ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL DE … · HACIA LA SINTESIS Y TRANSFORMACIÓN DE...
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ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL DE LA ESPECIE NATIVA Berberis tabiensis (LAC) BERBERIDACEAE LORENA PAOLA NUÑEZ ARÉVALO GRUPO DE INVESTIGACIÓN HACIA LA SINTESIS Y TRANSFORMACIÓN DE NETABOLITOS SECUNDARIOS UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA BOGOTÁ 2010
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ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL DE LA ESPECIE NATIVA Berberis tabiensis (LAC) BERBERIDACEAE
LORENA PAOLA NUÑEZ ARÉVALO
GRUPO DE INVESTIGACIÓN HACIA LA SINTESIS Y TRANSFORMACIÓN DE NETABOLITOS SECUNDARIOS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA
BOGOTÁ 2010
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ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL DE LA ESPECIE NATIVA Berberis tabiensis (LAC) BERBERIDACEAE
LORENA PAOLA NUÑEZ ARÉVALO
Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de Magíster en Ciencias-Química
DIRECTOR: RODOLFO QUEVEDO PASTOR Químico Dr.Sc
Profesor Asociado Departamento de Química
Universidad Nacional de Colombia
GRUPO DE INVESTIGACIÓN HACIA LA SINTESIS Y TRANSFORMACIÓN DE NETABOLITOS SECUNDARIOS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA
BOGOTÁ 2010
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AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos: Primero que todo a DIOS y a mis ángeles porque sin ellos nada de esto hubiera sido posible. A mi familia, mi MAMI, JAIME, NATALIA Y MANOLO, que siempre estuvieron y están siempre apoyándome y colaborándome en todo, dándome su amor y cariño incondicional. A mi motor de ahora en adelante YANN JERÓNIMO por darme la motivación para culminar este proceso. A CRISS… por su amor y apoyo incondicional durante estos últimos años. . A la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA - DIB por permitirme realizar mis estudios de Maestría y apoyarme en la financiación de la misma. Al profesor RODOLFO QUEVEDO por haberme dado su orientación, colaboración y apoyo total en este proceso de formación. Porque con todo y todo siempre nos entendimos y formamos un buen equipo. A la profesora BÁRBARA MORENO la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación Productos Naturales Vegetales Bioactivos y Química Ecológica y por ser más que una profesora una amiga. Al profesor LUIS ENRIQUE CUCA porque siempre recibí de el muchos consejos y enseñanzas que me enriquecieron personal y profesionalmente. A los profesores del Dpto. de Química aportarme su conocimiento y siempre estar presentes para resolver cualquier duda. A amigas y compañeras Litta, Sonia y Carolina, con quienes compartí muchos momentos inolvidables y quienes fueron mi apoyo en aquellos momentos difíciles de este proceso. A mis compañeros de laboratorio, July y Karen, a mis otros amigos los de arriba (os pupilos del profe Cuca y a todas aquellas personas que de una u otra forma me aportaron diferentes cosas, desde sonrisas, tiempo y demás a lo largo de este trayecto. Y por supuesto a mis gatos, mi mejor forma de desestresarme cuando hubo momentos de presión, porque si que los hubo!!!!
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CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
CAPITULO 1. Estado actual del tema
1.1 Familia Berberidaceae
1.1.1 Clasificación taxonómica y distribución geográfica
1.1.2 Química
1.2 Género Berberis
1.2.1 Clasificación taxonómica
1.2.2 Distribución geográfica
1.2.3 Usos
1.2.4 Química
1.3 Actividad Insecticida
1.3.1 Actividad insecticida en el género Berberis
1.4 Alcaloides
1.4.1 Generalidades
1.4.2 Alcaloides isoquinolínicos del género Berberis
1.4.3 Biosíntesis
CAPITULO 2. Metodología
2.1 Procedimientos generales
2.2 Material biológico
2.2.1 Metodología propuesta por McLaughlin
2.3 Material vegetal
2.4 Obtención del extracto etanólico
2.5 Obtención del extracto alcaloidal
2.6 Fraccionamiento
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CAPITULO 3. Resultados y discusión
3.1 Elucidación del compuesto A4.3
3.2 Berberina
3.3 Elucidación del compuesto C3.4
3.4 Actividad Insecticida
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS
ANEXOS: Espectros RMN 1D y 2D para tabienina B y columbamina
Mecanismo biosintético para tabienina B
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ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de etilo
°C Grados centígrados
CC Cromatografía en Columna por gravedad
CCD Cromatografía en Capa Delgada
CG-EM Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
CE50 Concentración efectiva del 50%
d Doblete
dd Doble de doblete
EM Espectrometría de Masas
ESI Ionización por electrospray
IR Espectro Infrarrojo
J Constante de acoplamiento
m Multiplete
m/z Relación masa/carga
MeOH Metanol
min Minutos
PF Punto de fusión
PM Peso molecular
ppm Partes por millón
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RMN 1H Resonancia Magnética Nuclear Protónica
RMN 13C Resonancia Magnética Nuclear de carbono trece
s Singlete
uma Unidades de masa atómica
δ Desplazamiento químico
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INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción A1
Tabla 2. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C1
Tabla 3. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C3
Tabla 4. Datos espectroscópicos para tabienina B
Tabla 5. Datos espectroscópicos del compuesto C3.4
Tabla 6. Comparación de datos espectroscópicos del compuesto C3.4 con
compuestos de literatura
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40
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación taxonómica de la familia Berberidaceae
Figura 2. Esqueleto base de un alcaloide protoberberínico
Figura 3. Esqueleto base de una bencilisoquinolina
Figura 4. Estructura de aporfina: aporeina
Figura 5. Esqueleto base de pavina
Figura 6. Estructuras de alcaloides bbi: berbamina y oxiacantina
Figura 7. Estructura de la rotenona
Figura 8. Piretrinas
Figura 9. Nicotina
Figura 10. Algunos núcleos comunes de alcaloides.
Figura 11. Esqueleto base de los alcaloides isoquinolínicos
Figura 12. Estructura de tabienina A
Figura 13. Biosíntesis general de los alcaloides bbi I
Figura 14. Biosíntesis general de los alcaloides bbi II
Figura 15. Fotografía de los frutos y hojas de la especie B. tabiensis
Figura 16. Esquema general del proceso de purificación de los compuestos
aislados
Figura 17. Espectro de masas de alta resolución en modo ESI de Tabienina B
Figura 18. Espectro RMN 1H de la zona aromática de Tabienina B
Figura 19. Espectro COSY de la zona aromática de Tabienina B
Figura 20. Espectro RMN 1H de la zona alifática de Tabienina B
Figura 21. Espectro RMN 13C de la zona aromática de Tabienina B
Figura 22. Datos espectroscópicos para Tabienina B
Figura 23. Correlaciones (H - C) de tabienina B observado en el espectro
HMBC.
Figura 24. Ruta biosintética de la formación de N-metilcoclaurina
Figura 25. Formas canónicas lábiles a sufrir reacción de acoplamiento
fénolico monooxidativo
Figura 26. Dimerización cola-cola en la formación de tabienina B
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Figura 27. Hidroxilación orto al puente éter en la formación de tabienina B
Figura 28. Unión cabeza-cabeza vía radicales libres en la formación de
tabienina B
Figura 29. Unión cabeza-cabeza vía reacciones polares en la formación de
tabienina B
Figura 30. Berberina, alcaloide característico del género Berberis
Figura 31. Diagrama general de la biosíntesis de berberina
Figura 32. Estructura y numeración de 5,6-dihidro-2-hidroxi-3,9,10-
trimetoxidibenzo[a,g]quinolizinium: columbamina
Figura 33. Espectro RMN 1H de la zona aromática para el compuesto C3.4
Figura 34. Espectro COSY del compuesto C3.4
Figura 35. Espectro RMN 13C del compuesto C3.4
Figura 36. Correlaciones (H - C) del compuesto C3.4 observadas en el
espectro HMBC.
Figura 37. Esquema de realización de bioensayos iniciales
Figura 38. Esquema de realización de bioensayos siguiendo la purificación
de compuestos de tipo alcaloidal
Figura 39. Espectro RMN 1H de tabienina B, zona aromática y alifática
Figura 40. Espectro RMN 13C de tabienina B, zona aromática y alifática
Figura 41. Espectro COSY de tabienina B, zona aromática
Figura 42. Espectro COSY de tabienina B, zona alifática
Figura 43. Espectro HMQC de tabienina B
Figura 44. Espectro HMBC de tabienina B
Figura 45. Espectro RMN 1H de columbamina
Figura 46. Espectro RMN 13C de columbamina
Figura 47. Espectro COSY de columbamina
Figura 48. Espectro HMQC de columbamina
Figura 49. Espectro HMBC de columbamina
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INTRODUCCIÓN
El estudio de los productos naturales puede verse como una herramienta que
permite ampliar el conocimiento a nivel científico de diferentes organismos,
teniendo presente los criterios actuales enfocados hacia el mantenimiento y
aprovechamiento de las especies animales, vegetales u otras. Reconociendo
este campo como la búsqueda continúa de rutas alternas y amigables con el
ecosistema, involucrando investigación multidisciplinaria y generando
resultados más asertivos. En este sentido, la química de los productos
naturales muestra una gama de propuestas acordes a los principios ecológicos
y científicos, aportando al estudio químico de los organismos que pueden
presentar actividad biológica promisoria. Dentro de estos organismos se
encuentran las especies vegetales que en su proceso evolutivo han adquirido la
capacidad de sintetizar sustancias que poseen estructuras novedosas útiles en
solución de diferentes afecciones de salud humana, animal y vegetal; en su
gran mayoría presentan variados usos a nivel etnobotánico, medicinal,
farmacéutico e industrial y son la base o principio en el desarrollo de nuevos
productos de síntesis.
