Bos taurus

Se seleccionarón los codones con mayor frecuencia

para remplazar en la secuencia proteica de Bm86

ccgcgacagctgcggtggttcgacgcagtgagatgcgtggcatcgctttgttcgtcgccg 60*

||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||| | ||||| ||||

ccgcgacagctgcggtggttcgacgcagtgagatgaggggcatcgccctcttcgtggccg 60

M R G I A L F V A A

ctgtttcactgattgtagagggcacagcagaatcatccatttgctctgacttcgggaacg 120*

| || || || || |||||||| || || ||| ||| |||||||| ||||

ccgtgagcctcatcgtggagggcaccgccgagagcagcatctgcagcgacttcggcaacg 120

V S L I V E G T A E S S I C S D F G N E

agttctgtcgcaacgctgaatgtgaagtggtgcctggtgcagaggatgatttcgtgtgca 180*

||||||| | ||||| || || || |||||||| || || ||||| || ||||||||||

agttctgcaggaacgccgagtgcgaggtggtgcccggcgccgaggacgacttcgtgtgca 180

F C R N A E C E V V P G A E D D F V C K

aatgtccgcgagataatatgtacttcaatgctgctgaaaagcaatgcgaatataaagaca 240*

| || || | || || ||||||||||| || || || ||||| ||||| || || ||||

agtgccccagggacaacatgtacttcaacgccgccgagaagcagtgcgagtacaaggaca 240

C P R D N M Y F N A A E K Q C E Y K D T

cgtgcaagacaagggagtgcagctatggacgttgcgttgaaagtaacccgagcaaggcta 300*

| |||||||| |||||||||||||| || | ||||| || || ||||| |||||||| |

cctgcaagaccagggagtgcagctacggcaggtgcgtggagagcaaccccagcaaggcca 300

C K T R E C S Y G R C V E S N P S K A S

gctgcgtctgcgaagcatcggacgatctaacgctacaatgcaaaattaaaaatgactacg 360*

||||||| ||||| || ||||| || || || || ||||| || || || |||||||

gctgcgtgtgcgaggccagcgacgacctcaccctccagtgcaagatcaagaacgactacg 360

C V C E A S D D L T L Q C K I K N D Y A

caactgactgccgaaatcgaggtggcactgctaagttgcgcacggatgggtttattggcg 420*

| || |||||| | || | || ||||| || ||| | | || || || || || ||||

ccaccgactgcaggaacaggggcggcaccgccaagctcaggaccgacggcttcatcggcg 420

T D C R N R G G T A K L R T D G F I G A

caacgtgtgactgtggtgaatggggtgcgatgaacatgaccacccggaactgtgtcccta 480*

| || || ||||| || || ||||| || ||||||||||||||| ||||||| || || |

ccacctgcgactgcggcgagtggggcgccatgaacatgaccaccaggaactgcgtgccca 480

T C D C G E W G A M N M T T R N C V P T

ccacgtgtcttcgtcccgacttgacctgcaaagacctctgcgagaaaaacctgcttcaaa 540*

|||| || || | |||||| | |||||||| |||||||||||||| ||||| || || |

ccacctgcctcaggcccgacctcacctgcaaggacctctgcgagaagaacctcctccaga 540

T C L R P D L T C K D L C E K N L L Q R

gggattctcgttgttgccaggggtggaacacagcaaactgttcagccgctcctccagctg 600*

|||| | || |||||||| |||||||| || ||||| ||||| || || || |

gggacagcaggtgctgccagggctggaacaccgccaactgcagcgccgccccccccgccg 600

D S R C C Q G W N T A N C S A A P P A D

actcctattgctctcctgggagccccaaaggaccggacggacagtgtataaatgcttgca 660*

|| ||| ||| || || |||||||| || || ||||| ||||| || || || ||||

acagctactgcagccccggcagccccaagggccccgacggccagtgcatcaacgcctgca 660

S Y C S P G S P K G P D G Q C I N A C K

agacgaaagaagctgggtttgtctgcaagcatggatgcaggtcgaccggcaaggcgtacg 720*

|||| || || || || || || |||||||| || |||||| ||||||||||| ||||

agaccaaggaggccggcttcgtgtgcaagcacggctgcaggagcaccggcaaggcctacg 720

T K E A G F V C K H G C R S T G K A Y E

agtgcacgtgcccgagtggctctaccgtcgccgaagatggcattacctgcaaaagtattt 780*

||||||| ||||| || ||| ||||| ||||| || ||||| |||||||| || ||

agtgcacctgccccagcggcagcaccgtggccgaggacggcatcacctgcaagagcatca 780

C T C P S G S T V A E D G I T C K S I S

cgcacacagtcagctgcactgctgagcaaaaacagacctgccgcccaaccgaagactgtc 840*

||||| || |||||||| || ||||| || ||||||||| | || ||||| |||||

gccacaccgtgagctgcaccgccgagcagaagcagacctgcaggcccaccgaggactgca 840

H T V S C T A E Q K Q T C R P T E D C R

gtgtgcacaaaggaactgtgttgtgtgagtgcccgtggaatcaacatctagtgggggaca 900*

| |||||||| || || ||| | || |||||||| ||||| || || || ||||| ||||

gggtgcacaagggcaccgtgctctgcgagtgcccctggaaccagcacctcgtgggcgaca 900

