Extensiones SanguneasEl frotis sanguneo consiste en la extensin uniforme de una gota de sangre sobre un portaobjetos; la misma que se lleva a cabo con otro portaobjetosEl frotis sanguneo se realiza de forma manual y automatizada ( spinner )

Partes de una extensinCabeza- es la zona inicial de la extensin- es la regin mas gruesa- en esta regin se encuentra el mayor nmero de linfocitos y GR apilados- No es una zona de lecturaCuerpo - es la zona media del frotis- su espesor es el apropiado- en ella existe una adecuada proporcin de leucocitos- contiene la zona ideal de observacin, que corresponde a la zona que limita con la cola

Cola - es la zona final de la extensin- suele tener un aspecto redondeado- es la regin mas fina- mayor proporcin de leucocitos grandes, hemates deformados y tonalidad uniforme

Caractersticas de un buen frotis- la cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta- la cola debe estar cerca de uno de los bordes- toda la extensin ha de ser fina y homognea- los bordes laterales han de estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente- presencia de barbas en el extremo terminal

Defectos de una extensin Presencia de escalones o estras. originado por una falta de uniformidad en el momento de realizar la extensinUn lmina con zonas huecas redondeadas por efecto de restos de grasa y suciedadExcesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud excesivo grosorError en el tamao de la gotaError en la velocidad de la extensinError por causa de un ngulo inapropiadoSe debe tener en cuenta el Hto del paciente, dependiendo de esta, se aplicar el ngulo apropiado de extensin

Coloraciones HematolgicasLas coloraciones hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que componen las clulas sanguneasEsto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y esto permite observarlas con mayor facilidadLas tinciones hematolgicas se pueden clasificar en :De acuerdo al nivel de vitalidad de lo que se quiere coloreara . Vitalesb . No vitalesDe acuerdo a su frecuencia :a . Rutinab . Especiales

Tinciones HabitualesColorantes cidos: tienen especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.Colorantes bsicos : especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metilenoColorantes neutros : son los que no tienen afinidad con las estructuras cidas o bsicas, uno de ellos es el Sudn III

Existen tambin combinaciones de colorantes que dan origen a tinciones polcromasEl primero de ellos fue Romanowsky, y todos los colorantes hematolgicos de la actualidad suelen derivar del que l preparEstos colorantes constan de un colorante cido (eosina) y otros bsicos (tiacinas).las tiacinas son el azul de metileno y los azuresTambin existen tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida en las estructuras celulares

Estructuras acidfilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida. Si captan la eosina se llaman eosinfilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosadoEstructuras basfilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con los tinciones habituales adquieren un color azulado.Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurfilas.

Tinciones especialesSolo se usan en condiciones especficas Tinciones fluorescentes : emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por LUV, emiten una radiacin visible caracteristica.Tinciones Citoqumicas : demuestran la presencia, mas o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias y/o enzimas, localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos.Sirven para reconocer clulas normales de las anmalas, y por tanto, reconocer una leucemia de otra. Por ejemplo : PAS, Sudan Black, MPO, alfa Naftilestearasa, etc

Coloracin cida

Coloracin Bsica

Causas de Error en las Tinciones Habituales de Frotis SanguneoSi la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente se deba a :Un pH bajo de coloranteUn tiempo de coloracin insuficienteUn lavado excesivamente prolongadoSi la tincin es demasiado azul probablemente sea por :Un empleo de portas suciosFalta de filtracin del coloranteUna coloracin excesivamente prolongadaUn secado del colorante durante al tincinUn lavado insuficiente