Hoy en día se sabe que estos metabolitos secundarios desempeñan un papel
importante en el mecanismo defensivo de las plantas. Por lo tanto en los
últimos años se está retornando al uso de las plantas como fuente de pesticidas
más seguros para el medio ambiente y la salud humana (Jacobson, 1989).
Es conocido que tanto la fauna como la flora colombiana se encuentran dentro
de las más diversas y exóticas del planeta. Por lo que se hace necesario
contribuir al conocimiento de nuestras especies, aportar desde nuestras bases
al desarrollo social y económico de nuestro país, de manera que se den a la
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sociedad nuevas herramientas que puedan ser aplicadas a nivel científico y
cultural. Se ha creado la necesidad de evaluar y conservar el patrimonio
ambiental y ecológico a nivel mundial que a futuro representará una riqueza
invaluable para aquellos que la posean. Desde esta perspectiva, la
investigación y los estudios de bioactividad, fitoquímicos y
quimiotaxonómicos que puedan avalar el desarrollo socio-cultural y científico
de una especie merecen ser realizados y evaluados.
CAPITULO 1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA
1.1 . Familia BERBERIDACEAE
1.1.1. Clasificación taxonómica y distribución geográfica
La familia Berberidaceae, pertenece al orden de la Ranunculales, está
conformada por 15 géneros y 650 especies distribuidas en ambos hemisferios
(Romero, 2005). Incluye cuatro subfamilias: Berberidoideae, que agrupa 6
géneros, siendo los más representativos Berberis y Mahonia;
Podophylloideae, Leonticoidaeae y Nandinoideae, esta última se caracteriza
por ser rica en alcaloides bencilisoquinolínicos y en compuestos como
nandinina, amentoflavona y benzaldehido-4-O-glucosido (Yong, 2006). En la
Figura 1, se presenta la clasificación taxonómica de la familia Berberidaceae.
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Figura 1. Clasificación taxonómica de la familia Berberidaceae
En Colombia, está familia se encuentra ampliamente distribuida a lo largo de
todo el país, encontrándose entre los 1800 y 2500 msnm, en zonas húmedas y
con temperaturas de páramo principalmente (Camargo, 1981).
1.1.2. Química
La familia Berberidaceae contiene principalmente compuestos de tipo
isoquinolina, lignano y flavonoide. Su composición química característica
muestra alcaloides derivados de la L-tirosina (Romero, 2005), siendo la
berberina el compuesto más representativo de los alcaloides de tipo
isoquinolínico presentes en esta familia; especialmente en los géneros
Berberis y Mahonia.
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1.2 Género Berberis
1.2.1 Clasificación taxonómica
El género Berberis cuenta con más de 500 especies distribuidas en ambos
hemisferios. Este género está dividido en 4 grandes subgrupos de acuerdo a su
ubicación geográfica y a la combinación de caracteres morfológicos:
Septentrionales, Australes, Occidentales y Orientales; los dos primeros
subgrupos corresponden a especies con hojas simples, Septentrionales como
Euroasiáticas, con excepción de 2 especímenes en Norte América y 4 en el
norte de África; las Australes, están divididas en 2 subgrupos Aequinoctiales,
al cual pertenecen las Berberis colombianas y Euaustrales, que son
exclusivamente del sur de Sur América; las Occidentales se encuentran en
Norte y Centro América y las Orientales, en el Sureste asiático, con excepción
de la especie B. nervosa originaria de Norte América (Kim, 2004; Landrum,
1999).
1.2.2 Distribución geográfica
1.2.2.1 Distribución mundial
Este género predominantemente holártico, con más de 500 especies, presenta
una importante distribución en Sudamérica, donde crecen más de 35 especies
en la franja paramuna. Aunque se había asignado un origen norteño para los
Berberis sudamericanos (Ahrendt 1961), parece difícil que este supuesto
pueda explicar la gran diversificación morfológica del género en la cadena de
15
los Andes y en la zona austral de Sudamérica. Los análisis recientes, muestran
afinidades entre las Berberis sudamericanas y los del pacífico austral
(Landrum 1999, Meléndez 2000).
1.2.2.2 Distribución en Colombia
En los Andes, la mayor concentración de especies se presenta en Colombia
con alrededor de 70 taxones, de acuerdo con la información depositada en
herbario. A su vez, el mayor número de taxones con distribución restringida se
presenta en la cordillera Oriental de Colombia donde se concentran alrededor
25 de ellas. Dentro de este grupo, se diferencia el sistema de páramos de
Cundinamarca y Boyacá que cuentan con mayor número de endemismos (ca.
18 taxones). En la Sierra Nevada de Santa Marta se encuentran cuatro especies
endémicas (Camargo, 1991; Meléndez, 2000).
1.2.3 Usos
Las especies del género Berberis se caracterizan por presentar una morfología
variada con una coloración amarilla característica en su madera, raíz y corteza;
tradicionalmente usada para dar coloración a los textiles; sus frutos son
comestibles fermentados para producir bebidas alcohólicas y en culinaria
(Bernal, 1989). De En medicina tradicional se emplea para el tratamiento
encuentran enfermedades del sistema circulatorio, especialmente la raíz como
hemostático y febrífugo (Shamsa, 1999), la infusión de las flores se utiliza
para tratar la anemia y sus síntomas (Fatehi, 2005), para el sistema linfático
como diurético, tónico y diaforético (Kupeli, 2002; Zeng, 200), para el sistema
16
digestivo en el tratamiento de disentería amebiana, como purgante y
analgésico (Lohombo-Ekombaa, 2004).
1.2.4 Química
Los alcaloides encontrados en el género Berberis se pueden agrupar de
acuerdo al núcleo del cual se derivan, como se muestra a continuación
(Bentley, 1995): (R = H, -OCH3, -O-CH2-O)
Protoberberinas
En este grupo normalmente se pueden encontrar bases cuaternarias con las
posiciones 2,3 y 9,10 (Figura 2) oxigenadas (Grycova, 2007).
N+
O
O
OR
OR
R
R1
2
34 5
6
8
9
1011
12
13
Figura 2. Esqueleto base de un alcaloide protoberberínico
17
Bencilisoquinolinas
Su biosíntesis se da a partir de la tirosina y son precursores de otros
compuestos alcaloidales que en su gran mayoría conservan las sustituciones
oxigenadas presentes en este núcleo base (Figura 3).
NH
O
O
O
O
R
R
R
R
Figura 3. Esqueleto base de bencilisoquinolina
Aporfinas
Los esqueletos aporfínicos se producen biogenéticamente por oxidación de
los grupos fenólicos de las benciltetrahidroquinolinas por medio de un
acoplamiento oxidativo mono-electrónico entre los carbonos 8 y 10 (Figura
4).
N
O
O
CH3Haporeina
Figura 4. Estructura de aporfina: aporeina
18
Pueden encontrarse moléculas cargadas como la magnoflorina, que al igual
que la aporeina, muestran oxigenación típica en las posiciones 5 y 6. Esta
clase de compuestos ha demostrado tener propiedades antiinflamatorias y
citoprotectoras que se supone están relacionados con su carácter antioxidante
(Cassels, 2001).
Pavinas
Clase de alcaloides derivados biogenéticamente de los bencilisoquinolinas
(Figura 5), se encuentran en la familia Lauraceae (Gözler, 1983). Han
demostrado tener variada actividad biológica tales como efectos del
comportamiento (Meisenberg, 1984) y efectos antitumorales (Wu, 1989).
N R
O
O
O
O
R
R
R
R
Figura 5. Esqueleto base de pavina
Bisbencilisoquinolinas (bbi)
Este tipo de alcaloides posee por lo general un puente éter que une dos
estructuras bencilisoquinolínicas. Pueden estar metiladas en el nitrógeno del
anillo heterocíclico y presentar alguna actividad dependiendo de su
estereoquímica en las posiciones 1 y 1´ (Figura 6) (Ratsimamanga-Urverg,
1992; Mambu, 2000).
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O
N
N
O
O
O
O
OH
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
berbamina
O
NN
O
O
O O
OH
CH3CH3
CH3
CH3 CH3
oxiacantina
Figura 6. Estructuras de alcaloides bbi: berbamina y oxiacantina
La estereoquímica de esta clase de alcaloides se ha podido determinar
haciendo el rompimiento del dímero por medio de una fisión sódica en
amoniaco líquido, luego se analizan los compuestos utilizando técnicas como
dicroísmo circular o poder rotatorio para cada uno de los fragmentos
obtenidos (Fajardo, 1984).