V H K G T V L C E C P W N Q H L V G D T

cgtgcataagtgattgcgtcgacaagaaatgccacgaagaatttatggactgtggcgtat 960*

| ||||| || || ||||| |||||||| |||||||| || || |||||||| ||||| |

cctgcatcagcgactgcgtggacaagaagtgccacgaggagttcatggactgcggcgtgt 960

C I S D C V D K K C H E E F M D C G V Y

atatgaatcgacaaagctgctattgtccatggaaatcaaggaagccgggcccaaatgtca 1020*

| ||||| | || |||||||| || || ||||| |||||||| ||||| || || |

acatgaacaggcagagctgctactgcccctggaagagcaggaagcccggccccaacgtga 1020

M N R Q S C Y C P W K S R K P G P N V N

acatcaatgaatgcctactgaatgagtattactacacggtgtcattcaccccaaacatat 1080*

||||||| || ||||| || || ||||| |||||||| ||| |||||||| |||||

acatcaacgagtgcctcctcaacgagtactactacaccgtgagcttcacccccaacatca 1080

I N E C L L N E Y Y Y T V S F T P N I S

cttttgattctgaccattgcaaatggtatgaggatcgtgttttggaagcgatacggacca 1140*

|| || ||||| ||||| ||||| ||||| | || | || || || ||||||

gcttcgacagcgaccactgcaagtggtacgaggacagggtgctcgaggccatcaggacca 1140

F D S D H C K W Y E D R V L E A I R T S

gtatcggaaaagaagtttttaaggttgagatacttaactgcacgcaggacattaaggcaa 1200*

| ||||| || || || || ||||| ||||| || |||||||| |||||||| ||||| |

gcatcggcaaggaggtgttcaaggtggagatcctcaactgcacccaggacatcaaggcca 1200

I G K E V F K V E I L N C T Q D I K A R

gactcatagcagagaaaccactgtcaaaacacgtgctcaggaaactacaagcatgcgagc 1260*

| ||||| || ||||| || || || |||||||||||||| || || || |||||||

ggctcatcgccgagaagcccctcagcaagcacgtgctcaggaagctccaggcctgcgagc 1260

L I A E K P L S K H V L R K L Q A C E H

atccaatcggcgaatggtgcatgatgtatccgaagttgctgatcaagaaaaactctgcaa 1320*

| || |||||||| |||||||||||||| || ||| | || |||||||| ||| || |

accccatcggcgagtggtgcatgatgtaccccaagctcctcatcaagaagaacagcgcca 1320

P I G E W C M M Y P K L L I K K N S A T

cagaaatcgaagaagagaacctttgcgacagtctgctcaaggatcaggaagctgcctaca 1380*

| || ||||| || |||||||| |||||||| || |||||||| ||||| || |||||||

ccgagatcgaggaggagaacctctgcgacagcctcctcaaggaccaggaggccgcctaca 1380

E I E E E N L C D S L L K D Q E A A Y K

aaggtcaaaacaaatgcgtcaaggtcgacaacctcttctggttccagtgcgctgatggtt 1440*

| || || ||||| ||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||| || || |

agggccagaacaagtgcgtgaaggtggacaacctcttctggttccagtgcgccgacggct 1440

G Q N K C V K V D N L F W F Q C A D G Y

acacaacaacttacgagatgacacgaggtcgcctacgccgctccgtgtgtaaagctggag 1500*

|||| || || ||||||||||| | || | || | | |||||| || || || |

acaccaccacctacgagatgaccaggggcaggctcaggaggagcgtgtgcaaggccggcg 1500

T T T Y E M T R G R L R R S V C K A G V

tttcttgcaacgaaaacgagcagtcggagtgtgctgacaaagggcaaatatttgtttacg 1560*

| |||||||| ||||||||| ||||| || ||||| || || || || || ||||

tgagctgcaacgagaacgagcagagcgagtgcgccgacaagggccagatcttcgtgtacg 1560

S C N E N E Q S E C A D K G Q I F V Y E

aaaacggcaaagcgaattgccaatgcccaccagacactaaacctggggagattggctgca 1620*

| |||||||| || || ||||| ||||| || ||||| || || || ||||| |||||||

agaacggcaaggccaactgccagtgcccccccgacaccaagcccggcgagatcggctgca 1620

N G K A N C Q C P P D T K P G E I G C I

ttgagcgtaccacatgcaaccctaaagaaatacaagaatgccaagacaagaagctggagt 1680*

| ||| | ||||| |||||||| || || || || || ||||| ||||||||||| ||||

tcgagaggaccacctgcaaccccaaggagatccaggagtgccaggacaagaagctcgagt 1680

E R T T C N P K E I Q E C Q D K K L E C

gcgtttacaaaaaccataaagcagaatgcgagtgtcctgatgatcacgagtgttacaggg 1740*

|||| ||||| ||||| || || || |||||||| || || || |||||||| |||||||

gcgtgtacaagaaccacaaggccgagtgcgagtgccccgacgaccacgagtgctacaggg 1740

V Y K N H K A E C E C P D D H E C Y R E

agcctgccaaagactcttgcagtgaagaggataatggtaaatgtcaaagcagtgggcagc 1800*

|||| ||||| ||| ||||| || ||||| || || || || || ||||| || |||

agcccgccaaggacagctgcagcgaggaggacaacggcaagtgccagagcagcggccaga 1800

P A K D S C S E E D N G K C Q S S G Q R

