RADIOBIOLOGIA

Estudio  de  los  efectos  de  las  radiaciones  ionizantes  en  tejidos  biológicos

RADIACION  IONIZANTE

DIRECTA  

• Electrones,  protones,  iones  pesados,  par>culas  alfa  y  beta  

INDIRECTA  

• Fotones  (rayos  X,  rayos  Gamma)  y  neutrones

LET    Energía  media  (dE)  imparHda  por  los  eventos  de  excitación  e  ionización  causados  por  una  parHcula  cargada  atravesando  una  determinada  distancia  LET  =  dE/dl  (keV/micra)

MAGNITUDESGRAY  :  Unidad  Ssica  de  radiación  

Unidad  de  dosis  absorbida  (1Gy=1Jul/Kg)  

(Rad:  ergio/gramo  -­‐  100rad=1Gy)  

Produce  1-­‐2  x  105  eventos  ionizantes/célula  

1%  en  ADN  

Un  único  rayo  de  Co60  depositará  alrededor  de  1mGy  en  una  célula

Otras  unidades

• Dosis  equivalente:  dosis  al  órgano  corregida  por  un  factor  de  ponderación  del  Hpo  de  radiación  que  Hene  en  cuenta  la  eficacia  biológica  relaHva  de  la  radiación  incidente  para  producir  efectos  estocásHcos.  Este  factor  de  corrección  es  numéricamente  1  para  rayos  X.  Se  mide  en  Sievert  (Sv)  

• Dosis  efecAva:  suma  ponderada  de  las  dosis  equivalentes  de  todos  los  órganos  y  tejidos.  Se  mide  en  Sievert  (Sv)

RELATIVE  BIOLOGICAL  EFFECTIVENESS

RADIACION  Secuencia  de  eventos

EFECTOS  DE  LA  RADIACION

• Directa:  daño  directo  al  ADN  

!

• Indirecta:  por  ionización  del  agua  u  otros  átomos  y  moléculas  que  producen  radicales  libres  que  actúan  como  intermediarios  para  causar  daño  al  ADN

REACTIVE  OXYGEN  SPECIES  (ROS)

Dado  que  el  mayor   componente  de   las   células  es   el   agua,   el   evento   de   ionización   más  frecuente  es  la  radiolisis  del  agua,  produciendo  ROS  

El  agua  más  relevante  es   la  que  está   localizada  dentro  de  un  radio  de  2nm  del  ADN  

El  efecto  neto  de  los  ROS  es  la  oxidación  de  los  consHtuyentes  celulares  

Alrededor   del   60%   del   daño   al   ADN   causado  por  Rayos  X  es  debido  a  ROS  

Alrededor   del   75%   es   debido   a   radicales  hidroxilo  (OH.)  

Prx:  peroxiredoxina

OXIGENOSe  une  a  radicales  H  para  formar  PEROXIDO  DE  HIDROGENO  

    H.  +  O2                  HO2.  (+HO2

.  )                                H2O2  (+O2)  

 Se  une  a  electrónes  para  dar  SUPEROXIDO  

    e-­‐  +  O2                  O2-­‐        +  (H2O)                HO2

.  +  OH-­‐  

Se  une  a  radicales  orgánicos  para  formar  PEROXIDOS  

    R.    +  O2                RO2.  (radical  peroxido)  

    RO2.  +  R’  H                    ROOH  +  R’    (hIdroperoxido)  

    RO2.  +  R’.       ROOR’    (peroxido)  

El  oxígeno  fija  las  lesiones  que  los  radicales  libres  en  el  ADN  de  forma  que  no  puedan  ser  facilmente  reparadas  (potente  radiosensibilizante)  

Oxygen  Enhancement  RaAo  (OER)

DNA  As  RadiaAon  Target

MulHple  lines  of  evidence  point  to  DNA  damage  being  criAcal  component  in  cell  death  • Micro-­‐irradiaHon  studies  show  that  to  kill  a  cell  requires  much  higher  dose  if  

cytoplasm  only  is  irradiated  vs.  if  nucleus  is  irradiated  • Isotopes  with  short-­‐range  emission  (e.g  I-­‐125)  produce  efficient  killing  when  

incorporated  directly  into  DNA  • Incidence  of  single  strand  DNA  breaks  doesn't  result  in  cell  kill,  while  incidence  of  

double  strand  breaks  and  chromosome  abnormaliHes  is  associated  closely  with  cell  kill  

• Thymidine  analogues  (IUdR,  BrUdR)  modify  radiosensiHvity  when  incorporated  into  chromaHn  

However,  there  is  some  evidence  that  radiaHon  damage  to  cell  membranes  may  also  be  important,  possibly  triggering  apoptosis  Finally,  there  is  also  evidence  for  'bystander  effect',  where  for  every  micro-­‐targeted  cell  damaged  by  RT,  neighboring  80-­‐100  would  also  die  and/or  show  evidence  of  damage

SINGLE  STRAND  BREAK  1000  /  CELL  /  GRAY  !

