Extensiones Sanguneas

El frotis sanguneo consiste en la extensin uniforme de una gota de sangre sobre un portaobjetos; la misma que se lleva a cabo con otro portaobjetos

El frotis sanguneo se realiza de forma manual y automatizada ( spinner )

Partes de una extensin Cabeza

- es la zona inicial de la extensin- es la regin mas gruesa- en esta regin se encuentra el mayornmero de linfocitos y GR apilados

- No es una zona de lectura Cuerpo

- es la zona media del frotis- su espesor es el apropiado- en ella existe una adecuada proporcin de leucocitos- contiene la zona ideal de observacin, que corresponde a la zona que limita con la cola

Cola- es la zona final de la extensin- suele tener un aspecto redondeado- es la regin mas fina- mayor proporcin de leucocitos grandes,hemates deformados y tonalidad uniforme

Caractersticas de un buen frotis- la cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta

- la cola debe estar cerca de uno de los bordes- toda la extensin ha de ser fina y homognea- los bordes laterales han de estar separados de losbordes del porta por 1 mm aproximadamente

- presencia de barbas en el extremo terminal

Defectos de una extensin Presencia de escalones o estras. originado por una falta

de uniformidad en el momento de realizar la extensin Un lmina con zonas huecas redondeadas por efecto de

restos de grasa y suciedad Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud

excesivo grosor Error en el tamao de la gota Error en la velocidad de la extensin Error por causa de un ngulo inapropiado Se debe tener en cuenta el Hto del paciente,

dependiendo de esta, se aplicar el ngulo apropiado de extensin

Anticoagulantes El estudio de la sangre en hematologa, requiere

siempre el empleo de sangre sin coagular. Se debe elegir el anticoagulante idneo y

mantener una adecuada proporcin con la sangre extraida ( medio isotnico )Caractersticas del Anticoagulante Idneo :

No altera el volumen de los hemates No produce hemlisis Evita la agregacin plaquetaria No altera la morfologa leucocitaria

EDTA( cido etilendiaminotetractico )

Esta sal realiza su accin quelando el calcio ( Ca ++ ), es decir, fijndolo sin llegar a precipitarlo.

Sal de EDTA : C10H16N2O8 Existen sales disdicas EDTA Na2 EDTA K2 y EDTA K3 Se recomienda las de K mas que las de

Na por su mayor solubilidad en sangre, especialmente en forma seca

Coloraciones Hematolgicas Las coloraciones

hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que componen las clulas sanguneas

Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y esto permite observarlas con mayor facilidad

Las tinciones hematolgicas se pueden clasificar en :

De acuerdo al nivel de vitalidad de lo que se quiere coloreara . Vitalesb . No vitales

De acuerdo a su frecuencia :a . Rutinab . Especiales

Todos los colorantes derivan del tipo Romanowsky, constituidos por la mezcla de eosinas y derivados de las tiazinas.

Romanowsky lo utiliz por vez primera para observar el parasito de paludismo o malaria, basada en la neutralidad de Ehrlich

Este principio consiste en dejar que un colorante bsico reaccione con otro cido, que da lugar a un compuesto con nuevas propiedades.

Posteriormente May-Grunwald y Reuter en Alemania y Leishmann y Jenner en Inglaterra perfeccionaron el colorante

Principios : a fijacin de la sangre extendida sobre el

portaobjetos b empleo de derivados del azul de metileno (

demitilacin oxidativa ) llamados Azures ( azur A, B y C ), responsable de la coloracin roja-purpura de la cromatina y de los grnulos azurfilos

La calidad de la coloracin y su reproducibilidad dependen del tipo y calidad de colorante

Los colorantes de tipo romanowsky son muy sensibles a las variaciones del pH

Tinciones Habituales Colorantes cidos: tienen especial afinidad por

las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.

Colorantes bsicos : especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno

Colorantes neutros : son los que no tienen afinidad con las estructuras cidas o bsicas, uno de ellos es el Sudn III

Existen tambin combinaciones de colorantes que dan origen a tinciones polcromas

El primero de ellos fue Romanowsky, y todos los colorantes hematolgicos de la actualidad suelen derivar del que l prepar

Estos colorantes constan de un colorante cido (eosina) y otros bsicos (tiacinas).las tiacinas son el azul de metileno y los azures

Tambin existen tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida en las estructuras celulares

Estructuras acidfilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida. Si captan la eosina se llaman eosinfilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado

Estructuras basfilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con los tinciones habituales adquieren un color azulado.

Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurfilas.

