UNIVERSIDAD TCNICA FEDERICO SANTA MARA

Estudio de perfiles de la B-galactosidasa.

Bioprocesos avanzados Marcelo Llorens - Gustavo Garay

11/05/2015

En el presente informe se presentan la metodologa y resultado para el anlisis de la B-galactosidasa, utilizada para la produccin de leche sin lactosa. Se muestran los diferentes perfiles de conversin de sustrato, inactivacin trmica de la enzima y, finalmente, la curva de produccin volumtrica a diferentes temperaturas.

Enunciado. La enzima -galactosidasa (EC 3.2.1.23) cataliza la hidrlisis de lactosa generando glucosa y galactosa. Una de las preparaciones comerciales de esta enzima es Lactozym producida por la empresa Novozymes. Analice el proceso de produccin de leche sin lactosa utilizando Lactozym en un reactor por lotes en condicin isotrmica utilizando el modelo cintico propuesto por Jurado et al. (2002 y 2004). El reactor por lotes contiene leche con un contenido de lactosa de 150mM (5% m/m) y se utiliza una concentracin de Lactozym de 0,80 g/l.

Fig 1: Hidrlisis de Lactosa mediante -galactosidasa. Determine el perfil de comportamiento del reactor por lotes (curva de conversin vs tiempo) junto con el perfil de actividad enzimtica (E/E0) durante la hidrlisis de lactosa con Lactozym a diferentes temperaturas. Calcule a partir de estos datos la productividad volumtrica en funcin de la temperatura para la produccin de leche deslactosada (X = 0,90). Tabla 1: Modelo.

Modelo Definicin Ecuacin Velocidad de reaccin = + + (1) Inactivacin trmica de la enzima ! = !!!! = ! !!!! (2) Efecto de T sobre k = !",!"!!"#$! (3) Efecto de T sobre kd ! = !"#,!"!!"#$%! !! (4) Efecto de T sobre K = !!,!!!!"#"! (5) Referencias: Illanes, A. (2008) Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications. Springer Science+Business Media B.V. Jurado, E., Camacho, F., Luzn, G., Vicaria, J.M. (2002). A new kinetic model proposed for enzymatic hydrolysis of lactose by a -galactosidase from kluyveromyces fragilis. Enzyme Microb Technol 31, 300-309. Jurado, E., Camacho, F., Luzn, G., Vicaria, J.M. (2002). Kinetic models of activity for -galactosidase: influence of pH, ionic concentration and temperature. Enzyme Microb Technol 31, 300-309.

Problemtica. La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, la cual causa problemas gastrointestinales a una parte de la poblacin. Una solucin a esta problemtica es la hidrolisis de la lactosa para formar una mezcla de glucosa y galactosa, lo que permitira poder producir leche y algunos de sus derivados sin lactosa. Un anlisis del perfil de comportamiento de un reactor por lotes permite comprender de una mejor manera el sistema de accin de la enzima, adems, es posible obtener los diferentes comportamientos de los parmetros de inters en la produccin de la leche sin lactosa. La enzima -galactosidasa (EC 3.2.1.23) sufre inactivacin trmica, es necesario crear perfiles de actividad a diferentes temperaturas de esta manera evaluar los tiempos y las temperaturas en las cuales la inactivacin comienza a ser significativa. El intervalo de temperaturas en las cuales la produccin volumtrica de leche sin lactosa es mxima no siempre es el mismo intervalo en el que se encuentra una menor inactivacin o mayor actividad enzimtica, por lo que es necesario generar un perfil de produccin en relacin al tiempo para estimar el intervalo de temperaturas donde la produccin es mxima. Para poder abordar la problemtica requiri definir el sistema y las suposiciones principales. El sistema se define como un reactor tipo Batch, isotrmico, perfectamente agitado y volumen conocido. Suposiciones principales:

1. La temperatura es constante durante todo el proceso.

2. Las concentraciones en el reactor son homogneas.

3. Se asume que los moles de H2O son muchos mayores que los de sustrato.

4. No existen reacciones enzimticas o no enzimticas paralelas que impliquen los componentes a estudiar.

Anlisis del enunciado:

1. Se deduce de la ecuacin 1 de la tabla 1, existe una inhibicin por producto en el sistema.

2. Se deduce de la ecuacin 2 de la tabla 1, la enzima posee una inactivacin a causa de la temperatura.

3. Se deduce de la ecuacin 1 de la tabla 1, la afinidad enzima-sustrato disminuye en relacin a la temperatura.

4. Se deduce por el carcter de las ecuaciones 3, 4 y 5, existe un mximo de velocidad de conversin a

90% en relacin a las temperaturas.

