Estudio microsatelital de Ipomoea batatas para entender su información y variabilidad genética...
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UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO
RECINTO UNIVERSITARIO DE MAYAGÜEZ
FACULTAD DE ARTES Y CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Estudio microsatelital de Ipomoea batatas para entender su información y
variabilidad genética realizado en el laboratorio de Genética del Departamento
de Biología de la Universidad de Puerto Rico - Recinto de Mayagüez
Jorge L. Fernández De Jesús
Isamar Flores Rodríguez
Stefanny Santana Rivera
BIOL3300-066L
Inst. Stephanie Cosme Reyes
30 de abril de 2012
Estudio microsatelital de Ipomoea batatas para entender su información y
variabilidad genética realizado en el laboratorio de Genética del Departamento
de Biología de la Universidad de Puerto Rico - Recinto de Mayagüez
JORGE L. FERNÁNDEZ DE JESÚS
ISAMAR FLORES RODRÍGUEZ
STEFANNY SANTANA RIVERA
Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico – Recinto
de Mayagüez, P.O. Box 9000, Mayagüez, Puerto Rico, 00681-9000
INTRODUCCIÓN
La batata (Ipomoea batatas) es uno
de los alimentos cosechados más importantes
del mundo. Son versátiles y sin explotar (CIP,
1999). La batata también está clasificada
como el séptimo cultivo alimenticio más
importante del mundo después del trigo, el
arroz, el maíz, la papa, cebada y la yuca
(FAOSTAT, 2007). Más del 95% de la
producción de la batata se produce en países
en desarrollo, donde es el quinto cultivo
alimenticio más importante en términos de
peso fresco. En el 2004 aproximadamente
129,536,275 millones de toneladas fueron
producidas en más de 100 países (CGIAR,
2004). La raíz de este almidón crece mejor en
climas templados pero es cultivada en la
mayoría de los países tropicales. La batata es
alta en carbohidratos y vitamina A y puede
producir más energía comestible por hectárea
por día que el trigo, el arroz o la yuca (CIP,
2010). Para el año 2050, el 90% de la
humanidad vivirá en países en desarrollo,
donde la agricultura sigue siendo la actividad
económica más importante (Raven et al.,
2006). Por los contenidos nutricionales de la
batata, en África se han utilizado para
combatir la deficiencia de vitamina A que
puede conducir a la ceguera y la muerte de
más de 300,000 niños africanos en un año.
En genética, un marcador molecular o
marcador genético es un fragmento de la
secuencia de ADN que está asociado a una
parte del genoma. Los marcadores
moleculares se utilizan en experimentos de
biología molecular y biotecnología para
identificar una secuencia particular de ADN.
Como las secuencias de ADN son altamente
especificas, pueden ser identificadas con las
ayuda de marcadores moleculares conocidos.
Marcadores moleculares basados en ADN,
como los polimorfismos de longitud de
restricción (RFLP) por sus siglas en ingles,
amplificación de azarosa de ADN
polimórfico (RAPD) por sus siglas en ingles
y repeticiones de secuencia simple (SSR) por
sus siglas en ingles fueron utilizadas en el
desarrollo del mapa genético de la batata
(Fregene et al., 1997). Estos marcadores
moleculares y otros has sido utilizados para
evaluar la variabilidad genética de los
pequeños grupos de batata germoplasma y
para establecer relaciones entre la batata y sus
parientes silvestres. Por lo general, en un
cultivo donde cultivares han sido
seleccionados y distribuidos por los mismos
agricultores y a menudo los diferentes
cultivares pueden poseer el mismo nombre
(además de la misma variedad teniendo más
de un nombre), obtener un método de
identificación, clasificación y medición de la
diversidad genética que sea objetivo es
requisito (Beeching et al.,1993; Chavarriaga-
Aguirre et al., 1998, 1999; Haysom et al.,
1994). Para lograr este objetivo, la evaluación
de la variabilidad genética de las colecciones
de germoplasma requiere marcadores
altamente polimórficos, así como de alto
rendimiento de genotipificación de los
sistemas. Los marcadores de SSR son
particularmente atractivos para estudiar la
variabilidad genética, ya que son abundantes
y ampliamente distribuidos en los genomas
de las plantas. Marcadores SSR muestran
altos niveles de polimorfismo basado en
número de unidades repetidas halladas para
cada locus en una población determinada, lo
que los hace adaptable a la automatización
(Morgante & Olivieri, 1993; Fregene et al.,
2003).
