ESTUDIO TEÓRICO DE LA ESTRUCTURA ELECTRÓNICA Y DE LOS...

UNIVERSIDAD DE CHILEFacultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

ESTUDIO TEÓRICO DE LA ESTRUCTURA ELECTRÓNICA Y DE LOS MECANISMOS DE TAUTOMERÍA LACTAMA-LACTIMA

EN BILINAS DE FITOCROMO

Tesis Entregada a la U. de ChilePara Optar al Grado Académico de

Doctor en Química

POR

Ricardo Andrés Matute Morales

DIRECTOR:Renato Contreras Ramos

CO-DIRECTOR:Leticia González Herrero

Santiago, Chile

2010

UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓNTESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato:

RICARDO ANDRÉS MATUTE MORALES

Ha sido aprobado por la Comisión Informante de Tesis para optar al grado de Doctor en Química, en el examen de defensa de Tesis rendido el día ….........................................................................................................

______________________________________Directores de Tesis:

Dr. Renato Contreras …..........................................

Dr. Leticia González …..........................................

Comisión Informante de Tesis:

Dr. Octavio Vásquez (Presidente) …..........................................

Dr. Boris Weiss …..........................................

Dr. Antonio Zanocco …..........................................

Dr. Eduardo Lissi …...................................

ii

A la memoria de mi padre,

Ricardo Segundo Matute Carvajal

iii

Publicaciones Originadas de esta Tésis

1. Ricardo A. Matute, Renato Contreras, Guillermo Pérez-Hernández, and

Leticia González*. (2008) The Chromophore Structure of the Cyanobacterial

Phytochrome Cph1 As Predicted by Time-Dependent Density Functional

Theory. J. Phys. Chem. B, 112, 16253-16256.

2. Ricardo A. Matute*, Renato Contreras, and Leticia González*. (2010).

Time-Dependent DFT on Phytochrome Chromophores: A Way to the Right

Conformer. J. Phys. Chem. Lett., 1, 796-801.

3. Ricardo A. Matute*, Jorge Soto-Delgado, Leticia González, and Renato

Contreras. (2010). A Lactam-Lactim Tautomerism Involved in the Pr/Pfr

Interconversion of Phytochrome. (Submitted)

* Corresponding Author

iv

Presentaciones en Reuniones Científicas

1. Ricardo A. Matute, Renato Contreras, Guillermo Pérez-Hernández, Leticia

González, “Time-Dependent DFT on Phytochrome Chromophores: A Way to

Find the Right Conformer”, XXIV International Conference on

Photochemistry (ICP2009), 2009, Toledo, Spain. (Oral Presentation)


González, “Conformation adopted by Phytochromobilin in the Pr isoform of

plant phytochrome: ZZZssa or ZZZasa?”, 15th International Congress on

Photobiology (ICP2009), 2009, Düsseldorf, Germany. (Poster)


González, “Time-Dependent DFT on Phytochrome Chromophores: A Way to Find

the Right Conformer”, 9th International Conference on Tetrapyrrole

Photoreceptors of Photosynthetic Organisms (ICTPPO2009), 2009, Asilomar

Conference Center, Monterey, California, USA. (Poster)

v

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi director de tesis, Prof. Dr. Renato Contreras, quién supervisó mi

trabajo, brindándome todo el apoyo necesario al momento de proponer y desarrollar mis ideas.

De igual manera, agradezco profundamente a mi co-director de tesis, Prof. Leticia González,

quién me recibió especialmente bien en su laboratorio cuando realicé las pasantías de tesis en

Alemania, inicialemte en Berlin (Freie Universität Berlin) y luego en Jena (Friedrich-Schiller-

Universität Jena), donde pude aprender métodos de fotoquímica computacional.

Toda mi gratitud para ambos profesores, Prof. Contreras y Prof. González, por guiarme

en el diseño de metodologías y estrategias de trabajo, en la discusión y organización de

resultados, y en la redacción de los artículos correspondientes, entre otras muchas tareas que se

ven plasmadas en este trabajo. Además, agradezco al Dr. Gerrit Groenhof, quién me recibió

cordialmente y fue mi supervisor durante la pasantía de tesis que realice en su laboratorio, en el

Instituto Max-Planck de Química Biofísica (Göttingen, Alemania). Con él pude aprender y

deasorrollar todo el trabajo relacionado con simulaciones de dinámica molecular.

Esta tesis contó con el financiamiento de la Beca de Doctorado CONICYT, la Beca

Integrada CONICYT-DAAD para poder realizar mi primera pasantía de tesis en Alemania, los

beneficios de BECAS CHILE de Pasantías Doctorales para la realización de mi segunda

pasantía de tesis, y la Beca de Asistencia a Conferencias Internacionales para poder presentar

mis resultados en la conferencia sobre fitocromos realizada en California. Sin tal financiamiento

esta tesis no hubiese sido posible, por lo que agradezco a CONICYT, BECAS CHILE y DAAD.

Finalmente, agradezco a mi madre y hermanas por su incondicional cariño,

comprensión, y apoyo; y extiendo mi sincero agradecimiento a toda la gente que de uno u otro

modo colaboraron y me apoyaron en este proyecto de tesis, especialmente al Prof. Dr. Lagarias

y al Dr. Rockwell de la UC Davis (California, USA) por sus valiosos consejos y discusión sobre

fitocromo; también a Jorge Soto, Claudio Pérez, Guillermo Pérez, Rodolfo Briones, Mauricio

Sandoval, Julio Matute, Mauricio Ipinza, Michel Agredo, Sebastian Miranda, Carlos Areche,

German Miño, Daniel Kinzel, Hartmut Preuβ, Marteen Wolf, y Sarath Chandra.

vi

TABLA DE CONTENIDOS

Página

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................ vi

TABLA DE CONTENIDOS ….......................................................................................... vii

ÍNDICE DE FIGURAS ….................................................................................................... ix

ÍNDICE DE TABLAS ….................................................................................................... x

ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS …................................................................................ xi

RESUMEN …....................................................................................................................... xii

ABSTRACT …....................................................................................................................... xiv

CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN 1

1.1 Estructura y Función del Fitocromo …............................................................. 1

1.2 Hipótesis y Objetivos …...…............................................................................... 11

1.3 Referencias ….................................................................................................... 13

CAPÍTULO II ANÁLISIS ESTRUCTURAL 15

2.1 Aspectos Generales ......................................................................................... 15

2.2 Modelos Moleculares y Metodología Computacional ….................................... 16

2.3 Efecto de Protonación y Entorno …................................................................... 22

2.4 Estructura de la Ficocianobilina en Fitocromo de Cianobacteria ….................. 25

2.5 Estructura de la Fitocromobilina en Fitocromo de Planta …............................. 29

2.6 Modelo Teórico del Comportamiento del Índice Q/S …...................................... 34

2.6 Referencias …..................................................................................................... 37

vii

CAPÍTULO III TAUTOMERÍA EN LA INTERCONVERSIÓN 40

3.1 Aspectos Generales ......................................................................................... 40

3.2 Modelos Moleculares y Metodología Computacional ….................................... 42

3.3 En Busca del Desplazamiento Batocrómico de Pfr …........................................ 44

3.4 Mecanismo de la Tautomería Lactama-Lactima en Bacteriofitocromo …............. 46

3.5 13C-NMR de Ficocianobilina en Fitocromo …....................................................... 52

3.6 Referencias …..................................................................................................... 57

CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES 59

APÉNDICE A MARCO TEÓRICO 61

A.1 Teoría del Funcional de la Densidad Dependiente del Tiempo .......................... 62

A.2 Modelo de Continuo Polarlizable …................................................................... 65

A.3 Cálculo de Apantallamiento RMN por el Método GIAO …............................... 69

A.4 Referencias …..................................................................................................... 71

APÉNDICE BTABLAS SUPLEMENTARIAS 72

B.1 Tablas Suplementarias del Capítulo II …........................................................... 73

B.2 Tablas Suplementarias del Capítulo III ….......................................................... 80

APÉNDICE C PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES ASOCIADAS 84

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1.1. Esquema para el fotociclo del fitocromo en planta 2

Figura 1.2. Diagrama de estados electrónicos involucrados en la fotoconversión del fitocromo 3

Figura 1.3. Bilinas con estructuras en discusión 6

Figura 1.4. Espectros electrónicos de absorción para fitocromo de plantas 7

Figura 1.5. Tautomería Lactama-Lactima 10

Figura 1.6. Entorno proteico de la biliverdina en bacteriofitocromo 10

Figura 2.1. Modelos para predecir estructura de PCB en fitocromo Cph1 de cianobacteria 17

Figura 2.2. Estructura del anillo A del cromóforo según el estado de unión a la cisteína 18

Figura 2.3. Modelos para predecir estructura de PФB en fitocromo A de planta 21

Figura 2.4. Espectros TDDFT de absorción UV-Vis para BV y PCB en fitocromo 26

Figura 2.5. Orbitales moleculares involucrados en el espectro de absorción UV-Vis de PCB-ssa 26

Figura 2.6. Espectros TDDFT de absorción UV-Vis para modelos de la fitocromobilina 30

Figura 2.7. Orbitales moleculares involucrados en el espectro de absorción UV-Vis de PФB-ssa 30

Figura 2.8. Estructura del cromóforo dentro de la estructura cristalográfica 31

Figura 3.1. Modelos de tautómeros para la forma Pfr de biliverdina en bacteriofitocromo 44

Figura 3.2. Espectros TDDFT de absorción UV-Vis para tautómeros de BV en bacteriofitocromo 45

Figura 3.3. Mecanismo no disociativo de tautomería con transferencia protónica intramolecular 46

Figura 3.4. Estados de transición para el mecanismo intramolecular de tautomería 48

Figura 3.5. Interacciones de la biliverdina en el cristal y en el TS catalizado por agua 49

Figura 3.6. Mecanismos propuestos para la tautomería de BV en bacteriofitocromo 51

Figura 3.7. Desplazamientos químicos para 13C-RMN por cálculos GIAO DFT 54

ix

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 2.1. Efectos de protonación y entorno sobre la TDDFT para BV y PCB en fitocromo 23

Tabla 2.2. Máximos de absorción e índices Q/S calculados por la TDDFT 33

Tabla 2.3. Relación entre Q/S, F8, FQ 35

Tabla 3.1. Desplazamientos químicos para espectros 13C-RMN de modelos Pfr de PCB 53

Tabla B.1. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la figura 2.4-a 73

Tabla B.2. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la figura 2.4-b 74

Tabla B.3. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la figura 2.4-c 75




Tabla B.7. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la figura 2.6-d 79




Tabla B.11. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la figura 3.2-d 83

x

ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS

Å Angstrom. 10-10 metrosδ Desplazamiento Químico; utilizado en Resonancia Magnética Nuclearε Constante DieléctricaB3LYP Becke-3-parameter-Lee-Yang-ParrBphP BacteriofitocromoBV BiliverdinaCASSCF Complete-Active-Space Self-Consistent-Fieldcols. colaboradores13C-RMN Resonancia Magética Nuclear de 13CDFT Teoría del Funcional de la Densidade.g. “exempli gratia” (en latin), se usa en escritura inglesa: “por ejemplo”f fuerza de osciladorFWHM Full Width at Half Maximum HF Hartree-FockHOMO Orbital Molecular ocupado de mayor energíaLUMO Orbital Molecular desocupado de menor energíaMAS Magic Angle SpinningMPW1PW91 Funcional de intercambio-correlación de Perdew-Wang nm nanómetro. 10-9 metrosPФB FitocromobilinaPBE0 Funcional híbrido no empírico (libre de parámetros)PCB FicocianobilinaPCM Modelo de Continuo PolarizablePDB Protein Data BankPfr Forma fisiológicamente inactiva del fitocromo (absorbe en rojo-lejano)ppm partes por millónPr Forma fisiológicamente activa del fitocromo (absorbe en rojo)Q/S Cuociente de fuerzas de oscilador de la banda Q sobre la banda SoretRef. / Refs. Referencia / ReferenciasRMN Resonancia Magnética NuclearTDDFT Teoría del Funcional de la Densidad dependiente del TiempoTS Estado de Transiciónu.a. unidades arbitrariasZZEssa C5-Z,syn; C10-Z,syn; C15-E,antiZZZasa C5-Z,anti; C10-Z,syn; C15-Z,antiZZZssa C5-Z,syn; C10-Z,syn; C15-Z,antiZZZsss C5-Z,syn; C10-Z,syn; C15-Z,syn

xi

RESUMEN

El fitocromo es un fotoreceptor de plantas que también se encuentra en bacterias

y hongos. En plantas, el fitocromo regula respuestas fotomorfogénicas de la planta

como, por ejemplo, el desarrollo y crecimiento del tallo, regulación en el periodo de

dormancia y de germinación de las semillas, floración, fototaxis, mecanismos de

evasión de la sombra, etc. Todos ellos activados o desactivados en forma diferencial

mediante longitudes de onda específicas en la región UV-Visible del espectro

electromagnético. El receptor se fotoconvierte entre una forma fisiológicamente

inactiva, Pr, y una forma fisológicamente activa, Pfr. La interconversión entre ambas

formas ocurre por mecanismos diferentes que aun se desconocen. Por ello, hay un

interés creciente respecto al mecanismo de fotoconversión del fitocromo debido a

potenciales aplicaciones en biotecnología. Sin embargo, un obstáculo en la

investigación del fitocromo ha sido la escasez de estructuras cristalográficas resueltas en

el sistema.

Con el propósito de predecir las estructuras del cromóforo en fitocromo, hemos

utilizado la teoría del funcional de la densidad dependiente del tiempo (TDDFT). Un

análisis estructural con cálculos teóricos basados en la TDDFT nos permitieron predecir

correctamente una estructura semicíclica ZZZssa para la ficocianobilina en el fitocromo

Cph1 de cianobacteria. Con dicho análisis pudimos evaluar el efecto del estado de

protonación del cromóforo y el entorno proteico sobre las energías de excitación que

xii

entrega la TDDFT, logrando una aproximación cuantitativa cuando se utiliza la

geometría de un molde cristalográfico sin optimizar junto con el modelo de polarizable

continuo (PCM) para simular las interacciones electrostáticas entre el cromóforo y la

apoproteína. Utilizamos un modelo teórico similar para predecir una estructura

semicíclia ZZZssa para la fitocromobilina en el fitocromo A de planta donde, además de

la aproximación cuantitativa del modelo, también pudimos reproducir el índice

espectroscópico Q/S, correspondiente a la razón entre las fuerzas de oscilador de las

bandas Q y Soret, respectivamente. Con el propósito de explicar el comportamiento

general del índice Q/S para bilinas, se propuso un modelo teórico, donde definimos un

término empírico F para el sistema, el cual presenta un componente FS asociado a las

funciones intrínsecas del sistema conjugado (corriente de anillo y aromaticidad) y un

componente FQ asociado a la fotoisomerización del cromóforo. Nuestro modelo teórico

plantea que, cuando se cambia la conformación del sistema, el término F se conserva

(F = FS + FQ), por lo que solamente cambia la distribución entre sus componentes.

Con respecto al fotociclo del fitocromo, estudiamos la fase térmica de la

fotoconversión de Pr a Pfr. Los espectros teóricos de absorción para la forma Pfr, el

análisis de los estados de transición involucrados, y los desplazamientos químicos de

RMN nos sugieren que durante la interconversión Pr/Pfr ocurre una tautomería lactama-

lactima en el anillo A del cromóforo (no así en el anillo D). Además, nuestros

resultados indican que es posible que la tautomería se lleve a cabo a través de un

mecanismo catalizado por cierta molécula de agua cristalográfica localizada en las

proximidades del anillo A de la bilina, , denominada “agua pirrólica”, la que haría de

catalizador bifuncional.

xiii

ABSTRACT

Theoretical Study of the Electronic Structure and of the

Mechanisms of Lactam-Lactim Tautomerism in Bilins of Phytochrome

Phytochrome is a photoreceptor of plants that is also found in bacteria and fungi.

In plants, phytochrome regulates photomorphogenic responses of the plant, e.g., the

development and growth of the stem, regulation in the dormancy period and seed

germination, flowering, phototaxis, shade avoiding mechanisms, etc. All of them are

activated or deactivated in a differential way by means of specific wavelengths on the

UV-Visible region of the electromagnetic spectra. The receptor is photoconverted

between a physiological inactive form, Pr, and a physiological active form, Pfr. The

interconversion between both forms occurs through different mechanisms that are still

unknown. Thus, there is a growing interest concerning the mechanism of

photoconversion of phytochrome since the potential applications in biotechnology.

However, an obstacle in the research on phytochrome has been the scarce of

crystallographic structures resolved in the system.

With the purpose to predict the structures of the chromophore in phytochrome,

we have used the time-dependent density functional theory (TDDFT). A structural

analysis with theoretical calculations based on the TDDFT has allowed to predict

correctly a semicyclic structure ZZZssa for the phycocyanobilin in phytochrome Cph1

of cyanobacteria. With such analysis we could assess the effect of the protonation state

and the protein environment over the excitation energies delivered by the TDDFT,

getting a quantitative approximation when the geometry of a crystallographic template

xiv

is used without optimization, together with the polarizable continuum model (PCM) to

mimic the electrostatic interactions between the chromophore and the apoprotein. We

have used a similar theoretical model to predict a semicyclic structure ZZZssa for the

phytochromobilin in phytochrome A of plants where, besides the quantitative

approximation of the model, we could also predict the spectroscopic index Q/S,

corresponding to the ratio between the oscillator strengths of the Q and Soret bands,

respectively. With the purpose to explain the general behavior of the index Q/S for

bilins, a theoretical model was proposed, where we defined an empirical term F for the

system, which has a component FS associated to the intrinsic functions of the conjugated

system (ring current and aromaticity) and a component FQ associated to the

chromophore photoisomerization. Our theoretical model suggests that, when changing

the conformation of the system, the term F is preserved (F = FS + FQ), so that only

changes the distribution between its components.