DOUBLE  STRAND  BREAK  30/  CELL  /  GRAY  

BASE  CHANGE  (eg  C  -­‐  U)  BASE  LOSS  BASE  MODIFICATION  (eg  thymine/cytosine  glycol)  1000  /  CELL  /  GRAY

DNA-­‐PROTEIN  CROSSLINK  1  /  CELL  /  GRAY  INTRASTRAND  CROSSLINK  0.5  /  CELL  /  GRAY  

DNA  As  RadiaAon  Target

El  depósito  de  energía  no  es  uniforme.  Sigue  dos  patrones:    

"Spur":  diameter  de  ~4  nm  (2x  DNA  diameter),  100  eV  energy  deposited,  ~3  ion  pairs.  X-­‐rays  deposit  95%  of  their  energy  via  spurs  

"Blob":  diameter  of  ~7  nm,  100-­‐500  eV  energy  deposited,  ~12  ion  pairs.  Neutrons  and  alpha  parHcles  deposit  much  of  their  energy  via  blobs.  Due  to  higher  number  of  ion  pairs  generated,  DNA  damage  can  be  much  more  severe  than  in  spurs  

Damage  from  spur  and  blob  energy  deposiHons  can  lead  to  mulHple  close  sites  of  DNA  damage,  termed  locally  mul/ply  damaged  site  (MDS)

DNA  As  RadiaAon  Target

!

Eliminación  de  radicales  libres  (scavengers)  

Número  de  ionizaciones  próximas  al  ADN  (LET)  

EfecHvidad  en  la  reparación  del  ADN

!• D0:  dosis  que  produce  de  media  un  evento  letal  por  célula  

• EstadísHcamente  aproximadamente  el  37%  de  las  células  de  una  población  expuesta  a  una  dosis  de  radiación  D0  sobrevivirá  (SF),    mientras  que  el  resto  acumulará  uno  o  múlHples  eventos  letales  

• Para  la  mayoría  de  células  de  mamíferos  D0  para  fotones  está  entre  1-­‐2Gy

Frecuencia  de  daño  al  ADN  con  fotones

Reparable  sublethal  damage  

Base  damage  and  single  strand  breaks  

Typically  efficiently  repaired.  However,  if  incorrectly  repaired,  may  lead  to  alteraHon  in  DNA  base  sequence  and  thus  to  mutaHons  

Frequency  of  mutaHons  usually  increases  in  dose-­‐dependent  manner,  but  at  higher  doses,  lethal  events  begin  to  predominate  and  frequency  of  surviving  mutaHons  decreases  

At  high  dose,  intertrack  repairable  Sublethal  Damage  may  Accumulate  forming  unrepairable,  lethal  MDS,  also  Known  as  β-­‐type  killing  

Double  strand  breaks  

Simple  DSB:  defined  as  the  occurrence  of  two  single-­‐strand  breaks  (SSBs)  within  approximately  6-­‐10  base  pairs  caused  by  a  single  radiaHon  track.    

Complex  DSB:  In  addiHon  characterized  by  a  presence  of  other  DNA  damage  sites  (oxidaHve  base  lesions,  abasic  (AP)  sites,  single  strand  breaks)  in  close  proximity  to  the  break  termini.  Occur  in  ~30%  of  low  LET  induced  DSBs  

It  is  postulated  that  complex  DSBs  may  similarly  be  responsible  for  majority  of  cell  kill  resulAng  from  low  LET  radiaAon,  aver  simple  DSBs  are  repaired.  A  high  degree  of  associated  base  damage  in  complex  DSBs  may  be  a  factor  in  poor  repair  via  the  non-­‐homologous  end-­‐joining  pathway  (NHEJ)  

α-­‐type  killing

Lethal  damage

CROMATINA

Cada  célula  2m  de  ADN  

La  estructura  básica  es  el  nucleosoma,  que  son  146  pares  de  base  de  ADN  envueltos  alrededor  de  2  copias  de  histonas  H2A,  H2B,  H3,  y  H4  

Los  nucleosomas  se  evuelven  a  su  vez  alrededor  de  otras  proteinas  para  formar  la  cromaAna  compacta  

La  cromaHna  está  máximamente  compactada  durante  la  mitosis  y  es  2,8  veces  más  sensible  a  las  roturas  de  ADN  que  en  la  interfase  

La  trascripción  requiere  decompactación  para  faciHlar  la  iniciación  y  elongación  (aceHlación  y  desaceHlación  de  histonas)

700R! 1500R!