Los genomas eucariotas están
densamente intercalados con secuencias
simples que consisten en tramos de
nucleótidos repetidos tándem que pueden ser
de 1 a 10 nucleótidos (pero típicamente de 2 a
3 nucleótidos). El numero de las unidades
repetidas varia ampliamente entre los
organismos hasta un máximo de 50 copias.
Cuando estas regiones son amplificadas
individualmente por medio del “Polymerase
Chain Reaction”(PCR), utilizando un par de
oligonucleótidos de flanqueo único como
cebadores, casi siempre muestran
polimorfismos amplios debido a la variación
en longitud del sitio-especifico, que es
producido como consecuencia de diferentes
números de unidades de repetición (Morgante
y Olivieri, 1993). En eucariotas se puede
esperar encontrar al menos una secuencia
simple estirada cada 10kb de secuencia de
ADN. Los loci SSR son muy variables a
cuenta del número de unidades de repetición
encontrado para cada locus en cualquier
población dada (Morgante y Olivieri, 1993).
Los altos niveles de heterocigosidad, la
naturaleza basada en el PCR de repetición de
estos loci y su naturaleza codominante han
hecho a los marcadores moleculares SSR la
elección para la cartografía genética y los
estudios de diversidad (Tautz, 1989; Mba et
al, 2001). Actualmente, los microsatélites has
sido evaluados para muchas plantas de
cultivo incluyendo la remolacha azucarera,
melón, tomate, pimiento, algodón, sorgo,
maíz, arroz, soja y manzana. Por otra parte,
los marcadores genéticos de SSR están siendo
aplicados para plantar proyectos de
cartografía en muchas especies para saturar
los mapas genéticos existentes, por ejemplo,
en el trigo, avena, frijol, arroz, cebada,
centeno, maíz, sorgo, caña de azúcar thaliana,
Arabidopsis, tomate, papa, trigo hexaploide,
soja, entre otros (Kumar, 1999).
Esta experimentación es basada en un
módulo de laboratorio basado en la
investigación del Dr. Dimuth Siritunga
(Departamento de Biología, RUM) que va a
estudiar la diversidad genética presenta en la
batata de Puerto Rico. Para lograr esto, ellos
recogerán muestras de toda la isla, extraerán
su ADN y utilizarán la técnica molecular
conocida como marcadores SSR (repeticiones
de secuencia simple) para el análisis de
diversidad. Los marcadores de SSR, también
conocidos como microsatélites, son
marcadores codominantes que han ganado
popularidad en los últimos años debido a la
facilidad de su uso. Este módulo de
laboratorio será un ejercicio de varias
semanas y su objetivo es contribuir al
conocimiento de los estudiantes. Los
miembros del laboratorio del Dr. Siritunga
han utilizado marcadores polimórficos SSR
para evaluar la diversidad alélica dentro y las
relaciones entre las accesiones de esta batata
germoplasma de Puerto Rico. En este estudio,
ocho marcadores de SSR polimórficos fueron
utilizados con éxito. Al final de este proyecto
el estudiante habrá aprendido técnicas
moleculares avanzadas de un cultivo
alimentario muy importante del mundo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para comenzar la extracción de
ADN de batata, primero se tuvo que
recolectar sus hojas. Luego de esto, en el
laboratorio se llenó un formulario con la
información de las hojas de batata. Se
comenzó cortando un pedazo de la hoja (2
cm x 2 cm) y colocándolo en un
microtubo de 1.5 ml con un poco de arena
para macerar la hoja. Se maceró por tres
minutos. Luego se volvió a macerar por
un minuto después de agregarle 800 µl de
amortiguador con un micropipetador. Se
incubó a 65°C por 30 minutos en baño de
maría y después se centrifugó a 13,000
rpm por tres minutos más. Entonces, se
transfirió 500 µl del sobrenadante a un
nuevo microtubo de 1.5ml y se le añadió
350 µl de isopropanol frío para mezclar
por inversión. Después de mezclado, se
centrifugó a 13,000 rpm por 3 minutos.
Al terminar, se descartó el sobrenadante,
se dejó secar el pellet por cinco minutos y
se le añadió 700 µl de etanol al 70% para
volver a mezclar por inversión. Entonces,
se centrifugó a 13,000 rpm por tres
minutos, nuevamente, y se descartó el
sobrenadante. Luego de que se secara el
pellet por cinco minutos a temperatura
ambiente, se le añadió 200 µl de TE
(10:1) y 4.0 µl de polimerasa RNA
(RNAase). Se incubó a 65°C por cinco
minutos en baño de maría y, por último,
se colocó el tubo a 4°C hasta el próximo
paso: añadir la muestra al gel de agarosa.