With respect to the photocycle of phytochrome, we studied the thermal phase of

Pr to Pfr photoconversion. The theoretical absorption spectra for the Pfr form, the

analysis of the involved transition states, and the NMR chemical shifts suggest that

during the Pr/Pfr interconversion, a lactam-lactim tautomerism occurs in ring A of the

chromophore (not in ring D). In addition, our results indicate that is possible that the

tautomerism is carried out through a mechanism catalysed by a certain crystallographic

water molecule located in the vicinity of ring A of the bilin, called "pyrrole water,"

which would be a bifunctional catalyst .

xv

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

1.1 Estructura y Función del Fitocromo

En plantas se pueden encontrar tres tipos de fotoreceptores: fitocromos,

criptocromos, y fototropinas. En el espectro UV-visible, los fitocromos absorben en la

región del rojo y rojo-lejano, mientras que los criptocromos y fototropinas absorben en

la región del UV-azul. La clorofila y los carotenoides presentes en las hojas de las

plantas absorben fotones en gran parte del espectro visible de la luz solar incidente

correspondiente a la región fotosintéticamente activa, salvo en la región del rojo lejano,

donde hay muy poca fotoabsorción, por lo tanto la luz, al ser transmitida o reflejada por

las hojas, genera una mayor cantidad relativa de luz en el rojo lejano (far red o FR) con

respecto a la luz en el rojo (red o R), y así la razón R:FR se presenta como una señal

clara de la presencia de otras plantas en la vecindad, siendo el fitocromo el responsable

de percibirla, dada su sensibilidad a dichas longitudes de onda. Además, los fitocromos

que se encuentran en plantas responden a la cantidad, calidad, y dirección de la luz

incidente mediante la regulación de procesos de fotomorfogénesis, como la germinación

de semillas, fototropismo, floración, crecimiento, y desarrollo de la planta [1].

1


El fitocromo puede encontrarse en dos estados metaestables interconvertibles: Pr

y Pfr [1]. La interconversión entre ambos estados depende de la longitud de onda de la

luz incidente [2]; es así como el paso de Pr a Pfr se induce con luz en el rojo, mientras

que el proceso inverso de Pfr a Pr se logra en respuesta a la luz en el rojo lejano. La

forma Pr corresponde al estado fisiológicamente inactivo, mientras que la forma Pfr es

el estado fisiológicamente activo [1]. En el fotociclo de fotoconversión del fitocromo en

planta se han detectado algunos de los intermediarios, tanto para la fotoconversión

directa (desde Pr a Pfr) como para la fotoconversión reversa (desde Pfr a Pr): Lumi-R,

Meta-RA, y Meta-RC para la fotoconversión directa; Lumi-F y Meta-F para la conversión

reversa (ver Figura 1.1).[3;4] Además, cabe señalar que la fotoconversión reversa compite

con una conversión térmica que no requiere la presencia de luz, conocida como

reversión oscura.[1]

Figura 1.1. Esquema para el fotociclo del fitocromo en planta.Intermediarios en la fotoconversión directa: Lumi-R, Meta-RA, Meta-RC. Intermediarios en la fotoconversión reversa: Lumi-F, Meta-F. El esquema también incluye la reversión oscura que ocurre sin la necesidad de luz.

2


Figura 1.2. Diagrama de estados electrónicos involucrados en la fotoconversión del fitocromo.El diagrama se reproduce tal como lo describe Sineshchekov (Ref. 5) en base a mediciones efectuadas a bajas temperaturas para la fotoconversión y fluorescencia de Pr y Lumi-R. A, estado inicial, Pr; B, el primer fotoproducto estable, Lumi-R; A-B, el intermediario inestable de corta vida, posiblemente, prelumi-R o bato-R; k, constantes de velocidad para la fluorescencia (kf), des-excitación independiente de la temperatura (kd), fotoreacción primaria (kp), fototransformación en producto (kab), y retorno al estado inicial (kba); Ea y Ea', energías de activación de las fotoreacciones primarias dependientes de la temperatura directas y reversas.

En el fotociclo del fitocromo (Figura 1.1), la fotoconversión del fitocromo

presenta una primera fase fotoinducida y una segunda fase térmica (ver Figura 1.2).[5]

El cromóforo presente en el fitocromo es responsable de la detección y fase

inicial en la transducción de la señal luminosa; pertenece al grupo de pigmentos

biológicos conocidos como bilinas, que son tetrapirroles lineales estructuralmente

relacionados a las porfirinas. La estructura del crómoforo depende del tipo de

3


fitocromo, ya que los fitocromos no sólo se encuentran en plantas, sino que también en

bacterias, cianobacterias, y hongos.[1] En plantas, el cromóforo es la fitocromobilina

(PФB); en algunas cianobacterias, es la ficocianobilina (PCB); mientras que en

bacterias, hongos, y otras cianobacterias, es la biliverdina (BV). Cabe señalar que estos

cromóforos tienen diferencias puntuales en su estructura (Figura 1.3) y, considerando a

la fitocromobilina como referencia de comparación, podemos notar que la

ficocianobilina tiene un enlace reducido en la cadena lateral del anillo D y que la

biliverdina presenta un anillo A más oxidado, con una cadena lateral alílica en vez del

grupo etilideno.[1] Las diferencias y similitudes en el anillo A determinan el proceso de

ensamblaje del cromóforo con la apoproteina, proceso en el cual se genera un enlace

tioeter covalente con una cisteína de la apoproteína a partir del ataque nucleofílico del

grupo sulfidrilo del residuo aminoacídico a la cadena lateral del anillo A. En

fitocromobilina y ficocianobilina, el cromóforo se encuentra unido por el carbono C31 de

la cadena lateral, en tanto que en biliverdina, el ataque nucleofílico sobre el grupo alilo

genera un grupo etilideno además de un carbono quiral en el carbono C2 del anillo,

quedando así el grupo prostético enlazado por el carbono C32. No obstante, el proceso

de ensamblaje del cromóforo aun dista mucho de estar claro, ya que al parecer no sólo

depende del tipo de cromóforo, sino que además depende de la especie, entre otros

factores, y en algunos casos incluso se ha detectado que el cromóforo no se encuentra

unido covalentemente. Algunos estudios sugieren que en dichos casos una histidina

podría estar interaccionando con el cromóforo en forma no covalente. Además, el

proceso de ensamblaje podría estar precedido por la activación del nucleófilo,

posiblemente con la participación de otros aminoácidos contiguos a la cisteína [6-8].

4


Figura 1.3. Bilinas con estructuras en discusión. BV-sss: Biliverdina en conformación helicoidad cíclica ZZZsss; BV-ssa: Biliverdina en conformación semicíclica ZZZssa; PCB-ssa: Ficocianobilina en conformación semicíclica ZZZssa; PCB-asa: Ficocianobilina en conformación extendida ZZZasa; PФB-ssa: Fitocromobilina en conformación semicíclica ZZZssa; PФB-asa: Fitocromobilina en conformación extendida.

5


En general, la caracterización conformacional de los fitocromos ha sido una

materia de mucho debate, y sólo recién a fines del 2005 se dio a conocer la primera

estructura cristalizada determinada por difracción de rayos-X para el fitocromo de la

bacteria Deinococcus radiodurans,[9] con lo que se logró un notable avance para poder

determinar las conformaciones que el fitocromo estaría adoptando en las diferentes

especies. Con lo de caracterización conformacional nos estamos refiriendo

puntualmente a la configuración Z o E que podrían tener los dobles enlaces en los

puentes entre anillos, y también a la conformación syn o anti que podrían adoptar los

enlaces simples en esos puentes (ver Figura 1.3). La estructura que se encontró en el

cristal tiene todos los dobles enlaces de los tres puentes con una conformación Z,

mientras que los enlaces simples de los puentes presentan una conformación syn en los

carbonos C5 y C10; y una conformación anti en C15.[9;10] La estructura del cromóforo

suele denotarse en base a las conformaciones de los tres puentes, refiriéndose a la

conformaciones syn o anti con su primera letra, por lo que la estructura del cristal de

fitocromo correspondería a ZZZssa, que es una conformación semicíclica, a diferencia

de la conformación helicoidal cíclica ZZZsss que adoptan los cromóforos libres en

solución,[1] o de la conformación extendida ZZZasa que adopta, por ejemplo, la

ficocianobilina en la C-ficocianina,[11] una proteína antena del complejo fotosintético de

plantas. En base al cristal de fitocromo[9;10] de la bacteria D. radiodurans se podría

generalizar, considerando una estructura ZZZssa para todos los bacteriofitocromos; no

así para cianobacterias, donde hay experimentos de Resonancia Raman que sugieren

una estructura ZZZasa para el cromóforo,[4] aunque últimamente también han aparecido

evidencias experimentales apoyando una estructura ZZZssa[12;13]; en cuanto al fitocromo

de plantas, se presentan dos propuestas para la forma Pr del cromóforo (Figura 1.3):

(i) ZZZssa, apoyada por estudios de homología entre secuencias peptídicas de diferentes

especies;[1] y (ii) ZZZasa, apoyada por experimentos de Resonancia Raman[4].

6


Figura 1.4. Espectros electrónicos de absorción para fitocromo de plantas. a) Forma Pr de fitocromo; b) Forma Pfr de fitocromo. Los datos experimentales correspondientes fueron puestos a nuestra disposión por gentileza del Prof. Dr. James C. Lagarias (UC Davis, California, EE.UU.). Estos espectros se encuentran publicados en Ref. 14 [Lagarias et al., Photochem. Photobiol. (1987), 46, 5-13].

Nuestra estrategia para abordar la problemática respecto a la estructura del

cromóforo en fitocromo de cianobacterias y de plantas considera el análisis de espectros

teóricos de absorción electrónica, generados mediante la teoría funcional de la densidad

dependiente del tiempo, comúnmente llamada TDDFT[15] (ver marco teórico de la

TDDFT en el Apéndice A). En plantas, la forma Pr presenta su máximo de absorción en

666 nm, y la forma Pfr absorbe con un máximo en 730 nm, ambas con presencia de dos

bandas: la banda Q en la región del rojo y la banda Soret en la región del azul (Figura

1.4); por lo que el primer aspecto a considerar es el que tiene relación con la longitud de

onda de la banda Q del cromóforo, ya que esta banda absorbe en forma dependiente de

la configuración estructural del cromóforo, por lo que a partir de un enfoque teórico

pretendemos asignar los valores experimentales de absorción a determinadas

configuraciones del cromóforo. El segundo aspecto a considerar tiene como base una

propuesta teórica presentada a fines de los años setenta,[16-18] la que señala una estrecha

7


relación entre la conformación de las bilinas y su propiedades espectroscópicas,

particularmente sobre la razón de fuerzas de oscilador entre la banda roja (o banda Q) y

la banda azul (o banda Soret) del espectro de absorción, de modo que resulta práctico

referirnos a la razón entre estas bandas como índice "Q/S", considerando las iniciales de

dichas bandas.

El análisis del Q/S obtenido mediante métodos semiempíricos[16-18] CNDO

mostraron que los valores de la razón Q/S permitían predecir la “extensión” en que se

encontraban las distintas conformaciones de las bilinas: los valores menores a 1 se

relacionaron con una conformacion “cíclica o cerrada” del tipo ZZZsss, los valores en el

rango aproximado entre 1 y 4 se relacionaron con una conformación “semicíclica o

semiextendida” del tipo ZZZssa o ZZZass, y los valores mayores a 4 se relacionaron

con una conformación “extendida” del tipo ZZZasa. Las predicciones de estos primeros

estudios computacionales semiempíricos fueron corroboradas posteriormente a través

del análisis de datos experimentales obtenidos a partir de espectros de absorción de

aductos sintetizados para las distintas conformaciones.[19;20] Curiosamente, la

determinación de conformaciones para las bilinas en base al parámetro Q/S no ha sido

mayormente investigada con posterioridad a lo ya mencionado, salvo estudios

esporádicos de tipo semiempírico,[21;22] o bien, como mero parámetro de referencia para

datos espectroscópicos experimentales.[23] En el presente trabajo de tesis analizamos el

índice Q/S, pero esta vez en el contexto de la teoría del funcional de la densidad, ya que

al validar el modelo con tal nivel de teoría se estaría proporcionando una base teórica lo

suficientemente consistente como para poder utilizar el análisis de los valores de Q/S

como un criterio importante para la determinación del estado conformacional de las

bilinas, convirtiéndose así en una herramienta de incalculable valor para poder predecir

estructuras para intermediarios y productos formados en el proceso de fotoconversión,

ya que experimentalmente la espectroscopia ultrarápida de femtosegudo desarrollada en

8


los últimos años logra resolver los espectros de absorción para los intermediarios pero

no resuelve las estructuras que los generan.

Volviendo al fotociclo del fitocromo (Figura 1.1), se dice que la etapa

fotoinducida se caracteriza por una fotoisomerización del doble enlace C15=C16 , que es

la hipótesis que se ha respaldado por muchos años.[24] No obstante, un estudio reciente

sorprendió con la idea de una fotoisomerización en el doble enlace C4=C5 en lugar del

enlace C15=C16.[25] En el contexto de esta controversia, nuestro estudio asume la

fotoisomerización del doble enlace C15=C16 en la etapa fotoinducida, apoyando así el

consenso general que existe al respecto[24]. Pero dejaremos a un lado el proceso de

fotoisomerización, debido a que su estudio a nivel teórico requiere métodos

multiconfiguracionales de alta demanda de cómputo, tales como cálculos CASSCF,[26] y

nos preocuparemos de la fase térmica del fotociclo (ver Figura 1.2), enfocándonos

particularmente en el proceso directo de la fotoconversión desde Pr a Pfr, intentando

dilucidar los mecanismos de reacción involucrados. El grupo de Lagarias propuso que

en dicha etapa se produce intercambio de protones entre el cromóforo y su entorno

proteico;[1] tal propuesta nos lleva a pensar en la posibilidad de que ocurra una

tautomería en la bilina, ya que ésta implica una transferencia protónica, ya sea

intramolecular, o bien, intermolecular cuando hay algun catalizador presente.[27;28] Por lo

tanto, es posible pensar en una tautomería lactama-lactima (Figura 1.5); y,

considerando la presencia de un agua cristalográfica en las inmediaciones del nitrógeno

del anillo A de la bilina, denominada “agua pirrólica” (Figura 1.6),[9;10] proponemos que

un mecanismo de tautomería lactama-lactima catalizado por agua sobre el anillo A

podría estar involucrado en la fase térmica de la fotoconversión de Pr a Pfr, pese a que

un estudio reciente haya descartado la posibilidad de tautomería en el sistema.[29]

9


Figura 1.5. Tautomería Lactama-Lactima. Esquema de la tautomería lactama-lactima en un modelo heterocíclico (parte superior). Se destacan los átomos involucrados en la transferencia protónica (parte inferior).

Figura 1.6. Entorno proteico de la biliverdina en bacteriofitocromo . A). Entorno Proteico de la Biliverdina. Estructura cristalográfica de bacteriofitocromo en D. radiodurans, con 2.5 angstroms de resolución. La Figura se reprodujo de Ref. 9 [Wagner et al., Nature (2005), 438, 325-331]. B) Red de interacciones del agua pirrólica (en negro). Estructura cristalográfica de bacteriofitocromo en D. radiodurans, con 1.45 angstroms de resolución. La Figura se reprodujo de Ref. 10 [Wagner et al., J. Biol. Chem. (2007), 282, 12298-12309].

10


1.2 Hipótesis y Objetivos

Sobre la base de los antecedentes expuestos, en esta tesis planteamos como

Hipótesis que tanto la ficocianobilina como la fitocromobilina presentes en fitocromo

de cianobacterias y plantas, respectivamente, adoptan una estructura semicíclica

ZZZssa tal como su símil de biliverdina presente en fitocromo de proteobacterias; y

que, además, la fase térmica del fotociclo del receptor presenta un mecanismo de

tautomería lactama-lactima catalizado por agua sobre el anillo A del cromóforo.

Nuestra Hipótesis nos conduce a los siguientes Objetivos Generales :

I. Analizar mediante modelos teóricos la estructura que adopta la

ficocianobilina y la fitocromobilina en los fitocromos de cianobacterias

y plantas, respectivamente.

II. Evaluar los posibles mecanismos de tautomería lactama-lactima en

la biliverdina presente en bacteriofitocromo.

Con el propósito de abordar apropiadamente los Objetivos Generales se

proponen los siguientes Objetivos Específicos :

1. Predecir la estructura de la ficocianobilina presente en el fitocromo de

cianobacterias mediante espectros electrónicos de absorción calculados

en el contexto de la teoría del funcional de la densidad dependiente del

tiempo.

11


2. Predecir la estructura de la fitocromobilina presente en el fitocromo de

plantas mediante espectros electrónicos de absorción calculados en el

contexto de la teoría del funcional de la densidad dependiente del tiempo.

3. Analizar la relación entre el índice Q/S y el isomerismo conformacional

de las bilinas; y, en caso de encontrar que exista dependencia entre

ellos, proponer algun modelo teórico que sea capaz de generalizar.

4. Analizar el desplazamiento de la banda Q en espectros teóricos de

absorción de posibles estructuras de biliverdina para la forma Pfr del

fitocromo, asumiendo que ocurre una tautomería lactama-lactima.

5. Encontrar las estructuras para los estados de transición de diferentes

mecanismos de tautomería lactama-lactima para la biliverdina de

bacteriofitocromo, y calcular las energías asociadas.

6. Calcular los desplazamientos químicos de RMN para la ficocianobilina

de fitocromo de cianobacterias, y comparar con valores experimentales

para evaluar la posibilidad de tautomería lactama-lactima.

12


1.3 Referencias

[1.] N. C. Rockwell, Y. S. Su, J. C. Lagarias, Ann. Rev. Plant Biol. 2006, 57, 837-858.

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330.

[3.] K. Schaffner, W. Gärtner, Spectrum 1999, 12, 1-7.

[4.] M. A. Mroginski, D. H. Murgida, P. Hildebrandt, Acc. Chem. Res. 2007, 40, 258-266.

[5.] Sineshchekov, V. A. 1999. Phytochromes: molecular structure, photoreceptor process and

physiological function. In Concepts in Photobiology: Photosynthesis and Photomorphogenesis.

(Edited by G. S. Singhal, G. Renger, S. K. Sopory, K.-D. Irrgang and Govindjee), pp. 755–795.

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[6.] B. Quest, W. Gärtner, Eur. J. Biochem. 2004, 271, 1117-1126.

[7.] H. Scheer, K. H. Zhao, Mol. Microbiol. 2008, 68, 263-276.

[8.] H. J. Jorissen, B. Quest, I. Lindner, N. Tandeau de Marsac, W. Gärtner, Photochem. Photobiol.

