Estudio químico comparativo del extracto apolar de las hojas de la especie Elaeis

oleífera (H.B.K) Cortés colectada en dos diferentes hábitats de Colombia y Perú.

Alejandra Franco Rojas

Pontificia Universidad Javeriana

Facultad de Ciencias

Carrera de Biología

Bogotá D.C.

Estudio químico comparativo del extracto apolar de las hojas de la especie Elaeis

oleífera (H.B.K) Cortés colectada en dos diferentes hábitats de Colombia y Perú.

Alejandra Franco Rojas

Jorge Robles Camargo

Profesor Asociado Depto. De Química

Director

Ricardo Vera Bravo

Profesor Asociado Depto. Química

Jurado

Nota de advertencia

Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946

“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica

y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ella

el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

AGRADECIMIENTO

Agradezco de todo corazón a todas aquellas personas que me brindaron su apoyo y compañía

en la realización de este trabajo de grado, en especial a mi hija MARIA JOSE, por ser el

motor de mi vida, a mi padre por el apoyo incondicional que me ha brindado desde que inicie

la carrera de biología. Agradezco también a mi director de tesis JORGE ROBLES por la

orientación, el seguimiento y la supervisión continua de la misma.

RESUMEN

Los aceites esenciales y los extractos vegetales son mezclas complejas de Metabolitos

secundarios que cubren un amplio espectro de efectos farmacológicos mostrando diversas

propiedades biológicas. El propósito de este trabajo es la identificación de los componentes

químicos de los extractos apolares de E. oleifera, y los compuestos encontrados se

compararon entre las cuatro muestras de palmas estudiadas (P1, P2, P19 Y P129). Se

procesaron los foliolos de la hoja 17, se mezclaron por siete días en etanol y se extrajeron las

fracciones totales y apolares. La identificación química de las fracciones apolares se realizó

mediante cromatografía de capa delgada, cromatografía bidimensional y cromatografía de

gases. El análisis de los compuestos químicos mostró la presencia de similitudes entre las

cuatro palmas. Cabe destacar la presencia de los ácidos grasos omega 3 y 6, Vitamina E,

ácidos grasos de membrana. Se concluyó que hay diferencia de compuestos de la palma 129

con respecto a las palmas 1, 2 y 19.

INTRODUCCIÓN

Elaeis es un género relativamente reducido de la familia Arecaceae, existiendo solo dos

especies hasta ahora registradas: Elaeis oleífera y Elaeis guineensis con sus respectivas

variedades. La palma africana (E. guineensis) es la más comercial y se siembra en grandes

extensiones, en el mundo hay aproximadamente 13, 5 millones de hectáreas en producción, el

país con mayor área sembrada es Malasia con 9,09 millones de hectáreas, mientras Colombia,

el país de mayor área sembrada en América, tiene una producción de 267.000 hectáreas en

producción (Fedepalma 2012). Esta especie es fuente de aceite de gran importancia

económica convirtiéndola en el cultivo de mayor crecimiento en las regiones tropicales del

mundo. E. oleífera es de origen Americano de ahí su nombre, se encuentra en países

centroamericanos y suramericanos incluido Colombia. Esta especie no explota

comercialmente pese a que produce un aceite de excelente calidad y rico en fitonutrientes,

cuyas propiedades químicas son ideales para la industria cosmética, nutracéutica y

farmacéutica; también, es de gran importancia genética, por la generación de híbridos

interespecíficos con la palma africana, los cuales han mostrado ser una alternativa agronómica

para reducir el impacto de las enfermedades letales de común ocurrencia en los cultivos

comerciales de E. guineensis (Patiño, 1977).

Descripción taxonómica del género

Se conocen dos especies, Elaeis guineensis (especie Africana) y Elaeis oleífera (especie

Americana). Son palmeras con un tallo (estipe) grueso, largas hojas pinnadas y en general

arqueadas, peciolos fuertemente armados, y foliolos basales espinosos. Las inflorescencias

masculinas y femeninas están en una misma planta (Dioicas). Los frutos tienen mesocarpio

muy aceitoso y endocarpio grueso, lo cual ha situado a la especie E. guineensis entre las

palmas más cultivadas y con mayor importancia del mundo (Del Cañizo 2011). En cuanto a la

especie E. oleífera, su importancia radica en su utilización como madre en cruzamientos con

padres de la palma africana para obtener híbridos interespecíficos denominados OXG, los

cuales producen una mejor calidad del aceite, presentan una menor tasa de crecimiento

vertical, que facilita la cosecha por un mayor número de años, y presentan tolerancia a las

principales enfermedades letales que atacan a los cultivos comerciales de E. guineensis

(Franco 2010).

Reino: Plantae

División: Angiospermae

Clase: Equisetopsida

Subclase: Magnoliidae

Superorden: Lilianae

Orden: Arecales

Familia: Arecaceae Bercht. & J. Presl 1820

Género: Elaeis Jacq.

Especies: Elaeis oleifera (H.B.K) Cortes 1897

Elaeis guineensis Jacq 1763

Sinonimia: Alfonsia oleifera Kunth 1816

Elaeis melanococca Mart. 1824

Elaeis melanococca var. semicircularis Oersted 1859

Elaeis oleifera (Kunth) Cortes ex Prain 1915

Corozo oleífera (Kunth) L. H. Bailey 1933

Elaeis oleifera (Kunth) Cortés ex Wess. Boer 1965

Descripción química del género Elaeis

En los aceites obtenidos a partir de los frutos de las palmas del género Elaeis es posible

encontrar: ácidos grasos, vitamina E, carotenoides y esteroles, compuestos que son comunes

para E. guineensis y variedades naturales dura, pisíferas y ténera, también para la especie E.

oleífera y su híbrido interespecífico. En los ácidos grasos se encuentran, los isómeros de

carotenoides, tocoferoles y tocotrienoles. Los carotenos, la vitamina E y los fitoesteroles son

componentes bioactivos de los alimentos ya que, además de los micronutrientes, siendo

sustancias que suministran efectos beneficiosos sobre la salud (reducción del colesterol

plasmático y prevención de arteriosclerosis, cáncer y enfermedades degenerativas)

(Cenipalma 2002).