Used  the  macrocolony  assay  in  mouse  jejunum  to  assessed  the  effects  of  2  radiaHon  doses  given  varying  Hmes  apart  to  measure  the  Hme  to  and  extent  of  repair,  redistribuHon,  and  repopulaHon  (regeneraHon)  between  dose  fracHons.  

Withers, H. R. and Elkind, M. M. Radiology 91:998, 1968!

Respuesta  Asular

12.5Gy! 14.0Gy!

15.5Gy! 17.0Gy!

Respuesta  Asular

TEJIDOS  DE  RESPUESTA  AGUDA  IntesHno  Piel  Médula  ósea  Mucosas  !!TEJIDOS  DE  RESPUESTA  TARDIA  Cerebro  Médula  espinal  Riñones  Pulmón  Vejiga  

Las  5  R’s  de  la  Radioterapia

• Reparación  del  daño  subletal  

• Redistribución  de  las  células  en  el  ciclo  celular  

• Repoblación/regeneración  

• Reoxigenación  

• Radiosensibilidad  específica

EFICACIA  BIOLOGICA  DE  LA  RADIOTERAPIA

• Dosis  total  (D)  -­‐  (alpha  and  beta)  

• Dosis  por  fracción  (d)  -­‐  (alpha  and  beta)  

• Duración  (T)-­‐  (alpha  and  beta)  

• Tiempo  entre  fracciones  (t)  

• Volumen  irradiado  (V)  

• Calidad  de  la  radiación  (Q)  -­‐  RBE  

• Presencia/Ausencia  de  oxígeno  -­‐  OER  

• Eficiencia  y  compleHtud  de  la  reparación  del  ADN  

• Fase  del  ciclo  celular  y  nivel  de  acHvación  génica  

• Tipo  de  tejido/tumor

REPARACION  DEL  ADN

•Base  excision  repair  

• NucleoHde  excision  repair  

• DNA  mismatch  repair  

• Double  strand  break  repair

REPARACION  DEL  ADN

130  genes  parHcipan  en  reparación  del  ADN  

Procesos  principales  en  la  reparación  

• Nucleasas:  eliminan  el  ADN  dañado  

• Polimerasas:  reconstruyen  el  ADN  

• Ligasas:  restauran  el  esqueleto  fosfodiester

RECOMBINACION  HOMOLOGA  !a,  La  DSB  es  reconocida  por  el  complejo  MRN  (complejo  de  proteinas  reparadoras  Mre11,  RAD50  y  NBS1)  !b,  Los  finales  del  ADN  se  cortan  permiHendo  su  unión  a  RPA,  RAD51  y  RAD52  a  las  colas  del  ADN  !c,  Busqueda  de  región  homóloga  en  el  ADN  intacto  iniciando  el  emparejamiento  facilitado  por  RAD54  !d,  Sintesis  de  ADN  y  formación  de  una  Holliday  junAon  (unión  cruzada  que  ocurre  entre  las  cuatro  cadenas  de  AND  durante  la  recombinación)  !6.  Esta  unión  posteriormente  se  libera  por  una  resolvasa  y  las  terminaciones  del  ADN  se  reunen  y  manHene  intacto

RECOMBINACION  NO  HOMOLOGA  (NHEJ)  !a,  La  DSB  es  reconocida  por  el  dimero  ku  (Ku70–Ku80)  y  la  DNA-­‐PKcs    b,  Se  unen  las  dos  terminaciones  de  ADN    c,  DNA-­‐PKcs  y  Artemis  se  fosforilan  y  las  terminaciones  de  ADN  son  procesadas  por  un  complejo  consistente  en  XLF  (XRCC4-­‐like  complex;  también  conocido  como  NHEJ1),  XRCC4  (X-­‐ray-­‐repair  cross-­‐complemenHng  protein  4)  y  DNA  ligase  IV,  y  Artemis.    d,  Las  terminaciones  del  ADN  son  ligadas  por  DNA  ligasa  IV  y  disocia  los  factores  reparadores