Metodologa: Analizando las ecuaciones empricas y tericas entregadas por el enunciado se establece, que el problema puede ser abordado tanto analstica como numricamente, ya que las ecuaciones 1 y 2 dependen del tiempo y las ecuaciones 3, 4 y 5 son constantes en un sistema isotrmico. Para encontrar en un comienzo el perfil de comportamiento del reactor por lotes, se requiere analizar el modelo de la velocidad de reaccin, ver ecuacin 6. = + + 6 Podemos expresar la velocidad y los productos en funcin de la concentracin de sustrato presente en el reactor, ver ecuacin 7 y 8. = (7) = ! 8 Si remplazamos los trminos de Ec. 7 y 8 en la Ec. 6. Obtenemos una ecuacin que relaciona el tiempo con la concentracin de sustrato. = + + ! 9 Finalmente la variacin de sustrato en el tiempo se expresa como: = + ! (10) Se decide aplicar mtodos numricos para resolver el problema, a pesar de que, como se ha dicho con anterioridad, es posible resolver el problema con mtodos analticos. Se aplica mtodo de Euler, ya que este satisface las necesidades del problema al utilizar MatLab. A diferencia de utilizar mtodos numricos ms elaborados como Runge Kutta o Taylor, el mtodo de Euler de diferencias finitas es simple de aplicar y satisface el problema ya que las ecuaciones a trabajar no poseen cambios bruscos de pendientes. Es necesario redefinir todas las variables a utilizar para poder aplicar correctamente el mtodo de Euler. Redefinimos la ecuacin en base a diferencias finitas y establecemos las dependencias de las variables, ver ecuacin 11. !!! !!!! ! = ()(, !)!() + ! 11

Obtenemos el valor de la concentracin de sustrato en el tiempo i+1 en base al paso anterior i, ver ecuacin 12. !!! = , ! ! + ! !!! ! + ! 12 La conversin (X) se define de la siguiente manera: ! = ! = 13 Despejando la conversin obtenemos, ver ecuacin 14: = 1 ! (14) La conversin se redefine en base al mtodo del Euler obteniendo, ver ecuacin 15: !!! = 1 !!!! 15 La inactivacin trmica de la enzima es considerada variable en el tiempo, por lo que se redefine de la siguiente manera: ! = !!!! = ! !!!! 2 ! = ! !!! !! !!! 16 Siendo ! la constante de inactivacin trmica, la cual tiene comportamiento exponencial (ver ecuacin 4), esta se redefine de la siguiente manera: !! = !"#,!"!!"#$%!! (17) Con todo lo anterior es posible aplicando un paso de Temperatura (Fue distinto para cada grfico obtenido, debido a la necesidad de mas precisin o mayor diferencia para comprender el comportamiento de cada uno)y de tiempo de t=1 minuto es posible encontrar los perfiles de comportamiento de la enzima y los perfiles de inactivacin trmica a diferentes temperaturas. Se modela en MatLab de la siguiente manera: Se gener distintas matrices de k y de kd (que slo dependen de la temperatura), y luego mediante un for se procedi a hacer la evaluacin de los modelos, en el tiempo (esto incluye la evaluacin del Km, adems del la concentracin de enzima E y la concentracin de sustrato).

La productividad volumtrica se define para todo reactor como: ! = . (18) Por lo que para el caso de estudio se define como: ! = ! ! (19) Se establece en el enunciado que la conversin deseada es de 90%, por lo que la productividad volumtrica a temperatura constante se establece como, ver ecuacin 20. !! ! = 0,90 !! = 0,90,! 20 En base a esta ecuacin (Ec. 20) y los resultados obtenidos para los perfiles de conversin e inactivacin, se aplica el mtodo de Euler en MatLab, con esto se obtiene el perfil de la productividad volumtrica en el tiempo. Con las matrices obtenidas de conversin para cada temperatura, se utilizo un parmetro de bsqueda (llamado : tolerancia)`, de tal manera que se encontrar el tiempo necesario para alcanzar una conversin del 90%. Con todo lo anterior, sumado a las ecuaciones del modelo (inactivacin, y efecto de la temperatura en los distintos parmetros del modelo) se calcula de manera discreta la concentracin en el reactor isotrmico en el tiempo a distintas temperaturas, por consiguiente, obtenindose la conversin en el tiempo evaluada a las distintas temperaturas. La inactivacin trmica de la enzima (perfil de actividad trmica) se obtiene y grafica con el mismo modelo proporcionado en el enunciado del problema, y se evala a lo largo del tiempo a distintas temperaturas.