En la fracción metanolica de las hojas de E. guineensis, se ha reportado: tetracosahexano con

actividad antimicrobial (Rajoo et al. 2010). Polifenoles, Vitamina E, butilato hidroxitolueno

como antioxidantes (Sasidharan et al. 2009, Vijayarathna et al. 2012). Contenido de

polifenoles como antoixidante (Rosalina Tan et al. 2011). Dimetil sulfóxido; tetrahidro-trans-

3,4-furanodiol; 1-amino-2, 6 - dimetilpiperidina; 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-piran-

4-ona; 4-metil-1-(1-metiletil)-3-ciclohexeno-1-ol; 5-(hidroximetil)-2-Furancarboxaldehido;

D-manosa; 1,6-anhidro-α-D-glucopiranosa (levoglucosano); 3-terc-butil-4-hidroxianisol; 3,4-

dihidro-2 (1H)-isoquinolinecarboximidamide; y 5-isopropenil-2-metilciclopent-1-eno-

carboxaldehído (Vijayarathna et al. 2012). Xantina oxidasa como antioxidante y potencial

hepatoprotector (Vijayarathna et al. 2012). Catequinas (Jaffri et al. 2011). Fenoles, difenoles

y flavonoides (Han & Choo 2010)

Los principios activos de origen vegetal son sustancias que se encuentran en las distintas

partes u órganos de las mismas y que alteran o modifican el funcionamiento de órganos y

sistemas del cuerpo humano y animal. La investigación científica ha permitido descubrir una

variada gama de principios activos, de los cuales los más importantes desde el punto de vista

de la salud, son los aceites esenciales, los alcaloides, los glucósidos o heterósidos, los

mucílagos y gomas, y los taninos. Existen en las plantas otros principios activos relevantes

denominados nutrientes esenciales, como las vitaminas, minerales, aminoácidos,

carbohidratos y fibras, azúcares diversos, ácidos orgánicos, lípidos y los antibióticos. Entre

estos principios activos encontramos a los metabolitos secundarios, los productos que derivan

de ellos no son esenciales para el metabolismo de las plantas sino sustancias de defensa,

adaptación, entre otras. Sin embargo, el no ser esenciales para la planta no significa que no

sean de importancia para otros organismos (Arraiza 2009).

JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El follaje de las plantas es parte de la biomasa producida por ellas y en muchos casos el

exceso de follaje en las plantas de los cultivos comerciales se convierte en un problema,

debido a que obstaculiza las labores agronómicas del siguiente cultivo. Algunas aplicaciones

y usos de la biomasa de los cultivos y en particular del follaje, se han enfocado a su

reutilizarla como compostaje y como materia prima básica para la industria del papel.

Cultivos como la Palma Africana, producen grandes cantidades de follaje y el alto costo del

transporte de esa biomasa, hace poco viable su reutilización en industrias como la papelera

(Corley & Tinker 2003). De otra parte, en el follaje de muchas especies de plantas se

encuentran altos contenidos de nutrientes como aminoácidos, proteínas y carbohidratos. Las

plantaciones de palma africana en Malasia, producen de 22 a 26,2 millones de toneladas de

follaje por año (Husin et al. 2012, Azlan 2008). Según Franco 2010, las hojas sobrantes de la

poda o cosecha en cultivos de palma africana pueden ser un problema cuando se acumulan en

franjas continuas, mientras que cuando se distribuyen en forma radial, alrededor de cada

palma, éstas se incorporaran rápidamente como materia orgánica al suelo. Se han realizado

muchos estudios con el fin de resolver el problema del manejo del follaje. Países como

Malasia y sus grandes avances científicos, busca la máxima utilización de los subproductos

de las plantaciones (Corley & Tinker 2003). Es así como las hojas de la palma africana se han

usado para la alimentación animal, suplemento alimenticio en humanos y productos

biodegradables (Azlan 2008).

Por lo tanto, esta investigación será de utilidad a productores del sector de palma u otros

cultivos con alta producción de biomasa foliar a maximizar la utilización de subproductos

como el follaje y convertirlos en producto de mayor valor agregado, como por ejemplo la

fibra de celulosa u otros componentes como la vitamina E.

Los científicos Malayos se han enfocado siempre en la especies Elaeis guineensis (Palma

Africana de Aceite) para su mejoramiento, a su vez, muestran interés en la especie Elaeis

oleífera (Palma Americana) para el mejoramiento de la calidad del aceite, la tasa de

crecimiento y la sanidad del cultivo, mediante el desarrollo del hibrido interespecífico entre

las dos especies, denominado comúnmente OXG, por las iniciales de la especie de cada

palma. Sin embargo, la palma americana posee mejor calidad y mayor proporción de

compuestos en los frutos con respecto a la palma africana, por lo que se lleva a suponer que

los compuestos de las hojas pueden ser más diversos e incluso cantidades superiores a la

especie E. guineensis.

El problema del proyecto de investigación está centrado en la escasa información que hay de

estudios químicos a partir de extractos foliares en el género Elaeis. Sin embargo, como se

menciona anteriormente solo se encuentra información actualizada en la palma africana.

MARCO TEÓRICO

En el contexto mundial sobre la utilización del follaje, se enfatiza en la conversión de la

biomasa en alguna forma de energía para satisfacer necesidades de los habitantes de las

ciudades e industrias. Países como Cuba reutilizan la biomasa resultante de la caña de azúcar

en biocombustible y alimentación de ganado; la caña de azúcar es la fuente más importante de

biomasa con que cuentan para el desarrollo de energía renovable, y es la única a partir de la

cual se está generando electricidad (Montiel 2003).

La importancia industrial del uso del follaje, se ve reflejada en el avance de los brasileños,

quienes con la mayor área cultivada de caña de azúcar en el mundo (5.02 millones de

hectáreas), han mostrado desde los años 80 mediante la fabricación de bioetanol para uso

energético, de los subproductos recuperables (bagazo) que la caña. Además, se produce etanol

hidratado (con 4 o 5% de agua), que se utiliza directamente en motores de explosión

preparados para ello. Actualmente, en Brasil han llegado a funcionar más de 5 millones de

automóviles con esta tecnología, de los que 3 millones funcionan exclusivamente con este

combustible, el mismo está comenzando a convertirse en una alternativa importante frente al

uso de los combustibles fósiles tradicionales (Díaz & Portocarrero 2002).