2002, 75, 554-559.

[9.] J. R. Wagner, J. S. Brunzelle, K. T. Forest, R. D. Vierstra, Nature 2005, 438, 325-331.

[10.] J. R. Wagner, J. Zhang, J. S. Brunzelle, R. D. Vierstra, K. T. Forest, J. Biol. Chem. 2007, 282,

12298-12309.

[11.] M. Mimuro, P. Fulglistaller, R. Rimbeli, H. Zuber, Biochim. Biophys. Acta 1986, 848, 155-

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[12.] J. Hahn, R. Kühne, P. Schmieder, ChemBioChem 2007, 8, 2249-2255.

[13.] J. J. van Thor, M. Mackeen, I. Kuprov, R. A. Dwek, M. R. Wormald, Biophys. J. 2006, 91,

1811-1822.

[14.] J. C. Lagarias, J. M. Kelly, K. L. Cyr, W. O. Smith Jr., Photochem. Photobiol. 1987, 46, 5-13.

[15.] M. E. Casida, Recent Advances in Density Functional Methods, Part I; World Scientific;

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[16.] Q. Chae, P. S. Song, J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 4176-4179.

[17.] G. Wagnière, G. Blauer, J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 7806-7810.

[18.] W. Pastenak, G. Wagnière, J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 1662-1667.

[19.] P. Nesvadba, A. Gossauer, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 6545-6546.

13


[20.] J. B. Iturraspe, S. Bari, B. Frydman, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 1525-1527.

[21.] C. R. W. Guimaraes, J. D. D. M. Neto, R. B. De Alencastro, Int. J. Quant. Chem. 1998, 70,

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[22.] A. H. Göller, D. Strehlow, G. Hermann, ChemPhysChem 2005, 6, 1259-1268.

[23.] J. R. Wagner, J. Zhang, D. von Stetten, M. Gunther, D. H. Murgida, M. A. Mroginski, J. M.

Walker, K. T. Forest, P. Hildebrandt, J. Biol. Chem. 2008, 283, 12212-12226.

[24.] N. C. Rockwell, J. C. Lagarias, ChemPhysChem 2010, 11, 1172-1180.

[25.] A. T. Ulijasz, G. Cornilescu, C. C. Cornilescu, J. Zhang, M. Rivera, J. L. Markley, R. D.

Vierstra, Nature 2010, 463, 250-254.

[26.] B. O. Roos, Adv. Chem. Phys. 1987, 69, 399.

[27.] J. A. Kereselidze, T. Sh. Zarqua, T. J. Kikalishvili, E. J. Churgulia, M. C. Makaridze, Russ.

Chem. Rev. 2002, 71, 993-2002.

[28.] M. J. Field, I. H. Hillier, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1987, 617-622.

[29.] C. Bongards, W. Gärtner, Acc. Chem. Res. 2010, 43, 485-495.

14

CAPÍTULO II. ANÁLISIS ESTRUCTURAL

CAPÍTULO II

ANÁLISIS ESTRUCTURAL

2.1 Aspectos Generales

Este capítulo se dedica al análisis estructural del cromóforo en fitocromo, con el

fin de evaluar las estructuras que estan en discusión. La estructura semicíclica ZZZssa

se propuso en base a comparaciones de homología entre las secuencias de aminoácidos

de las estructuras proteicas de diversas especies, considerando entre ellas

proteobacterias, cianobacterias, hongos, y plantas;[1;2] mientras que la estructura

extendida ZZZasa fue sugerida por estudios con espectroscopia de resonancia Raman,

en los cuales se compararon espectros experimentales y teóricos.[3-6] Nuestro estudio

considera ambas propuestas, ZZZssa y ZZZasa, con el propósito de predecir la

estructura del cromóforo en fitocromo Cph1 de cianobacteria y en fitocromo A de

planta.

La primera parte de este capítulo describe la manera en que el estado de

protonación del cromóforo y la geometría que impone el entorno proteico sobre el

sistema conjugado de la bilina pueden afectar las energías de excitación de la TDDFT

(ver marco téorico de la TDDFT en Apéndice A), las que se utilizan para la obtención

15


de los espectros teóricos de absorción. Para ello, se utilizó la estructura cristalográfica

de la biliverdina como un control de estructura, y se utilizaron modelos moleculares

para representar las dos propuestas estructurales de ficocianobilina y fitocromobilina.

Un análisis de los efectos de protonación y entorno nos muestra las condiciones

propicias para realizar los cálculos de la TDDFT y, por lo tanto, en la segunda parte del

capítulo utilizamos tales condiciones de cálculo para predecir la estructura de la

ficocianobilina en fitocromo Cph1 de cianobacteria y la estructura de la fitocromobilina

en fitocromo A de planta.

2.2 Modelos Moleculares y Metodología Computacional

Para discriminar entre las conformaciones propuestas se hizo un análisis

comparativo entre los espectros teóricos provenientes de nuestros cálculos y los

espectros experimentales publicados.

En el caso del fitocromo Cph1 de cianobacteria, se diseñaron modelos

moleculares para las dos estructuras propuestas, ZZZssa y ZZZasa, incluyendo una

estructura control, correspondiente a la biliverina ZZZssa de una de las estructuras

resueltas de bacteriofitocromo.[7;8] La Figura 2.1 muestra los modelos utilizados: BV-ssa

(control), PCB-ssa, y PCB-asa. Los modelos con geometría semicíclica, BV-ssa y

PCB-ssa, se construyeron a partir de la estructura cristalográfica resuelta para el

fitocromo de la proteobacteria Deinococcus radiodurans;[7;8] mientras que el modelo de

geometría extendida se construyó a partir de la estructura cristalográfica de la

C-ficocianina,[9] proteína que tiene cromóforos de ficocianobilina con estructura

ZZZasa, y que por ello suele utilizarse para modelar el cromóforo de fitocromo en dicha

conformación.

16


Figura 2.1. Modelos para predecir estructura de PCB en fitocromo Cph1 de cianobacteria. BV-ssa, biliverdina con estructura semicíclica ZZZssa; PCB-ssa, ficocianobilina con estructura semicíclica ZZZssa; y PCB-asa, ficocianobilina con estructura extendida ZZZasa.

Los modelos BV-ssa y PCB-ssa utilizaron como molde la estructura

cristalográfica del dominio de unión a cromóforo del bacteriofitocromo con resolución

de 1.45 Å (PDB:2O9C).[8] El modelo PCB-asa hizo uso de la estructura cristalográfica

de la subunidad α de la C-ficocianina con resolución de 1.45 Å (PDB:1JBO).[9] Las

estructuras cristalográficas utilizadas no tienen resueltos los hidrógenos, por lo que

estos se agregaron apropiadamente segun los requerimientos estructurales de cada uno

de los modelos, haciendo uso de parámetros geométricos internos del programa

GaussView[10]. Es importante señalar que los modelos corresponden a los cromóforos

ensamblados a la apoproteina, en donde el puente de unión a cisteína es sustituido por

un hidrógeno (Figura 2.2). Además, con el fin de minimizar el costo computacional, no

se incluyeron las cadenas laterales de ácido propiónico presentes en los anillos B y C

del cromóforo (compárese los modelos de la Figura 2.1 con las estructuras de los

cromóforos de la Figura 1.3), por considerar que estas no afectan la energías de

absorción al no formar parte del sistema π conjugado, lo que ya ha sido comprobado en

los cálculos teóricos realizados por el grupo de Durbeej y cols.[11]

17


Figura 2.2. Estructura del anillo A del cromóforo según el estado de unión a la cisteína. (a) BV con unión a cisteína; (b) BV sin unión a cisteína; (c) PCB con unión a cisteína; (d) PCB sin unión a cisteína.

Con el propósito de evaluar el efecto de la protonación y el entorno para cada

uno de los modelos moleculares de PCB, se definen cuatro condiciones de cálculo:

CONDICIÓN I: Modelo neutro in vacuo.

CONDICIÓN II: Modelo catiónico in vacuo.

CONDICIÓN III: Modelo catiónico en agua.

CONDICIÓN IV: Modelo catiónico en ambiente proteico.

Los modelos catiónicos corresponden a las estructuras que se muestran en la

Figura 2.1, y el efecto de protonación hace referencia al protón unido al nitrógeno del

pirrol C. Para generar la condición III se utilizó un modelo de continuo polarizable

(PCM)[12] (ver marco teórico de PCM en Apéndice A) con la constante dieléctrica del

agua (ε=78,4). La condición IV también se genera con un modelo de continuo

polarizable, pero utilizando una constante dieléctrica igual a 4,0, valor que se ha

sugerido como el apropiado para simular entornos proteicos.[13;14]

18


El efecto del entorno sobre la geometría del cromóforo se evaluó al calcular las

energías de excitación, tanto para geometrías cristalográficas sin optimizar como

para geometrías previamente optimizadas por DFT con un nivel de cálculo

B3LYP/6-31G(d).[15;16]

Los estados excitados de las transiciones verticales y las fuerzas de oscilador

asociadas se obtuvieron mediante cálculos de la DFT dependiente del tiempo

(TDDFT),[17] utilizando un nivel de teoría B3LYP/6-31G(d)[15;16] sobre los ocho

primeros singuletes (S1 – S8). Respecto a la elección del funcional de intercambio-

correlación en la TDDFT, hemos optado por B3LYP porque se trata de un funcional

híbrido que posee un 20% proveniente del marco teórico Hartree-Fock (HF), ya que

estudios del efecto del funcional sobre el cálculo TDDFT proponen que precisamente el

grado de contribución de un término de intercambio HF en el funcional juega un papel

importante, con mejores resultados en funcionales con mayor intercambio HF.[18] Por

ello, es común en TDDFT el uso del funcional B3LYP (20% de intercambio HF) o el

funcional PBE0 (25% de intercambio HF). En lo referente al set de base, lo óptimo es

utilizar una base de tamaño mediano con polarización, como por ejemplo lo son las

bases 6-31G(d), 6-31+G(d), y 6-311+G(2d,p).[18] Por lo tanto, un nivel de teoría TD-

B3LYP/6-31G(d), como el que hemos utilizado, es el adecuado para nuestros

requerimientos.

Los espectros teóricos se generaron mediante la convolución de las energías de

excitación con funciones Gaussianas, utilizando arbitrariamente un FWHM (Full Width

at Half Maximum) de 4000 cm-1. Todos los cálculos de DFT y TDDFT se hicieron con

el programa Gaussian03;[10] y la expansión en Gaussianas para generar los espectros se

hizo con el programa GaussSum2.2.[19]

19


En el caso de la estructura de la fitocromobilina en el fitocromo A de planta,

se construyeron tres modelos moleculares: PΦB-sss, PΦB-ssa, y PΦB-asa (Figura 2.3).

Cabe destacar que durante el desarrollo de esta tesis el grupo de Essen resolvió la

estructura cristalográfica de un fitocromo de cianobacteria,[20] la que hemos considerado

en el análisis estructural de la fitocromobilina. Por lo tanto, con el propósito de evaluar

el efecto que tiene el uso de diferentes moldes para determinada conformación, se

utilizaron los dos moldes estructurales disponibles para la estructura semicíclica

ZZZssa: el cristal de la forma Pr del bacteriofitocromo de Deinococcus radiodurans con

resolución de 1,45 Å (PDB:2O9C);[6] y el módulo fotosensor completo de la forma Pr

del fitocromo Cph1 de la cianobacteria Synechocystis 6803 con resolución de 2,45 Å

(PDB:2VEA).[6;20] Para modelar la fitocromobilina en la estructura extendida ZZZasa se

utilizó como molde la subunidad α-84 del cristal de C-ficocianina de la cianobacteria

termófila Synechococcus elongatus con resolución de 1,45 Å (PDB:1JBO).[9] Para los

modelos PΦB-ssa y PΦB-asa, los hidrógenos se agregaron con el programa

GaussView[11] de acuerdo al arreglo molecular específico de cada modelo, pero esta vez

los hidrógenos se relajaron con DFT B3LYP/6-31G(d),[15;16] manteniendo fijos los

átomos restantes del cromóforo. Para modelar la situación de la bilina en solución, la

que adopta una conformación helicoidal cíclica ZZZsss,[1] se utilizó la estructura del

modelo ZZZssa proveniente de biliverdina,[6] al cual se le hizo una rotación syn/anti

sobre el enlace C14-C15, para luego optimizar in vacuo la geometría del sistema usando

un nivel de teoría B3LYP/6-31G(d).[15;16]

20


Figura 2.3. Modelos para predecir estructura de PΦB en fitocromo A de planta. PΦB-sss, fitocromobilina con estructura helicoidal cíclica ZZZsss; PΦB-ssa, fitocromobilina con estructura semicíclica ZZZssa; y PΦB-asa, fitocromobilina con estructura extendida ZZZasa.

La metodología con las condiciones óptimas de cálculo que fueron utilizadas

para la predicción de la estructura de PCB en fitocromo Cph1 de cianobacteria fueron

las que se utilizaron para la predicción de la estructura de la fitoccromobilina en

fitocromo A de planta. Sin embargo, para el caso particular de la fitocromobilina, se

evaluó también el comportamiento del índice espectroscópico Q/S en los espectros

teóricos y su relación con el isomerismo conformacional del cromóforo, con el

propósito de utilizarlo como un segundo criterio para dicriminar entre las

conformaciones ZZZssa y ZZZasa.

21


2.3 Efecto de Protonación y Entorno

La posición de la banda Q presente en el espectro de absorción del fitcromo

depende de la estructura del cromóforo, por lo se puede utilizar para discriminar entre

las dos conformaciones en estudio, ZZZssa y ZZZasa.

Los máximos de absorción de las bandas Q de los modelos de biliverdina

(Figura 2.1) se evalúan para cuatro condiciones específicas (ver Tabla 2.1). Las

condiciones I y II corresponden a cálculos TDDFT en fase gas (in vacuo) para el

cromóforo en su forma neutra y en su forma protonada, respectivamente. La

comparación entre ambas condiciones permite evaluar el efecto de la protonación del

cromóforo sobre el desplazamiento de la banda Q. Luego, las condiciones III y IV

corresponden a cálculos que incluyen el efecto del entorno utilizando un modelo de

continuo polarizable (ver marco teórico en Apéndice A) con constantes dieléctricas

apropiadas para representar un entorno acuoso y un entorno proteico, respectivamente.

Además, se tabulan los resultados de la TDDFT para estructuras cristalográficas sin

relajar y para geometrías cristalográficas optimizadas por DFT con el fin de evaluar el

efecto de la geometría del cromóforo sobre el cálculo de las energías de excitación.

Finalmente, se muestran como referencia los valores experimentales de absorción

(banda Q)[8;21-23] y las energías de excitacion calculadas por otros grupos.[24;25]

22


Tabla 2.1. Efectos de protonación y entorno sobre la TDDFT para BV y PCB en fitocromo.

Modelo Condición Ia

(nm)Condición Iib

(nm)Condición IIIc

(nm)Condición IVd

(nm)Experimental(nm)

BV-ssa Rayos-X 648 662 708 712 702 (BV en BphP)e

DFT 588 643 659 665PCB-ssa Rayos-X 603 620 659 661 659 (PCB en Cph1)f

DFT 526 590 609 613DFT - 574g - -

PCB-asa Rayos-X 528 590 606 614 618 (PCB en C-PC)h

DFT 508 559 584 588DFT 539i 541g; 582i - -

a Condición I: Modelo neutro in vacuo.b Condición II: Modelo catiónico in vacuo.c Condición III: Modelo catiónico en agua.d Condición IV: Modelo catiónico en ambiente proteico.e Refs. 8 y 21; f Ref. 22; g Ref. 24; h Ref. 23; i Ref. 25.

Al comparar los resultados de las geometrías sin optimizar con aquellas

optimizadas por DFT se logra apreciar un claro desplazamiento de la banda Q. La

diferencia que se observa entre ambas geometrías pone de manifiesto las restricciones

estéricas impuestas por el entorno proteico sobre el cromóforo. Uno de los cambios

específicos entre estas geometrías es que es mas cíclica o cerrada para las estructuras

optimizadas, apreciándose en ellas un aumento en la desviación de la planaridad de los

anillos A, B, y C. Como consecuencia, todas las estructuras con geometría optimizada

muestran un desplazamiento hipsocrómico con respecto a las estructuras

cristalográficas, y también con respecto a los datos experimentales.[8;21-23] La diferencia

observada con respecto a los cálculos teóricos publicados por otros grupos[24;25] se

explica por las diferencias estructurales en el anillo A del cromóforo, ya que esta región,

al ser modificada durante el proceso de ensamblaje a la apoproteina, muestra

desplazamientos de la banda Q dependiendo de la estructura que se estudie, vale decir,

cromóforo ensamblado o cromóforo sin ensamblar (Figura 2.2). Nuestros estudios se

realizaron sobre el cromóforo ensamblado (Figura 2.2a; Figura 2.2c), el cual, como

23


producto del proceso de unión a la apoproteina, pierde un doble enlace. Los resultados

de Wan y cols. para geometrías optimizadas por DFT,[25] con valores de 539 nm y

582 nm en las condiciones I y II, respectivamente (ver las entradas correspondientes en

la Tabla 2.1), se obtuvieron a partir de cálculos con la ficocianobilina sin ensamblar

(Figura 2.2d), lo que explica el desplazamiento de alrededeor de 30 nm hacia el azul.

Por otro lado, el grupo de van Thor trabajó con el cromóforo ensamblado,[24] por lo que

atribuimos el desplazamiento de alrededor de 15 nm en sus cálculos a que ellos utilizan

un funcional de intercambio-correlación distinto para la TDDFT (MPW1PW91)

respecto al que utilizamos nosotros (B3LYP).