Preparacin del Colorante de Wright ( Merck )Pesar 2 3 gr del colorante en polvo comercial1000 ml de metanolGlicerina ( 5 ml ) opcionalColocar en un mortero el colorante y aadir la glicerinaAadir de a pocos el metanol al mortero e ir machacando hasta que adquiera una coloracin azul intensa y luego verter a un frasco color caramelo o mbar, previo filtrado con papel filtroRepetir la operacin hasta que se acabe el metanolGuardar en lugar oscuro, fuera de la luz para evitar su oxidacin por aprox. una semana hasta que madureLuego de cumplido el tiempo filtrar nuevamenteListo para su usotcnica de tincin :Cubrir el frotis con el colorante por 1 3 minutosAgregar agua tamponada pH 7.2 7.4 por 5 7 minutos ( homogenizar )Verificar la formacin de una pelcula plateada sobre el coloranteLavar con agua corriente y dejar secarLeer con objetivo de inmersin

Para tener en cuenta Un aspecto clave es el grosor del extendido. Una extensin de calidad no debe ser gruesa ni muy delgadaUna extensin gruesa dificultar la observacin de la morfologa eritrocitaria y la diferenciacin entre linfocitos y monocitos. Adems de dificultar al ojo inexperto la tincin de las clulas sanguneasPor el contrario, si es muy fina, la mayora de neutrfilos y monocitos se hallarn en las reas perifricas. Esto alterar la relacin normal de la distribucin celular leucocitariaSe recomienda entonces, que el grosor ideal, es aquel que nos permita leer a travs de la extensin

Estudio de Lmina PerifricaEl estudio de lmina perifrica comprende la evaluacin morfolgica de las tres lneas celulares ( elementos formes ) que componen la sangreSerie Blanca : LeucocitosSerie Roja : HematesSerie Tromboctica : Plaquetas

Procedimiento del Diferencial Manual de Sangre PerifricaExamen ocular a bajo aumento ( 10X )Determinar las caractersticas de la tincinDeterminar la distribucin celulara. verificar si hay presencia de agregadosplaquetarios que pueden producir errores de conteo en los equipos o llevar a conteos bajos falsos b. Verificar la presencia de Rouleaux en GRc. verificar la presencia de agregados leucocitarios causados por inadecuada mezcla de sangre despus de su coleccinSeleccionar la mejor rea para una detallada evaluacin morfolgicaa. buscar una distribucin homognea donde los eritrocitos no se sobrepongan unos a otrosb. evitar reas huecasc. evitar reas extremas donde los eritrocitos adopten forman geomtricas

Lectura a mediano aumento ( 40X o 50X )este tipo de lectura nos sirve para tener una visin panormica y completa del frotis y es de utilidad para el personal adiestrado en el reconocimiento celular, porque nos permite lecturas a mayor velocidad, sin sacrificar la precisin. Se recomienda su uso para lminas de pacientes leucopnicos.Algunas personas inclusive pueden calcular el numero de leucocitos pmmc contando las clulas blancas normales y rotas, contando 10 campos, luego obteniendo su media y posteriormente multiplicandolo por 3000

Lectura a mayor aumento ( 100x )Se lleva acabo usando un tabulador o contmetro, manual o digital. Deben incluirse todas las clulas de la serie blanca, maduras e inmaduras.No deben incluirse en el recuento de 100 leucocitos a los GR nucleados y megacariocitos nucleadosCualquier leucocito conteniendo una inclusin anormal deber ser reportado pero con un conteo en paralelo por las 100 clulas contadasEjemplo : Ud observ 60 neutrfilos en su conteo de100 de los cuales 20 de ellos tenan cuerpos de Dhle, ud deber informar al final del recuento : neutrfilos (60%), y cuerpos de Dhle 20%Se deber reportar los siguientes inclusiones : - cuerpos de Dhle- cuerpos de Auer- anomala de Pelger Huet- anomala de May hegglin- inclusiones de Alder Reilly- inclusiones Chediak Higashi- granulaciones txicas - vacuolas citoplasmticas o degenerativas

Usted deber reportar cualquier clula anormal o indiferenciada que observeDeber reportar GR nucleados si estos exceden al 6% y corregir su recuento de leucocitos con la siguiente formula :