Tinciones especiales Solo se usan en condiciones especficas Tinciones fluorescentes : emplean colorantes

(fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por LUV, emiten una radiacin visible caracteristica.

Tinciones Citoqumicas : demuestran la presencia, mas o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias y/o enzimas, localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos.

Sirven para reconocer clulas normales de las anmalas, y por tanto, reconocer una leucemia de otra. Por ejemplo : PAS, Sudan Black, MPO, alfa Naftilestearasa, etc

Coloracin cida

Coloracin Bsica

Causas de Error en las Tinciones Habituales de Frotis Sanguneo

Si la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente se deba a :

Un pH bajo de colorante Un tiempo de coloracin insuficiente Un lavado excesivamente prolongado

Si la tincin es demasiado azul probablemente sea por :

Un empleo de portas sucios Falta de filtracin del colorante Una coloracin excesivamente prolongada Un secado del colorante durante al tincin Un lavado insuficiente

Preparacin del Colorante de Wright ( Merck ) Pesar 2 3 gr del colorante en polvo comercial 1000 ml de metanol Glicerina ( 5 ml ) opcional Colocar en un mortero el colorante y aadir la glicerina Aadir de a pocos el metanol al mortero e ir machacando hasta que

adquiera una coloracin azul intensa y luego verter a un frasco color caramelo o mbar, previo filtrado con papel filtro

Repetir la operacin hasta que se acabe el metanol Guardar en lugar oscuro, fuera de la luz para evitar su oxidacin por aprox.

una semana hasta que madure Luego de cumplido el tiempo filtrar nuevamente Listo para su uso

tcnica de tincin : Cubrir el frotis con el colorante por 1 3 minutos Agregar agua tamponada pH 7.2 7.4 por 5 7 minutos ( homogenizar ) Verificar la formacin de una pelcula plateada sobre el colorante Lavar con agua corriente y dejar secar Leer con objetivo de inmersin

Un aspecto clave es el grosor del extendido. Una extensin de calidad no debe ser gruesa ni muy delgada

Una extensin gruesa dificultar la observacin de la morfologa eritrocitaria y la diferenciacin entre linfocitos y monocitos. Adems de dificultar al ojo inexperto la tincin de las clulas sanguneas

Por el contrario, si es muy fina, la mayora de neutrfilos y monocitos se hallarn en las reas perifricas. Esto alterar la relacin normal de la distribucin celular leucocitaria

Se recomienda entonces, que el grosor ideal, es aquel que nos permita leer a travs de la extensin

Para tener en cuenta

Estudio de Lmina Perifrica

El estudio de lmina perifrica comprende la evaluacin morfolgica de las tres lneas celulares ( elementos formes ) que componen la sangre

Serie Blanca : Leucocitos Serie Roja : Hemates Serie Tromboctica : Plaquetas

Procedimiento del Diferencial Manual de Sangre Perifrica

Examen ocular a bajo aumento ( 10X ) Determinar las caractersticas de la tincin Determinar la distribucin celular

a. verificar si hay presencia de agregadosplaquetarios que pueden producir errores de conteo en los equipos o llevar a conteos bajos falsos b. Verificar la presencia de Rouleaux en GRc. verificar la presencia de agregados leucocitarios causados por inadecuada mezcla de sangre despus de su coleccin

Seleccionar la mejor rea para una detallada evaluacin morfolgicaa. buscar una distribucin homognea donde los eritrocitos no se sobrepongan unos a otrosb. evitar reas huecasc. evitar reas extremas donde los eritrocitos adopten forman geomtricas

Lectura a mediano aumento ( 40X o 50X )este tipo de lectura nos sirve para tener una visin panormica y completa del frotis y es de utilidad para el personal adiestrado en el reconocimiento celular, porque nos permite lecturas a mayor velocidad, sin sacrificar la precisin. Se recomienda su uso para lminas de pacientes leucopnicos.