Una información relevante que muestra la Tabla 2.1 corresponde a la

comparación de los cálculos TDDFT de los cálculos realizados sobre geometrías

cristalográficas sin optimizar con respecto a aquellos realizados sobre geometrías

relajadas. Al comparar los valores respectivos podemos concluir que sólo las estructuras

cristalográficas sin optimizar, al considerar la geometría que impone el entorno proteico

sobre el cromóforo, logran reproducir cuantitativamente los valores

experimentales,[8;21-23] ya que con las geometrías optimizadas se obtienen valores

bastante desplazados hacia el azul y muy alejados del valor experimental, por lo tanto, a

continuación nos referiremos únicamente a los resultados provenientes de cálculos

TDDFT sobre geometrías cristalográficas sin optimizar. Además, en la Tabla 2.1 se

observa que el efecto de la protonación en los tres modelos corresponde a un

desplazamiento batocrómico (hacia el rojo), el cual se aproxima bien a los valores

experimentales.[8;21-23] En la conformación ZZZssa este desplazamiento es de alrededor

de 15 nm, mientras que para la conformación extendida ZZZasa se aprecia un

desplazamiento de más de 60 nm. Por lo tanto, nuestro resultados permiten sugerir que

la forma protonada del cromóforo es la que se encuentra presente en fitocromo y en

C-ficocianina, apoyando así otros estudios realizados al respecto.[25-28]

24


El efecto solvatocrómico y el efecto del entorno proteico sobre el

desplazamiento de la banda Q también fueron evaluados (condiciones III y IV en la

Tabla 2.1). Tanto en entorno acuoso (condición III) como en entorno proteico

(condición IV) se observa un desplazamiento batocrómico considerable con respecto a

las condiciones in vacuo (condiciones I y II). Sin embargo, la diferencia entre el entorno

acuoso (condición III) y el entorno proteico (condición IV) es sutil.

2.4 Estructura de la Ficocianobilina en Fitocromo de Cianobacteria

Con el propósito de dilucidar la estructura de la ficocianobilina en fitocromo

Cph1 de Cianobacteria, se calcularon los espectros teóricos que se muestran en la

Figura 2.4 para los modelos BV-ssa, PCB-ssa, PCB-asa (Figura 2.1) en sus formas

protonadas y en entorno proteico (Condición IV), condición que consideramos la

apropiada para generar espectros en este sistema. Para los ocho primeros estados

excitados singuletes, S1 a S8, se calculó por TDDFT la energía de excitación y la fuerza

de oscilador asociada. La expansión en Gaussianas de los picos resultantes del cálculo

TDDFT generan dos bandas para cada espectro: la banda Soret y la banda Q. Los

espectros nos muestran que la banda Soret se genera a partir de múltiples estados (con

distinta longitud de onda), mientras que la banda Q se forma solamente con el primer

singulete excitado, S1, el cual presenta como contribución principal la transición

HOMO ---> LUMO en los tres modelos estudiados. La banda Soret, en cambio,

presenta en su estado más preponderante una superposición de dos transiciones:

HOMO–1 ---> LUMO y HOMO ---> LUMO+1. Los orbitales moleculares involucrados

en las transiciones electrónicas para uno de los modelos de interés, PCB-ssa, se

muestran en la Figura 2.5, los que corresponden a orbitales π,π* delocalizados a lo

largo de toda la molécula.

25


Figura 2.4. Espectros TDDFT de absorción UV-Vis para BV y PCB en fitocromo.(a) BV-ssa; (b) PCB-ssa; (c) PCB-asa. Todos los espectros se modelaron en entorno proteico (ε = 4.0).

Figura 2.5. Orbitales moleculares involucrados en el espectro de absorción UV-Vis de PCB-ssa.Principales orbitales moleculares que participan en las transiciones electrónicas que forman la banda Q y banda Soret del modelo PCB-ssa según cálculos de la TDDFT (TD-B3LYP/6-31G(d)): HOMO-1, HOMO, LUMO, y LUMO+1.

26


Los máximos de absorción para la banda Q de los espectros teóricos de

absorción (ver Tabla 2.1 y Figura 2.4) nos muestran que los valores experimentales de

702 nm[8;21] para el modelo BV-ssa y de 618 nm[23] para el modelo PCB-asa en

C-ficocianina son cuantitativamente bien reproducidos por los valores teóricos de

708/712 nm y 606/614 nm, respectivamente. En lo que respecta al modelo PCB-ssa, los

659/661 nm de nuestros cálculos reproducen los 659 nm del dato experimental[22] para

ficocianobilina en fitocromo Cph1 de cianobacteria y, considerando que dicho valor

experimental se encuentra lo suficientemente alejado del valor teórico de PCB-asa,

podemos entonces concluir que dicho valor experimental se genera por la

ficocianobilina en conformación ZZZssa y no así por la conformación ZZZasa propuesta

por el grupo de Mroginski.[4-6] Además, en la Tabla 2.1 se puede observar que el cambio

de una conformación semicíclica a una extendida provoca un desplazamiento

hipsocrómico, tal como ha sido descrito en estudios con cálculos semiempíricos.[29]

La conformación ZZZssa propuesta por el grupo de Lagarias se fundamentó en

base a los alineamientos de secuencia para 122 proteínas correspondientes a fitocromo y

proteínas relacionadas,[1;2] donde se observó lo siguiente: (i) todos los fitocromos

mantienen en general un alto grado de conservación en dos de los tres dominios de la

región fotosensora; (ii) los residuos clave que forman el nudo entre dichos dominios se

encuentran altamente conservados; (iii) las diferencias observadas entre las secuencias

se encuentran en regiones que no son importantes en la estructura secundaria de la

proteína. Tales observaciones nos señalan que el cromóforo en fitocromo de

cianobacteria adopta la misma conformación que su par en proteobacteria, Por otro

lado, la conformación ZZZssa ha sido respaldada por experimentos de espectroscopia

RMN sobre fitocromo Cph1 de cianobacteria.[30] Nuestros estudios teórico-

computacionales también apuntan hacia esta misma conformación semicíclica,

descartando la conformación extendida ZZZasa propuesta por Mroginski y cols.,[4-6]

27


fundamentada en el análisis con espectroscopia de resonancia Raman. Al respecto,

podemos discutir que los cálculos teóricos utilizados como referencia en dichos

estudios, para asignar las bandas del espectro experimental y discriminar la

conformación del cromóforo, se realizaron en estructuras relajadas in vacuo, y por ello

la conformación ZZZasa que se propone puede no corresponder al cromóforo en su

entorno nativo, tal como lo discute el mismo grupo de Mroginski en estudios teóricos

realizados en la ficocianobilina de C-ficocianina,[31] donde se demuestra que al

considerar el entorno en forma explícita por medio de un método híbrido QM/MM se

logra una mejoría significativa con respecto al cálculo QM del cromóforo aislado.

Durante el proceso de revisión y publicación de los resultados de la TDDFT

expuestos en el presente capítulo, donde respaldamos la propuesta de conformación

semicíclica ZZZssa para la ficocianobilina en fitocromo Cph1 de cianobacteria,

aparecieron publicados dos trabajos importantes en relación directa al tema en

cuestión.[20;32] El primero de ellos presentó la primera estructura en solución para el

fitocromo de cianobacteria, resuelta mediante espectroscopia RMN,[32] donde se

encontró que el cromóforo adopta la conformación ZZZssa. Pero es el trabajo de Essen

y cols. el que definitivamente confirmó la conformación semicíclica ZZZssa al resolver

la estructura cristalográfica de la forma Pr para el módulo fotosensor completo del

fitocromo Cph1 de cianobacteria.[20] En consecuencia, la confirmación de la estructura

ZZZssa de la ficocianobilina nos permite asumir que nuestra metodología de cálculo

para la obtención de espectros teóricos de absorción logra reproducir y predecir en

forma acertada los espectros de absorción experimental en este sistema.

28


2.5 Estructura de la Fitocromobilina en Fitocromo de Planta

Para dilucidar la estructura de la fitocrombilina en fitocromo A de plantas, se

calcularon los espectros teóricos que se muestran en la Figura 2.6 para los modelos

PФB-sss, PФB-ssa, PФB-asa (Figura 2.3) en sus formas protonadas y en entorno

proteico (Condición IV), tal como lo hicimos para el caso de la ficocianobilina (sección

2.4). Pero para el caso de fitocromobilina, además del análisis de máximos de absorción

de la banda Q, se hizo un análisis de índices Q/S y, por lo tanto, se realizaron cálculos

para biliverdina y fitocromobilina en las tres conformaciones de estudio: helicoidal

cíclica ZZZsss, semicíclica ZZZssa, y extendida ZZZasa.

La contribución orbitalaria en los espectros se logra apreciar en la Figura 2.7,

donde se muestran los orbitales moleculares involucrados en las transiciones

electrónicas para el modelo PФB-ssa proveniente del molde de biliverdina.[8] En este

modelo, la transición HOMO ---> LUMO que genera la banda Q es π,π* entre orbitales

delocalizados, mientras que la transición principal que compone la banda Soret es una

superposición de dos transiciones: HOMO-1 ---> LUMO y HOMO ---> LUMO+1, que

también son de naturaleza π,π* entre orbitales delocalizados. Estas mismas transiciones

se observaron para ficocianobilina (sección 2.4) y biliverdina. Curiosamente, los cuatro

orbitales que generan la banda Soret de estas bilinas coinciden con aquellos propuestos

por Gouterman para porfirinas en su llamado “modelo de cuatro orbitales”: HOMO-1,

HOMO, LUMO, LUMO+1.[33] Aparentemente la banda Soret podría ser clave en un

intento de relacionar tetrapirroles abiertos, como las bilinas, con tetrapirroles cíclicos,

como las porfirinas; y al respecto podemos preveer que la simetría del sistema podría

estar involucrada: sistemas más simétricos originando una banda Soret más

pronunciada, y sistemas menos simétricos originando una banda Soret más débil.

29


Figura 2.6. Espectros TDDFT de absorción UV-Vis para modelos de la fitocromobilina.(a) PФB-sss; (b) PФB-ssa construido con el molde de BV; (c) PФB-ssa construido con el molde de PCB; (d) PФB-asa.

Figura 2.7. Orbitales moleculares involucrados en el espectro de absorción UV-Vis de PФB-ssa.Principales orbitales moleculares que participan en las transiciones electrónicas que forman la banda Q y banda Soret del modelo PФB-ssa construido con el molde de BV según cálculos de la TDDFT (TD-B3LYP/6-31G(d)): HOMO-1, HOMO, LUMO, y LUMO+1.

30


Figura 2.8. Estructura del cromóforo dentro de la estructura cristalográfica.(A) Biliverdina en bacteriofitocromo de D. radiodurans; (B) Ficocianobilina en fitocromo Cph1 de Synechocystis 6803.

El espectro para el modelo PФB-ssa proveniente del molde de biliverdina[8]

muestra una banda Soret con un máximo de absorción en los 395 nm y una banda Q

centrada alrededor de los 664 nm, mientras que el modelo PФB-ssa proveniente del

molde de ficocianobilina[20] muestra sus máximos de absorción en los 410 nm y 688 nm.

La banda Q del espectro experimetal para fitocromo de planta tiene un valor de

666 nm,[34] por lo tanto, solamente el modelo PФB-ssa construido a partir del molde de

biliverdina (cristal de bacteriofitocromo en D. radiodurans)[8] reproduce con exactitud

este valor, en consecuenica, a la luz de estos resultados podemos sugerir que la

fitocromobilina en fitocromo de planta presenta una estructura semicíclica ZZZssa

similar a la que presenta la biliverdina del bacteriofitcromo,[7;8] pero diferente a la

31


estructura ZZZssa que presenta la ficocianobilina en el cristal de fitocromo de

cianobacteria.[20] Pero si analizamos las causas del desplazamiento espectroscópico para

PФB-ssa en las dos situaciones, podemos intuir que se trata de diferencias estructurales

entre los moldes utilizados,[8;20] y, efectivamente, al comparar los cristales de fitocromo

de proteobacteria y de fitocromo de cianobacteria, podemos apreciar una diferencia en

la torsión del anillo D del cromóforo por sobre el plano formado por los tres anillos

restantes (ver Figura 2.8), ya que en bacteriofitocromo (proteobacteria) esta torsión

tiene un ángulo diedro de aproximadamente 45˚,[8] mientras que en fitocromo de

cianobacteria este ángulo de torsión es de alrededor de 26˚,[20] de modo que el anillo D

del cromóforo de cianobacteria es más coplanar con respecto al anillo D del cromóforo

de proteobacteria. Por lo tanto, el molde de ficocianobilina presenta una mayor

delocalización electrónica en su sistema π conjugado con respecto al molde de

biliverdina, y en consecuencia, un modelo PФB-ssa construido a partir del molde de

ficocianobilina tiene menor energía que aquel construido a patir de proteobacteria, lo

que se refleja en un desplazamiento batocrómico de 664 nm a 688 nm. Estudios de

resonancia Raman en fitocromo de planta sugieren una torsión del anillo D de la

fitocromobilina en fitocromo de planta con similares características a lo que se observa

para biliverdina, segun lo demuestra la fuerte actividad que se encontró en el modo

vibracional correspondiente al puente metilo que une dicho anillo.[35] Alternativamente,

estudios de mutagénesis han sugerido que la torsión del anillo D por sobre el plano del

sistema se produce como respuesta a la ausencia del dominio PHY,[36,37] como es el caso

de los cristales disponibles de bacteriofitocromo.

32


Tabla 2.2. Máximos de absorción e índices Q/S calculados por la TDDFT.a

ModeloMáximos de Absorción (nm) Q/S

Exptlb TDDFT Exptlc TDDFTd

BV-sss 377, 696, 710e 383, 712 0,29f 0,26PCB-sss 375, 692 368, 675 0,33; 0,43 0,37PФB-sss 386, 700 384, 701 - 0,34BV-ssa 380, 702 417, 712 2,69g 1,99PCB-ssa 380, 659 394, 661 1,17 2,28PФB-ssa 380, 666 395h (382)h; 664h (633)h;

410i (382)i; 688i (611)i1,36; 1,45 2,12h (2,02)h;

2,36i (1,90)i

PCB-asa 380, 618 385, 614 4,1 5,26PФB-asa - 398 (383); 640 (619) - 5,27 (4,26)

a Los valores en paréntesis corresponden a estructuras refinadas por medio de una optimización restringida (diedros fijos).b Datos extraídos desde Refs. 8,22,23,34,38,39.c Datos extraídos desde Refs. 29,40-43.d Constante dieléctrica ε = 4,0 para las conformaciones ssa y asa; constante dieléctrica ε = 78,4 para la conformación sss.e Máximo de banda Q para el éster dimetilo de biliverdina protonado (BVEH+) en solución correspondiente a la conformación cíclica helicoidad según Braslavsky y cols.(Ref. 39).f Este valor se obtuvo como el promedio de las fuerzas de oscilador contribuyentes de las bandas Q y Soret.g Este valor se encuentra probablemente sobrestimado debido a que se obtuvo como la razón entre las alturas de las bandas Q y Soret, y no como el área bajo las bandas, correspondiente a la fuerza de oscilador.h Estos valores se obtuvieron usando el molde de biliverdina (BV).i Estos valores se obtuvieron usando el molde de ficocianobilina (PCB).

Los valores de Q/S para todos los modelos se muestran en la Tabla 2.2, donde

se confronta el Q/S teórico que entrega la TDDFT contra el Q/S experimental. [29;40-43]

También se han considerado los Q/S calculados para estructuras refinadas por medio de

una optimización restringida con diedros fijos (valores en paréntesis en Tabla 2.2)

En forma práctica, y analizando todos los valores de Q/S tabulados, se puede

seguir el siguiente criterio de selección: la conformación es extendida si el Q/S es

mayor que 3,5; la conformación es semicíclica si el Q/S tiene un valor entre 0,8 y 3,0; y

la conformación es cíclica si el Q/S es menor que 0,7.

33


El Q/S teórico para la conformación ZZZssa es 2,12 y para la

conformación ZZZasa es 5,27. Si consideramos que el Q/S experimental para la

fitocromobilina en fitocromo de plantas es 1,36/1,45,[41;42] entonces es posible predecir

una conformación semicíclica ZZZssa para la forma Pr de la fitocromobilina.

2.6 Modelo Teórico del Comportamiento del Índice Q/S

Nuestros resultados muestran la dependencia del índice Q/S con respecto al

isomerismo conformacional de los cromóforos PCB y PФB de fitocromo. Sin embargo,

debido a que dicho comportamiento se encontró específicamente para sólo estos dos

cromóforos, es necesario proponer un modelo teórico que explique la relación entre los

índices Q/S y los confórmeros, de manera de poder generalizar el fenómeno. Con tal

propósito, hacemos uso de las fuerzas de oscilador con las que se construyeron los

espectros TDDFT de absorción (Figura 2.4 y Figura 2.6; Tablas Suplementarias en

Apéndice B).

En el caso particular de las bilinas, contamos con la fuerza de oscilador para

cada uno de los ocho estados excitados calculados (S1 a S8). Además, para nuestro

análisis hemos definido un término empírico “F8” como la sumatoria de las fuerzas de

oscilador de estos ocho estados singuletes:

F8 = ∑i=1

8

S i (1)

Es interesante observar que, para todos los espectros TDDFT de absorción

calculados, F8 presenta un valor relativamente constante para los isómeros estudiados:

sss, ssa, y asa (ver valores de F8 en las Tablas Suplementarias del Apéndice B).

34


Tabla 2.3. Relación entre Q/S, F8, FQ para confórmeros de PФB

Modelo Q/S F8 FQ a

PФB-sss 0,34 2,1 0,4354PФB-ssa b 2,12 2,1 1,3611PФB-asa 5,27 2,1 1,6693

a Los valores pueden ser mayores a 1 debido a que los cálculos no descuentan el valor asociado a la emisión.b Se consideró solamente el confórmero construido a partir del molde de BV.

La banda Q se compone mayoritariamente a partir de una única transición

electrónica, a la que llamaremos SQ, que presenta un fuerza de oscilador asociada que

denominaremos FQ. Al tabular cada conformación con sus respectivos valores de Q/S,

F8, y FQ (Tabla 2.3), podemos comprobar que efectivamente F8 se mantiene constante y

que el valor de FQ aumenta a medida que la conformación es más extendida. Por lo

tanto, el aumento del Q/S puede explicarse por una mayor efectividad en la excitación

al estado SQ para las conformaciones extendidas, es decir, en estas estructuras la

transición SQ se encuentra “más permitida” en comparación con estructuras más

cíclicas.