1.3 Actividad Insecticida
Evaluar la actividad insecticida involucra todo un legado de conocimientos y
de historia que se mencionará brevemente; un insecticida es una sustancia o
mezcla de sustancias usadas para prevenir, destruir, repeler o controlar
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organismos indeseados (Isman, 2005). Desde tiempos remotos la búsqueda del
hombre por lograr un bienestar propio y de su entorno ha propiciado el empleo
de productos químicos para destruir plagas, principalmente insectos. En el
siglo XVI, los chinos empleaban arsenicales como insecticidas y poco
después, empezó a usarse la nicotina extraída del tabaco, en Europa a
principios del siglo XIX se utilizaban elementos como cenizas, tabaco molido,
cianuro de hidrógeno, compuestos de mercurio, zinc, fósforo y plomo, etc. Los
anteriores, forman el grupo de los llamados insecticidas de 1ª generación, los
cuales, son en general muy tóxicos, poco efectivos en la lucha contra la plaga
y muy persistentes en el ambiente, hoy día todavía en muchas zonas existen
rastros de ellos, que provocaron grandes contaminaciones, enfermedades en
hombres y animales, aguas contaminadas y una lista enorme de defectos. La
agroquímica surgió debido a las dos grandes guerras mundiales, los avances
de la ciencia y de la industria química que hicieron posible la aparición de
mejores insecticidas que se suelen denominar de 2ª generación, como los
organoclorados, organofosfatos y carbamatos. Posteriormente, los insecticidas
del grupo del parathion como órganofosforados y el DDT (Zadoks and
Waibeu, 2000; Beard, 2006).
Actualmente, un gran número de investigaciones referentes a los insecticidas
se enfocan a la producción, distribución y uso de estos, pero en muy pocos
casos se hace referencia al control ambiental y ecológico. Los insecticidas
empleados en el control de plagas pueden llegar a ser generadores de severos
problemas alimentarios, convergiendo a la contaminación de acuíferos, suelos,
aire, sedimentos y biota (Després, 2007) .
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Sin lugar a dudas, los insecticidas naturales obtenidos a partir de extractos
vegetales surgen como una interesante alternativa en el control de insectos.
Algunos de los metabolitos que han sido utilizados con este fin son: rotenona,
flavonoide que se extrae de las raíces de Derris elliptica y Lonchocarpus
utilis, Fam. Leguminosae, Figura 7. Este compuesto es un insecticida de
contacto e ingestión, y repelente. Su modo de acción implica una inhibición
del transporte de electrones a nivel de mitocondrias bloqueando la
fosforilación del ADP a ATP, inhibiendo el metabolismo del insecto
(Yenesew, 2006; Lummen, 1998).
O O
O
O
CH2
O
O
CH3
CH3
CH3
H
H
Figura 7. Estructura de la rotenona
Las piretrinas Figura 8, son esteres con propiedades insecticidas obtenidos de
las flores del piretro (Chrysantemum cinaerifolium, Fam. Compositae). Estos
esteres están formulados por la combinación de los ácidos crisantémico y
pirétrico y los alcoholes piretrolona, cinerolona y jasmolona, atacan tanto el
sistema nervioso central como el periférico ocasionando descargas repetidas,
seguidas de convulsiones; conocido como efecto irritante o "knock down" que
hace que el insecto apenas entre en contacto con la superficie tratada deje de
alimentarse y caiga. (Marshall, 1997).
25
O
O
O
CH3CH3
CH2CH3
CH3
CH3
H
H
H
piretrina I
O
CH3 CH3
OHCH3
CH3
H H
ácido crisantémico
O
O
O
CH2CH3
H
OH
ácido pirétrico
Figura 8. Piretrinas
La nicotina Figura 9, es un alcaloide derivado principalmente del tabaco
(Nicotiana tabacum Fam. Solanaceae). Sus propiedades insecticidas fueron
reconocidas en la primera mitad del siglo XVI.. Su modo de acción consiste
en mimetizar la acetilcolina al combinarse con su receptor en la membrana
postsináptica de la unión neuromuscular. El receptor acetilcolínico, es un sitio
de acción de la membrana postsináptica que reacciona con la acetilcolina y
altera la permeabilidad de la membrana; la actividad de la nicotina ocasiona la
generación de nuevos impulsos que provocan contracciones espasmódicas,
convulsiones y finalmente la muerte (Danielson, 1996).
26
N
N
CH3
nicotina
Figura 9. Nicotina
La azadirachtina es un tetraterpenoide característico de la familia Meliaceae
aisalda principalmente del árbol Neem (Azadirachta indica), originario de la
india. Este compuesto se encuentra en la corteza, hojas y frutos de este árbol
pero la mayor concentración se ubica en la semilla. En el extracto se han
identificado alrededor de 18 compuestos entre los que destacan salanina,
meliantrol y azadiractina que es el que se encuentra en mayor concentración.
Muestra acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la
oviposición y esterilizante. (Silva, 2002)
Con el crecimiento de la industria y la población mundial, se ha incrementado
el número y la diversidad de plagas resistentes a los diferentes insecticidas
hasta ahora utilizados, y como consecuencia han proliferado las enfermedades
pandémicas transmitidas por estos insectos vectores, tal es el caso del
paludismo, enfermedad transmitida por la hembra del género Anopheles y que
causa cerca de 900.000 muertes al año en Africa (Stratton, 2008, Opreh,
2008). La filariosis, enfermedad tropical endémica transmitida por el vector
Culex quinquefasciatus, considerado como una especie acentuadamente
antropofágica transmisor de filarias como Wuchereria bancrofti y Dirofilaria
27
immitis (Isman, 1997; Sukumar, 1991), del virus del Nilo occidental y de los
virus causantes de la encefalitis de San Luís y la encefalitis equina
venezolana, entre otros (Coto, 2000). C. quinquefasciatus, habita en regiones
tropicales y subtropicales y abarca hasta las isotermas de 20°C; abunda
principalmente en América y África tropical, Medio y Lejano Oriente, sur de
Asia, Nueva Guinea, Australia y en el sur de Estados Unidos (Salazar, 2004).
Este zancudo se encuentra asociado con mayor frecuencia al hábitat humano
tanto urbano como rural en Colombia y a pesar de que no existe riesgo de
transmisión de agentes patógenos, constituye un problema de salud pública.
Una situación crítica se presenta en el municipio de Sibaté en la sabana de
Bogotá, en donde se reproduce en cantidades descomunales que alcanzan la
concentración más alta del mundo: 74 millones de insectos que enloquecen a
32 mil habitantes (2312,5 por persona) (Sarmiento, 1999).
1.3.1 Actividad insecticida en el género Berberis
Como se mencionó, las especies del género Berberis tienen variados usos y
entre estos estan los relacionados con la actividad insecticida: el extracto
alcaloidal de la raíz de la especie B. lycium L., mostró actividad promisoria
frente ejemplares adultos de Aphis craccivora (Koch), Tetranychus urticae
(Koch), frente a larvas de segundo estadio de Helicoverpa armígera (Hubner),
y Plutella xylostella (Linnaeus), con valores de porcentaje de mortalidad de
68, 43, 44 y 44% respectivamente, evaluados en extractos no polares de éter
de petróleo y con el extracto etanólico, con valores de porcentaje de
mortalidad de 98, 26, 28 y 28% respectivamente (Tewary, 2005). En otro
estudio, las especies B. samacana y Berberis saboyana mostraron actividad
insecticida frente a Tecia solanivora con un porcentaje de reducción de
28
población de 21.5 % y 53.7% respectivamente (Castillo, 1998); la especie B.
glauca mostró actividad antialimentaria frente a larvas de 3° y 4° estadío de la
polilla Spodoptera sunia (Lepidoptera), con porcentaje de mortalidad de 46%
para concentraciones de 1% (p/v) (Moreno, 1995). Sobre la especie B.
tabiensis, se evaluó la actividad insecticida frente a larvas de tercer estadio del
mosquito Culex quinquefasciatus (Say) (CE50: 350 ppm) y realizando ensayos
guía de toxicidad frente a nauplios del crustáceo Artemia salina (Leach)
(CE50: 476 ppm), concluyéndose que esta es una especie con actividad
insecticida promisoria (Quevedo, 2007).
1.4 Alcaloides
1.4.1 Generalidades
Son compuestos heterocíclicos nitrogenados de carácter básico de donde se
deriva su nombre “alkali”, obtenidos principalmente de plantas superiores,
hongos y organismos marinos, mostrando actividades farmacológicas muy
variadas (Trevor, 1981; Gros, 1985). La clasificación de estos compuestos es
basada en el esqueleto químico de su precursor, es decir, la biogénesis de los
alcaloides se puede dar por la vía del ácido acético o del ácido shikímico, por
reacción con los aminoácidos se forman los núcleos base que dan origen a los
diferentes estructuras. Algunos de estos núcleos se muestran en la Figura 10.
29
NH
pirrolidina
NH
piperidina
N
NH N
N
NCH3
NN
NH
N
N
piridina
indol isoquinolinaquinolina
tropano purina bencilisoquinolina
Figura 10. Algunos núcleos comunes de alcaloides.
Físicamente la mayoría de los alcaloides son compuestos incoloros, sólidos
ligeramente solubles en soluciones acuosas neutras o alcalinas, pero muy
solubles en soluciones ácidas y en disolventes como éter, cloroformo o etanol.
Algunos alcaloides como la nicotina y la coníina son líquidos a temperatura
ambiente y algunos son coloreados como la berberina y la sanguinarina
(Trevor, 1981).
1.4.2 Alcaloides isoquinolínicos del género Berberis
Para que un alcaloide sea llamado isoquinolínico debe poseer en su estructura
o ser derivado de la siguiente unidad básica:
N
Figura 11. Esqueleto base de los alcaloides isoquinolínicos
30
Es conocido que las especies del género Berberis poseen un ordenamiento
característico de sus compuestos de tipo alcaloidal derivados
biogenéticamente de la tirosina y que a su vez están agrupados según su
núcleo alcaloidal que caracteriza quimiotaxonómicamente las especies del
género Berberis.
En Colombia existen cerca de 70 especies nativas pertenecientes al género
Berberis, único representativo de la familia Berberidaceae en el hemisferio sur
(Camargo, 1981), de las cuales se han descrito alrededor de 50 que son
utilizadas en medicina tradicional en diversas regiones del país.