gttgtgtaatagaaaacggaaaggctgtttgcaaggaaaagtctgaagcaacaacagctg 1860*

| || || || || ||||| ||||| || |||||||| ||| || || || || || |

ggtgcgtgatcgagaacggcaaggccgtgtgcaaggagaagagcgaggccaccaccgccg 1860

C V I E N G K A V C K E K S E A T T A A

cgactacaacaacgaaagcgaaagacaaggatccagatcctggaaagtcaagtgctgcag 1920*

| || || || || || || || |||||||| || || || || ||||||||||||||||

ccaccaccaccaccaaggccaaggacaaggaccccgaccccggcaagtcaagtgctgcag 1920

T T T T K A K D K D P D P G K S S A A A

cagtatcagctactgggctcttgttactgctcgcagctacttcagtcaccgcagcatcgt 1980*

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

cagtatcagctactgggctcttgttactgctcgcagctacttcagtcaccgcagcatcgt 1980

V S A T G L L L L L A A T S V T A A S L

tgtaaggaagatgtccaacttgaatacggaacagcttgaatatgtatatatacatcacgc 2040*

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

tgtaaggaagatgtccaacttgaatacggaacagcttgaatatgtatatatacatcacgc 2040

Ter

Alineamiento de las secuencia silvestre

y optimizada del gen bm86 con la

secuencia proteica de Bm86, líneas

indican nucleótidos homólogos.

14% contenido de G+C en secuencia

optimizada

Homología con los genes silvestres

bm86 y bm95

Conclusiones

• El plásmido pSO2C1 indujo la expresión de

la proteína Cry11Bb durante un largo periodo

de tiempo y así la respuesta inmune humoral

inducida contra dicha proteína, esto también

estuvo correlacionado con la persistencia del

plásmido.

• Estos eventos pueden depender del gen que

se esta expresando y del destino de la

proteína, además del hospedero del

plásmido.

Conclusiones

• La respuesta inmune inducida depende

de la concentración del plásmido y la

ruta de inoculación, esto se pudo

observar en los ratones inmunizados

con pBMC2 que en general presentaron

una mayor respuesta con la

concentración mas alta por la vía

intramuscular.

Conclusiones

• A pesar del potencial de la inmunización genética contra la proteína Bm86 de B. microplus, se evidencia la necesidad de modular la respuesta inmune inducida por pBMC2 mediante el uso de adyuvantes genéticos.

• La vacuna de ADN contra garrapatas se podría optimizar a nivel de la expresión del gen bm86, esto mediante la construcción de un gen con los codones optimizados para una mejor expresión de la proteína en el hospedero.

AGRADECIMIENTOS

• COLCIENCIAS y CIB por la financiación de las investigaciones aquí presentadas.

• Comité Científico de la CIB.

• Dirección Administrativa de la CIB.

• Personal de la Unidad de Biotecnología y Control Biológico de la CIB, de la Unidad de Micología Médica y Experimental de la CIB y el Grupo de Inmunodeficiencias Primarias de la Universidad de Antioquia por el soporte técnico y académico.

• Postgrado de Biología de la Universidad de Antioquia por el soporte académico.

• Evaluadores del trabajo de grado.

Publicaciones

• 1: Ruiz LM, Orduz S, López ED, Guzmán F, Patarroyo ME, Armengol G.

Immune response in mice and cattle after immunization with a Boophilus

microplus DNA vaccine containing bm86 gene. Vet Parasitol. 2007 Mar

15;144(1-2):138-45. Epub 2006 Oct 20. PubMed PMID: 17055651.

• 2: Ruiz LM, Armengol G, Habeych E, Orduz S. A theoretical analysis of

codon adaptation index of the Boophilus microplus bm86 gene directed to the

optimization of a DNA vaccine. J Theor Biol. 2006 Apr 21;239(4):445-9.

Epub 2005 Sep 19. PubMed PMID: 16171828.

• 3: Armengol G, Ruiz LM, Orduz S. The injection of plasmid DNA in mouse

muscle results in lifelong persistence of DNA, gene expression, and humoral

response. Mol Biotechnol. 2004 Jun;27(2):109-18. PubMed PMID: 15208453.

GRACIAS