Leucocitos contados / mm3 x 100 = leucocitos corregidos / mm3 100 + N hemates nucladosEjemplo : si un paciente tiene un conteo de 15,000 leucocitos pmmc y 35 % de GRN, su conteo corregido ser de 11,111 pmmc

Evaluacin de la Serie RojaEn este punto el observador deber reportar su minucioso examen de los GR, indicando la presencia de Hipocroma, Anisocitosis y Poiquilocitosis.Deber reportar tambin inclusiones eritrocitarias y hemoparsitos si los hubiera.Tambien indicar la presencia de clulas inmaduras de la serie roja si las hubieran

MADURACINSERIE

ROJA

Hipocroma : cuando una clula roja individual contiene un rea plida central que es mayor a la tercera parte de su dimetro se denomina clula hipocrmicaRango medio para denominar hipocrma en 10 campos microscpicos ( 100 160 hemates por campo )

a. normocroma : 0 - 5b. leve hipocroma : 6 - 15c. moderada hipocroma : 16 - 30d. marcada hipocroma : > 30

Nota : la hipercroma no esta reportada aqu pero se relaciona con la presencia de esferocitos.

Hipercroma : se denomina as a las clulas rojas profundamente coloreadas en relacin al resto, y esto debido a su alto contenido en hemoglobina, mayor al que debera contener

Anisocitosis : cuando se presenta en el campo eritrocitos de diferentes tamaosNormoctos :dimetro longitudinal : 7 8 Diamatro transversal ( espesor )perifrico : 2 central : 1 Superficie : 120 - 140 Volumen : 80 95

Microcitosis : hemates con un dimetro inferior a 7 y un volumen inferior a 80 3Macrocitosis : hemates con un dimetro superior a las 8 y un volumen superior a las 100 3Megalocitos : hemates con dimetro superior a las 11

Rango medio para anisocitosis / 10 campos

Normal Leve Anisocitosis Moderada Anisocitosis Marcada Anisocitosis

0 - 5 6 - 15 15 - 30 > 30

Poiquilocitosis : cuando se presentan varias formas diferentes en los hemates en un campo microscpicoSi se observa solo un tipo leve de anormalidad la poiquilocitosis ser leve, pero si coexisten diferentes formas de hemates, entonces ser marcada, no importando que individualmente sean leves Se recomienda que cada forma anormal sea evaluada separadamente

Rango medio para tipificar poiquilocitosis /10 campos

Normal : 0 - 1Leve : 1 - 5Moderada : 6 - 15Marcada : > 15

Acantocitos AHAA. sideroblsticaAHMEnfermedad hepticaEnfermedad renal Post- esplecnotomaDrepanocitos Clulas facliformesA. drepanocticaEnfermedad Hb S - C

Esquistocitos Son GR fragmentadosAHMA. megaloblasticaTalasemia mayorA. hemolticasLeucemia agudaHiperesplenismo Megalocitos

Anemias megaloblasticasDimetro > a 11 micras

ANEMIA MEGALOBLASTICA ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA MIELOFIBROSIS TALASEMIA MAYOR TRAUMA MECANICO

Rouleaux Cuando los GR se presentan en fila de monedaMieloma MultipleIncremento de gamma globulina Macroglobulinemia de Waldenstrom

Dianocito Clula en Tiro al Blanco ESTOMATOCITOSIS HERDITARIA LEUCEMIA AGUDA ALCOHOLISMO CON ENFERMEDAD HEPTICA ARTEFACTOS TALASEMIAS

Anillo de CabotCuerpos de PappenheimerPunteado BasfiloCuerpos de Heinz

Reticulocitos Policromatofila Cuerpos de Howell JollyPappenheimer

Serie BlancaLa frmula leucocitaria es la denominacin usual que se da al recuento porcentual de los diferentes leucocitos que circulan en la sangreEn condiciones de normalidad esta constituida por 5 poblaciones de leucocitos :Neutrfilos ( en su gran mayora segmentados )Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos

Variables que pueden influir en la formula leucocitaria realizada mediante el mtodo visualDistribucin irregular y no aleatoria de los leucocitos en la extensinRealizacin de la lectura en una zona inapropiadaVariaciones de la calidad y las caractersticas de la tincin ( tincin cida o bsica )Observacin de un nmero insuficiente de clulasPericia del observador en la identificacin celular neutrfilos segmentados Vs neutrfilos en banda monocitos Vs linfocitos activados o atpicos formas inmaduras de granulocitos neutrfilos

SERIE

MIELOIDE

Mieloblastos :Es redondeadoDimetro entre 15 20 Su ncleo es grande, redondeado, rojizo y tiende a centrarseSu cromatina es laxa y contiene de 2 a 3 nucleolos visiblesSu citoplasma es basfilo y algunas contienes finas granulaciones azurfilas

Promielocito :Se origina por maduracin y maduracin del mieloblastoEs redondeadoDimetro de 16 25 Ncleo grande, redondeado, menos rojizo y tiende a excentraraseCromatina laxa y generalmente se observa nucleolos en ella, puede presentar zonas de condensacinCitoplasma abundante, repleto de grnulos primarios muy azurfilos

MIELOCITOS

JUVENILES O METAMIELOCITOS

METAMIELOCITOS

Metamielocitos Vs No SegmentadosRegla de la Mediana : Si al completar mentalmente la circunferencia nuclear y trazamos una lnea media imaginaria y esta muestra la hendidura antes de la media estamos frente a un juvenil o metamielocito. Si por el contrario la hendidura esta detrs de la lnea media, estamos frente a un abastonado Juvenil No Segmentado

Metamielocitos Vs No segmentadosRegla del Dimetro : esta se basa en el ancho del ncleo. Si la anchura de esta es similar a la mitad de la longitud del ncleo estamos frente a un metamielocito o juvenil, en cambio si el ancho nuclear es menor a la mitad de la longitud del ncleo, estamos frente a una clula en banda. Juvenil No Segmentado

CLULAS ENBANDAOEN CAYADOOABASTONADOS

Clulas Neutrfilas en Banda

Neutrfilos Vs No SegmentadosRegla del TercioSi la estrangulacin de la continuidad nuclear es menor a un tercio de la parte mas ancha del mismo ncleo, entonces es un segmentado

Regla del FilamentoSe dice que estamos frente a un segmentado siempre y cuando se observe un ncleo polisegmentado y se observe al menos un puente de cromatina

Neutrfilos Vs No SegmentadosNeutrfilos Clulas en Banda

Criterios para la diferenciacin entre neutrfilos Vs no segmentadosSi seguimos con la mirada la continuidad nuclearY en algn momento esta se entrecruza con otraLnea del mismo ncleo , entonces lo llamamosSegmentado. Del mismo modo si al termino de laObservacin de la continuidad de la membranaNuclear sobra ncleo lo llamamos segmentado.( Fig. 1 )

Si al observar la continuidad nuclear no notamosCruce de lneas, entonces lo estamos frente a unAbastonado. ( fig. 2 )

Fig. 2

Son clulas redondeadas, de tamao entre 12 y 14 um. Su ncleo est segmentado en 2 a 5 lbulos, unidos por unos finos puentes cromatnicos. El citoplasma es rosa plido y contiene numerosos grnulos neutrfilos que se tien de color marrn con las coloraciones panpticas habituales, as como cierto nmero de grnulos primarios ( 10 20 % ) o azurfilos dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrfilos. Su ncleo es de color violeta oscuro y presenta cromatina densaAlgunas veces su ncleo presenta un pequeo pndice en palillo de tambor ( cromatina sexual )

NEUTRFILOSPOLISEGMENTADOS

Granulaciones Txicas Pelger - Huet

Vacuolas CitoplasmticasVacuolas Degenerativas

BASFILOPoseen un ncleo bilobulado y grandes grnulos esfricos basoflicos y metacromticos dados por heparina e histamina. Liberan adems aminas vasoactivas y sustancia de reaccin lenta de la anafilaxia.