Se conocen pocos estudios sobre la composición química de las plantas del
género Berberis colombianas; los primeros se realizaron en la especie B.
rigidifolia de donde se aisló berberina, el alcaloide mayoritario y común en
plantas de este género (Aristizabal, 1989). A la especie B. monguiensis se
realizó una caracterización espectroscópica preliminar encontrándose
berberina y protoberberina (Jimenez, 1995). De la especie B. glauca se han
idenificado varios derivados bisbencilisoquinilinicos, tales como:
isothalicberina, O-metilisothalicberina y 7-O-demetilisothalicberina (Moreno,
1995), estos alcaloides se aislaron previamente de B. chilensis de Chile y B.
laurina originaria de Uruguay (Martinez, 1997; Falco, 1968).
En un estudio reciente de la fracción alcaloidal de los tallos de la especie B.
tabiensis, se logró aislar un nuevo alcaloide bisbenciltetrahidroisoquinolínico,
denominado tabienina A (Figura 12); (Quevedo, 2008).
31
N
O
O
OH
O
O
N
O
O
OCH3
CH3 CH3
CH3CH3
CH3
CH3 CH3
11 11´
1 1´
12´
13
tabienina
Figura 12. Estructura de tabienina A
Este nuevo alcaloide mostró un patrón de sustitución con metoxilos sobre los
carbono 11 y 11´ y unión cola-cola entre los carbonos 13 y 12´ poco común en
alcaloides aislados de este género.
1.4.3 Biosíntesis
Los alcaloides bisbencilisoquinolínicos son producto de la dimerización por
acoplamiento oxidativo de bencilisoquinolinas como coclaurina, que a su vez
se deriva de un núcleo isoquinolínico formado biogenéticamente a partir del
aminoácido tirosina como se muestra a en la Figura 13 (Dewick, 2007):
32
O
NH2OH
OHtirosina
OH
NH2
O
OH
OH
PLP
transaminación
-CO2
PLP
tiramina ácido-4-hidroxifenilpiruvico
O -CO2
OH
NH2OH
O
H
OHdopamina 4-hidroxifenilacetaldehido
NHOH
OH
OH
NHOH
O
OH
CH3
NOH
O
OH
CH3
CH3
SAMSAM
(S)-norcoclaurina (S)-coclaurina (S)-metilcoclaurina
Figura 13. Biosíntesis general de los alcaloides bbi I
A partir de metilcoclaurina o norcloclaurina, pueden darse reacciones
secundarias posteriores de metilación, reducción, oxidación, deshidratación, y
condensaciones cola-cola, seguida de condensaciones cabeza-cabeza por
33
medio de enlaces difeniléter formando compuestos diméricos como la
tubocurarina y la tetrandrina, Figura 14 (Dewick, 2007).
OH
NOH
OMe
Me
O
NO
OMe
Me
O2
NADPH
OH
NOH
OMe
Me
.
.
O
N
N
O
OH
O
O
OH
Me
Me
Me
Me
O
N
N
O
O
O
O
O
Me
Me
Me
Me
Me
Me
SAM
Acoplamiento oxidativo vía radicales
libres
tetrandrina
Figura 14. Biosíntesis general de los alcaloides bbi II
34
CAPITULO 2. METODOLOGÍA
2.1. Procedimientos generales
Para cromatografía en capa delgada (CCD) se utilizaron cromatofolios de gel
de sílice 60 F254 Merck, para algunos controles de cromatografía en columna
se utilizó alúmina neutra, fase reversa RP-8 y RP-18 y celulosa.
Para cromatografía en columna (CC) de compuestos de baja y mediana
polaridad se emplea como fase estacionaria gel de sílice (70-230 Mesh)
Merck y para CC al vacío se utilizó gel de sílice (230-400 Mesh) Merck. Para
la fracciones polares se empleó como soporte Sephadex LH-20 (3.0 cm x 85
cm).
El revelado en CCD se realizó con ácido sulfúrico con posterior calentamiento
a 100 °C, vapores de iodo, lámpara de luz ultravioleta de 254 nm y 360 nm
y reactivo de Dragendorff .
Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de las fracciones y
compuestos puros se registraron en un equipo Brucker AVANCE 400 (400
MHz para 1H y 100 MHz para 13C). Se empleó como disolventes CDCl3
(99.8%) y MeOD (99.8%) referenciados con TMS como patrón interno.
Los análisis por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) acoplado a
espectrometría de masas de alta resolución (MS) se hicieron en un
cromatógrafo Shimadzu con un detector UV/vis L-4250 a 210 nm usando una
columna LichroCART RP-18 (250 x 10 mm d.i.), como eluente se utilizó
35
mezcla de MeOH:H2O 80:20 a un flujo de 3 mL/min. La interfase utilizada
ESI-TOF-MS-MS.
La actividad óptica fue medida en un polarímetro Polartronic E,
Schmidt+Haensch, las concentraciones se expresan como g/100 mL,
utilizando metanol (R.A) como disolvente.
Los solventes utilizados fueron de grado R.A.
Para la realización de los bioensayos se utilizaron placas multipozos con 96
reservorios.
2.2 Material biológico
Para la realización de los bioensayos de actividad larvicida se empleó como
material biológico larvas de tercer estadio del mosquito Culex
quinquefasciatus. El material entomológico fue suministrado por el
Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotá y los ensayos se realizarán siguiendo la
metodología propuesta por JL McLaughlin (McLaughlin, 1998).
2.2.1 Metodología propuestas por McLaughiln.
Se toman 2 mg de compuesto puro o 20 mg de una mezcla de compuestos y se
disuelven en 2 ml de etanol (R.A), para obtener la muestra patrón, a partir de
la cual se preparan las diluciones correspondientes a 5000, 1000, 500, 100 y
10 ppm. En placas multipozos de 96 reservorios, se colocan 8 aplicaciones de
36
cada una de las disoluciones correspondientes y se completa volumen de 250
l con agua reposada. De esta forma se dejan las placas en reposo y se realizan
lecturas de actividad larvicida (conteo de larvas muertas y vivas), a las 24 y 48
horas. Los resultados son evaluados utilizando el método estadístico Probit
(Therone, 1995).
2.3 Material Vegetal
La muestra de tallos de la especie Berberis tabiensis fue recolectada en junio
del 2005, en la vereda La Valvanera, municipio de Chía, departamento de
Cundinamarca, Colombia. La identificación de la especie fue realizada por el
Dr. L.A. Camargo y un ejemplar reposa en el herbario del Instituto de
Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia con el número de
colección COL198116 (Camargo, 1981).
Figura 15. Fotografía de los frutos y hojas de la especie B. tabiensis
37
2.4 Obtención del extracto etanólico
Una muestra seca (255 g de tallos) triturada y molida, se sometió a extracción
por maceración utilizando como solvente etanol al 96%, haciendo renovación
del solvente cada 24 horas por 7 días, se reunieron todos los extractos, se
eliminó el solvente a presión reducida para obtener el extracto crudo (24,20g).
2.5 Obtención del extracto alcaloidal
El extracto crudo, se concentró y aprovechando las propiedades básicas de los
alcaloides presentes (fracción de interés), se realizó una extracción ácido-base;
primero se trató con HCl al 10%; la parte soluble en HCl se neutralizó con una
solución de NH4OH al 10% y seguido a esto se realizó una partición líquido-
líquido con CH2Cl2 y posteriormente con AcOEt, obteniéndose las
correspondientes fracciones A (1,05g) y B (2,88g), además de la fracción
acuosa C (19,02g).
2.6 Fraccionamiento
Fracción A
Esta fracción sometidó a procesos de purificación sucesivos por cromatografía
en columna CC: se realizó una primera separación CCA1, utilizando un sistema
de elución isocrático AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5), obteniéndose un total de
135 fracciones, reagrupadas posteriormente en 10 fracciones que fueron
evaluadas por CCD, con la fase móvil AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5) y como
patrón de referencia berberina. Los resultados se muestran en la Tabla 1:
38
Tabla 1. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción A1
Fracción Peso (mg)
A1.1 20
A1.2 27
A1.3 13
A1.4 88
A1.5 38
A1.6 213
A1.7 63
A1.8 142
A1.9 275
A1.10 289
Rendimiento de columna 91.7%. Por las cantidades obtenidas y los grupos de
compuestos presentes se decide reunir las fracciones A1.2 – A1.5 (A2) (166mg)
y A1.7 – A1.8 y continuar la purificación de la fracción A2.
Se realizó otro proceso de purificación CCA2, eluyendo con
AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5). Se obtuvieron 8 fracciones, de las cuales A2.5 y
A2.6 mostraron compuestos de tipo alcaloidal cuando se reveló con el reactivo
de Dragendorff.
La reunión de A2.5 y A2.6, A3 (37 mg), se sometió nuevamente a purificación
utilizando una microcolumna con fase estacionaria en gel de sílice de 43 – 60
mesh, AcOiPr:MeOH:NH3 (73:22:5), se recogieron 50 fracciones de 0.5 ml
aproximadamente. Las fracciones A3.30 – A3.40, A4 (28 mg), contenían los
compuestos de interés.