Podemos proponer un modelo téorico que logre explicar satisfactoriamente el

comportamiento de Q/S en bilinas si consideramos que la banda Soret en porfirinas se

asocia tanto a la corriente de anillo[44] como a la aromaticidad[45]. Por otro lado, se

postula que sólo el primer singulete excitado (S1) participa en la fotoisomerización de

bilinas en fitocromo.[46;47] En nuestros resultados encontramos que, en la mayoría de los

casos, el estado SQ corresponde al estado S1, por lo que consideraremos que la transición

electrónica que forma la banda Q corresponde al estado electrónico asociado a la

fotoisomerización del fitocromo. Por lo tanto, es posible particionar la constante

empírica F8, o simplemente F, en dos componentes variables: (i) FS, correspondiente a

35


transiciones electrónicas asociadas a la actividad intrínseca del sistema π conjugado

(corriente de anillo y aromaticidad); (ii) FQ, correspondiente a la transición electrónica

asociada a la fotoisomerización del cromóforo. Entonces, proponemos que la base

teórica que logra explicar el comportamiento del índice Q/S es:

F = FS + FQ (F constante; FS y FQ variables) (2)

La aditividad asumida en la ecuación (2) puede asociarse con una

aproximación de osciladores independientes, es decir, despreciando la interacción entre

ellos. Este modelo es ciertamente muy aproximado y requiere de una justificación

formal.

36


2.7 Referencias

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39

CAPÍTULO III. TAUTOMERÍA EN LA INTERCONVERSIÓN

CAPÍTULO III

TAUTOMERÍA EN LA INTERCONVERSIÓN

3.1 Aspectos Generales

El presente capítulo no se enfoca en la etapa fotinducida, sino que en la etapa

térmica que le sigue (Figura 1.2). El estudio de mecanismos involucrados en la etapa

térmica de la fotoconversión del fitocromo es de gran interés dado que se sabe muy

poco al respecto. Por tal motivo, y aprovechando la disponibilidad de estructuras

cristalográfica de la forma Pr de fitocromo, se estudió el mecanismo de la etapa térmica

que describe el proceso de interconversión desde la forma Pr a la forma Pfr,

entendiendo que el mecanismo involucrado puede también formar parte de la etapa

térmica de la interconversión en sentido inverso, es decir, desde Pfr a Pr.

Nuestro estudio se centra en un mecanismo en particular: la tautomería lactama-

lactima,[1;2] que puede ser considerada para los anillos A y D de la bilina, ya sea como

una tautomería favorecida para uno de los anillos, o bien, como una tautomería que

involucre a ambos anillos.

40


Lo que se sabe acerca de la tautomería lactama-lactima se basa principalmente

en los estudios realizados en el sistema de la 2-piridona,[2-5] los que sugieren que la

tautomería que rige el equilibrio 2-piridona/2-hidroxipiridina puede cursar dos tipos de

mecanismo: disociativo y no disociativo, ambos basados en transferencia de protones.[2]

El mecanismo disociativo de transferencia protónica es típico de reacciones ácido-base,

donde ocurre una protonación y desprotonación en serie del sustrato, que es el

mecanismo dominante para soluciones acuosas no neutras. Por otro lado, el mecanismo

no disociativo de transferencia protónica es importante en fase gaseosa, en medios

apróticos, y en soluciones acuosas neutras. Este mecanismo no disociativo puede ocurrir

de tres maneras: (i) transferencia de protón a través de un mecanismo intramolecular;

(ii) interconversión tautomérica a partir de la formación de un dímero; (iii) un

mecanismo que considere la participación de una o más moléculas de agua como

catalizador bifuncional para la formación de un intermediario de estructura cíclica. [2]

Considerando todos estos antecedentes, se hizo un análisis teórico sobre los

mecanismos plausibles de tautomería para el sistema de la bilina en fitocromo.

La posibilidad de que ocurra una tautomería no es una idea nueva en el sistema

de las bilinas, ya que hay estudios relacionados para bilinas en solución.[6] Sin embargo,

para el caso de las bilinas presentes en fitocromo la posibilidad de tautomería ha sido

abordada solamente, y a un nivel muy superficial, por el grupo de Matysik,[7] el cual en

base a experimentos de espectroscopia 13C-RMN en estado sólido por rotación al ángulo

mágico (MAS) señala que no es posible la ocurrencia de una tautomería. Las

asignaciones en mediciones bidimensionales son usualmente muy seguras, pero

evidentemente los resultados en estado sólido no son extrapolables a una solución. Por

lo tanto, con el propósito de incluir este antecedente en nuestro estudio, hemos realizado

cálculos teóricos de 13C-RMN para el caso de la ficocianobilina de fitocromo.

41


Por otro lado, mucho se ha especulado acerca del desplazamiento batocrómico

que ocurre tras la fotoconversión directa de Pr a Pfr, y se ha buscado una explicación en

base a la estructura de la forma Pfr.[8] Por lo tanto, también abordamos este aspecto,

utilizando espectros teóricos de absorción.

3.2 Modelos Moleculares y Metodología Computacional

Debido a que la forma Pfr se ha resuelto solamente para el caso de la biliverdina

en fitocromo de proteobacteria,[9] se utilizaron modelos de esta bilina para evaluar la

posibilidad de tautomería.

Los modelos moleculares de biliverdina para la forma Pfr (Figura 3.1) se

construyeron en base a la biliverdina del cristal resuelto por el grupo de Moffat.[9] Las

cadenas laterales de ácidos propiónicos presentes en los anillos B y C no se

consideraron, para así evitar la distorsión indeseada que generan sus cargas negativas

durante el proceso de optimización de geometría. Los hidrógenos, al no estar resueltos,

se agregaron de acuerdo al arreglo molecular de los modelos. Las estructuras con las

que se trabajó para los cálculos de TDDFT fueron geometrías cristalográficas sin

optimizar, en las que solamente los hidrógenos fueron relajados, manteniendo el resto

de los átomos fijos, usando la DFT con el funcional B3LYP[10;11] y la base 6-31G(d).

Para la obtención de los espectros teóricos de absorción de la biliverdina en la

forma Pfr, se calcularon las energías de excitación y fuerzas de oscilador asociadas a

partir de cálculos TDDFT, utilizando un PCM[12] con una constante dieléctrica de 4,0,

tal como fue descrito en el capítulo anterior. La TDDFT se calculó para 8 raíces, con un

nivel de teoría de B3LYP/6-31G(d);[10;11] luego los picos de excitación se

convolucionaron con funciones Gaussianas utilizando un FWHM de 4000 cm-1 para

generar las bandas de absorción.

42


Se calcularon las barreras de energía para los distintos mecanismos propuestos

de tautomería lactama-lactima, utilizando el funcional híbrido de correlación-

intercambio B3LYP[10;11] en conjunto con el set de base 6-31G(d). Para las

optimizaciones se utilizó el método de optimización por gradiente analítica de

Berny.[13;14] Todos los cálculos se hicieron con el programa Gaussian03.[15] Los puntos

estacionarios se caracterizaron por cálculos de frecuencia.

Para los desplazamientos químicos de RMN, las estructuras se optimizaron in

vacuo por DFT con el funcional híbrido B3LYP[10;11] de la aproximación de gradiente

generalizada (GGA) y el set de base 6-31G(d). Los tensores de apantallamiento químico

para los átomos 13C se calcularon para cada estructura optimizada por DFT usando el

formalismo de la GIAO[16] (ver marco teórico de la GIAO en Apéndice A) junto con el

set de base 6311+(2d,p). Se evaluaron dos funcionales de intercambio-correlación

B3LYP y mPW1PW91. Los desplazamientos químicos anisotrópicos (δ) en ppm se

calcularon para ambos niveles de teoría: B3LYP/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d) y

mPW1PW91/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d). Los valores para δ se calcularon como la

diferencia entre el apantallamiento isotrópico atómico 13C de los modelos moleculares

de la ficocianobilina con respecto a los átomos de carbono en la molécula de referencia,

correspondiente a tetrametilsilano (TMS). La corrección por escalamiento linear

propuesta por Aliev y cols.,[17] implementada para corregir en forma específica los

errores sistemáticos asociados con un nivel de teoría GIAO B3LYP/6-

311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d), se utilizó para los cálculos de los desplazamientos

químicos de 13C-RMN de acuerdo a la siguiente relación: δscalc = 0.95 δcalc + 0.30; en

donde δcalc y δscalc corresponden al valor calculado y al valor corregido,

respectivamente.

43


Figura 3.1. Modelos de tautómeros para la forma Pfr de biliverdina en bacteriofitocromo.a) DITAM: Dilactama (anillos A y D); b) TIM-A: Lactima en A, Lactama en D; c) TIM-D: Lactama en A, Lactima en D; d) DITIM: Dilactima (anillos A y D).

3.3 En Busca del Desplazamiento Batocrómico de Pfr

Con el propósito de explicar el desplazamiento batocrómico que se observa con

la interconversión directa desde Pr a Pfr, se calcularon los espectros teóricos que se

muestran en la Figura 3.2 para los modelos DITAM, TIM-A, TIM-D, y DITIM (Figura

3.1); en sus formas protonadas y en entorno proteico, acorde a las condiciones de

cálculo propicias discutidas en detalle en el capítulo II.

Los espectros teóricos de absorción de los modelos tautoméricos de Pfr (Figura

3.2) reproducen dos bandas de absorción. La banda Q, en la región del rojo en el

espectro visible, es descrita principalmente por la transición electrónica

HOMO ----> LUMO, mientras que la banda Soret, en la región del azul en el espectro

visible, está compuesta por varias transiciones electrónicas, con una mayor contribución

por parte de cuatro orbitales: HOMO-1, HOMO, LUMO, y LUMO+1.

44


Figura 3.2. Espectros TDDFT de absorción UV-Vis para tautómeros de BV en bacteriofitocromo.a) DITAM: Dilactama (anillos A y D); b) TIM-A: Lactima en A, Lactama en D; c) TIM-D: Lactama en A, Lactima en D; d) DITIM: Dilactima (anillos A y D).

Las transiciones electrónicas de los espectros TDDFT son π,π* con orbitales

delocalizados a lo largo del sistema conjugado, tal como se encontró para

ficociacianobilina y fitocromobilina en la forma Pr de fitocromo (capítulo II).

Si analizamos el desplazamiento batócromico que presenta la banda Q para los

distintos tautómeros (Figura 3.2), podemos observar que DITAM y TIM-D tienen

máximos similares, con 735 nm y 731 nm, respectivamente; mientras que DITIM y

TIM-A presentan un desplazamiento batocrómico de alrededor de 20 nm, con 750 nm

45


para DITIM y 747 nm para TIM-A, valores que concuerdan muy bien con el valor

experimental de referencia de 749 nm[18] o 750 nm[19;20], correspondiente a la forma Pfr

de bacteriofitocromo. El desplazamiento batocrómico para el modelo dilactima

(DITIM) es consecuencia de una tautomería en el anillo A, ya que no se observa

desplazamiento para TIM-D cuando se compara con el modelo dilactama (DITAM)

como referencia. Por lo tanto, estos resultados sugieren que una tautomería lactama-

lactima puede explicar el desplazamiento batocrómico que se observa con la formación

de Pfr, pero en forma dependiente del anillo, es decir, presentándose sólo para el

tautómero lactima en el anillo A.

3.4 Mecanismos de la Tautomería Lactama-Lactima en Bacteriofitocromo

La tautomería lactama-lactima puede ocurrir en el grupo funcional imida

presente en la bilina, por lo tanto, puede afectar tanto al anillo A como al anillo D del

cromóforo. Con el propósito de saber si la tautomería es favorecida en uno de los anillos

por sobre el otro se calcularon las barreras de energía considerando, por motivos

prácticos, solamente el mecanismo no disociativo de tautomería con transferencia

protónica intramolecular (Figura 3.3). De esta manera, pretendemos obtener la

estructura de los TS asociados para ambos casos, a los que nos referirermos como TSA

y TSD para la tautomería en el anillo A y en el anillo D, respectivamente.

Figura 3.3. Mecanismo no disociativo de tautomería con transferencia protónica intramolecular.La interconversión de lactama a lactima puede ocurrir mediante la transferencia de un protón desde el nitrógeno al oxígeno con formación de un estado de transición.

46


La coordenada de reacción para la transferencia intramolecular no disociativa

corre desde el reactivo, correspondiente al tautómero dilactama DITAM (Figura 3.1),

hasta la formación del producto TIM-A en el caso de una tautomería en el anillo A, o

bien, hasta la formación del producto TIM-D en el caso de una tautomería en el anillo

D. Ambas reacciones compiten, y deben pasar por sus respectivos TS antes de formar

cada producto, de modo que la barreras energéticas asociadas al TSA y al TSD nos

pueden mostrar, en principio, si la tautomería lactama-lactima se encuentra

energéticamente favorecida en uno de lo anillos. La Figura 3.4 muestra la estructura de

los estados de transición TSA y TSD, sus respectivas barreras de energías, y la

frecuencia imaginaria asociada a la transferencia del protón. El estado de transición

TSA (Figura 3.4A) presenta una diferencia de 7 kcal/mol con respecto al estado de

transición TSD (Figura 3.4B), es decir, la tautomería en A se encuentra

energéticamente favorecida con respecto a la tautomería en D, lo que concuerda

perfectamente con los resultados de la TDDFT para Pfr discutidos en la sección anterior

(sección 3.3). Sin embargo, las barreras de energía para la formación de los estados de

transición TSA y TSD aun son bastante altas para que la tautomería ocurra por este

mecanismo en condiciones normales de temperatura y, por lo tanto, un mecanismo de

transferencia protónica intramolecular es inviable para la tautomería lactama-lactima de

biliverdina en bacteriofitocromo. En consecuencia, la tautomería en el anillo A,

energéticamente favorecida, podría ser viable solamente en presencia de un catalizador,

y si consideramos la presencia inequívoca de una molécula de agua cristalográfica en la

vecindad del anillo A,[9;20-23] podemos intuir que dicha molécula de agua podría actuar

como catalizador.

47


Figura 3.4. Estados de transición para el mecanismo intramolecular de tautomería.(A) TSA: Estado de transición para tautomería intramolecular en el anillo A. (B) TSB: Estado de transición para tautomería intramolecular en el anillo B. Las estructuras de los estados de transición se muestran junto a la barrera de energía y a la frecuencia imaginaria asociada a la transferencia protónica.

En todos los cristales resueltos para el fitocromo se ha encontrado una molécula

de agua en la vecindad del grupo carbonilo del anillo A del cromóforo, [9;20-23] la que

estaría formando parte de una red de interacción electrostática estabilizada por una

histidina en la parte superior, el carbonilo del enlace petídico de un aspartato en la parte

inferior, y los nitrogénos pirrólicos de la bilina en los costados (Figura 3.5A, Figura

3.5B). Como la forma Pfr ha sido resuelta solamente para el fitocromo de

proteobacteria,[9] nos preocupamos sólo de la situación de la biliverdina en

bacteriofitocromo. En dicho contexto, la biliverdina presenta un entorno cercano similar

al que se muestra en la Figura 3.5A para la forma Pr[22] y como el que se muestra en la

Figura 3.5B para la forma Pfr.[9] En estas figuras se logra apreciar que la histidina y el

aspartato forman parte de la red de interacción del agua, residuos presentados como

His260 y Asp207, respectivamente.

48


Figura 3.5. Interacciónes de la biliverdina en el cristal y en el TS catalizado por agua.(A) Entorno cercano de BV en la estructura cristalográfica de la forma Pr de bacteriofitocromo de D.radiodurans segun Ref. 22; (B) Entorno cercano de BV en la estructura cristalográfica de la forma Pfr de bacteriofitocromo segun Ref. 9; (C) Estructura del estado de transición TS-1wc asociado al mecanismo no disociativo de tautomería lactama-lactima en el anillo A con una molécula de agua como catalizador bifuncional; (D) Estructura desprovista de hidrógenos para el estado de transición TS-1wc.

El compromiso del agua en la tautomería es una de las características del

mecanismo no disociativo con agua como catalizador bifuncional,[2] donde el agua capta

el protón del nitrógeno y simultáneamente dona un protón al carbonilo. Los cálculos

teóricos asociados al perfil energético de esta reacción nos entrega la estructura TS-1wc,

49


correspondiente al estado de transición asociado a dicho mecanismo (Figura 3.5C). El

estado de transición TS-1wc nos muestra que efectivamente la molécula de agua actúa

como catalizador bifuncional en la reacción, con el protón del nitrógeno localizado a

1,36 Å del oxígeno del agua, mientras que el protón que el agua dona a la bilina se

encuentra a 1,07 Å del oxígeno del carbonilo del anillo A.

Al comparar la estructura de TS-1wc (Figura 3.5C) con el entorno cercano de la

biliverdina en los cristales para Pr y Pfr (Figura 3.5A; Figura 3.5B), podemos observar

que la posición del agua en TS-1wc no dista mucho de la posición que adopta el agua

cristalográfica; por ello hemos incluido la estructura del TS sin los hidrógenos (Figura

3.5D) para hacer más directa la comparación de las distancias interatómicas importantes

con respecto a las del cristal. Podemos así observar que la similitud en el

posicionamiento del agua entre TS-1wc y el cristal es evidente. Además, la barrera

energética de 18,6 kcal/mol asociada al estado de transición TS-1wc se puede superar

en condiciones normales de temperatura, por lo tanto, estos resultados indican que la

tautomería lactama-lactima por medio de un mecanismo no discociativo con agua es

viable.

El mecanismo de tautomería que involucra un estado de transición TS-1wc

presenta una catálisis concertada por parte del agua, pero es importante considerar que

existe una segunda forma en que puede presentarse la catálisis: el mecanismo

disociativo. La catálisis disociativa consiste en un mecanismo por pasos con formación

de intermediarios iónicos (Figura 3.6). Este mecanismo no se ha considerado en los

cálculos de este trabajo, sin embargo, pensamos que puede ser perfectamente viable.

Por lo tanto, en la Figura 3.6 se resumen los mecanismos de tautomería lactama-lactima

que proponemos: (i) mecanismo no disociativo de transferencia protónica catalizada por

agua, y (ii) mecanismo disociativo de transferencia protónica catalizada por agua.