Enfermedades  autosómicas  recesivas  con  defectos  en  la  reparación  del  ADN

• Xeroderma  pigmentosum  (XP)  and  related  Cockayne’s  syndrome      

• Fanconi’s  anemia  

• Bloom’s  and  Werner’s  syndromes  

• Li  Fraumeni  syndrome  

• Ataxia  telangiectasia  

• Nijmegen-­‐breakage  syndrome

“Muerte  celular”  radiobiológica

Pérdida  de  su  integridad  reproducHva  

catastrofe   mitóAca:   muerte   celular   resultante   de  mitosis   aberrantes   en   celulas   con   puntos   de   control  defectuosos    

senescencia:   reHrada   de   células   peligrosas   del   pool  proliferaHvo  

apoptosis:  muerte  celular  programada  

necrosis:  muerte  celular  patológica

Senescencia  en  fibroblastos  →  FIBROSIS

Mecanismos  de  muerte  celular

•Muerte  programado  Hpo  1:  Apoptosis  

•Muerte  programada  Hpo  2:  Autofagia  

•Muerte  patológica:  Necrosis

AUTOFAGIA  !Las  organelas  y  otros  componentes  celulares  son  secuestrados  en  autofagosomas  que  se  fusionan  con  liposomas  (autodigesHon)  

NECROSIS  !Es  un  proceso  rápido  no  fisiológico  asociado  con  la  pérdida  de  integridad  de  la  membrana  plasmátca  y  disregulación  de  la  homeostasis  de  iones  

Se  procude  la  inflamación  y  explosión  de  la  células  al  entrar  agua  

Suele  afectar  a  grupos  de  células  más  que  a  células  aisladas  

!

APOPTOSIS  !La  célula  y  el  núcleo  se  encoge  Fragmentación  nuclear:  cuerpos  apoptóHcos  

Membrana  bullosa  pero  sin  pérdida  de  integridad  

Falta  de  respuesta  inflamatoria  y  fagocitosis  (muerte  silenciosa)  

!

Exposición  accidental  a  la  radiación

• Industria  nuclear:  Tokaimura;  Chernobyl  

• Pérdida  de  material  radiacHvo  

• Bomba  atómica  (Hiroshima  y  Nagasaki)

Síndrome  de  irradiación  aguda

• Síndrome  hematológico  

• Síndrome  gastrointesHnal  

• Síndrome  neurológico  

• Eritema-­‐descamación  

• Daño  citogenéHco  (alteraciones  cromosómicas)  

• Daño  genéHco  (células  germinales)

Efectos  clínicos  de  la  radiación  ionizante

Efectos  no  estocásAcos  (o  no  probabilísAcos).  

Son  los  efectos  que  se  relacionan  con  la  dosis  de  forma  determinista,  es  decir,  si  se  ha  depositado  una  dosis  equivalente  suficientemente  alta,  aparecerán  cierto  Hpo  de  efectos.  Por  ejemplo,  si  una  dosis  de  rayos  X  excede  de  1Gy,  se  observará  un  enrojecimiento  de  la  piel,  tras  cierto  nivel  de  dosis  se  producen  cataratas  en  los  ojos,  etc.  

Efectos  estocásAcos  (probabilísAcos)  

Son  efectos  que  pueden  aparecer,  pero  no  lo  hacen  necesariamente.  Lo  más  que  se  puede  decir  es  que  existe  una  cierta  probabilidad  de  que  estos  efectos  se  produzcan.  Los  ejemplos  más  conocidos  son  el  desarrollo  de  cáncer  y  las  mutaciones  genéHcas.  

Efectos  clínicos  de  la  radiación  ionizante

Efectos  somáAcos  

Cualquier  tejido  

Agudos  (0-­‐2  meses)  y  tardíos  (2  meses-­‐20  años)  

Variabilidad  individual,  especie,  celular,  Hsular,  extensión  de  la  exposición,  dosis  y  tasa  de  dosis  

Efectos  determinísHcos

• These  effects  are  observed  aver  large  absorbed  doses  of  radiaHon.  Doses  required  to  produce  determinisHc  effects  are,  in  most  cases,  in  excess  of  1-­‐2  Gy.    

• There  is  usually  a  threshold  dose  below  which  the  effects  are  not  manifested.    

• With  increasing  dose  the  severity  of  the  effect  increases.