Para esto, se preparó una gel de agarosa al
1% (0.5 g de agarosa + 50 mL Tris-Boret
1X), al cual se le añadió 3 µl de bromuro
de etidio y se colocó en la cámara de
electroforesis. Se mezcló 15 µl del ADN
con 3 µl de buffer loading dye y 2 µl de
dos marcadores (Lambda Hind) y fue
añadido al gel de agarosa.
Ya para el PCR (Polymerase Chain
Reaction) se obtuvo cinco microtubos por
cada mesa. Estos microtubos contenían 2
µl de ADN de batata y un primer por
mesa de los cinco que se utilizaron (entre
ellos, primer F, primer R y primer M13).
A cada tubo se le añadió 12.5 µl del Mix
1 y 10.5 µl del Mix 2 con un
micropietador de 2-20 µl. El Mix 1 estaba
compuesto por: PCR Master Mix (agua
doblemente destilada –ddH2O- con el
cofactor dicloruro de magnesio (MgCl2) y
dinucleótidos trifosfataos), 0.05 u/µl de
polimerasa Taq, Buffer (50 mM de
cloruro de potasio con 10 mM de Tris.Cl
–ph 8.3 a temperatura ambiente-) y por
último 400 uM de nucleótidos
trifosfatados. El Mix 2 contenía 4 mM de
dicloruro de magnesio, primer F, primer
R y primer M13. Luego de añadir ambas
mezclas, se colocaron los tubos en el
termociclador el cual calentará y enfriará
tiempos y temperaturas específicas.
Primero estará a 94°C por siete minutos.
Luego a la misma temperatura por 30
segundos para entonces bajar a 50°C por
1.5 minutos. El cuarto paso es a 72°C por
1 minuto. Entonces, volverá a los pasos 2,
3 y 4 por 35 ciclos, luego volverá a los
72°C por 10 minutos y para finalizar se
estará estabilizando la reacción a 4°C. De
éste producto transferimos 15 µl a un gel
de agarosa al 3%.
Por último, se corrió el gel de
poliacrilamida (siempre con guantes) en
el cual se utilizó el equipo de ADN
analizador. Para la preparación del gel se
utiliza acrilamida, persulfato de amonio y
TEMED. Se preparan, además, varias
soluciones: Stop (Cianol de xileno,
EDTA, azul de bromofenol, agua
deionizada) y de tinción con nitrato de
plata entre otras. El gel se sumerge a una
solución fijadora que utiliza ácido acético,
luego se escurre y se lava con agua
bidestilada o deionizada hasta que no
hayan restos del ácido. Después se
sumerge a la solución de tinción a oscuras
o tapado ya que el nitrato de plata es
sensible a la luz. Se vuelve a lavar con
agua deionizada y después de ser bien
escurrida se sumerge a una solución que
revela las bandas de ADN. Se escurre y se
introduce a la solución de parada (ácido
acético) y por último se vuelve a lavar
con agua deionizada hasta eliminar los
rastros del ácido. Éstos pasos siempre
deben ser llevados a cabo con guantes.
RESULTADOS
Por medio de la gel de agarosa se
confirmó la presencia del ADN genómico
de la batata al ver, en cada columna o
carril, las bandas del ADN (enzimas de
restricción). En el PCR los cinco
marcadores se observaron y se vio las
diferentes regiones donde se amplificó,
por ejemplo, IBR-03 se encuentra un
poco más arriba de IB-R19. En cuanto a
las bandas del gel de poliacrilamida, se
pudo apreciar que el producto (cebador 2)
obtuvo menos variabilidad versus el
cebador 1 y 4, pero mayor variabilidad
versus el cebador 3 y 5. A continuación
una tabla con las diferentes variabilidades
genéticas entre los cebadores.
Cebadores Primer 1 Primer 2 Primer 3 Primer 4 Primer 5
Primer 1 - √ √ √
Primer 2 - √ √
Primer 3 -
Primer 4 √ √ √ - √
Primer 5 √ -
√= mayor variabilidad
DISCUSIÓN
Quizá por una contaminación con
saliva o ADN externo a la muestra,
mucha exposición al aire, instrumentos
no-esterilizados suficientemente,
desnaturalizan del ADN, demasiada
exposición a la luz u otros factores que
pudieron haber dañado la muestra y
provocar que en la corrida del gel de
agarosa no pudiera apreciarse en el
laboratorio y hubo que recurrir a los
resultados de otra sección del laboratorio.
Imagen 1. Corrida electroforética del ADN de
batata: se muestra la migración de cada muestra
al cátodo indicando variabilidad en pesos moleculares.