Algunas personas inclusive pueden calcular el numero de leucocitos pmmc contando las clulas blancas normales y rotas, contando 10 campos, luego obteniendo su media y posteriormente multiplicandolo por 3000

Lectura a mayor aumento ( 100x ) Se lleva acabo usando un tabulador o contmetro, manual o digital. Deben incluirse todas las clulas de la serie blanca, maduras e

inmaduras. No deben incluirse en el recuento de 100 leucocitos a los GR

nucleados y megacariocitos nucleados Cualquier leucocito conteniendo una inclusin anormal deber ser

reportado pero con un conteo en paralelo por las 100 clulas contadas

Ejemplo : Ud observ 60 neutrfilos en su conteo de100 de los cuales 20 de ellos tenan cuerpos de Dhle, ud deber informar al final del recuento : neutrfilos (60%), y cuerpos de Dhle 20%

Se deber reportar los siguientes inclusiones : - cuerpos de Dhle- cuerpos de Auer- anomala de Pelger Huet- anomala de May hegglin- inclusiones de Alder Reilly- inclusiones Chediak Higashi- granulaciones txicas - vacuolas citoplasmticas o degenerativas

Usted deber reportar cualquier clula anormal o indiferenciada que observe

Deber reportar GR nucleados si estos exceden al 6% y corregir su recuento de leucocitos con la siguiente formula :

Leucocitos contados / mm3 x 100= leucocitos corregidos / mm3

100 + N hemates nuclados

Ejemplo : si un paciente tiene un conteo de 15,000 leucocitos pmmc y 35 % de GRN, su conteo corregido ser de 11,111 pmmc

Evaluacin de la Serie Roja

En este punto el observador deberreportar su minucioso examen de los GR, indicando la presencia de Hipocroma, Anisocitosis y Poiquilocitosis.

Deber reportar tambin inclusiones eritrocitarias y hemoparsitos si los hubiera.

Tambien indicar la presencia de clulas inmaduras de la serie roja si las hubieran

MADURACIN

SERIE

ROJA

Hipocroma : cuando una clula roja individual contiene un rea plida central que es mayor a la tercera parte de su dimetro se denomina clula hipocrmica

Rango medio para denominar hipocrma en 10 campos microscpicos ( 100 160 hemates por campo )

a. normocroma : 0 - 5b. leve hipocroma : 6 - 15c. moderada hipocroma : 16 - 30d. marcada hipocroma : > 30

Nota : la hipercroma no esta reportada aqu pero se relaciona con la presencia de esferocitos.

Hipercroma : se denomina as a las clulas rojas profundamente coloreadas en relacin al resto, y esto debido a su alto contenido en hemoglobina, mayor al que debera contener

Anisocitosis : cuando se presenta en el campo eritrocitos de diferentes tamaos

Normoctos :dimetro longitudinal : 7 8 Diamatro transversal

( espesor )perifrico : 2 central : 1

- Superficie : 120 - 140 - Volumen : 80 95

Microcitosis : hemates con un dimetro inferior a 7 y un volumen inferior a 80 3

Macrocitosis : hemates con un dimetro superior a las 8 y un volumen superior a las 100 3

Megalocitos : hemates con dimetro superior a las 11

Rango medio para anisocitosis / 10 campos

Normal Leve Anisocitosis Moderada Anisocitosis Marcada Anisocitosis

0 - 5 6 - 15 15 - 30 > 30

Poiquilocitosis : cuando se presentan varias formas diferentes en los hemates en un campo microscpico

Si se observa solo un tipo leve de anormalidad la poiquilocitosis ser leve, pero si coexisten diferentes formas de hemates, entonces ser marcada, no importando que individualmente sean leves

Se recomienda que cada forma anormal sea evaluada separadamente

Rango medio para tipificar poiquilocitosis /10 campos

Normal : 0 - 1 Leve : 1 - 5 Moderada : 6 - 15 Marcada : > 15

Acantocitos AHA A. sideroblstica AHM Enfermedad heptica Enfermedad renal Post- esplecnotoma

Drepanocitos Clulas facliformes A. drepanoctica Enfermedad Hb S - C

Esquistocitos Son GR fragmentados AHM A. megaloblastica Talasemia mayor A. hemolticas Leucemia aguda Hiperesplenismo

Megalocitos

Anemias megaloblasticas Dimetro > a 11 micras

ANEMIA MEGALOBLASTICA ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA MIELOFIBROSIS TALASEMIA MAYOR TRAUMA MECANICO

Rouleaux Cuando los GR se

presentan en fila de moneda

Mieloma Multiple Incremento de

gamma globulina Macroglobulinemia de

Waldenstrom

Dianocito Clula en Tiro al Blanco

ESTOMATOCITOSIS HERDITARIA LEUCEMIA AGUDA ALCOHOLISMO CON ENFERMEDAD HEPTICA ARTEFACTOS TALASEMIAS

Anillo de Cabot Cuerpos de Pappenheimer

Punteado Basfilo Cuerpos de Heinz

Reticulocitos

Policromatofila

Cuerpos de Howell JollyPappenheimer

Serie Blanca La frmula leucocitaria es la denominacin

usual que se da al recuento porcentual de los diferentes leucocitos que circulan en la sangre