Sin embargo, no se ha dado un uso interesante como para la industria farmacéutica o

cosmética, a partir de los componentes básicos, los cuales podrían ser precursores de un sinfín

de productos naturales muy apetecidos en los últimos tiempos.

En la palma africana se ha evidenciado contenidos bajos (según el extracto utilizado) de

Vitamina E, importante por su actividad antioxidante que a su vez protege los tejidos

corporales dañados a causa del exceso de radicales libres, la vitamina también actúa como

anticoagulante, protegiendo el sistema inmunitario, a su vez, ayuda a prevenir enfermedades

como el cáncer, la cardiopatía, la demencia, la enfermedad hepática y el accidente

cerebrovascular (Rodríguez 2009). Se encuentra este compuesto comúnmente en el aceite del

mesocarpio de la Palma Africana, también lo encontramos en hojas. Adicionalmente se puede

suponer que en la Palma Americana también se debe presentar y posiblemente en mayor

cantidad.

La importancia de esta especie se da en que es una especie nativa de Colombia y su uso

empezó a desarrollarse muchos años atrás en el departamento de Córdoba, como una fuente

de alimento para animales y humanos, al igual que para calmar algunas dolencias de la gente,

aunque también fue utilizado como combustible (Patiño 1977). Con la llegada de la especie

africana E. guineensis, el gobierno incentivo su cultivo hasta completar en la actualidad cerca

de medio millón de hectáreas y como consecuencia de este apoyo, sumado a otras causas, se

abandonó el crecimiento de una industria nacional que pudo ser muy importante en la década

de los 50 y 60 (Fedepalma 2013). A partir del interés que han tenido los diferentes centros de

investigación de palma africana en el mundo sobre esta especie, como una ruta para

desarrollar híbridos interespecíficos entre la palma africana y palma americana, dejando de un

lado el potencial de esta última especie como cultivo comercial (Patiño 1977). En el estudio

se identificaron metabolitos secundarios del extracto apolar de las hojas de Elaeis oleífera. Se

propone que a partir de los resultados del mismo, sea posible fomentar la domesticación de la

E. oleífera, cuyos productos primarios como son las ácidos grasos, aceites esenciales, entre

otros compuestos, sean utilizados como materia prima en la elaboración de productos

farmacéuticos y cosméticos, lo cual motivaría el desarrollo de cultivos de la especie.

OBJETIVOS

Objetivo General

Detectar los metabolitos mayoritarios presentes en las hojas de Elaeis oleífera de diferentes

hábitats en Colombia y Perú.

Objetivos específicos

1. Colectar los foliolos de la hoja 17 de diferentes hábitats en Colombia y Perú.

2. Obtener extractos totales y fracciones apolares de los anteriores.

3. Desarrollar cromatografías de capa delgada bidimensional y cromatografía de gases a las

fracciones apolares.

4. Comparar los contenidos de las diferentes muestras.

METODOLOGÍA

Colecta de material vegetal

Las muestras se colectaron en el mes de Julio, tomando foliolos del área media de la hoja

número 17 de cada palma madura, debido a que esta hoja es la utilizada para todo tipo de

análisis foliar de laboratorio en las investigaciones de palma africana (Rivera 2009). Se

tomaron cuatro muestras en dos hábitats diferentes, distribuidos así:

Código

muestra Hábitat Ubicación

Altura sobre el nivel

del mar (msnm) Departamento

Coordenadas

(Google Earth) País

Cantidad

de

muestras

Palma 1 Terreno drenado Montería 59 Córdoba N8° 25´56.6´´

W75° 44´31.2´´ Colombia 200 g

Palma 2 Terreno anegado Montería 65 Córdoba N8° 24´57.7´´

W75° 43´53.7´´ Colombia 200 g

Palma19 Terreno anegado Campo Verde 162 Ucayali S8º 36´21.3´´

W74º 41´15.3´´ Perú 200 g

Palma 129 Terreno drenado Campo Verde 172 Ucayali S8º 36´ 19.4´´ W74º

41´13.3´´ Perú 200 g

Figura 1. Fotografías correspondientes a las palmas estudiadas en el presente trabajo. Las fotos P1 y P2 son las palmas colectadas en Colombia y las fotos P19 Y P129 son las palmas colectadas en Perú.

Posteriormente los foliolos fueron separados del raquis, se secaron a medio ambiente por

cuatro días y se almacenaron 200 gramos de hojas secas y molidas en bolsas ziploc

debidamente rotuladas e identificadas.

Procedimiento de extracción

El material vegetal ya seco, se procesó hasta dejarlo casi polvo y se obtuvo las siguientes

fracciones:

a. Extracto total: Aproximadamente 200 g de muestra seca se extrajo con 1 L de etanol y se

puso en contacto con este durante 7 días. La eliminación de la muestra a partir de disolventes

se llevaron a cabo por filtración a través de papel de filtro de celulosa pura y el filtrado se

concentró a presión reducida con rota-evaporador a 40 ºC hasta una quinta parte del volumen

inicial.

b. Fracción apolar: Se realizó fraccionamiento líquido-líquido con aproximadamente 4,5 g

de la extracción total en un balón de decantación, se agregó 15 ml de Cloroformo formando

dos fases líquidas, rescatando la fase inferior debido a que el cloroformo es más denso

(pesado) que el agua. Finalmente se concentró a presión reducida con rota-evaporador a 40 ºC

hasta una quinta parte del volumen inicial.

Cromatografía de capa delgada

Se empleó gel de sílice (SiO2) para separar los compuestos polares y apolares. La fase

estacionaria (gel de sílice) se agregó en láminas de vidrio en placas de 10 cm x 10 cm. Las

diferentes fracciones se sembraron en forma de punto con capilares y separadas cada 10 mm.