Clula redondeada12 17 Ncleo violeta, generalmente bilobulado simtrico unido por un puente de cromatina o en forma de anteojosPresenta grnulos, grandes y acidfilos que no cubren el ncleoEstos grnulos se tien con la eosina y contienen diversas sustancias como la peroxidasa, fosfatasa cida, hidrolasas, etc

Eosinfilos

Serie Linfoide:

Linfoblasto Linfocitos Prolinfocitos

Dimetro variable de 7 18 Pueden diferir en su relacin N / CEl citoplasma es variable ( escaso o abundante )Su coloracin es azul plida, pero aumenta en los linfos reactivos ( estimulados )Pueden presentar una granulacin azurfila escasa en el ciptoplasmaNcleo redondeado y cromatina compactaLa densidad de la cromatina puede variar entre los diferentes estados. Es generalmente elevada pero pueden presentar zonas mas laxas

Linfocitos

LINFOCITOS ATPICOS

MAS LINFOCITOS ATPICOS

Plasmocitos 8 20 de dimetroRelacin N/C 2:1 o 1:1Ncleo redondo u ovalCromatina densa azul purpura con grandes muescas cerca al margen nuclearNo presenta nucleolosCitoplasma moderado, basfilo, con zona clara perinuclear adjacente al ncleoPuede contener una o mas vacuolasNo presenta granulaciones citoplasmticas

Monoblasto Promonocito Monocito Serie Monoctica

MONOCITOSSon las clulas circulantes de mayor tamao. Poseen un ncleo excntrico en forma de U en forma arrionadaEl ncleo suele presentar una ubicacin central 14 20 de diametro Citoplasma abundante y de color lila plidoPresenta fina granulacin azurfilaPresenta cromatina laxa o filamentosaEn ocasiones se halla vacualizadoSon los precursores del sistema mononuclear fagoctico, que incluye macrfagos (histiocitos), osteoclastos, macrfagos alveolares, clulas de Kupfer en el hgado y la microglia en el sistema nervioso central.

El recuento diferencial leucocitario suministra informacin sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos de la sangre y permite la deteccin de clulas anormalesSe basa en la observacin microscpica de 100 a 200 leucocitos dispuestos en una extensin de sangre ( frotis ) convenientemente teidaLa calidad de la extensin de la sangre es de vital importancia para la realizacin de una correcta lectura de la lmina.

Promegacariocito Megacariocito GranularMegacariocito en BrotacinMegacariocito Productor de Plaquetas

Serie Tromboctica

Las plaquetas son las clulas sanguneas mas pequeas del organismo Se producen por fragmentacin simple del citoplasma de los megacariocitos. Son clulas anucleadas de forma discoide de 2 4 micras de dimetro y 8 micras de volumen. poseen una vida media de 7 - 10 das y su rango va de 150,000 a 450,000 pmmc

Trombocitopenia :

Leve: 150,000 - 100,000Moderada : 100,000 - 50,000Severa: < 50,000

Macroplaqueta Plaquetas Normales

Serie Tromboctica Debemos reportar la cantidad de plaquetas en lmina ( trombocitopenias o trombosis )Debemos dar un informe detallado sobre la citomorfologa de las plaquetasReportar si hay plaquetas normales, degranuladas, pequeas o macroplaquetasSe debe informar si existe la presencia de agregados plaquetariosEs muy importante una impecable tcnica en el momento de realizar el frotis, es decisivo.

Recuento en Lmina Perifrica Damacheck :

( Rcto 1000 GR + F ) x 100

Factor = ?

Hto 35 ( + 5 )Hto : 35 - 39 ( + 3 )Hto : 40 ( + 1 )