Resultados y discusin: Perfil de conversin de sustrato. En base a la metodologa planteada se obtuvo las siguientes curvas representativas de la conversin en el tiempo a diferentes temperaturas.

Figura 1 Curva de conversin del sustrato a diferentes temperaturas

En base a la modelacin realizada, se aprecia que el perfil que alcanza una conversin del 90% es el que posee una temperatura de 42 C, no obstante en los primeros minutos de reaccin hasta alcanzar una conversin de 50% son temperaturas mayores que llegan a conversiones mayores, en base a esto, se puede inferir que a tiempos mayores y conversiones superiores los perfiles con temperaturas menores tienen un mejor desempeo. La inhibicin por producto se ve percibe a niveles de conversin elevados, disminuyendo la velocidad de conversin, esto se ve reflejado en el comportamiento asinttico de las curvas a 42 y 38,5C. Los perfiles caen abruptamente a pesar de que las diferencias de temperatura son constantes, esto se explica por carcter exponencial de ! (ver Ec. 4) y a vez el carcter exponencial de la proporcin de la concentracin de Enzima y Enzima inicial (Ver Ec. 2).

Perfil de actividad enzimtica En base a la metodologa planteada se obtuvo las siguientes curvas representativas de la actividad enzimtica en el tiempo a diferentes temperaturas.

Figura 2 Inactivacin enzimtica de la enzima a diferentes temperaturas.

La inactivacin de la enzima a raz de la temperatura se debe a su rpida desnaturalizacin de la misma, afectado la afinidad enzima-sustrato, lo que se ve claramente reflejado en la cada del tiempo de vida media. Como se mencion en el anlisis preliminar, a medida que aumenta la temperatura el perfil de actividad enzimtica cae. A los 48 C la vida media de la enzima no supera los 10 min, en cambio la vida media a los 42 C (T con mayor conversin) es muy superior a los 100 min. En el caso de utilizar enzima inmovilizada la inactivacin trmica reduce significativamente el nmero de ciclos en el que esta es eficiente, significando un costo importante de operacin ya que la enzima suele ser una de las materias primas ms costosas del proceso productivo.

Productividad volumtrica en funcin de la temperatura En base a la metodologa planteada se obtuvo el perfil de la productividad volumtrica en funcin de temperatura, para un conversin de 90% de sustrato.

Figura 3 Productividad volumtrica en funcin de la temperatura.

La productividad volumtrica alcanza su mximo en el intervalo de temperatura de 41 a 43 C, teniendo un descenso rpido y significativo, se estima que despus de los 46 C la productividad cae a 0 al no alcanzar la enzima el 90% de conversin antes de que esta se inactive por efecto de la temperatura. Lo que coincide con lo presentado en la Figura 1. Existe una amplia zona donde la productividad es alta, lo que implica flexibilidad de trabajo a nivel industrial, no obstante los parmetros de operacin deben ser establecidos en base a costos de produccin, los cuales suelen diferir a los mximos operacionales. En caso de realizar un diseo industrial de un reactor, la temperatura de operacin ptima debe corregirse en base a los costos de los servicios, ya que estos aumentan proporcionalmente a la temperatura de operacin del sistema. Una alternativa operacional es el uso de reactores no isotrmicos, generando perfiles de temperatura para alargar el tiempo de vida media de la enzima sin perjuicio de la productividad.|||||||||||||

Conclusiones En base al anlisis realizado en el presente informe se establece que las suposiciones y metodologa utilizada es capaz de realizar una modelacin correcta del comportamiento de la enzima, reflejado en el cumplimiento de las deducciones iniciales planteadas en el anlisis de la problemtica. La ecuacin de cintica entregada en el enunciado (Ec. 1) muestra una inhibicin por producto, la cual se expresa en el carcter asinttico de los perfiles mostrados en la figura 1. sta inhibicin genera un disminucin de la velocidad de conversin cuando se alcanzan altas concentraciones de glucosa y galactosa. En base a la modelacin realizada y los perfiles obtenidos se establece que, para niveles de conversin de 90%, a los 42 C se alcanza la velocidad mxima de conversin, esto implica que a esta temperatura se reducen los efectos negativos de inactivacin trmica e inhibicin por producto. El perfil de productividad volumtrica en funcin de la temperatura refleja una zona de amplia de temperatura (de 41 a 43C) en donde se maximiza la produccin, esto otorga flexibilidad de operacin del reactor. En base a los datos obtenidos es posible realizar un diseo industrial de un reactor de carcter enzimtico para la produccin de leche sin lactosa, no obstante, es necesario complementar el diseo con un anlisis de costos de produccin e inversin, realizando una minimizacin de costo volumtrico de producto.