33
20
3
2
2
1
1
110
579
33
20
3
2
2
1
1
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20
3
2
2
1
1
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579
33
20
3
2
2
1
1
110
579
Pri Pri Pri Pri Pri
Imagen 3.. Corrida de PCR de Ipomoea batatas: refleja una
escalera de pares bases no tan pronunciada pero que también
confirma la variación alélica entre los microsátelites de los
cebadores utilizados, siendo el Cebador 1 el más diferente a los otros cuatro.
Imagen 2. PCR de los cebadores.
Precisamente, con estos resultados, se
pudo probar que sí existe variabilidad
genética dentro de la especie Ipomoea
batatas en Puerto Rico. Esto puede ser
explicado con que la variabilidad genética es
producto de las diferentes adaptaciones que
una misma especie puede tener e ir
acumulándose y dentro de un tiempo
indeterminado producirse la evolución de una
nueva especie. Al observarse la corrida
electroforética en agarosa de la muestra de
ADN de batata (Imagen 1) puede notarse que
algunas muestras migraron más que otras
hacia el cátodo, lo que es indicativo que el
peso molecular entre éstas fue levemente
distinto. Por otra parte, el PCR hecho a las
muestras (Imagen 2 y 3) refleja una escalera
de pares bases no tan pronunciada pero que
también confirma la variación alélica entre
los microsátelites de los cebadores utilizados,
siendo el Cebador 1 el más diferente a los
otros cuatro. Como las hojas utilizadas
procedían de diferentes regiones de la isla,
cada una tenía diferentes adaptaciones a sus
zonas de cultivo, las cuales pueden ser unas
más calurosas u otras más lluviosas u otras
más expuestas a patógenos, en fin, las plantas
están adaptadas a sus respectivos entornos.
CONCLUSIÓN
La batata es el séptimo cultivo más
importante en la economía mundial por su
gran capacidad de ser utilizado para la
fabricación de distintos productos
derivados, por lo tanto, es muy
importante estudiar su información
genética para así poder aprovechar más
esa eficiencia alimenticia que provee esta
especie. Su adaptabilidad es crucial que
sea conocida para así tener mayor
producción, ya que de esta forma podría
atacarse la hambruna que tanta gente en el
mundo sufre especialmente en países
poco desarrollados. Con este laboratorio
se pretendió tener una idea de la
variabilidad genética de la batata en
Puerto Rico y quizá así aprovechar esa
versatilidad que ofrece este cultivo para el
beneficio no sólo de los puertorriqueños
sino que también de otras poblaciones.
Una vez entendida mejor la genética de la
batata puede conllevarse a experimentos
futuros en la agricultura en los cuales
poner a prueba ese dinamismo como
cultivo que posee la batata para que sea
aun más alternativo que lo que es
actualmente frente a otros cultivos.
LITERATURA CITADA
Beeching et al.,1993;
Chavarriaga-Aguirre et al., 1998, 1999;
Haysom et al., 1994. Assessment of
genetic diversity among African
cassava Manihot esculentaGrantz
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http://www.springerlink.com/content/p50
613720234867l/. 27 Abril 2012.
CIP. 1999. Farmer Field School
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Web.
http://cipotato.org/publications/annual_re
ports/1999spa/112. 27 Abril 2012.
CGIAR, 2004. CGIAR Annual
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http://www.cgiar.org/publications/annual/
pub_ar2004.html. 28 abril 2012
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abril 2012
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resistance to the cassava mosaic disease.
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(9), pp.873-881. Web.
http://www.ajol.info/index.php/ajb/article
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Kumar, 1999. A microsatellite
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Morgante & Olivieri, 1993;
Fregene et al., 2003. An SSR-based
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Springer Link. Web.
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more realistic risk–benefit analysis of
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles
/PMC2288773/. 28 Abril 2012.
Tautz, 1989, Mba et al, 2001.
Aislamiento y caracterización de
marcadores moleculares microsatelites a
partir de la construcción de librerias
genomicas enriquecidas de
camote(Ipomoen batatas (L) Lam). Web.
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesi
s/basic/ya%C3%B1ez_a_v/antecedentes.h
tm. 28 Abril 2012.
AGRADECIMIENTOS
Se le agradece a la instructora del
Laboratorio de Genética del Recinto
Universitario de Mayagüez, Stephanie
M. Cosme Reyes, por su
profesionalismo al ayudarnos a hacer este
experimento. Además, el mérito va al
personal encargado de brindar todos los
materiales requeridos y las guías
necesarias para poder realizar el mismo, y
a la coordinadora de los laboratorios, Sra.
Gladys Toro Labrador. Por último, se
reconoce la cooperación de todos los
compañeros del laboratorio de la Sección
066L por su colaboración y orden.