50


Figura 3.6. Mecanismos propuestos para la tautomería de BV en bacteriofitocromo.La BV con estructura ZZEssa (1) que se forma como producto de la fotoisomerización inicial puede sufrir una tautomería lactama-lactima en el anillo A considerando dos mecanismos viables: (a) mecanismo no disociativo de transferencia protónica con una molécula de agua como catalizador bifuncional; y (b) mecanismo disociativo de transferencia protónica con la formación de un primer intermediario neutro IN1(b) y un segundo intermediario iónico IN2(e) estabilizado por resonancia (c,d). Ambos mecanismos conducen al tautómero de BV que sugerimos para la forma Pfr de fitocromo. Estados de transición involucrados: TS-1wc para el mecanismo no disociativo de transferencia; TS1-1wsw, TS-2wsw, y TS-3wsw para el mecanismo disociativo de transferencia.

51


3.5 13C-RMN de la Ficocianobilina en Fitocromo

La tautomería lactama-lactima puede ocurrir en el grupo funcional imida

presente en la bilina, por lo tanto, el cromóforo puede tautomerizar en el anillo A, en el

anillo D, o en ambos. Sin embargo, el grupo de Matysik descarta la posibilidad de

tautomería en base a estudios experimentales con espectroscopia 13C-RMN,[7] donde

encuentran que en Pfr los grupos carbonilos de los anillos A y D no se presentan en la

forma enólica sino que en la forma ceto, por lo que señalan que la bilina en Pfr es

dilactama como en Pr.[7] Por consiguiente, resulta de gran utilidad realizar los cálculos

teóricos respectivos para corroborar que las bandas experimentales se asignaron

correctamente, sin ambigüedades, y es por ello que nuestros resultados teóricos los

comparamos con los resultados experimentales del grupo de Matysik.[7]

Los cálculos para RMN se hicieron con la GIAO DFT (ver marco teórico en el

Apéndice A),[19] pero utilizando dos funcionales de correlación-intercambio, B3LYP y

mPW1PW91, que son los que se utilizan con mayor frecuencia en este tipo de cálculos

(ver Tabla 3.1). Además, para el caso de la GIAO B3LYP hemos utilizado la corrección

por escalamiento lineal propuesta específicamente para el nivel de teoría B3LYP/6-

311+G(2d,p)//B3LYP/6-31G(d) en base a estudios sistemáticos realizados en una serie

de moléculas orgánicas.[20]

52


Tabla 3.1. Desplazamientos químicos para espectros 13C-RMN de modelos Pfr de PCB.

Átomo GIAO B3LYPa, b GIAO mPW1PW91c Exptl.d

DITAM TIM-A TIM-D DITIM DITAM TIM-A TIM-D DITIMC1 188.0 (178.9) 194.6 (185.2) 185.4 (176.4) 195.3 (185.9) 182.3 189.5 180.0 190.2 182.9C2 46.6 (44.6) 50.5 (48.3) 46.0 (44.0) 50.9 (48.6) 40.9 44.9 40.4 45.2 37.3C21 19.1 (18.5) 18.7 (18.1) 19.6 (18.9) 18.6 (17.9) 14.3 13.8 14.8 13.8 18.2C3 57.2 (54.6) 58.7 (56.1) 57.6 (55.1) 59.4 (56.8) 51 52.8 51.5 53.4 54.3C31 34.3 (32.9) 34.1 (32.7) 33.9 (32.5) 34.0 (32.6) 28.6 28.4 28.3 28.2 49.7C32 12.9 (12.6) 13.4 (13.1) 13.4 (13.0) 13.4 (13.1) 8.5 8.9 8.9 9.0 21.2C4 166.3 (158.3) 179.8 (171.1) 169.2 (161.1) 181.0 (172.3) 161.2 174.5 164.2 175.7 153.5C5 94.0 (89.6) 104.7 (99.8) 92.6 (88.2) 104.1 (99.2) 89.1 100.1 87.7 99.5 88.5C6 159.9 (152.2) 159.3 (151.6) 162.2 (154.4) 160.5 (152.8) 154.9 154.4 157.3 155.5 149.3C7 139.7 (133.0) 139.2 (132.6) 140.9 (133.8) 139.2 (132.6) 134.1 133.5 134.9 133.5 126.3C71 12.6 (12.3) 12.6 (12.3) 12.9 (12.5) 12.5 (12.2) 8.4 8.3 8.7 8.3 9.2C8 141.1 (134.4) 139.0 (132.4) 142.6 (135.7) 139.1 (132.4) 137.3 135.1 138.7 135.2 143.8C9 140.8 (134.1) 138.2 (131.6) 140.7 (134.0) 138.8 (132.1) 135.0 132.3 134.8 132.8 130.9C10 123.3 (117.4) 123.0 (117.2) 123.3 (117.4) 123.6 (117.7) 119.7 119.4 119.7 120.0 112.4C11 141.0 (134.3) 139.0 (132.3) 139.8 (133.1) 138.9 (132.3) 135 133.0 133.8 133.0 130.9C12 140.7 (134.0) 139.8 (133.1) 140.3 (133.6) 138.9 (132.2) 136.8 135.7 136.2 134.7 145.8C13 139.4 (132.7) 136.0 (130.0) 139.7 (133.1) 137.7 (131.1) 134.0 130.7 134.3 132.3 130.7C131 13.5 (13.1) 12.2 (11.9) 12.6 (12.3) 12.1 (11.8) 9.3 8.1 8.6 8.0 11.6C14 161.0 (153.3) 157.7 (150.1) 160.9 (153.1) 157.4 (149.8) 155.8 152.2 155.6 151.9 152.0C15 96.5 (92.0) 95.9 (91.4) 116.1 (110.6) 118.1 (112.5) 91.4 91.1 111.0 113.1 91.6C16 161.5 (153.7) 158.5 (150.9) 175.3 (166.9) 171.8 (163.5) 156.1 153.0 169.2 165.7 151.6C17 143.2 (136.3) 145.6 (138.6) 147.0 (140.0) 148.0 (140.9) 138.2 140.5 142.4 143.4 137.5C171 11.8 (11.5) 11.8 (11.5) 12.4 (12.1) 12.4 (12.0) 7.7 7.7 8.2 8.2 10.0C18 154.5 (147.1) 153.9 (146.5) 150.1 (142.9) 148.2 (141.1) 149.5 148.7 145.0 143.1 140.5C181 23.2 (22.3) 23.7 (22.8) 22.8 (22.0) 23.2 (22.3) 18.3 18.7 17.8 18.2 15.7C182 15.2 (14.7) 15.5 (15.1) 15.4 (15.0) 15.7 (15.2) 10.6 10.9 10.8 10.9 13.3C19 174.0 (165.6) 174.9 (166.4) 186.6 (177.6) 185.7 (176.7) 168.7 169.6 181.3 180.4 169.1

a GIAO B3LYP/6-311+G(2d,p)//B3LYP/6-31G(d).b Valores en paréntesis corresponden a valores escalados de acuerdo a Ref. 17.

c GIAO mPW1PW91/6-311+G(2d,p)//B3LYP/6-31G(d).d Datos extraídos desde Ref. 7.

La Tabla 3.1 muestra los desplazamientos químicos para los 19 átomos de

carbonos presentes en los modelos de ficocianobilina para las cuatro formas

tautoméricas: DITAM, TIM-A, TIM-D, y DITIM. Cada valor de la GIAO DFT se

compara con el respectivo valor experimental.

53


Figura 3.7. Desplazamientos químicos para 13C-RMN por cálculos GIAO DFT.a) DITAM: Dilactama (anillos A y D); b) TIM-A: Lactima en A, Lactama en D; c) TIM-D: Lactama en A, Lactima en D; d) DITIM: Dilactima (anillos A y D). En Azul: cálculo GIAO B3LYP/6-311+G(2d,p)//B3LYP/6-31G(d) con valores escalados de acuerdo a Ref. 17. En Rojo: cálculo GIAO mPW1PW91/6-311+G(2d,p)//B3LYP/6-31G(d). En Negro: valores experimentales extraídos de Ref. 7.

Para mayor claridad en la presentación de nuestros resultados, los

desplazamientos químicos de la Tabla 3.1 que se consideraron significativos para el

análisis se muestran en la Figura 3.7.

En la Tabla 3.1, al fijar nuestra atención en el carbono C1 que forma el carbonilo

en el anillo A, y comparando el valor teórico de cada tautómero con respecto al valor

de referencia experimental,[7] podemos ver que el par DITAM/TIM-D presenta un valor

de alrdedor de 185 ppm para el caso de la GIAO B3LYP sin corregir, mientras que el

par DITIM/TIM-A presenta un valor cercano a los 195 ppm, y en comparación con el

valor experimental[7] de 182.9 ppm podemos pensar que la asignación de la forma ceto

en A es la correcta; aunque esta apreciación se vuelve ambigua cuando consideramos

54


los valores corregidos (valores en azul en la Figura 3.7 y en paréntesis en la Tabla 3.1),

ya que en ese caso el par DITAM/TIM-D marca en alrededor de 178 ppm y el par

DITIM/TIM-A marca en alrededor de 185 ppm, quedando el valor de referencia en el

medio de ambos pares. No obstante, los cálculos por GIAO mPW1PW91 nos terminan

confirmando que la asignación correcta para el C1 es ceto, ya que el par DITAM/TIM-D

se encuentra muy cercano al valor experimental (compárese los 182.3 ppm de DITAM

con respecto a los 189.9 ppm del valor de referencia[7]), en tanto el par DITIM/TIM-A

se encuentra desplazado por cerca de 10 ppm.

Análogamente, en el caso del carbono C19, que forma el carbonilo del anillo D,

podemos observar en la Tabla 3.1 y en la Figura 3.7 que, en el caso de los cálculos

GIAO B3LYP, tanto los valores corregidos como los sin corregir se ajustan al valor

experimental en el caso del par en DITAM/TIM-A, y no así para el par DITIM/TIM-D,

que se encuentra desplazado. Además, los valores de 168.7 ppm y 169.6 ppm

calculados por GIAO mPW9PW91 para DITAM y TIM-A, respectivamente,

concuerdan con los 169.1 ppm de la referencia experimental,[7] en tanto el par

DITIM/TIM-D se ve desplazado por alrededor de 10 ppm. En consecuencia, estos

resultados nos indican que el anillo D se encuentra como tautómero lactama.

De lo anterior, confirmamos que los espectros 13C-RMN obtenidos por el grupo

de Matysik[7] para la forma Pfr de ficocianobilina efectivamente corresponden a una

estructura dilactama, con ambos carbonilos en su forma ceto. Este resultado parece

contradecir nuestra hipótesis acerca de la formación del tautómero lactima en A

(modelo TIM-A) durante la interconversión del fitocromo de Pr a Pfr. Incluso, la

revisión reciente que hizo Gärtner[8] sobre estructuras del cromóforo en fitocromo

también discute sobre aquello, señalando que la participación de una tautomería en la

fotoconversión se puede descartar, ya que es un mecanismo incompatible con los

espectros 13C-RMN para la forma Pfr (referencia experimental de la Tabla 3.1). Sin

55


embargo, nuestra posición al respecto es que el argumento de la incompatibilidad de los

espectros RMN con una tautomería es discutible, ya que se sabe que la tautomería es un

mecanismo dependiente de las condiciones experimentales. En un medio polar, por

ejemplo, se favorece la forma lactama, y lo contrario sucede en un medio apolar, donde

se favorece la forma lactima.[2] También se ha obsevado que en fase sólida se favorece el

tautómero lactama[24-27] y, por lo tanto, es común encontrar ese tautómero en las

estructuras cristalográficas; y, precisamente, esa podría ser la situación para el

fitocromo, donde las bilinas en los cristales se encontrarían como tautómeros lactama.

Pero el argumento que consideramos de mayor utilidad en favor de nuestra hipótesis de

tautomería es que los estudios experimentales a los que hemos hecho referencia[7] en

esta sección (referencia experimental en Tabla 3.1 y en Figura 3.7) corresponden a

resultados obtenidos con espectroscopia RMN en fase sólida,[7;8] lo que explicaría la

presencia de una estructura dilactama (modelo DITAM), con sus dos carbonilos en la

forma ceto. Por lo tanto, en virtud de nuestros espectros TDDFT de absorción, la

barrera de energía para la formación del estado de transición TS-1wc, y la comparación

de la estructura de TS-1wc con respecto a las estructuras cristalográficas de Pr y

Pfr,[9;21] podemos concluir que nuestra hipótesis de tautomería es válida, asumiendo que

los espectros de 13C-RMN de la Ref. 7 fueron condicionados experimentalmente al

realizarse en fase sólida.

56


3.6 Referencias

[1.] J. A. Kereselidze, T. Sh. Zarqua, T. J. Kikalishvili, E. J. Churgulia, M. C. Makaridze, Russ.

Chem. Rev. 2002, 71, 993-2002.

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57


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Nanayakkara, M. Challacombe, P. M. W. Gill, B. Johnson, W. Chen, M. W. Wong, C.

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[19.] B. Borucki, D. v. Stetten, S. Seibeck, T. Lamparter, N. Michael, M. A. Mroginski, H. Otto, D.

H. Murgida, M. P. Heyn, P. Hildebrandt, J. Biol. Chem. 2005, 280, 34358-34364.

[20.] X. Yang, E. A. Stojkovic, J. Kuk, K. Moffat, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104, 12571-

12576.



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[23.] L. O. Essen, J. Mailliet, J. Hughes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 14709-14714.

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[26.] U. Ohms, H. Guth, E. Heller, H. Dannöhl, A. Schweig, Z. Kristallogr. 1984, 169, 185–200.

[27.] J. Almlöf, A. Kvick, I. Olovsson, Acta Crystallogr. B 1971, 27, 1201–1208.

58

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES

CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES

1. Los espectros teóricos de absorción calculados en el contexto de la teoría

del funcional de la densidad dependiente del tiempo sugieren que la

ficocianobilina presente en el fitocromo Cph1 de cianobacteria adopta

una estructura semicíclica ZZZssa.

2. Los espectros teóricos de absorción calculados en el contexto de la teoría

del funcional de la densidad dependiente del tiempo sugieren que la

fitocromobilina presente en el fitocromo A de planta adopta una

estructura semicíclica ZZZssa.

3. En el contexto de la TDDFT, el índice Q/S y el isomerismo

conformacional se encuentran relacionados: valores menores de Q/S para

la estructura helicoidal cíclica ZZZsss, valores medios de Q/S para la

estructura semicíclica ZZZssa, y valores mayores de Q/S para la

estructura extendida ZZZasa. Proponemos un modelo teórico para el

comportamiento general de Q/S en bilinas: F = FS + FQ.

59

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES

4. Los tautómeros lactima de biliverdina inducen un desplazamiento

batocrómico en forma dependiente del anillo pirrólico. La tautomería en

el anillo A induce un desplazamiento batocrómico con 20 nm adicionales

por sobre la tautomería en el anillo D, y reproduce cuantitativamente el

valor experimental de la forma Pfr de bacteriofitocromo. Estos

resultados sugieren que en la interconversión de Pr a Pfr ocurre una

tautomería lactama-lactima en el anillo A de la biliverdina.

5. Los estados de transición para el mecanismo intramolecular de

tautomería lactama-lactima en los anillos A y D muestran que la

tautomería se encuentra favorecida energéticamente para el anillo A, pero

las altas barreras de energía asociadas descartan la posibilidad

de un mecanismo intramolecular. Por otro lado, el estado de transición

para el mecanismo de tautomería catalizado por agua tiene una barrera de

energía de 19 kcal/mol, por lo tanto, la tautomería lactama-lactima es

viable con este mecanismo.

6. Los cálculos RMN corroboran que, en los espectros 13C-RMN del grupo

de Matysik, la estructura de la ficocianobilina en la forma Pfr de

fitocromo es dilactama, lo que sugiere que en la interconversión de Pr a

Pfr no ocurre tautomería lactama-lactima. Sin embargo, los experimentos

de referencia se realizaron en estado sólido, donde se favorece la

presencia del tautómero lactama, por lo tanto, una tautomería lactama-

lactima no se puede descartar en el sistema real.

60

__________________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

Marco Teórico __________________________________________________________________________________________________________________________

61

APÉNDICE A. MARCO TEÓRICO

A.1 Teoría del Funcional de la Densidad Dependiente del Tiempo

La teoría del funcional de la densidad dependiente del tiempo (TDDFT),

formulada a partir de los teoremas de Runge-Gross[1] y sus extensiones,[2;3] utiliza las

ecuaciones de Kohn-Sham dependientes del tiempo,[3-6]

i∂

∂ tir ,t = FKS

r ,t i r ,t (1)

Además, la densidad dependiente del tiempo (r,t) se encuentra definida como

r , t =∑i

nocc

∣i r , t ∣² (2)

En las ecuaciones (1) y (2), (r,t) representa los orbitales moleculares ocupados

dependientes del tiempo y FKS(r,t) es el operador Kohn-Sham dependiente del tiempo.

Existen dos formas de aplicar la TDDFT:

(1) Método de Yabana o TDDFT en tiempo real

(2) Método de Casida o TDDFT de respuesta lineal

En el método de Yabana, la función de onda Kohn-Sham tiempo-dependiente se

propaga en el tiempo.[7;8] En el método de Casida, se analiza la respuesta lineal de las

ecuaciones Kohn-Sham dependientes del tiempo cuando se perturban con un campo

eléctrico externo.[4] En el trabajo de esta tésis se utilizó la TDDFT según el método de

Casida, cuyo formalismo se explica a continuación.

62


La idea central del método de Casida es aplicar la teoría de perturbación

dependiente del tiempo a primer orden para así describir la respuesta lineal dependiente

del tiempo de la densidad frente a un campo electrico oscilante tiempo-dependiente.

Antes de perturbar el sistema con el campo eléctrico, se asume que el sistema molecular

se encuentra en su estado electrónico fundamental, por lo que se cumple la ecuación

Kohn-Sham para el estado fundamental,

FKS ,0r 0KS=E0

KS0KS (3)

con densidad electrónica igual a

0r =∑

i

nocc

∣ir ∣² (4)

donde FKS,0(r) es el operador Kohn-Sham independiente del tiempo, Φ0KS es el

determinante de Slater Kohn-Sham del estado fundamental, (r) son los orbitales Kohn-

Sham ocupados, y E0KS es la energía total para el estado fundamental.

Al aplicar un campo eléctrico oscilante tiempo-dependiente,

Et =fei t f ∗ e−it (5)

se produce un cambio en los orbitales Kohn-Sham, en la densidad electrónica, y en el

operador Kohn-Sham.