En condiciones de normalidad esta constituida por 5 poblaciones de leucocitos :

Neutrfilos ( en su gran mayora segmentados ) Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos

Variables que pueden influir en la formula leucocitaria realizada mediante el mtodo

visual

Distribucin irregular y no aleatoria de los leucocitos en la extensin

Realizacin de la lectura en una zona inapropiada Variaciones de la calidad y las caractersticas de la

tincin ( tincin cida o bsica ) Observacin de un nmero insuficiente de clulas Pericia del observador en la identificacin celular

neutrfilos segmentados Vs neutrfilos en banda monocitos Vs linfocitos activados o atpicos formas inmaduras de granulocitos neutrfilos

SERIE

MIELOIDE

Mieloblastos : Es redondeado Dimetro entre 15 20 Su ncleo es grande,

redondeado, rojizo y tiende a centrarse

Su cromatina es laxa y contiene de 2 a 3 nucleolos visibles

Su citoplasma es basfilo y algunas contienes finas granulaciones azurfilas

Promielocito : Se origina por maduracin y

maduracin del mieloblasto Es redondeado Dimetro de 16 25 Ncleo grande,

redondeado, menos rojizo y tiende a excentrarase

Cromatina laxa y generalmente se observa nucleolos en ella, puede presentar zonas de condensacin

Citoplasma abundante, repleto de grnulos primarios muy azurfilos

MIELOCITOS

JUVENILES O METAMIELOCITOS

METAMIELOCITOS

Metamielocitos Vs No Segmentados

Regla de la Mediana : Si al completar mentalmente la circunferencia nuclear y trazamos una lnea media imaginaria y esta muestra la hendidura antes de la mediaestamos frente a un juvenil o metamielocito. Si por el contrario la hendidura esta detrs de la lnea media, estamos frente a un abastonado

Juvenil No Segmentado

Metamielocitos Vs No segmentados

Regla del Dimetro : esta se basa en el ancho del ncleo. Si la anchurade esta es similar a la mitad de la longitud del ncleo estamos frente a un metamielocito o juvenil, en cambiosi el ancho nuclear es menor a la mitad de la longitud

del ncleo, estamos frente a una clula en banda.

Juvenil No Segmentado

CLULAS EN

BANDAO

EN CAYADO

OABASTONADOS

Clulas Neutrfilas en Banda

Neutrfilos Vs No Segmentados

Regla del Tercio Si la estrangulacin

de la continuidad nuclear es menor a un tercio de la parte mas ancha del mismo ncleo, entonces es un segmentado

Regla del Filamento Se dice que estamos

frente a un segmentado siempre y cuando se observe un ncleo polisegmentado y se observe al menos un puente de cromatina

Neutrfilos Vs No Segmentados

Neutrfilos Clulas en Banda

Criterios para la diferenciacin entre neutrfilos Vs no segmentados

Si seguimos con la mirada la continuidad nuclearY en algn momento esta se entrecruza con otraLnea del mismo ncleo , entonces lo llamamosSegmentado. Del mismo modo si al termino de laObservacin de la continuidad de la membranaNuclear sobra ncleo lo llamamos segmentado.( Fig. 1 )

Si al observar la continuidad nuclear no notamosCruce de lneas, entonces lo estamos frente a unAbastonado. ( fig. 2 )

Fig. 2

Son clulas redondeadas, de tamao entre 12 y 14 um.

Su ncleo est segmentado en 2 a 5 lbulos, unidos por unos finos puentes cromatnicos.

El citoplasma es rosa plido y contiene numerosos grnulos neutrfilos que se tien de color marrn con las coloraciones panpticas habituales, as como cierto nmero de grnulos primarios ( 10 20 % ) o azurfilos dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrfilos.

Su ncleo es de color violeta oscuro y presenta cromatina densa

Algunas veces su ncleo presenta un pequeo pndice en palillo de tambor( cromatina sexual )

NEUTRFILOSPOLISEGMENTADOS

Granulaciones Txicas Pelger - Huet

Vacuolas Citoplasmticas Vacuolas Degenerativas

BASFILO Poseen un ncleo

bilobulado y grandes grnulos esfricos basoflicos y metacromticos dados por heparina e histamina. Liberan adems aminas vasoactivas y sustancia de reaccin lenta de la anafilaxia.