Los compuestos mayoritarios observados en el control de la fracción A4, se
separaron por cromatografía en capa delgada preparativa en gel de silice
39
utilizando como fase móvil la mezcla AcOiPr:MeOH:NH3 (73:22:5). Se
separaron 4 compuestos de tipo alcaloidal, A4.1 (3mg), A4.2 (5mg), A4.3 (10mg)
y A4.4 (1mg); de los compuestos obtenidos solo fue posible elucidar
completamente el compuesto A4.3 y se realizó una elucidación parcial de los
compuestos A4.1 y A4.2, debido a la poca cantidad obtenida de cada uno de
estas compuestos.
Fracción B
La fracción de B (2,88g), se sometió a purificación por CC, en gel de sílice y
elueyndo con AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5). Se recogieron 80 fracciones de
0.5 ml, las fracciones B42 a B61 correspondieron a berberina (112mg).
Fracción C
La fracción acuosa resultante de la particiones liquido – liquido se purificó
utilizando una columna de exclusión por tamaño en Sephadex LH-20 como
fase estacionaria y un gradiente continuo de metanol - agua como fase móvil,
el rendimiento de columna fue 98,6%.
40
Tabla 2. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C1
Fracción Peso (g)
C1.1 1,68
C1.2 1,80
C1.3 1,58
C1.4 0,68
C1.5 12,01
C1.6 1,01
La fracción C1.5, (C2) fue nuevamente purificada por CC, utilizando como fase
estacionaria Sephadex LH-20 y un gradiente discontinuo de fase móvil
(MeOH - H2O: 100:0, 70:30, 50:50, 30:70 y 0:100). Se obtuvieron 9
fracciones. De estas fracciones, la 6 y la 7 contenian compuestos de tipo
alcaloidal.
La reunión de estas 2 fracciones (C3) (100 mg), se sometió nuevamente a
purificación por CC, utilizando como fase estacionaria alúmina tipo I y un
sistema de elución AcOiPr:MeOH:NH3 (70:25:5), se recogieron 20 fracciones,
reagrupadas en 4 fracciones, con un rendimiento de columna del 71,0%.
Tabla 3. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C3
Fracción Peso (mg)
C3.1 12
C3.2 10
C3.3 2
C3.4 47
41
De estas 4 fracciones se tomo la fracción C3.4, se purificó por solubilidad y
filtración para obtener finalmente 20 mg de un compuesto de color naranja
oscuro, en forma de agujas muy finas.
42
CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudios previos de bioactividad y fitoquímicos sobre especies del género
Berberis colombianas (Jiménez, 1995; Aristizabal, 1989; Moreno, 1995;
Castillo, 1998) y sobre la especie B. tabiensis (Quevedo, 2007; Quevedo,
2008), permitieron concluir que esta es una especie promisoria tanto por su
actividad insecticida como por los constituyentes novedosos. Continuando con
la búsqueda de nuevas moléculas e tipo alcaloidal, biológicamente activas y
con estructuras novedosas que puedan orientar posteriores trabajos sintéticos
que conduzcan finalmente al desarrollo de moléculas orgánicas útiles en el
control de insectos plaga se realizó el estudio químico del extracto alcaloidal
proveniente de los tallos de la especie nativa B. tabienis.
Siguiendo la metodología descrita, fue posible aislar y caracterizar mediante el
uso de técnicas espectroscópicas 3 compuestos; uno de ellos corresponde a un
nuevo alcaloide bisbencilisoquinolínico (tabienina B) que presenta un
novedoso patrón de sustitución tanto en el género Berberis como en la familia
Berberidaceae; los otros dos son alcaloides protoberberinicos, berberina el
compuesto más representativo del género Berberis y columbamina aislada de
B.buxifolia (Cava, 1965) Figura 16.
43
Figura 16. Esquema general del proceso de purificación de los compuestos
aislados
3.1 Elucidación del compuesto A4.3 (Tabienina B)
El espectro de masas de alta resolución mostró un ion molecular
pseudomolecular [M+H] = 595,3269, que corresponde a un peso calculado
PM = 594.2730 u.m.a y a la fórmula molecular C36H38N2O6.
Figura 17. Espectro de masas de alta resolución en modo ESI de Tabienina B
Extracto CH2Cl2
• A4.3
Extracto AcOEt • berberina
Extracto acuoso • C3.4
44
En los espectros RMN 1H y COSY, se observaron 36 señales: 9 señales que
corresponden a 10 protones aromáticos (Figura 18 y Figura 19): 4 dobles
dobletes (dd) que aparecen a : 6,46; 6,59; 7,08 y 7,38 ppm, para un sistema
p-disustituido AA’BB’.
Figura 18. Espectro RMN 1H (MeOD, 400 MHz)) de la zona aromática de
Tabienina B
45
Figura 19. Espectro COSY de la zona aromática de Tabienina B
Se observa un doblete a : 6,70 ppm correspondiente a un sistema de
acoplamiento en orto con un protón a : 6,40 ppm; las otras 4 señales
aparecen como singletes a : 5,96; 6,38; y una señal que integra para 2
protones aromáticos a 6,72 ppm.
En la zona alifática, se observan 2 grupos metoxilo a : 3,74 (s, 3H) y 3,66 (s,
3H) y dos grupos metilo unidos a nitrógeno, en este caso el nitrógeno del
anillo isoquinolínico a : 2,24 (s, 3H) y 2,55 ppm (s, 3H), señales
características de los esqueletos tetrahidroisoquinolínicos. Aparecen otras 4
señales integradas para un total de 12 protones a : 2,97; 2,86; 2,48 y 2,24
46
ppm, además de la señal de solvente a : 3.31 ppm y una impureza del proceso
de purificación a : 3.34 ppm.
Figura 20. Espectro RMN 1H de la zona alifática de Tabienina B
En el espectro RMN 13C (Figura 21) se observan 36 carbonos, 24 aromáticos
y 12 alifáticos. En la región aromática se presentan 8 carbonos desplazados
hacia campo bajo indicando su unión a heteroátomo que en este caso es
oxígeno: 2C (O-Me, 149,8 y 151,6 ppm), 2C (R-OH, 145,4 y 149,0 ppm) y 4C
(144,2; 145,8; 156,3 y 158,7 ppm) que corresponden a puentes éter. La unión
cabeza-cabeza entre C-6 y C-7’ (145,8 y 144,2 ppm) y la unión cola-cola entre
C-12 y C-11’ (156,3 y 158,7 ppm) asignadas con la información obtenida del
47
espectro HMBC; las señales en la región alifática se observan por parejas
indicando la presencia de las dos subunidades bencilisoquinolínicas.
,Figura 21. Espectro RMN 13C de la zona aromática de Tabienina B
Con los experimentos COSY, HMQC (Figura 43) y HMBC (Figura 44), se
obtuvieron correlaciones y desplazamientos ilustrados en las Figuras 22 y 23.
48
Figura 22. Datos espectroscópicos de Tabienina B
Figura 23. Correlaciones (H C) de tabienina B observadas en el espectro
HMBC.
49
Tabla 4. Datos espectroscópicos para tabienina B
Posición 1H, m, HZ 13C 1H - 1H COSY HMBC 1 4,03 (1H, m) 63,0 2 N-Me 2,24 (3H, s) 43,1 --- 1,3 3 2,85*(m) 45,7 4 --- 4 2,45*(m) 25,8 3 --- 4a --- 124,5** --- --- 5 6,38 (1H, s) 106,0 --- 4,6 6 --- 144,2 --- 5 7 --- 145,4 --- 8 8 6,72 (2H, s) 111,4 --- 7 8a --- 125,1 --- 1 2,75*(m) 38,9 1 --- 9 --- 136,4 --- --- 10 --- 149,0 --- --- 11 --- 158,7 --- --- 12 --- 149,8 --- 13 13 6,40 (1H, brs) 113,6 14 --- 14 6,70 (1H, d, J = 1,6, 8,1) 122,7 13 12 1´ 3,89 (1H, m) 65,0 2 2´ N-Me 2,55 (3H, s) 42,6 --- 1,3 3´ 2,75 (m)* 46,5 4’ 2’ 4´ 2,95 (m)* 26,3 3’ 3’ 4a’ --- 117,4** --- --- 5´ 6,72 (2H, s) 113,1 6’ 4a’,6’ 6´ --- 151,6 --- 5 7´ --- 145,8 --- 8 8´ 5,96 (1H, s) 116,6 --- --- 8a’ --- 134,4** --- --- ’ 2,85* (m) 37, 1’ --- 9´ --- 133,5** --- --- 10´ 6,59 (1H, dd, J = 2,4, 8,0) 121,5 11’,14’ 12’ 11´ 6,46 (1H, dd, J = 1,9, 8,3) 131,5 10’,13’ 9’ 12´ --- 156,3 --- 10’,13’ 13´ 7,08 (1H, dd, J = 2,5, 7,5) 122,9 11’,14’ 11’ 14´ 7,38 (1H, dd, J = 2,1, 8,1) 130,0 10’,13’ 12’
6’-OMe 3,66 (3H, s) 56,4 --- 6’ 12-OMe 3,74 (3H, s) 56,3 --- 12 *Estas señales se presentan como multipletes no definidos que integran para 12 protones en total. **Son señales de C-cuaternarios que pueden ser intercambiables entre sí, se asignaron teniendo en cuenta las estructuras encontradas en Schiff, 1997.
50
Al hacer una búsqueda en Scifinder y en bases bibliográficas como
ScienceDirect, Springerlink y ACS no se encontró ningún compuesto
reportado con las características espectroscópicas o estructurales
mencionadas, así concluimos que es la primera vez que se aísla en la
naturaleza este compuesto que se denomino tabienina B.