63


Dado que la aplicación del campo externo puede considerarse como una

pequeña perturbación del sistema, la nueva densidad incluye una perturbación de primer

orden,

r , t =0r r , t (6)

y así el operador Kohn-Sham dependiente queda definido como

FKS r ,t = FKS ,0r [ FKS ,0

r ] t=t 0

r , t Et (7)

dónde el segundo término de la derecha corresponde al cambio lineal del operador

Kohn-Sham del estado fundamental FKS,0 al momento de activar la perturbación.

Por otro lado, tenemos que la energía del estado singulete más bajo es

Esing=2 ESsing−ES

trip (8)

Esing=2 ⟨Ssing∣ FKS ∣S

sing⟩ − ⟨Strip∣ FKS ∣S

trip⟩ (9)

por lo tanto, al sustituir las ecuaciones (6) y (7) en la ecuación (9); el posterior análisis

de las restricciones de ortogonalidad; y luego de la transformación de Fourier al espacio

de energía; se obtiene la ecuación de Casida para la TDDFT, [4;5;9;10] con la que se llega a

las energías de excitación y vectores de transición a través de una ecuación de

autovalores. En notación matricial, las ecuación de Casida es

A BB∗ A∗ X

Y = 1 00 −1X

Y (10)

64


Los elementos de la matriz A y B en la ecuación (10) corresponden a

funcionales híbridos de correlación-intercambio,

Aia , jb = ijaba−i ja | ib−CHF ji |ab1−CHF ja | f xc | ib (11)

B ia, jb = ja |bi −CHF jb | ai1−CHF ja | f xc |bi (12)

La ecuación de Casida (10) es una ecuación de autovalores no hermítica, cuya

solución entrega las energías de excitación y los vectores de transición |XY> que

determinan el cambio a primer orden de la densidad electrónica y, por lo tanto,

determinan también la función de onda del estado excitado.

Aun cuando el kernel de correlación-intercambio xc, en las ecuaciones (11) y

(12), es formalmente dependiente de la energía, en la práctica se utilizan funcionales de

correlación-intercambio del estado fundamental (tales como SVWN,[11;12] BLYP,[13;14]

PBE,[15;16] o B3LYP[17]) para evaluar tales términos, lo que es consecuencia de la

aplicación de la aproximación de densidad local adiabática (ALDA),

f xc ,r , r ' = f xcr r−r ' (13)

A.2 Modelo de Continuo Polarizable

En general, un modelo continuo se define como un modelo en el cual los grados

de libertad de las partículas constituyentes se describen mediante un continuo,

usualmente a través de una función de distribución.

En el caso particular del modelo de continuo polarizable (PCM), el solvente se

representa como un dieléctrico continuo infinito, mientras que el soluto se localiza en

65


una cavidad molecular que se genera con esferas entrelazadas localizadas alrededor de

cada átomo del soluto, de manera de poder conservar la forma real de la molécula.[18]

En la interacción eletrostática soluto-solvente, la distribución de carga M del

soluto, dentro de la cavidad, polariza el dieléctrico continuo, el que luego polariza la

distribución de carga del soluto. Esta manera de tratar la interacción electrostática

corresponde a un proceso autoconsistente, el cual se resuelve numéricamente en forma

iterativa.[18]

El potencial de reacción del solvente se define como el potencial de interacción

para modelos continuos, donde el soluto se modela como un dipolo puntual polarizable,

mientras que la interacción electrostática entre un medio polarizable y un dipolo se

expresa en términos de un campo electrostático, el cual tiene su origen en la

polarización del dieléctrico.[18;19] Sin embargo, el modelo básico requiere la solución de

un problema electrostático clásico: el problema de Poisson. Para tratar este problema, es

necesario definir las condiciones de la superficie de la cavidad ,

[V ] = 0 en (14)

[∂V ] = 0 en (15)

La primera condición (14) expresa la continuidad del potencial en la superficie,

donde también se cumple que

[V ] = V i n − V out = 0 (16)

66


La segunda condición (15) involucra la discontinuidad del componente del

campo que es perpendicular a la superficie de la cavidad. Si consideramos una cavidad

con una constante dieléctrica igual a 1 tenemos que

[∂V ] = ∂V∂n

i n

− ∂V∂n

out

= 0 (17)

donde n corresponde al vector que apunta al exterior que es perpendicular a la superficie

de la cavidad.

En el modelo de continuo polarizable se utiliza un método de carga aparente de

superfice denominado método ASC (Aparent Surface Charge), en el cual, a partir de la

condición (17), se deriva una carga aparente de superficie (s), donde s es la variable de

posición en la superficie .[18;20]

El método ASC define un potencial sobre todo el sistema,

V r = ∫

ss

∣r−s∣d2 s (18)

Al considerar que la fuente del potencial de reacción proviene de una

distribución de carga limitada a una superficie cerrada, se simplifica considerablemente

el problema electrostático en comparación con otras formulaciones en las cuales el

medio dieléctrico completo se toma como la fuente del potencial de reacción.

Debido al gran costo computacional que se requiere para la resolución de la

integral de la ecuación (18), la superficie de cavidad se aproxima en términos de

elementos finitos denominados tesserae, que se hacen lo suficientemente pequeños para

considerar (s) prácticamente como una constante dentro de cada tessera.[18] Al

67


describir (s) en forma discreta, es posible definir un set de cargas puntuales, qk, en

términos del valor local de (s) de cada tessera por el área correspondiente, Ak. Por lo

tanto,

V r ∝ ∑k

ssk Ak

∣r−sk∣= ∑

k

qk

∣r−s k∣(19)

Luego, el vector de polarización lo entrega el gradiente del potencial total V(r),

Pir = −i−1

4∇ V r (20)

donde i es la constante dieléctrica de la región i. Además, en la frontera entre dos

regiones i y j, existe una distribución ASC definida como

ij = − P j − Pi⋅nij (21)

donde nij es el vector unitario de la superficie fronteriza que apunta desde el medio i al

medio j.

La definición básica del modelo PCM se deriva de la ecuación (20), tomando en

consideración que el caso más básico es cuando i = 1 y j = 1, lo que nos permite

calcular el gradiente sobre la parte interna de la superficie,

s = − 14

∂

∂ nV M V i n (22)

donde VM es el potencial electrostático generado por una distribución de carga M.

68


A.3 Cálculo del Apantallamiento RMN por el Método GIAO

Como punto de partida se utiliza la aproximación de Hartree-Fock, en la cual la

función del estado fundamental se construye con un determinante de Slater,

0 = N !−1/2∥1 1... j j ...N /2 N /2∥ (23)

Comúnmente, los orbitales moleculares se representan como una combinación

lineal de orbitales atómicos al utilizar la aproximación MO-LCAO,

j =∑

C j (24)

Además, sabemos que la matriz de densidad de una molécula de capa cerrada se

define como

D = 2∑i=1

N /2

Ci∗Ci (25)

La primera derivada de la matriz de densidad con respecto al campo magnético

aplicado, ∂D /∂B0 , se puede obtener a partir de la resolución de las ecuaciones

Hartree-Fock con pertubación acoplada (coupled-perturbed Hartree-Fock o CPHF) en

las cuales la pertubación generada por el campo magnético externo, 12

B0 × r iA−R0, se

incluye en el operador de Fock.[21]

69


El campo magnético externo es independiente del origen de gauge R0, y se

puede demostrar que el tensor de apantallamiento también es independiente de la

elección de R0, es decir,

AR0 − A

0 = 0 (26)

para cualquier valor de R0.[22] La ecuación (26) se cumple solamente si se satisface la

relación de completitud y si las funciones de onda se obtienen variacionalmente. Esta

última condición, en la práctica, se puede satisfacer fácilmente; sin embargo, la primera

condición, al requerir el uso de un set completo de bases, no se puede satisfacer. Por lo

tanto, en la práctica, existe cierta dependencia respecto a la elección del origen de

gauge R0, la que debe ser eliminada por algún método. Uno de estos métodos

corresponde a la aproximación por GIAO (Gauge-Including Atomic Orbitals).[22;23] En el

método GIAO se trabaja con funciones de base complejas que dependen del campo

magnético externo B0,

GIAO

B0 = e−iB0×R −R 0⋅r /2c (27)

las cuales se utilizan en la aproximación MO-LCAO de la ecuación (24). En la ecuación

(27), es un orbital atómico real independiente del campo que se encuentra centrado

en la posición R. Las funciones GIAO tienen la propiedad de cambiar el origen R0 por

R cuando interactúan con el operador de momento, por lo que son muy convenientes

para el cálculo de apantallamiento. Por lo tanto, el uso de GIAOs en el cálculo de los

elementos de matriz para el Hamiltoniano molecular conduce a la cancelación de la

dependecia con en el origen de gauge R0.[22]

70


A.4 Referencias

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71

__________________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

Tablas Suplementarias __________________________________________________________________________________________________________________________

72

APÉNDICE B. TABLAS SUPLEMENTARIAS

B.1 Tablas Suplementarias del Capítulo II

Tabla B.1. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la Figura 2.4-a.

Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb

S1 1,74 712 1,4303 33 H →LS2 2,34 531 0,0136 28 H-1→ L

21 H → L+1S3 2,55 486 0,0105 42 H-3 → L

S4 2,70 459 0,0462 39 H-2 → L

S5 2,93 423 0,5543 13 H → L+111 H-1 → L6 H-4 → L

S6 3,11 398 0,0995 39 H-4 → L

5 H-5 → L

S7 3,28 378 0,1577 27 H → L+2

15 H-5 → L

S8 3,38 367 0,0024 19 H-5 → L

17 H-1 → L+1

8 H → L+1

___________F8 = Σf = 2,3

a Los valores pueden ser mayores a 1 debido a que los cálculos no descuentan el valor asociado a la emisión.b H: HOMO; L: LUMO

73


Tabla B.2. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la Figura 2.4-b.


S1 1,88 661 1,2904 32 H →LS2 2,49 498 0,0078 27 H-2→ L

14 H-1 → L5 H → L+1

S3 2,56 485 0,0134 20 H → L+1

15 H-2 → L

12 H-1 → L

S4 3,08 402 0,0017 45 H-4 → L

S5 3,10 400 0,0002 49 H-3 → LS6 3,15 394 0,6238 16 H → L+1

15 H-1 → L

S7 3,57 347 0,0033 35 H-5 → L

8 H-1 → L+1

S8 3,77 329 0,0738 34 H-6 → L

11 H-1 → L+1

___________F8 = Σf = 2,0


74


Tabla B.3. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la Figura 2.4-c.


S1 2,02 614 1,5852 35 H →LS2 2,30 539 0,0068 33 H-2→ L

9 H-1 → LS3 2,67 465 0,0682 27 H-1 → L

13 H → L+1

7 H-2 → L

S4 2,81 441 0,0002 49 H-3 → L

S5 3,11 398 0,0016 43 H-4 → LS6 3,22 385 0,2576 26 H → L+1

5 H-6 → L

S7 3,30 376 0,0101 5 H-1 → L

42 H-5 → L

S8 3,42 362 0,0005 24 H-6 → L

16 H-7 → L

___________F8 = Σf = 1,9


75



Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,77 701 0,4354 36 H →L π,π*S2 2,55 486 0,0085 29 H-1→ L π,π*

21 H → L+1 π,π*S3 2,97 418 0,1826 33 H-2 → L π,π*

7 H → L+1 π,π*

S4 3,23 384 1,0594 13 H → L+1 π,π*

11 H-2 → L π,π*

8 H-1 → L π,π*

S5 3,34 372 0,0036 28 H-3 → L π,π*13 H-5 → L nO,π*

S6 3,47 358 0,0450 15 H-3 → L π,π*

13 H-5 → L nO,π*

12 H-4 → L π,π*

5 H → L+2 π,π*

S7 3,54 0 0,1711 16 H-5 → L nO,π*

15 H-4 → L π,π*

5 H → L+2 π,π*

S8 3,57 347 0,1483 23 H → L+2 π,π*

8 H-6 → L π,π*

6 H-4 → L π,π*

5 H-1 → L+1 π,π*

___________F8 = Σf = 2,1


76



Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,87 664 1,3611 33 H →L π,π*S2 2,48 500 0,0128 30 H-1→ L π,π*

19 H → L+1 π,π*S3 2,59 478 0,0051 42 H-3 → L nO,π*

S4 2,80 444 0,0356 34 H-2 → L π,π*

S5 3,06 405 0,0021 49 H-4 → L nO,π*S6 3,13 396 0,6294 10 H-2 → L π,π*

10 H-1 → L π,π*

14 H → L+1 π,π*

S7 3,54 351 0,0042 32 H-5 → L π,π*

S8 3,73 333 0,0568 13 H-6 → L π,π*

24 H-1 → L+1 π,π*

___________F8 = Σf = 2,1


77



Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,77 700 1,0417 30 H →L π,π*S2 1,93 642 0,2391 23 H-2→ L nO,π*

13 H-1 → L π,π*S3 2,28 545 0,1538 25 H-1 → L π,π*

13 H-2 → L nO,π*

7 H → L+3 π,π*

S4 2,49 499 0,0085 31 H-3 → L π,π*

15 H → L+1 π,π*

S5 2,85 434 0,0031 48 H-4 → L nO,π*S6 2,98 416 0,3111 12 H → L+1 π,π*

8 H-1 → L+1 π,π*

6 H-3 → L π,π*

6 H-2 → L nO,π*

5 H-2 → L+1 nO,π*

S7 3,08 402 0,2100 18 H-1 → L+1 π,π*

12 H-2 → L+1 nO,π*

5 H → L+1 π,π*

S8 3,27 379 0,0352 22 H-2 → L+1 nO,π*

16 H-1 → L+1 π,π*

___________F8 = Σf = 2,0


78


Tabla B.7. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la Figura 2.6-d.

Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,94 640 1,6693 35 H →L π,π*S2 2,26 549 0,0090 36 H-2→ L nO,π*

7 H-1 → L π,π*S3 2,45 505 0,0421 32 H-1 → L π,π*

6 H → L+1 π,π*

5 H-2 → L nO,π*

S4 2,74 453 0,0028 48 H-3 → L nO,π*

S5 2,75 451 0,0348 33 H-4 → L π,π*12 H → L+1 π,π*

S6 3,11 398 0,3042 23 H → L+1 π,π*

7 H-4 → L π,π*

S7 3,33 373 0,0056 46 H-5 → L π,π*

S8 3,45 360 0,0059 18 H-6 → L π,π*

16 H-7 → L π,π*

10 H-1 → L+1 π,π*

___________F8 = Σf = 2,1


79


B.2 Tablas Suplementarias del Capítulo III


Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,69 735 1,0462 34 H → L π,π*S2 2,13 582 0,0162 30 H-1 → L π,π*

20 H → L+1 π,π*S3 2,48 501 0,0381 34 H-2 → L π,π*

7 H → L+1 π,π*

S4 2,72 456 0,2306 23 H-3 → L nO,π*

7 H → L+1 π,π*

S5 2,81 442 0,3665 17 H-3 → L nO,π*6 H → L+1 π,π*6 H-2 → L π,π*5 H-1 → L π,π*

S6 2,99 414 0,1819 32 H → L+2 π,π*

8 H-1 → L+1 π,π*

S7 3,12 398 0,0453 23 H-1 → L+1 π,π*

16 H-4 → L π,π*

S8 3,31 375 0,0058 30 H-2 → L+1 π,π*

13 H-4 → L π,π*

___________F8 = Σf = 1,9


80



Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,66 747 0,9888 34 H → L π,π*S2 2,09 595 0,0016 27 H-1 → L π,π*

24 H → L+1 π,π*S3 2,52 493 0,1256 29 H-2 → L π,π*

7 H → L+1 π,π*

6 H-1 → L π,π*

S4 2,71 457 0,4983 13 H-2 → L π,π*

9 H → L+1 π,π*

7 H-1 → L π,π*

S5 2,83 439 0,0223 32 H-3 → L nO,π*6 H → L+2 π,π*

S6 2,92 424 0,2859 27 H → L+2 π,π*

6 H-1 → L+1 π,π*

S7 3,07 404 0,0400 21 H-1 → L+1 π,π*

19 H-4 → L π,π*

S8 3,31 375 0,0121 30 H-2 → L+1 π,π*

9 H-4 → L π,π*

___________F8 = Σf = 2,0


81



Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,59 779 0,0454 41 H-1 → L π,π*S2 1,70 730 0,9848 33 H → L π,π*S3 2,17 571 0,0174 28 H-2 → L π,π*

22 H → L+1 π,π*

S4 2,49 497 0,0086 44 H-1 → L+1 π,π*

S5 2,74 452 0,0350 39 H-3 → L nN,π*S6 2,77 448 0,6420 17 H → L+1 π,π*

12 H-2 → L π,π*

S7 3,02 411 0,0286 36 H → L+2 π,π*

8 H-4 → L π,π*

S8 3,14 395 0,0634 24 H-4 → L π,π*

20 H-2 → L+1 π,π*

___________F8 = Σf = 1,8


82


Tabla B.11. Tabla suplementaria del espectro TDDFT de la Figura 3.2-d.

Estado ΔE (eV) ΔE (nm) f a Peso Configuraciónb AsignaciónS1 1,60 774 0,2690 30 H-1 → L π,π*

11 H → L π,π*S2 1,67 0 0,7052 24 H → L π,π*

13 H-1 → L π,π*S3 2,12 584 0,0030 25 H → L+1 π,π*

25 H-2 → L π,π*

S4 2,50 497 0,0068 44 H-1 → L+1 π,π*

S5 2,71 457 0,7585 16 H → L+1 π,π*15 H-2 → L π,π*

S6 2,81 441 0,0043 24 H-4 → L nN,π*

19 H-3 → L nN,π*

S7 2,97 418 0,0487 35 H → L+2 π,π*

5 H-4 → L nN,π*

S8 3,05 406 0,0632 19 H-2 → L+1 π,π*

15 H-3 → L nN,π*

11 H-4 → L nN,π*

___________F8 = Σf = 1,9


83

__________________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE C

Publicaciones y Presentaciones Asociadas __________________________________________________________________________________________________________________________

84

The Chromophore Structure of the Cyanobacterial Phytochrome Cph1 As Predicted byTime-Dependent Density Functional Theory

Ricardo A. Matute and Renato ContrerasDepartamento de Química, Facultad de Ciencias, UniVersidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile

Guillermo Perez-Hernandez and Leticia Gonzalez*Institut fur Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-UniVersitat Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena, Germany

ReceiVed: August 20, 2008; ReVised Manuscript ReceiVed: September 25, 2008

The UV-vis absorption spectra of the photoreceptor chromophores biliverdin (BV) in the ZZZssa conformationand the phycocyanobilin (PCB) with conformations ZZZssa and ZZZasa have been investigated by means oftime-dependent density functional theory (TD-DFT) with a polarized continuum model. The three systemsare studied in different conditions to include protonation, solvation- and protein-environmental effects on gasphase and available X-ray structures. The crystal structures of BV in bacteriophytochrome of Deinococcusradiodurans and PCB in C-Phycocyanin serve to calibrate the performance of the TD-DFT method and allowestimating the spectral shifts created when gas phase structures instead of a proper environment are used. Incontrast, the structure of PCB in the cyanobacterial phytochrome Cph1 is unknown. The excellent agreementof the theoretical spectrum with experimentally recorded data for the PCB in the cyanobacterial phytochromeCph1 strongly supports a semicyclic ZZZssa structure, similar to that found for the BV chromophore.