Clula redondeada 12 17 Ncleo violeta,

generalmente bilobulado simtrico unido por un puente de cromatina o en forma de anteojos

Presenta grnulos, grandes y acidfilos que no cubren el ncleo

Estos grnulos se tien con la eosina y contienen diversas sustancias como la peroxidasa, fosfatasa cida, hidrolasas, etc

Eosinfilos

Serie Linfoide:

Linfoblasto

Linfocitos

Prolinfocitos

Dimetro variable de 7 18 Pueden diferir en su relacin

N / C El citoplasma es variable

( escaso o abundante ) Su coloracin es azul plida,

pero aumenta en los linfos reactivos ( estimulados )

Pueden presentar una granulacin azurfila escasa en el ciptoplasma

Ncleo redondeado y cromatina compacta

La densidad de la cromatina puede variar entre los diferentes estados. Es generalmente elevada pero pueden presentar zonas mas laxas

Linfocitos

LINFOCITOS ATPICOS

MAS LINFOCITOS ATPICOS

Plasmocitos 8 20 de dimetro Relacin N/C 2:1 o 1:1 Ncleo redondo u oval Cromatina densa azul

purpura con grandes muescas cerca al margen nuclear

No presenta nucleolos Citoplasma moderado,

basfilo, con zona clara perinuclear adjacente al ncleo

Puede contener una o mas vacuolas

No presenta granulaciones citoplasmticas

Monoblasto

Promonocito

Monocito

Serie Monoctica

MONOCITOS Son las clulas circulantes de

mayor tamao. Poseen un ncleo excntrico en forma de U en forma arrionada

El ncleo suele presentar una ubicacin central

14 20 de diametro Citoplasma abundante y de color

lila plido Presenta fina granulacin

azurfila Presenta cromatina laxa o

filamentosa En ocasiones se halla vacualizado

Son los precursores del sistema mononuclear fagoctico, que incluye macrfagos (histiocitos), osteoclastos, macrfagos alveolares, clulas de Kupfer en el hgado y la microglia en el sistema nervioso central.

El recuento diferencial leucocitario suministra informacin sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos de la sangre y permite la deteccin de clulas anormales

Se basa en la observacin microscpica de 100 a 200 leucocitos dispuestos en una extensin de sangre ( frotis ) convenientemente teida

La calidad de la extensin de la sangre es de vital importancia para la realizacin de una correcta lectura de la lmina.

Promegacariocito

Megacariocito Granular

Megacariocito en Brotacin

Megacariocito Productor de Plaquetas

Serie Tromboctica Las plaquetas son las

clulas sanguneas mas pequeas del organismo

Se producen por fragmentacin simple del citoplasma de los megacariocitos.

Son clulas anucleadas de forma discoide de 2 4 micras de dimetro y 8 micras de volumen.

poseen una vida media de 7 - 10 das y su rango va de 150,000 a 450,000 pmmc

Trombocitopenia :

Leve : 150,000 - 100,000Moderada : 100,000 - 50,000Severa : < 50,000

Macroplaqueta Plaquetas Normales

Serie Tromboctica Debemos reportar la cantidad de plaquetas en

lmina ( trombocitopenias o trombosis ) Debemos dar un informe detallado sobre la

citomorfologa de las plaquetas Reportar si hay plaquetas normales,

degranuladas, pequeas o macroplaquetas Se debe informar si existe la presencia de

agregados plaquetarios Es muy importante una impecable tcnica en el

momento de realizar el frotis, es decisivo.

Recuento en Lmina Perifrica

Damacheck :

( Rcto 1000 GR + F ) x 100

Factor = ?

Hto 35 ( + 5 ) Hto : 35 - 39 ( + 3 ) Hto : 40 ( + 1 )

Extensiones SanguneasPartes de una extensinDefectos de una extensin Anticoagulantes EDTA( cido etilendiaminotetractico ) Coloraciones HematolgicasTinciones HabitualesTinciones especialesColoracin cida Coloracin BsicaCausas de Error en las Tinciones Habituales de Frotis SanguneoPreparacin del Colorante de Wright ( Merck )Para tener en cuenta Estudio de Lmina PerifricaProcedimiento del Diferencial Manual de Sangre PerifricaEvaluacin de la Serie RojaSerie BlancaVariables que pueden influir en la formula leucocitaria realizada mediante el mtodo visualMieloblastos :Neutrfilos Vs No SegmentadosNeutrfilos Vs No SegmentadosCriterios para la diferenciacin entre neutrfilos Vs no segmentadosBASFILOSerie Linfoide:Plasmocitos MONOCITOSSerie TrombocticaSerie Tromboctica Recuento en Lmina Perifrica