Los alcaloides bbi aislados del género Berberis muestran patrones
estructurales y de sustitución característicos; generalmente tienen los puentes
éter entre los carbonos C-8 y C- 7’ para la unión cabeza-cabeza y entre C-11 y
C-12’ par la unión cola-cola, además de presentar su estereoquímica como (R,
S), característica de los alcaloides bbi aislados de especies pertenecientes a la
familia Berberidaceae. Un estudio previo de la especie B. tabiensis condujo al
aislamiento de un nuevo alcaloide bbi altamente oxigenado denominado
tabienina; este alcaloide presenta las posiciones 6, 7, 12, 6’ 7’ y 13’
oxigenadas (-O-Me), la posición 12 por un grupo hidroxilo y unión cola-cola
entre C-11 y C-12’, las posiciones 5, 8, 5’ y 8’ sin sustituyentes oxigenados.
Analizando las sustituciones encontradas en tabienina B, puede notarse que
presenta la última característica citada para tabienina, es decir, posee sólo dos
grupos metoxilo ubicados sobre los carbonos 12 y 6’, siendo una característica
estructural que lo diferencia de tabienina A y de los otros bbi aislados de la
familia Berberidaceae, que usualmente presentan al menos 3 de estos grupos.
La unión cola-cola, entre C-11 y C-12’ en común en los bbi aislados de la
familia Berberidaceae, teniendo usualmente en C-12 un sustituyente
oxigenado y en el anillo C’ un sistema AA’BB’ con protones que muestran
desplazamientos químicos distintos en RMN 1H debido a la posición espacial
en la que presentan estas moléculas, es decir, uno de los monómeros puede
localizarse encima del otro monómero estando unidos por los puentes éter, lo
51
que se aplica a esta nueva estructura. La posición C-10 está sustituida por un
grupo hidroxilo, característica poco común previamente reportada en la
especie B. buxifolia en el alcaloide bbi chillanamina (Leet, 1983), ya que esta
posición generalmente tiene un sustituyente de tipo metoxi o se encuentra
libre. Usualmente, la unión cabeza - cabeza para esta clase de alcaloides
aislados en la familia Berberidaceae se observa entre C-7 y C-8’ ò entre C-8 y
C-6’, pero en tabienina B se encuentra entre C-6 y C-7’; esta unión se ha
reportado solamente en las familias Menispermaceae (Chang, 2005) y
Monimiaceae (Shiff, 1997).
Biosíntesis
Los alcaloides bbi son producto de la dimerización por acoplamiento
oxidativo de bencilisoquinolinas como coclaurina (Anexo 1), que a su vez se
deriva de un núcleo isoquinolínico formado biogenéticamente a partir del
aminoácido tirosina. Este aminoácido sufre dos procesos de transformación
catalizados por enzimas: el primero de ellos es una descarboxilación para la
formación de tiramina y el segundo es un proceso de transaminación para
formar el ácido-4-hidroxifenilprúvico, en ambos casos utilizando PLP como
coenzima y las correspondientes enzimas. La tiramina, sufre un proceso de
oxidación para formar dopamina, mientras que por la otra via se genera el 4-
hidroxifenilacetaldehído por medio de una descarboxilación. Estos dos
compuestos formados reaccionan entre sí, vía reacción de Pictet-Spengler para
formar un compuesto de carácter alcaloidal de núcleo isoquinolínico
(norcoclaurina) (Dewick, 2007).
52
Figura 24. Ruta biosintética de la formación de N-metilcoclaurina
O
NH 2OH
OH
tirosina
PL P
E.C. 4.1.1 .2 5
D esca box il aci ón
CO 2
PL P
E .C . 2 .6.1.5
T ra nsa min aci ón
H
N H2OH
O
OH
O
O H
tira min a 4-hidroxife nilp irúvico
H
NH 2OH
OH
OH
O
dopa min a 4-hidroxife nila ce taldehíd o
O 2
E.C.1.1 4.18 .1
T PP
E.C.4 .1 .1.1 CO 2
E.C.4 .2 .1.78
N H
OH
OH
OH
no rcoclaurina
N H
OH
OH
OH
N H
O
OH
OH
CH 3
N
O
OH
OH
CH 3
CH 3
S AM
E..2 .1 .1.12 8
6O MT
SAM
E ..2 .1.1.14 0
cocla urinanorco clau rina N-me tilcoclaurina
53
A partir de N-metilcoclaurina o norcoclaurina, pueden darse reacciones
secundarias posteriores de metilación, reducción, oxidación, deshidratación
(Dewick, 2007).
Para la formación de los bbi, es necesario que ocurra una reacción catalizada
enzimáticamente por la enzima E.C.1.14.3 (N-metilcoclaurina oxidasa) que
genera unidades radicalarias de tipo fenólico, especies que por acoplamiento
fénolico monooxidativo vía radicales libres forman la unión difeniléter cola-
cola, seguida de la unión cabeza-cabeza.
Figura 25. Formas canónicas lábiles a sufrir reacción de acoplamiento
fénolico monooxidativo
O
O
N
O
CH3
CH3
H
H
H
H
N+
R
O
NH2
E.C.1.14.21.3
E.C.1.14.3: N-metilcoclaurina oxidase (C-O acoplamiento fenólico)
Estructuras resonantes de
(S) -N-metilcoclaurina
O
O
N
OH
CH3
CH3 O
O
N
OH
CH3
CH3O
O
N
OH
CH3
CH3O
O
N
OH
CH3
CH3
O2
OH
O
N
O
CH3
CH3
H
OH
O
N
O
CH3
CH3OH
O
N
O
CH3
CH3OH
O
N
O
CH3
CH3
A
B
2
A
B
NADP+
54
De esta forma, para tabienina B se propone una biosíntesis basada en reportes
previos, en donde se da una unión cola-cola entre los carbonos C-13 y C-12’.
Figura 26. Dimerización cola-cola en la formación de tabienina B
Seguida a esta unión ocurre la oxidación en C-14 y una O-metilación sobre C-
12 (SAM); lo anterior se propone analizando los sustituyentes del anillo
aromático, que muestra una activación del anillo en posición orto al puente
difeniléter, para obtener un primer intermediario, un compuesto previamente
aislado de Berberis buxifolia, llamado chillanamina, Figura 27 (Leet, 1983).
OH
O
N
O
CH3
CH3
H
OH
O
N
O
CH3
CH3
C
B A
OH
O
N
OH
CH3
CH3OH
O
N
CH3
CH3
O12’
13
14
55
Figura 27. Hidroxilación orto al puente éter en la formación de tabienina B
Posteriormente, se da una reacción de acoplamiento radicalario que forma la
unión cabeza-cabeza entre los carbonos 6 y 7’. Se propone una ruta vía
radicales libres catalizada enzimáticamente que genera dos formas canónicas,
muy reactivas, una en C6 que contiene un grupo metoxilo que será el grupo
saliente posterior a la reacción radicalaria y a la regeneración de la
aromaticidad del anillo de la isoquinolina, y otro estará como un radical
fenóxido en el carbono 7’.
12’13
14
OH
O
N
O
CH3
CH3
CH3
OH
O
N
CH3
CH3
O
OH
O
N
OH
CH3
CH3OH
O
N
CH3
CH3
O12
O-metilación C12
Hidroxilación orto al puente èter
O2E.C.1.14.18.1
NADP+
SAM
OH
O
N
O
CH3
CH3
CH3OH
OH
O
N
CH3
CH3
O
chillanamina
56
Figura 28. Unión cabeza-cabeza vía radicales libres en la formación de
tabienina B
Otra posible ruta, es similar a la propuesta para la biogénesis de trilobina,
alcaloide bbi aislado previamente de Cocculus hirsulus y Anisocyclea
grandidieri, especies pertenecientes a la familia Menispermaceae que presenta
3 puentes éter en su estructura (Fajardo, 1984).
NCH3 OH
OOH CH3
NCH3
OCH3
O
O
NCH3 O
OOH CH3
OCH3
NCH3
OCH3
O
OH
O
O
N
O
CH3
CH3
CH3OH
O
O
N
CH3
CH3
O
.
- CH3O.
Vía radicales libres O2
E.C.1.14.21.3NADP+
57
Figura 29. Unión cabeza-cabeza vía reacciones polares en la formación de
tabienina B
La Figura 29, muestra una posible ruta biogenética para formar la unión
cabeza-cabeza en la que se genera la formación de un ión oxonio sobre el
carbono 7’, quien por medio de una reacción de sustitución electrofílica
aromática forma el puente éter, seguido de la restauración de la aromaticidad.
3.2 Berberina
Este compuesto fue encontrado como el alcaloide mayoritario en la fracción
extraída con AcOEt, se aisló como un sólido fino de color amarillo, con un
punto de fusión, PF: 196 – 198°C y un comportamiento cromatográfico igual
al presentado por el patrón de referencia utilizado (cloruro de berberina de la
casa Merck).
NCH3 OH
OOH CH3
NCH3
OCH3
O
O
NCH3 OH
OOH CH3
O CH3
NCH3
OCH3
O
O
OH
O
N
O
CH3
CH3
CH3OH
O-
O
N
CH3
CH3
O
- CH3O+
Vía reacciones polares
58
La berberina fue aislado por primera vez en 1824 por Hûttenschmid en lo que
pensaba era Geoffroya inermis, en 1826 Chevallier y Pelletan encontraron esta
sustancia amarilla en Xanthoxylum clava herculis, a la cual denominaron
xanthopicrita. Buchner y Herberger en 1830, encontraron esta misma
sustancia en Berberis vulgaris de donde proviene su nombre actual (Benjamin,
2009).