Se usó como fase móvil 20 mL de una solución de mediana polaridad de éter de petróleo y

acetato de etilo (16:4) y otra solución polar de diclorometano y metanol (19:1).

Posteriormente, las placas se colocaron en una cámara de vidrio de 15 cm alto por 30 cm de

largo y 7 cm de ancho, en el que se colocaron previamente la fase móvil hasta un nivel de 2-5

mm. Finalmente los cromatogramas se observaron a luz ultravioleta de longitud de onda corta

(283 nm) y se revelaron con una solución de vainillina, disueltos en ácido sulfúrico

concentrado y se colocó el cromatograma en una plancha de calentamiento hasta que se

revelaron la totalidad de los compuestos.

Cromatografía de capa delgada bidimensional

Se empleó gel de sílice (SiO2) para separar los compuestos polares y apolares. Las

absorbentes se agregaron en un soporte de lámina de vidrio en placas de 10 cm x 10 cm. Las

muestras de las fracciones apolares se sembraron individualmente (por placa) en una esquina

y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes de la placa con una solución

apolar de Hexano y acetona (16:4). Luego de finalizar la primera corrida, se dejó secar la

placa, se giró 90º y se dejó correr con una solución polar de diclorometano y metanol

(19,6:0,4). Posteriormente, las placas se colocaron en una cámara de vidrio de 15 cm alto por

30 cm de largo y 7 cm de ancho 7 cm por 15 cm de altura, en el que se colocaron previamente

la fase móvil hasta un nivel de 2-5 mm. Finalmente los cromatogramas se observaron a luz

ultravioleta de longitud de onda corta (283 nm) y se revelaron con una solución de vainillina,

disueltos en ácido sulfúrico concentrado y se colocó el cromatograma en una plancha de

calentamiento hasta que se revelaran la totalidad de los compuestos.

Cromatografía de gases

El análisis por GC-MS se realizó en un cromatógrafo de gases termo espectrómetro de masas

(Agilent GC / MS 6890N/5873I) equipado con una columna HP-5ms (30 m de largo, 0,25

mm de diámetro, espesor de película 0,25 μm). La temperatura de entrada fue de 280 °C. La

temperatura del horno se programó a 70ºC durante 2 min, aumentando 20ºC por min hasta

llegar a 280 °C, que se mantuvo durante 20 min. El gas portador fue helio a una velocidad de

flujo de 1,2 ml / min (modo sin fraccionamiento). Calentador MSD línea de transferencia se

fijó a 280 °C. El espectrómetro de masas cuadrupolo, escaneó en el rango de 10 a 700 amu,

con un voltaje de ionización de 70 eV y una temperatura de la fuente de iones de 250 °C. Los

compuestos se identificaron mediante búsquedas electrónicas en las bibliotecas comerciales

del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) (Rajoo et al. 2010, Vijayarathna et al.

2012, Chong et al. 2008, Sasidharan et al. 2009).

RESULTADOS

Extracción de fracciones totales y apolares

En la tabla 1 se aprecia la cantidad de fracciones polares y apolares, obtenidas a partir de un

peso inicial de follaje seco de cuatro palmas procedentes de cuatro diferentes hábitats.

Tabla 1. Pesos y rendimientos de las fracciones a partir del peso seco inicial de las hojas de E.

oleífera.

Muestras Peso seco inicial (g)

Peso Fracción total (g)

Rendimiento

Peso Fracción

apolar (4,5 g)

Rendimiento (4,5g)

Palma 1 C 200 7,74 3,87% 0,76 16,82% Palma 2 C 200 8,84 4,42% 1,37 30,34% Palma 19 P 200 5,29 2,65% 1,45 32,26% Palma 129 P 200 4,63 2,31% 1,30 28,89%

Cromatografía de capa delgada (CCD)

Se hizo una CCD corrida en dos fases móviles; la primera fue con Acetato de Etilo y Éter de

Petróleo (16:4) y la segunda, con Diclorometano y Metanol (19:1). El propósito de usar estas

fases era determinar la ausencia o presencia de compuestos entre las palmas objeto de estudio

de la fracción total.

En la figura 2, se aprecia el cromatograma obtenido a partir del Éter de Petróleo y Acetato de

Etilo (16:4). A la izquierda, el cromatograma a luz visible y a la derecha el revelado con

Vainillina; en la parte inferior de cada cromatograma se identifica la palma, mientras que en

sentido vertical se enumera los colores presentes, los cuales corresponden a diferentes

compuestos. En el cromatograma a luz visible se observan seis compuestos (1 al 6), los cuales

son similares a los compuestos 1 a 6 del cromatograma revelado con Vainillina; sin embargo

en este último se aprecian tres colores adicionales que corresponden a igual número de

compuestos (6, 7 y 8), mientras que el compuesto 9 correspondería al que aparece como 6 en

el cromatograma sin revelar. También se destaca la presencia del compuesto 3 solamente en

las palmas 19 y 129, correspondientes a las colectadas en Perú.

En la figura 3, se aprecia el cromatograma obtenido a partir del Diclorometano y Metanol

(19:1). A la izquierda, el cromatograma sin revelar, en el centro el cromatograma expuesto en

luz UV y a la derecha el revelado con Vainillina; en la parte inferior de cada cromatograma se

identificada como en la figura anterior. En el cromatograma sin revelar se observan cinco

compuestos (1 al 5), los cuales son similares a los compuestos 1 al 5 del cromatograma

revelado con Vainillina; sin embargo en este último se aprecian tres colores adicionales que

corresponden a igual número de compuestos (5, 6 y 7) que se observan también en el

cromatograma expuesta en UV, mientras que el compuesto 8 correspondería al que aparece

como 5 en el cromatograma sin revelar. También se destaca la presencia del compuesto 7

solamente en las palmas 19 y 129, correspondientes a las colectadas en Perú. Asimismo en las

palmas 19 y 129, en el cromatograma expuesto a UV se observa un compuesto azul

fluorescente entre el compuesto 1 y 2.