Efectos  determinísHcos

• Piel.  Eritema  1.65-­‐3.5  Gy.    

• Pelo.  Depilación  2.0-­‐6.0  Gy  

• Esterilidad.  Hombre  4.0  Gy;  Mujer    6.25  Gy  

• Cataratas:  2-­‐5Gy  (10  Gy  protraido)

Efectos  de  la  irradiación  fetal

• Muerte  prenatal,  muerte  neonatal,  malformaciones  congénitas  y  retraso  de  crecimiento  y  desarrollo  

• La  mayor  incidencia  de  malformaciones  si  la  irradiación  es  durante  organogénesis  (3-­‐8  semanas)  

• Umbral  para  malformaciones  100-­‐200mGy  

• Umbral  para  daño  cerebral  200mGy

Efectos  tardíos  (estocásAcos)  de  la  exposición  a  radiación

• Carcinogénesis  (leucemia,  pulmón,  mama,  Hroides,  hueso)  y  efectos  genéHcos  

• La  probabilidad    del  efecto,  no  su  severidad,  aumenta  con  la  dosis  y  no  hay  umbral  

• Es  el  riesgo  para  la  salud  más  importante  de  las  dosis  bajas  de  radiación

Efectos  estocásAcosRadiaHon  Effects  Research  FundaHons  (RERF)  

• Life  spam  study  90000  (toda  la  población  expuesta)  

• Adult  health  study  20000  (altas  dosis)  

• F1  study  70000  niños  de  padres  expuestos  

• In-­‐Utero  study:  niños  nacidos  entre  sep  1945  a  Mayo  1946

Efectos  estocásAcos440  cancer  deaths  (4%)  and  nearly  100  leukaemia  deaths  (15%)  can  be  a~ributed  to  the  radiaHon  exposure  from  the  bomb  in  1945  

Stomach,  colon,  lung,  leukaemia,  breast,  oesophagus,  bladder,  ovary,  liver  

The  life-­‐Hme  risk  of  dying  from  radiaHon  induced  cancer  aver  an  acute  exposure  to  1  Gy  (or  1  Sv)  is  10%.  If  the  dose  is  given  over  a  period  of  weeks  or  months  the  risk  factor  is  5%,  and  if  spread  over  a  working  life  it  is  4%

Efectos  estocásAcos

• Trabajadores  centrales  nucleares  

• Personas  expuestas  por  enfermedad  (Tbc,  espondiliHs  anquilosante,  masHHs,  cáncer)  

• Personas  expuestas  a  alta  radiación  natural  (mineros,  personas  en  casa)  

• Personas  próximas  a  experimentación  armas  nucleares  y  accidentes  (Islas  Marshall,  Chernobyl)

Efectos  estocásAcos

• It  is  important  to  appreciate  that  in  the  U.S.,  almost  20  percent  of  deaths  are  a~ributable  to  cancer  (400,000  annually)  and  a  very  small  fracHon  of  this  total  number  is  due  to  radiaHon  exposure  

• A  staHsHcally  significant  increase  in  cancer  has  not  been  detected  in  populaHons  exposed  to  doses  less  than  50  mSv.

EsAmación  del  riesgo

• The  Biological  Effects  of  Ionizing  RadiaHons  (BEIR)  Commi~ee  of  the  U.S.  NaHonal  Research  Council  

• InternaHonal  Commission  on  Radiological  ProtecHon  (ICRP)  

• NaHonal  Council  on  RadiaHon  ProtecHon  and  Measurements  (NCRP)  

• United  NaHons  ScienHfic  Commi~ee  on  the  Effects  of  Atomic  RadiaHon  (UNSCEAR).  

EsAmación  del  riesgo

• RadiaHon  induced  tumors  are  clinically,  morphologically  and  biochemically  indisHnguishable  from  those  which  occur  spontaneously.    

• This  implies  that  carcinogenic  effects  of  radiaHon  may  be  demonstrated  on  staHsHcal  basis  only;  that  is,  one  may  infer  such  acHon  by  the  demonstraHon  of  an  excess  in  the  number  of  cancers  in  the  irradiated  populaHon  over  the  natural  incidence.    

• Alternately,  the  probability  of  the  cancer  incidence  from  a  small  dose  is  esHmated  by  extrapolaHng  from  cancer  rates  observed  following  exposure  to  large  doses.  

• Risk  vs  benefit

Carcinogénesis  por  radiación

•Modelo  culHvo  Hsular  

• Modelo  animal  

• Modelo  humano