La berberina pertenece al grupo de los alcaloides cuaternarios
protoberberinicos, alcaloides que se encuentran ampliamente distribuidos en
las familias Papaveraceae, Berberidaceae, Fumariaceae Mensperaceae,
Ranunculaceae, Rutaceae, Annonaceae y en algunos especímenes de las
familias Magnoliaceae y Convolvulaceae (Bentley, 1995). La berberina ha
sido empleada en la tumefacción esplénica, en el tratamiento de la malaria y
leishmaniasis cutánea, se ha demostrado que tienen actividad antiprotozoaria,
antibacteriana, antimicótica y fungicida utilizándose en tratamientos de
úlceras externas y como antiséptico de baja toxicidad (Bernal, 1989).
N+
O
O CH3
CH3
O
O
berberina
Figura 30. Berberina, alcaloide característico del género Berberis
59
Biosintesis
La biosíntesis de los alcaloides isoquinolínicos, fue investigada en Hidrastis
canadensis Ranunculaceae por Gear y Spenser en 1963. La tirosina es el
precursor de esta clase de compuestos, se forman en primer lugar
intermediarios de tipo benzilisoquinolina, como la (+)-reticulina, que
posteriormente se oxida dado origen a un ion iminio (Grycová, 2007).
Figura 31. Diagrama general de la biosíntesis de berberina
El ion iminio reacciona vía reacción de Pictet-Spengler con el carbono en
posición orto al fenol del anillo D, generando un intermediario tautomérico
que pasa a la forma de enol, correspondiente a (S)-scoulerina, que a su vez es
metilado para formar la (-)- tetrahidroberbernina y finalmente la berberina.
60
3.3 Elucidación del compuesto C3.4*
Este compuesto se obtuvo como un sólido fino de color naranja (20mg) con
punto de fusión PF: 196 - 198°C. El compuesto tiene un peso molecular de
338,1392 que corresponde a la formula C20H20NO4. Del espectro RMN 1H
(MeOD), se obtuvo la siguiente información: un total de 6 señales de protones
aromáticos, uno de ellos se presenta como un doblete : 8,00 (C12), que está
acoplando con un doblete : 7,92 (C11). Las otras señales se presentan como
singletes y fueron asignadas de acuerdo al análisis detallado de los demás
espectros. En la zona alifática se presentaron 5 señales, 3 de ellas
corresponden a protones de grupos metoxilo : 4,13; 4,03 y 3,94, las otras 2
señales corresponden a protones de grupo metileno, una a campo alto : 3,13,
y otra que no es claramente observable en el espectro de RMN 1H, pero si se
observan las respectivas correlaciones en los experimentos 2D, presentando un
desplazamiento aproximado de : 4,90.
N+
O
OH
O
O CH3
CH3
CH3
1
34
2
5
6
8
9
1011
12
13
A B
C
D
Figura 32. Estructura y numeración de 5,6-dihidro-2-hidroxi-3,9,10-
trimetoxidibenzo[a,g]quinolizinium: columbamina
61
Figura 33. Espectro RMN 1H de la zona aromática para el compuesto C3.4
Figura 34. Espectro COSY del compuesto C3.4
62
En el espectro de RMN 13C se observan 20 carbonos: 15 carbonos aromáticos,
de los cuales 6 corresponden a metinos, 4 carbonos cuaternarios, 5 carbonos
unidos a heteroátomo: 4 unidos a oxígeno, 3 de grupo metoxi y uno de grupo
hidroxi, y otro unido al nitrógeno de la sal del compuesto aislado.
Figura 35. Espectro RMN 13C del compuesto C3.4
De los espectros HMQC (Figura 48) y HMBC (Figura 49), se tomó la
información necesaria para realizar las asignaciones presentadas en la Tabla
5.
63
Tabla 5. Datos espectroscópicos del compuesto C3.4
Posición 1H, m, HZ 13C HMBC 1 7,55 110,0 4a, 13a, 2*, 3*
2* --- 150,0 --- 3* --- 153,2 --- 4 6,76 116,2 2*, 5, 13b
4a --- 130,4 --- 5 3,13 27,8 4a, 13a 6 4,90 57,7 4a 8 9,64 145,7 8a, 13a
8a --- 135,6 --- 9 --- 151,6 ---
10 --- 146,0 --- 11 7,92 124,4 9, 12a 12 8,00 128,2 8a, 10
12a --- 123,1 --- 13 8,66 120,7 12a
13a --- 140,5 --- 13b --- 118,8 ---
C2*-OR 3,94 57,5 2* C3*-OR ---
9-R 4,03 57,8 9 10-R 4,13 62,6 10
* Estas asignaciones pueden ser intercambiables
Del análisis de los espectros anteriores se establece la estructura del alcaloide
protoberberinico columbanina, previamente aislado y reportado en el género
Berberis y en la familia Berberidaceae (Grycová, 2007).
64
N+
O
OH
O
O CH3
CH3
CH3
1
34
2
5
6
8
9
1011
12
13
Figura 36. Correlaciones (H C) del compuesto C3.4 observadas en el
espectro HMBC.
La revisión bibliográfica (Grycová, 2007) de los datos espectroscópicos
muestra que dos isómeros: columbamina (C-2 = OH; C-3 = OCH3) y
jatrorrhizina (C-2 = OCH3; C-3 = OH) son congruentes con los datos
encontrados en el compuesto aislado Tabla 6, donde no se observa una
diferencia contundente entre los valores de desplazamiento químico del
compuesto aislado y los isómeros referentes.
65
Tabla 6. Comparación de datos espectroscópicos del compuesto C3.4 con
compuestos de literatura
C3.4 Jatrorrhizina Columbamina
Posición 1H (ppm) 13C (ppm) 1H (ppm) 13C (ppm) 1H (ppm) 13C (ppm) 1 7,55 110,0 7,33 110,9 7,52 114,9 2 --- 150,0 --- 149,4 --- 143,7 3 --- 153,2 --- 146,4 --- 150,4 4 6,76 116,2 6,50 116,3 6,80 109,4 4a --- 130,4 --- 130,2 --- 133,6 5 3,13 27,8 3,07 29,1 3,30 26,3 6 4,90 57,7 4,79 57,6 4,97 55,6 8 9,64 145,7 9,50 145,2 9,45 144,8 8a --- 135,6 --- 119,2 --- 117,4 9 --- 151,6 --- 151,5 --- 148,0 10 --- 146,0 --- 145,1 --- 149,9 11 7,92 124,4 7,96 122,9 7,58 126,5 12 8,00 128,2 7,85 125,7 8,11 123,3 12a --- 123,1 --- 128,2 --- 128,2 13 8,66 120,7 8,44 119,3 8,45 119,8 13a --- 140,5 --- 134,9 --- 138,3 13b --- 118,8 --- 120,9 --- 121,4
C2-OR 3,94 57,5
3,89 58,3 --- --- C3-OR --- --- 3,98 56,9
9-R 4,03 57,8 4,06 63,0 4,08 61,8 10-R 4,13 62,6 4,16 57,0 4,08 57,0
*Se utilizo CDCl3 en los compuestos de referencia
La comparación de los valores de literatura no es suficiente para determinar
con exactitud la identidad del compuesto aislado, pero el análisis
fisicoquímico (PF) sugiere que el compuesto aislado es columbamina, ya que
el PF para columbamina y jatrorrihizina es 194 y 206°C respectivamente
(Merck Index, 2001).
66
3.4 ACTIVIDAD INSECTICIDA
Como ya se ha mencionado la gran mayoría de enfermedades pandémicas son
transmitidas por insectos vectores, los cuales han sido controlados en gran
parte por insecticidas químicos, que a su vez han causado muchos problemas
de contaminación en diferentes sistemas ecológicos y son cada vez menos
eficientes debido a la resistencia que día a día crean estas plagas a ellos. Con
este estudio se quiso aportar a esta problemática realizando pruebas de
actividad larvicida frente a larvas del mosquito C. quinquefasciatus, utilizando
varios de los extractos y fracciones obtenidas durante el proceso de obtención
y purificación de compuestos de tipo alcaloidal de la especie B. tabiensis.
Los ensayos de actividad insecticida se realizaron en los extractos mostrados
en la Figura 37. Se presentan los resultados obtenidos a las 48 horas de
contacto de los extractos con las larvas del mosquito.
Figura 37. Esquema de realización de bioensayos iniciales
CE50(mg/L)
>1000• Extracto etanólico
938 • Extracto alcaloidal
803
>1000
>1000
• Extracto CH2Cl2
• Extracto AcOEt• Extracto acuoso
67
Al evaluar la actividad larvicida de forma bioguiada se observa una actividad
relevante en el extracto en diclorometano (A1) 803 (mg/L) a las 48 horas. El
fraccionamiento de este extracto: CCA1, produjo 10 fracciones que son
reagrupadas de acuerdo al criterio químico, presencia de compuestos de tipo
alcaloidal, se seleccionó la fracción A2 y se evalúo su actividad. Esta fracción
se sometió a purificación, para obtener 8 fracciones, de las cuales por criterio
químico se seleccionó la fracción A3. Finalmente, se evalúo su actividad, se
purificó por CC, se obtuvieron 50 fracciones, la fracción A4, que contenía la
tabienina B fue evaluada, encontrándose un valor de 78 (mg/L) a las 48h
(Figura 38).
Figura 38. Esquema de realización de bioensayos siguiendo la purificación de
compuestos de tipo alcaloidal
Estos resultados muestran que los compuestos alcaloidales provenientes de la
especie B. tabiensis pueden presentarse como posibles compuestos de
referencia para la búsqueda y la síntesis de nuevos pesticidas de origen natural
que ayuden a controlar los problemas que generan estos insectos vectores.