Figura

FiCro

a 2. CromatoC

igura 3. Cromomatograma

ografía de capCromatogram

matografía da luz visibleVainillina/H

pa delgada cma a luz visibl

de capa delgae, B) expuestH2SO4; en lo

corrida con Éle y B) revel

ada corrida cta a luz UV d

os círculos, co

Éter de petróllado con Vain

on Dicloromde onda cortaompuestos fl

eo y Acetatonillina/H2SO

metano y Meta (283nm) y luorescentes.

o de Etilo (16O4.

tanol (19:1). C) revelado .

6:4). A)

A) con

Cromatografía bidimensional

Se realizó una cromatografía bidimensional con las fracciones apolares, consistió en dos fases

móviles, en la figura 4 se observa la primera fase que fue corrida con Hexano y Acetona

(16:4), en la figura 5 se observa la segunda fase que fue corrida con Diclorometano y Metanol

(19,6:0,4). Con este tipo de cromatografía se buscaba separar las mezclas complejas por la

superposición de los colores y así facilitar su identificación.

Figura 4. Cromatografía bidimensional, primera fase, corrida con Hexano y Acetona (16:4); los

círculos rojos muestra la diferencias o similitudes en el patrón de coloración de los compuestos.

En la figura 4, se aprecian los cromatogramas de la primera fase con Hexano y Acetona

(16:4). Las cuatro fotos corresponden a las cuatro palmas, cuya identificación aparece en la

parte superior izquierda de cada recuadro. En los cromatogramas sin revelar a la luz visible se

observan cinco compuestos (1 al 5), los círculos rojos indican la presencia de un compuesto

de baja polaridad común a las palmas 1, 2, 19 pero no para la palma 129.

En la figura 5, se aprecian los cromatogramas de la segunda fase con Diclorometano y

metanol (19,6:0,4) ya reveladas con vainillina. En los cromatogramas se observan de 18 a 24

compuestos. Se identifica la presencia de los compuestos mediante círculos de color verde,

rojo, azul y lila. En la tabla 2 se relacionan la presencia de los compuestos en cada una de las

palmas.

Figura 5. Cromatografía bidimensional, segunda fase, corrida con Diclorometano y metanol (18,6:0,4)

y revelado con vainillina/H2SO4.

Tabla 2. Compuestos encontrados en la cromatografía bidimensional para cada fracción apolar de las hojas de E. oleífera.

Compuesto Color Círculos P 1 P 2 P 19 P 129 1 Azul X X X X 2 Azul X X X X 3 Lila X X 4 Lila X X 5 Rojo X X X X 6 Azul X X X X 7 Rojo X X X X

Compuesto Color Círculos P 1 P 2 P 19 P 129 8 Rojo X X X X 9 Rojo X X X X

10 Rojo X X X X 11 Rojo X X X X 12 Azul X X 13 Rojo X X X 14 Rojo X X X 15 Verde X X X 16 Verde X X X 17 Verde X X X X 18 Rojo X X X X 19 Azul X 20 Azul X 21 Azul X 22 Azul X 23 Azul X 24 Azul X 25 Azul X 26 Azul X

Cromatografía de gases

La cromatografía de gases fue la última técnica usada en el estudio. La fracción apolar de

cada una de las cuatro palmas fue inyectada con una jeringa hipodérmica a través de un

séptum de goma (o hule) de silicona autosellante, a un alineador de vidrio (glass insert)

contenido en un bloque metálico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna. El bloque

se calentó a una temperatura de 70ºC durante 2 min, aumentando 20ºC por min hasta llegar a

280 °C, que se mantuvo durante 20 min. lo suficientemente alto para convertir la muestra

líquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada fue del orden de 1 μL para líquidos. Para

la detección de compuestos, el espectrómetro de masas se une directamente al cromatógrafo

de gases y permite la identificación de los compuestos separados cromatográficamente.

En la figura 6 se observan los cromatogramas resultantes de las palmas analizadas con sus

respectivos tiempos de retención en color azul después de haber sido separados por la

columna y en la tabla 3 se relacionan los diferentes compuestos encontrados para cada palma

estudiada, con sus respectivos nombres comunes, pesos moleculares y fórmulas a excepción

del compuesto 2 etilhexil mercaptoacetato.

Figura

a 6. Cromatoograma de CGG-EM obteniido de los exxtractos apolaares de las paalmas 1, 2, 19 y 129

Tabla 3. Principales compuestos identificados por CG-EM en cada fracción apolar de las hojas de E. oleífera, con sus respectivas fórmulas moleculares y peso molecular obtenidos en PubChem.

Nombre Químico  Nombre Común  % coincidencia  Fórmula Peso molecular (g/mol)  P 1 P 2 P 19  P 129 

2 Metoxi 4 vinilfenol  4‐Vinilguaiacol  93  C9H10O2  150,1745.  X 

2 (4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahidro 4,4,7α trimetil 

2 (4H) Benzofuranona,  5,6,7,7a‐tetrahydro‐4,4,7a‐trimethyl, (7aR)‐4,4,7a‐trimethyl‐6,7‐dihydro‐5H‐1‐benzofuran‐2‐one. 

90  C11H16O2  180,24354.        X 

Quinona 4 oxime 2, 6 di tert butil  Quinona  93  C12H22NO2  196,314.  X 9 octadecenamide (Z)  Ácido oleico amida, oleamida  90  C18H35NO  281,4766.  X 

Etil hexadecanoato  Etil palmitato, etil éster del ácido palmítico, ácido palmítico, ácido hexadecanoico  93‐97  C18H36O2  284,47724.  X  X  X  X 

Fitol  Fitol, 3,7,11,15 tetrametil 2 hexadeceno 1 ol  86‐91  C20H40O  296,531.  X  X  X Vitamina E  Alfa tocoferol  99  C29H50O2  430,7061.  X Escualeno  Spinacene  93  C30H50  410,718.  X  X 

Ácido heptadecanoico, Etil éster  Etil heptadecanoato, etil heptadecanoico, ácido margárico  93‐98  C19H38O2  298,50382.  X  X  X   

9,17 Octadecadienal (Z)  Dietanolamida  93  C18H32O  264,44608.  X 2 etilhexil mercaptoacetato  87  C10H18SO2  222,272  X Gama tocoferol  7,8‐Dimetiltocol  95  C28H48O2  416,67952.  X Estigmasterol  89  C29H48O  412,69082.  X Gamma sitosterol  Beta Dihidrofucosterol  94  C29H50O  414,7067.  X Ácido linoleico, etil éster  Etil linoleato, Mandenol. Omega 6  99  C20H36O2  308,49864.  X  X  X Ácido octadecanoico  Estearato, ácido esteárico  90  C18H36O2  284,47724.  X 

Ácido octadecanoico, etil éster  Ácido esteárico etil éster, etil octadecanoico o etil esteárico  97  C20H40O2  312,5304.  X       

Miristato de etilo  Etil éster tetradecanoico, etil tetradecanoico, ácido mirístico  96  C16H32O2  256,42408.  X       

9,12,15 Ácido octadecatrienoico, etil éster  Alfa ácido linolénico, linolenato, alfa linolenato, ácido alfa linolénico o ácido linolénico. Omega 3  90‐99  C18H30O2  278,4296.  X       

2 Cloroetil linoleato  Ácido linoleico, 2 cloroetil éster. Omega 6  90  C20H35ClO2 342,9437.  X 

Figura 7. Espectro de masas del alfa tocoferol presente en la palma 19.

Figura 8. Fragmentación de la molécula alfa tocoferol.

Se obtuvo el espectro de masas de la Alfa tocoferol (Vitamina E) detectada en la palma 19

(figura 7), y en la figura 8 se muestran las respectivas fragmentaciones que suceden en la

molécula y mediante los cuales se obtienen los iones de referencia característicos para este

compuesto.

DISCUSION Y CONCLUSIONES Extracción de fracciones totales y apolares

Según la Tabla 1, durante el proceso de extracción de las fracciones total y apolar, hubo un

mayor rendimiento de la apolar, debido a la presencia mayoritaria de compuestos con baja

polaridad, como son los ácidos grasos de cadena larga C16, C18, C20, C28 O C29 y el escaso

contenido de compuestos con alta polaridad, como alcoholes, compuestos con azufre o con

nitrógeno, flavonoides, derivados del furano y compuestos no identificados, según Marrero et

al (2011) el bajo rendimiento de la fracción total se da por el bajo contenido de compuestos

de alta polaridad.

Cromatografía de capa delgada (CCD)

En la cromatografía de las figuras 2 y 3 se observa mayor presencia de compuestos de baja

polaridad ya que éstos avanzan fácilmente con el frente del solvente debido a la baja polaridad

del éter de petróleo separándose de los compuestos de alta polaridad. En la figura 2 se

aprecian dos tipos de clorofila, la clorofila a, cuya coloración es verde azulada (número 5 en

la escala vertical) que contiene un átomo central de Mg contenido en un anillo de porfirina

junto a un alcohol insaturado denominado fitol y un grupo metilo (-CH3). La clorofila b, es

similar a la clorofila a pero posee un grupo aldehído (-CHO), y se observa en el

cromatograma de color verde amarillento (número 4 en la escala vertical). Las manchas

amarillas (números 1 de la escala vertical) corresponderían a xantofilas (luteína, violaxantina

y neoxantina); estos compuestos son derivados oxigenados de los α, β-carotenos. Las

coloraciones amarillas que están con el frente del solvente corresponderían a carotenos

(número 6 en la escala vertical - Figura No. 2 A y B), estos últimos contienen hidrógenos y

carbonos (hidrocarburos); la coloración varía desde el amarillo al anaranjado siendo más

abundante los β-carotenos (Baundino 2007, García & García 1969).

En la figura 3 no hay una separación clara de compuestos como las clorofilas y carotenos,

posiblemente debido a la proporción de los solventes en la solución de la fase móvil y su alta

polaridad que no permitió la separación, ya que la clorofila b es más polar que la clorofila a,

se absorbe más intensamente y presenta, en consecuencia, una relación de frente (Rf) menor,

por lo que se deduce que el arrastre del frente del solvente genera superposición con los

carotenos los cuales quedan disueltos en la fase móvil y arrastrados por esta, fenómeno que ha

sido evidenciado en los trabajos de Baundino (2007). También se observó manchas de color

azul fluorescente para las palmas 19 y 129 encerrados en círculos de color rojo en el

cromatograma expuesta a los UV de onda corta de la figura 3 y corresponde a fenoles

glicosilados (Wagner & Bladt 2001).

Cromatografía bidimensional

Se empleó la técnica cromatográfica bidimensional porque no eran claras las manchas

superpuestas en el frente del solvente y porque la mezcla de sustancias no se pudo separar

completamente en una dirección de desplazamiento. En la figura 4 el patrón de coloración se

observa igual que la primera cromatografía (Fig. 2) correspondiente a la primera fase corrida

con la solución Hexano-acetona (16:4), mientras que en la segunda fase corrida con la

solución Diclorometano-metanol (19,6:0,4), se hace evidente la aparición de 18 a 20

compuestos.

Los compuestos 10 y 11 (Fig. 5) en las cuatro muestras de palmas equivalen a las clorofilas b

y a respectivamente; los compuestos 7 y 8 pertenecerían a las feofitina a y b que según

Baundino (2007) presentan la misma tonalidad verdosa como la clorofila y se debe a

productos de descomposición de esa misma (sustituye el magnesio por dos átomos de

hidrógeno). Los compuestos 15, 16, 17 y 18 (Fig. 5) corresponderían a una mezcla de lípidos,

sobre todo entre tipos de combinaciones de distinta polaridad y suelen desplazarse con el

frente del solvente porque se disuelven con la fase móvil de baja polaridad; García y García

(1969) indicó que los lípidos de cadena larga, se desplazan más lejos que los lípidos de

cadena corta, sin embargo la longitud de la cadena y el número de los enlaces dobles, solo

poseen una influencia relativa sobre la velocidad de desplazamiento. Posiblemente los

compuestos serían Vitamina E, γ tocoferol, estigmasterol, γ sitosferol, componentes del ácido

linoleico y linolénico, ácido esteárico registrados por el cromatógrafo de gases del cual se

hablará a continuación. Taiz y Zeiger (2006) sugieren que los ácidos grasos insaturados como

ácido linoleico y ácido alfa-linolénico aumenta la fluidez de la membrana en condiciones de

bajas temperaturas, cuando la planta no puede regular su temperatura.