• Fracción A2
24h: 357
48h: 184
• Fracción A3
24h: 234
48h: 148 • Fracción A4
24h: 173
48h: 78
68
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se realizó el estudio de la composición química de los
tallos de Berberis tabiensis como una contribución al estudio químico de
especies colombianas de la familia Berberidaceae y del único género que la
representa en Colombia, el género Berberis.
Los métodos espectroscópicos y espectrométricos permitieron elucidar un
nuevo alcaloide BBI, tabienina B, que presenta un novedoso patrón de unión
cabeza-cabeza, del cual no se conocen reportes en la familia Berberidaceae.
De esta forma, se muestra un nuevo patrón de sustitución y ordenamiento en
los alcaloides bbi no solo del género Berberis (subdivisión Aequinoctiales),
sino también para la familia Berberidaceae.
Se aislaron 2 alcaloides protoberberinicos cuaternarios: berberina, como el
alcaloide mayoritario en el género Berberis y columbamina, previamente
aislado de especies foráneas del género, siendo un aporte a la correlación
quimiotaxonómica de las Berberis colombianas con otras especies del
subgrupo Australes.
Se contribuyó así a la quimiotaxonomía de las Berberis colombianas, tomando
como referencia la especie B. tabiensis, especie con compuestos promisorios
en el control de insectos plaga mostrando valores de CE50: 78 mg/L frente al
vector C. quinquefasciatus.
69
RECOMENDACIONES
Es muy importante incentivar el estudio químico de productos naturales, ya
que está demostrado que estos tienen un gran potencial en diversos campos de
aplicación, tales como medicina, agroquímica, biotecnología, los compuestos
aislados sirven como referentes en la síntesis de nuevas moléculas, entre otros.
Se recomienda continuar con la evaluación de la actividad larvicida de los
compuestos presentes en la especie B. tabiensis, no solo frente al insecto
vector C.quinquefasciatus, sino evaluar dicha actividad con otras especies de
plagas tales como Aedes aegypti, Anopheles sp, entre otros.
Además, se recomienda continuar con la elucidación estructural de los
compuestos presentes en las fracciones no alcaloidales ya que estos pueden
presentar otras propiedades biológicas no evaluadas en las especies del género
Berberis.
70
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77
1) Formación de la tiramina
O
NH2OH
OH
N
OHO
O
CH3
P
PLP
E.C. 4.1.1.25
N
OHO
OH
CH3
P
O
N+
OH H
H
OH
H+
H-
N
OHO
O+
CH3
P
O
NOH
H
H
H
OH
N
OHO
CH3
P
O
NOH
OH
H2O
H+
NH
OHO
CH3
P
H
NOH
H+
CO2
N
OHO
CH3
P
H
NOH
OH-H
+
N
OHO
CH3
P
H
NHOH
OHN
OH
CH3
O
OP
H
NH2OH
+
tiraminaPLP
Hidrólisis
Restauración
aromaticidad
E.C.4.1.1.25: L-tirosina descarboxilasa
78
2) Formación de la dopamina
H
NH2OH
tiramina
H
NH2OH
OH
dopamina
H
NH2O
H
NH2O
H
NH2O
E.C.1.14.18.1
E.C.1.14.18.1: monofenol monooxigenasa
O2
79
3) Formación de 4-hidroxifenilpirúvico
O
NH2OH
OH
N
OHO
O
CH3
P
PLP
E.C. 2.6.1.5
N
OHO
OH
CH3
P
O
N+
OH H
H
OH
H+
H-
N
OHO
O+
CH3
P
O
NOH
H
H
H
OH
N
OHO
CH3
P
O
NOH
OH
H
H2O
H+
NH
OHO
CH3
P
NOH
O
OH
H+
N
OHO
CH3
P
H
NOH
OH-
H+
N
OHO
CH3
P
NHOH
O
OH
O
H
N
OH
CH3
OP
NH2
O+
OH
O
OH
H+
Hidrólisis
Restauración
aromaticidad
E.C.2.6.1.5: tirosina transaminasa
Base de Schiff
H+
OOH
O
OH4-hidroxifenilpirúvico
80
4) Descarboxilación de 4-hidroxifenilpiruvico para formar 4-
hidroxifenilacetaldehído
OOH
O
OH
4-hidroxifenilpirúvico
N+
N
SN
NH2CH3
OCH3
P
Cl-
E.C.4.1.1.1
TPPR1
R2
N+
SR
RCH3
1
2
OH-
H+
OH
O
O
N+
SR
RCH3
OH
H
H+
E.C.4.1.1.1: piruvato descarboxilasa
Descarboxilación de
B- iminioacido
OH N SR
RCH3
OH
CO2
H+
tautomeria
imina-enamina
OH N+
SR
RCH3
O H
O
OH
4-hidroxifenilacetaldehído
N+
SR
RCH3
+
81
5) Reacción de Manich
NH2OH
OH
E.C.4.2.1.78
N+
OH
OH
OH
OH
H
H
O
OH
H+ NH
OH
OH
OH
O+
H
H
OH-
H+
NOH
OH
OHBase de Schiff
N+
OH
OH
OH
H
H+
OH
O
NH
OH
OH
OH
NH
OH
H+
E.C.4.2.1.78: (S)-norcoclaurina sintetasa
Restauración
aromaticidad
(S)-norcoclaurina
6) Formación de SAM
N
N
N
N
NH2
O
OH OH
S+
O
OH
NH2
CH3
S-adenosilmetionina (SAM)
O
OH
NH2
S
CH3
ATP ADP, P
O
OH
NH2
S+
CH3
Ad
82
7) N-metilación y O-metilación de (S)-norcoclauirina
OH
OH
NH
OHO
OH
NH2
S+
CH3
Ad
+
E.C.2.1.1.128
OH
O+
NH
OH
H
CH3
H+
OH
O
NH
OH
CH3
(S)-coclaurina
E.C.2.1.1.140
E.C.2.1.1.128: (RS)-norcoclaurina-6-O-metiltransferasa, 6OMT
E.C.2.1.1.140: (RS)-coclaurina-N-metiltransferasa
OH
O
N
OH
CH3
CH3
SAM
(S)-N-metilcoclaurina
83
8) Cofactor NADP+ para deshidrogenaciones
N
N
N
N
NH2
O
OHO
O OP
O
O
O-
P
O
OH
O
OH OH
N+
ONH2
OHP
O
OH
N+
O
NH2
R
OH
R
H
R1
N
O
NH2
R
HH
NADP+NADPH
OR
R1
H+
NADP+: nicotinamida adeninadinucleotido fosfato
84
9) Estructuras resonantes para el acoplamiento oxidativo fenólico
O
O
N
O
CH3
CH3
H
H
H
H
N+
R
O
NH2
E.C.1.14.3
E.C.1.14.3:(S)-N-metilcoclaurina oxidase (C-O acoplamiento fenólico)
Estructuras resonantes de la (S) -N-metilcoclaurina
O
O
N
OH
CH3
CH3 O
O
N
OH
CH3
CH3O
O
N
OH
CH3
CH3O
O
N
OH
CH3
CH3
O2
OH
O
N
O
CH3
CH3
H
OH
O
N
O
CH3
CH3OH
O
N
O
CH3
CH3OH
O
N
O
CH3
CH3
A
B
2
A
B
85
EC 1.14.18.1 monofenol monooxigenasa
OH
O
N
O
CH3
CH3
H
OH
O
N
O
CH3
CH3
C
B A
OH
O
N
OH
CH3
CH3OH
O
N
CH3
CH3
O12’
13
14
12’13
14
OH
O
N
O
CH3
CH3
CH3
OH
O
N
CH3
CH3
O
OH
O
N
OH
CH3
CH3OH
O
N
CH3
CH3
O12
O-metilación C12
Hidroxilación orto al puente èter
O2E.C.1.14.18.1
NADP+
SAM
OH
O
N
O
CH3
CH3
CH3OH
OH
O
N
CH3
CH3
O
chillanamina
86
EC 1.14.21.3 berbamina sintetasa
NCH3 OH
OOH CH3
NCH3
OCH3
O
O
NCH3 O
OOH CH3
OCH3
NCH3
OCH3
O
OH
O
O
N
O
CH3
CH3
CH3OH
O
O
N
CH3
CH3
O
.
- CH3O.
Vía radicales libres O2
E.C.1.14.21.3NADP+
NCH3 OH
OOH CH3
NCH3
OCH3
O
O
NCH3 OH
OOH CH3
O CH3
NCH3
OCH3
O
O
OH
O
N
O
CH3
CH3
CH3OH
O-
O
N
CH3
CH3
O
- CH3O+
Vía reacciones polares
87
Figura 39. Espectro RMN 1H de tabienina B, zona aromática y alifática
88
Figura 40. Espectro RMN 13C de tabienina B, zona aromática y alifática
89
Figura 41. Espectro COSY de tabienina B, zona aromática
90
Figura 42. Espectro COSY de tabienina B, zona alifática
91
Figura 43. Espectro HMQC de tabienina B
92
Figura 44. Espectro HMBC de tabienina B
93
Figura 45. Espectro RMN 1H de columbamina
94
Figura 46. Espectro RMN 13C de columbamina
95
Figura 47. Espectro COSY de columbamina
96
Figura 48. Espectro HMQC de columbamina
97
Figura 49. Espectro HMBC de columbamina