Los compuestos 9, 12, 13 y 14 (Fig. 5) podrían ser ácidos grasos saturados de mediana

polaridad y peso molecular alrededor de los 256,4 a 284,5 g/mol como los ácido palmítico y

ácido mirístico como lo indica García & García (1969) cuando separa los lípidos en grupos de

sustancias en una cromatografía de capa delgada con éter de petróleo como fase móvil. Este

tipo de ácidos grasos se encuentran en la bicapa lipídica de la membrana plasmática de las

células.

Los compuestos del 1, 2, 6, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25 y 26 encerrados en círculos azules, 3

y 4 encerrados en círculos lilas, de las cuatro palmas podrían representar los componentes con

alta polaridad, alcoholes, compuestos no identificados, compuestos con azufre o con

nitrógeno, flavonoides y derivados del furano, según Marrero (2011). Sin embargo, Tan et al.

(2011) indican en su estudio, que los extractos alcohólicos de las hojas de E. guineensis

presenta contenidos de ácido gálico, compuestos fenólicos no tóxicos como flavonoides

glicosilados, catequinas y carotenoides.

Mediante la cromatografía de gases y los respectivos pesos moleculares (Tabla 2), se podría

llegar a suponer que los compuestos podrían ser: 2 Methoxi 4 vinilfenol (4-vinylguaiacol), 2

(4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahydro 4,4,7α trimetil, quinona (Quinona 4 oxime 2, 6 di tert

butil), oleamida, ácidos mirístico, palmítico, esteárico, 2 etilhexil mercaptoacetato.

Los compuestos encerrados en los círculos rojos a pesar de ser comunes para las cuatro

palmas analizadas, no se desplazaron de la misma manera, se debe posiblemente a la

interacción entre los compuestos de alta polaridad (círculos azules) que no dejan que se

desplacen correctamente (Palmas 1 y 2) reteniéndolos, como se observan en las palmas 19 y

129.

Cromatografía de gases

En el estudio de las fracciones apolares se presentaron cromatogramas (Figura 6) con gran

cantidad de picos de bajas intensidades a partir de 4 minutos (Palmas 1, 19 y 129) y 6 minutos

para la palma 2. En la tabla 3 se observan los principales compuestos identificados por CG-

EM de las fracciones apolares de las cuatro muestras. En el espectro de masas del ion

moleculares α-tocoferol (Vitamina E) y su respectiva fragmentación (Figura 8) se observó el

ión molecular de M+ 430,4. Un pico a 205,1 (M-225,3) en correspondencia con la pérdida de

C16H34. El pico base a 166,1 (M-39,2) que corresponde a la pérdida de C3H3. La presencia de

este compuesto tiene como función biológica, fluidez de la membrana y actividad

antioxidante, de la cual se hablara más adelante.

Se evidenciaron también compuestos como el ácido palmítico encontrándose para las cuatro

palmas, en conjunto con los ácidos mirístico y ácido esteárico, comunes en las membranas

plasmáticas específicamente en la bicapa lipídica. El ácido esteárico o ácido octadecanoico, se

encontró para las palmas 1 y 2; este ácido es la forma saturada del ácido oleico

(monoinsaturado) que se encuentra también en la bicapa lipídica de las membranas

plasmáticas vegetales con el ácido mirístico reportado en la palmas 1(Azcón y Talón 2008).

En las membranas de las células vegetales se pueden encontrar lípidos anfipáticos como el

sitosterol, el estigmasterol (P 19 de la tabla 2), el colesterol entre otros, sus características

permite que se forme la bicapa lipídica en las que las colas hidrófobas de los ácidos grasos se

mantienen unidas, mientras que las cabezas polares se orientan hacia la fase acuosa. Los

fitosteroles encontrados en la palma 19 fueron γ-sitosterol y estigmasterol, son esteroles de

estructura química muy similar a la del colesterol, son constituyentes de las membranas

vegetales y su concentración depende del tipo de membrana y su función a desempeñar dentro

de la célula (Azcón & Talón 2008). El consumo de fitosteroles en humanos hace que

disminuya los niveles de colesterol en sangre sin modificar los niveles de colesterol HDL,

disminuye la esterificación del colesterol en los enterocitos al inhibir la actividad de la enzima

acilCoA-colesterol-acil transferasa (Valenzuela & Roco 2004).

La fluidez de la membrana depende de la insaturación de los ácidos grasos, permitiendo el

movimiento transversal y lateral de las moléculas lipídicas como de las proteínas

transportadoras, sustratos y productos de las enzimas asociadas a la membrana, transporte de

electrones, entre otras. Los enlaces cis en las cadenas de la Vitamina E, ácido linoleico y

ácido α-linolénico, provoca dobleces de la cadena y disminuye su grado de empaquetamiento,

a su vez, hace que la Tc (temperatura de transición de fase) sea menor y permitiendo mantener

la fluidez de la membrana a temperaturas más bajas. Los ácidos grasos presentes fueron ácido

octadecatrienoico 9, 12, 15 etil éster (ácido linolénico) conocido como omega 3 y el 2

cloroetil linoleato y ácido linoleico etil éster (ácido linoleico) también conocido como omega

6, ambos compuestos están presentes en la palma 1 y sólo el ácido linoleico se encuentra en

las palmas 1, 2 y 19 (Azcón y Talón 2008); estos compuestos también son conocidos por sus

propiedades antioxidantes, es decir tienen una amplia capacidad para atrapar radicales libres

causantes del estrés oxidativo lo cual les atribuye un efecto beneficioso en la prevención de

padecimientos tales como enfermedades cardiovasculares, circulatorias, cancerígenas y

neurológicas, también poseen actividades antiinflamatorias, antialérgicas, antitrombóticas,

antimicrobianas y antineoplásicas (García et al. 2010).

Según Jara (2012) la Vitamina E (α-tocoferol) es el componente más abundante de los aceites

vegetales siendo el principal de los tocoferoles, y γ-tocoferol es uno de los tres (β, γ, δ-

tocoferol) compuestos que están en cantidades menores a comparación de los tocotrienoles

como el γ-tocotrienol que es el más abundante en los aceites vegetales, sin embargo en la

palma 19 se detecto el γ-tocoferol. Los compuestos anteriores tienen como función proteger a

las membranas biológicas, evitando la oxidación de los componentes celulares esenciales o

evitando la formación de productos tóxicos de oxidación como los peróxidos de ácidos grasos

no saturados (antioxidante) al igual que γ sitosterol (PubChem 2013), actuando así como

estabilizador de las estructuras lipídicas de los tejidos (Jara 2012).

El escualeno se detectó en las palmas 1 y 19, se forma por dos colas de farnesil difosfato

(DFF) es precursor de los triterpenos e intermediario en la biosíntesis del colesterol (Azcón &

Talón 2008) encontrados en los aceites de oliva, soya, germen de trigo y salvado de trigo.

Farmacológicamente, se ha reportado que disminuye la incidencia de patologías habituales de

la sociedad occidental, como infarto de miocardio, diabetes, dislipidemias, cáncer, entre otras

(Ronco 2009). A su vez, se detectó el fitol en las palmas 1, 19 y 129, es un alcohol insaturado

que hace parte de la clorofila (Lacruz 2012), tiene una larga cadena hidrófoba que les facilita

el anclaje de zonas o estructuras poco polares, por las propiedades del fitol, las clorofilas son

capaces de absorber la radiación luminosa en la zona del azul y también en la zona rojas; por

esto es que la clorofila es de color verde, y dan a las plantas ese color característico (Azcón y

Talón, 2008).

En la palma 129 se encontraron los siguientes compuestos: 2 Methoxy 4 vinylfenol (4-

vinylguaiacol), 2 (4H) Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahidro 4,4,7α trimetil, quinona (Quinona 4

oxime 2, 6 di tert butil) y oleamida (9-octadecenamida). En PubChem (2013) se sugiere que el

2 Methoxy 4 vinylfenol posee propiedades antiinflamatoria y funciona como inhibidor de la

germinación; la oleamida o dietanolamida de acido oleico relacionado estructuralmente con

ácido araquidónico, importante por la formación de estructuras coloidales en agua,

estabilizador de espuma y en el aumento de la viscosidad de disoluciones tensioactivos

aniónicos para la industria cosmética (PubChem 2013, Urresta et al 2004); el 2 (4H)

Benzofuranona 5,6,7,7α tetrahidro 4,4,7α trimetil y quinona (Quinona 4 oxime 2, 6 di tert

butil) no se encuentra reporte de función o relación con otro compuesto en la base de datos

Pubchem (2013) ni tampoco del compuesto 2 etilhexil mercaptoacetato.

Finalmente el ácido heptadecanoico o conocido también como ácido margárico es un ácido

graso saturado al igual que los ácidos palmíticos, mirísticos, pentanoico, esteárico y

araquidónico; se encuentra en muy poca proporción en los aceites de origen vegetal ya que

Alba et al. (2002) indica que se encuentra mayoritariamente en las grasas de los animales.

De los resultados obtenidos en los cromatogramas (Figura 6) no se tuvieron en cuenta los

tiempos de retención y % de áreas debido a que no se obtuvieron valores representativos,

cromatogramas con gran cantidad de picos de poca intensidad; predomina la presencia de

picos pequeños o conocidos también como errores aleatorios denominadas ruido, y se observa

generalmente en la palma 129 (Figura 6) (Gomis 2008). Esto puede deberse a múltiples

factores, la temperatura inicial del método cromatográfico propuestos por Rajoo et al. 2010,

Vijayarathna et al. 2012, Chong et al. 2008, Sasidharan et al. 2009; el método de extracción

de la fracción apolar; las condiciones en las que se colectaron las muestras foliares, como fue

la diferencia en los estados de maduración de los frutos, condiciones climáticas, épocas, años

y lugares de recolección, así como las variaciones intrínsecas de los métodos de preparación y

análisis empleados se debe también a que posiblemente la base de datos del equipo pueda

estar desactualizada (Gomis 2008). Otro factor que pudo afectar fue la cantidad de muestra

inyectada (1 μl) al cromatógrafo, donde sólo entra a la columna 0.01 μL en modo split; el

resto es desechado, impidiendo así, la sobrecarga de la columna. Otro factor que pudo influir

(Gomis 2008).

El presente trabajo puede ser un comienzo para la identificación de compuestos químicos en

extractos apolares de las hojas de E. oleífera. Este indica que la fracción apolar de las hojas de

E. oleífera presenta compuestos químicos de actividad antioxidante como la Vitamina E, γ-

sitosterol, ácido linoléino y α-linolénico, encontrándose también en la bicapa lipídica con los

ácidos mirístico, esteárico y palmítico. En los métodos usados para la identificación de

compuestos, como la cromatografía bidimensional y cromatografía de gases, se permitió la

identificación de los compuestos y las diferencias entre la palma 129 con respecto a las

palmas 1, 2 y 19 por el patrón de distribución de los compuestos en la cromatografía

bidimensional y la presencia de compuestos novedosos en la CG-EM, llegando a prever que

no pertenezca a la misma especie. Se reportaron por primera vez los compuestos Quinona 4

oxime 2, 6 di tert butil y 2 etilhexil mercaptoacetato.

Se recomienda estudiar más la fisiología de Elaeis oleífera, implementar nuevas técnicas de

extracción y métodos de cuantificación de compuestos. A su vez, cuantificar la concentración

de los compuestos antioxidantes detectados en el presente estudio como una posible fuente

para su extracción comercial, para la industria cosmética y farmacéutica. Finalmente, los dos

compuestos nuevos merecen un mayor análisis para determinar su participación en la

fisiología de la palma o su utilidad como principio activo.

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ANEXO 1

Estructuras de compuestos obtenidos en la cromatografía de Gases