Phytochromes are a family of photoreceptors present in allflowering plants (Phy family) and cryptophytes, but also incyanobacteria (phytochromes Cph1 and Cph2), nonoxygenicbacteria (bacteriophytochromes or BphPs), and even fungi(fungal phytochromes or Fphs). Each photoreceptor has achromophore whose function depends on the nature of thephytochrome. In most plant phytochromes the chromophore isthe phytochromobilin (PΦB), while phycocyanobilin (PCB) isin general related to cyanobacteria and biliverdin (BV) tononoxygenic bacteria.1 All these chromophores are bilins andshow a covalently linked open-chain tetrapyrrole (see Figure1), which is structurally related with the macrocyclic tetrapyrrolestructures of the well-known porphyrins. As such, they show asimilar absorption spectrum, governed by the so-called Soretand Q bands.2 In the visible absorption spectra of porphyrinsthe intense absorption band located between 350 and 450 nmis known as the Soret band and the typically weak absorptionbands between 450 and 700 nm are called Q bands.3,4 Likewise,bilins show a Soret band in the visible absorption region butonly one Q-band. The chromophore of plant phytochromescontrols many photomorphogenic processes regulating themetabolic response of the organism to its light environment.Upon light irradiation, phytochromes can switch from theinactive Pr, red-absorbing (R) form with a Q-band peakingaround 666 nm, to the active Pfr, far-red (FR) absorbing formwith a peak around 730 nm.5 This interconversion is lightreversible and it is well known6 that the difference between Pr

and Pfr involves a Z-E photoisomerization at the double bondC15dC16, (see Figure 1).

While numerous spectra have been available for phyto-chromes for several decades, crystal structures are rather scarce.Only a few proteins have been resolved in the last several years,namely, the one corresponding to the chromophore-bindingdomain of the bacterial phytochrome of Deinococcus radiodu-rans (DrBphP) with a BV chromophore in the Pr state7,8 andthe chromophore-binding domain of an unusual bacterialphytochrome RpBphP3 from Rhodompseudomonas palustris,also with a BV chromophore.9 In the X-ray structure of DrBphP,the Pr form of BV adopts a semicyclic ZZZssa (C5-Z, C10-Z,C15-Z, C5-syn, C10-syn, C15-anti) conformation (see Figure 1)and is covalently attached to a cysteine residue near theN-terminal domain by a thioether bond.7 Unfortunately, thecrystal structure of the cyanobacterial phytochrome has not yetbeen obtained. Thus, very often theoretical calculations ormechanistic studies on phytochromes are done using the PCBchromophore of the C-phycocyanin (C-PC), which is a light-harvesting pigment present in photosynthetic cyanobacteria forwhich the crystal structure was resolved long ago.10 In contrastto the semicyclic structure of BV, PCB in C-PC shows anextended ZZZasa conformation.

Nowadays, there is no consensus about the paramountquestion of chromophore conformation in cyanobacterial andplant phytochromes.1,11,12 On one hand, a ZZZssa structure, asin the BV chromophore of DrBphP, is put forward for the Pr

forms of PCB and PΦB with arguments such as the highsequence identity between bacterial, cyanobacterial, and plantphytochromes.1,11 Furthermore, two-dimensional nuclear Over-hauser effect13 as well as 15N NMR spectroscopy14 experimentsare consistent with a ZZZssa conformation for cyanobacterialphytochrome Cph1. On the other hand, theoretical and experi-mental resonance Raman (RR) spectra suggest a ZZZasa

* To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected].

16253

10.1021/jp807471e CCC: $40.75 2008 American Chemical Society

Published on Web 11/20/2008

2008, 112, 16253–16256

structure.12,15,16 In the present study, we shed light on thisconformational controversy through quantum chemical calcula-tions on PCB in Cph1. First, we investigate the UV-visabsorption spectra of the chromophores BV in BphP and PCBin C-PC for which three-dimensional structures are available.Then we use different models to probe the spectra of PCB inCph1, and we discuss the structure which would be consistentwith the available experimental data.

The calculations are done on the three structures shown inFigure 1. As template the crystal structure of the bacteriophy-tochrome chromophore binding domain at 1.45 Å resolution(PDB: 2O9C) is used for the BV and PCB chromophores inthe ZZZssa conformation,7 while the X-ray structure at 1.45 Åresolution of the R-84 subunit of C-PC from the thermophiliccyanobacterium Synechococcus elongatus (PDB: 1JBO) is usedfor PCB in the ZZZasa conformation.17 The hydrogen atomsare added according to the molecular arrangement of BV andPCB after the assembly with the apoprotein (see Figure 2 andlater in text). In all cases the cysteine linkage was replaced withhydrogen. The propionic-acid sidechains on the rings B and C(cf. Figure 1) are not included because they are not part of theconjugated system of the chromophore and as such they do notaffect the excitations energies (data not shown), which is inagreement with previous studies.18 For each system, four modelsof different complexity have been considered to account forprotonation, solvation, and protein surroundings. Model I is the

unprotonated chromphore in vacuo. Model II is the protonatedform also in vacuo. Model III and IV are protonated formssimulated in water and in a protein environment, respectively. Thespectra is calculated not only on X-ray structures, but also onchromophores previously optimized using density functional theoryDFT with the B3LYP/6-31G(d) protocol,19 as implemented in theGaussian03 set of programs.20 A calculation of the Hessian ensuredthat the obtained geometries are true minima, which can be foundin the Supporting Information. Vertical excited states and corre-sponding oscillator strengths are obtained using the time-depend-ent21 version of B3LYP/6-31G(d) over eight roots. The so-obtainedspectra are then convoluted with Gaussian functions with fullwidths of 4000 cm-1 at half-maximum using the GaussSum 2.1program.22 The environment is modeled with the polarizablecontinuum model (PCM).23 A dielectric constant of ε ) 78.4 isused for water, and ε ) 4.0 is used to represent the surroundingprotein moiety, as first suggested by Blomberg et al.24 and lateron by others.25-27

Experimentally, the absorption spectra of BV in BphP,8,28 PCBin Cph1,29 and PCB in C-PC10 show a UV Soret band centered inall cases at 380 nm and a Q-band around 700 nm. Since the exactposition of the Q-band depends on the specific chromophore andprotein, the accuracy describing this part of the spectrum will beused as a criterion to discern a semicyclic (ssa) from a extended(asa) conformation of the unknown PCB phytochrome in Cph1.Table 1 collects the experimental absorption Q peaks recorded forthe plant (oat) and cyanobacteria chromophores, as well as thecalculated values for the Models I-IV in both the X-ray and DFToptimized structures. Other theoretical values from the literatureare also compiled in Table 1.

First we compare the absorption peaks calculated on therelaxed and on the X-ray geometries with each other. We cansee that the Q bands are rather different, giving account of thesteric constraints imposed by the protein moiety. Specificobserved changes are that the optimized structures are moreclosed (or cyclic) than the X-ray ones and the rings A, B, andC show deviations from planarity. As a consequence, everyrelaxed structure, regardless of the conditions I-IV, exhibits amarkedly blue shift with respect to the crystal structure and the

Figure 1. Protonated biliverdin (BV) and phycocyanin (PCB) chromophores with conformations as indicated. Propionic side chains in rings B andC are not considered.

Figure 2. Possible conformations which can be considered for thering A of the chromophores BV (a and b) and PCB (c and d). In panelsa and c, the chromophores are assembled to the apoprotein, while inpanels b an d they are not.

TABLE 1: TD-B3LYP/6-31G(d) Q-bands (in nm) Contributing to the UV-Vis Absorption Spectra of the Chromophores BVand PCB Calculated on X-ray Structures and DFT Optimized Ones in Different Conformations in Different Environments;Experimental and Other DFT Values Are Given for Comparison

model I(unprotonated/in vacuo)

model II(protonated/in vacuo)

model III(protonated/water)

model IV(protonated/protein)

experimental

BV-ssa X-ray 648 662 708 712 702 (BV in BphP)a

DFT 588 643 659 665PCB-ssa X-ray 603 620 659 661 659 (PCB in Cph1)b

DFT 526 590 609 613DFT 574d

PCB-asa X-ray 528 590 606 614 618 (PCB in C-PC)c

DFT 508 559 584 588DFT 539e 541d, 582e

a References 8 and 28. b Reference 29. c Reference 10. d Reference 13. e Reference 25.

16254 J. Phys. Chem. B, Vol. 112, No. 51, 2008 Letters

experimental values. The difference between the DFT resultsfrom the literature13,25 and our values is related to the structureof the ring A (Figure 2) adopted in the calculations. This aspectcan be fiddly since the structure of the A ring depends, amongother reasons, on whether the chromophore is assembled or notto the apoprotein. Our calculations for BV follow the most recentX-ray structure resolved in 2007 which undoubtedly revealeda chiral center at the carbon C2 after ligation of the cysteineresidue to the C32 carbon8 (Figure 2a). Caution should beexercised in not considering the unassembled structure (Figure2b), since this contains one double bond more in the conjugatedπ system, which typically results in a red shift of 30 nm.8

Analogously to BV, for PCB we have used the structure shownin Figure 2c. In contrast, the calculations of Wan and co-workers25 adopt the chromophore before the apoprotein is linkedvia the cysteine residue at the C31 carbon (see Figure 2d); thisstructure implies an additional C3dC31 double bond, with theconcomitant red shift of ca. 30 nm (compare 508 and 559 nmwith 539 and 582 nm, respectively, in Table 1). The explanationfor the difference between the Q peaks obtained by van Thor13

et al. and ours is more subtle. They used the appropriateassembled chromophores for BV and PCB (Figure 2a,c,respectively), but a different density functional (MPW1PW91),leading to a blue shift of ca. 15-20 nm with respect to ourB3LYP values (see Table 1).

From all these considerations and our results, we concludethat calculated spectra based on relaxed geometries should betreated with caution, and henceforth we shall only discuss thechanges on the spectra calculated on the crystal models.

Since the crystal structure cannot evidence protonation, it isimportant to evaluate its effect on the absorption spectra. As itcan be seen, upon protonation the three chromophores suffer abathocromic shift; taking this into account, the neutral formshows a larger deviation from the experimental values. Thedifference between the neutral and the protonated forms is about15 nm for the conformation ZZZssa and larger for the ZZZasaconformation with a difference of more than 60 nm. Hence,our calculations support the fact that the chromophores areprotonated in agreement with refs 25 and 30-34.

Aqueous solution induces a variable solvatochromic red shiftin all chromophores. Conspicuously, a similar effect is obtainedin the protein environment. These values come very close tothe experimental ones with an accuracy seldom achieved withTD-DFT. The experimental values of 702 nm for BV-ssa and618 nm for PCB-asa in C-PC are quantitatively reproduced bythe theoretical 708/712 nm and 606/614 nm ones, respectively(see Table 1). We now turn to PCB in Cph1. Since the calculatedpeaks at 659 and 661 nm for water and protein environmentsare in excellent agreement with the experimental Q-bandmeasured at 659 nm and far away from 618 nm, which wouldcorrespond to a ZZZasa conformation, we are left to concludethat PCB in Cph1 must adopt a ZZZssa conformation. It is alsogratifying to realize that our calculations are also consistent witha hypsochromic shift which takes place when going to moreextended conformations (in this case from ssa to asa), as it hasbeen observed with semiempirical AM1 calculations on the PCBsystem.35

To uncover more details of the UV-vis spectra of the threechromophores, we show in Figure 3 the calculated absorption bandsin protein media, which we consider the most accurate ones. As itcan be seen the Soret band comprises several states with differentoscillator strengths. In contrast, the Q-band is described by a singlestate which upon inspection of the contributing orbitals can beattributed to an highest occupied molecular orbital (HOMO)flowest

unoccupied molecular orbital (LUMO) transition in the threechromophores. The strongest peak contributing to the Soret bandis a state with a superposition of HOMO-1fLUMO andHOMOfLUMO+1 excitations. The corresponding orbitals forPCB-ssa are shown in Figure 4; all of them correspond to π,π*orbitals delocalized between the four pyrrole rings.

In conclusion, the calculated spectra suggest that the Pr formof PCB very likely adopts a ZZZssa conformation in thecyanobacterial phytochrome. This conclusion fits into the pictureproposed by Lagarias et al. who analyzed a sequence alignmentof 122 known (or suspected) phytochromes and phytochrome-related proteins finding that (i) all phytochromes exhibitsequence conservation in two of the three domains of the

Figure 3. TD-DFT absorption UV-vis spectra of the protonated BV-ssa (a), PCB-ssa (b), and PCB-asa (c) chromophores modeled in aprotein environment (e ) 4).

Letters J. Phys. Chem. B, Vol. 112, No. 51, 2008 16255

photosensory region, (ii) key residues in the knot between thesetwo domains are also conserved, and (iii) differences in thesequences are not within the secondary structure.1,11 These factsindicate that the architecture of the photosensory core is verylikely to be conserved in all phytochromes, implying then thatthe chromophores should all have the same ZZZssa conforma-tion as found in bacteriophytochromes. This proposal is backedup by the recent 13C- and 15N NMR spectroscopic experimentsof refs 13 and 14 respectively, performed in the cyanobacterialphytochrome Cph1. Moreover, taking into account that in bothplants and cyanobacteria the chromophore links in the sameway to the apoprotein (by a cysteine at the 31 carbon, see Figure1), it is very plausible that the plant phytochrome PΦB alsopresents a ZZZssa conformation. Lagarias and co-workers havegone even further on proposing a photoconversion mechanismwhich involves a semicyclic ssa conformation for the Pfr formtoo, with no net charge transport over the full path.1

Contrary to the appealing idea of a unified ssa conformationfor all the phytochrome species, the RR data of Mroginski etal.15,11 suggest an asa structure for both the Pr and Pfr states, aswell as for the intermediate Lumi-R of the photocycle. However,one should note that these calculations have been done in vacuo,that is, without the protein environment, even when it has beendemonstrated that both the experimental36 and theoretical37 RRspectra are very sensitive to the protein environment. Indeed,the recent hybrid quantum mechanics/molecular mechanics(QM/MM) study on the PCB chromophore explicitly bound tothe R-subunit of C-PC clearly shows significant improvementswith respect to the pure QM calculations of the isolatedchromophore indicating that the comparison of experimentalRR spectra of the protein-bound chromophore with calculatedRR spectra of the isolated cofactor may not always beunambiguous.37

Summarizing, according to our results protonation and theconformational change from asa to ssa induce a bathochromicshift, whereas deprotonation and the isomerization from ssa toasa induce a hypsochromic shift. Most importantly, the excellentagreement between the experimental absorption spectra and theherein calculated one provides additional support that the Cph1phytochrome adopts a ZZZssa conformation as in the bacte-riophytochrome.

Acknowledgment. We thank early discussions with Dr. M.A.Mroginski (TU Berlin) and financial support from the DeutscheForschungsgemeinschaft (GO 1059/2-1) as well as CONICYT(Chile) and DAAD (Germany).

Supporting Information Available: This material is avail-able free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

Note Added in Proof. At the time of processing this article,a ZZZssa confirmation was found in two cyanobacterialchromophores by NMR38 and diffraction39 experiments.

References and Notes

(1) Rockwell, N. C.; Su, Y. S.; Lagarias, J. C. Ann. ReV. Plant Biol.2006, 57, 837.

(2) Gouterman, M. The Porphyrins; Dolphin, D, Ed.; Academic Press:New York, 1978; Vol. III, p 1.

(3) Soret, J. L. C. R. Acad. Sci. 1983, 97, 1267.(4) Weiss, C. J. J. Mol. Spectrosc. 1972, 44, 37.(5) Chai, Y. G.; Singh, B. R.; Song, P. S.; Lee, J.; Robinson, G. W.

Anal. Biochem. 1987, 163, 322.(6) Braslavsky, S. E.; Gartner, W.; Schaffner, K. Plant Cell EnViron.

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JP807471E

Figure 4. Selected molecular orbitals of PCB-ssa involved in theabsorption spectra given in Figure 2b.

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Published on Web Date: February 02, 2010

r 2010 American Chemical Society 796 DOI: 10.1021/jz900432m |J. Phys. Chem. Lett. 2010, 1, 796–801

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Time-Dependent DFT on Phytochrome Chromophores:AWay to the Right ConformerRicardo A. Matute,*,† Renato Contreras,† and Leticia Gonz�alez*,‡

†Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile, and ‡Institut f€urPhysikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universit€at Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena, Germany

ABSTRACT A theoretical approach based on time-dependent density functionaltheory (TDDFT) togetherwith a polarizable continuummodel for incorporating thebulk effect of the surrounding environment is used to estimate the excitationenergies for the phytochromobilin chromophore of plant phytochrome. TheTDDFT results reproduce well the experimental values of the absorption maximaand those of the ratio of the spectroscopic bands (Qbandover the Soret band orQ/Sindex). Our results suggest that the phytochromobilin within the Pr form of thephytochrome holoprotein should adopt a semicyclic ZZZssa structure as it does inbacteria.

SECTION Biophysical Chemistry

P hytochromes are photoreceptors in plants and are alsofound in nonoxygenic bacteria, cyanobacteria, andfungi. In plants, phytochromes regulate photomorpho-

genic responses as germination, de-elotation, shade avoid-ance, phototropism, chloroplast movement, stomatal open-ing, and flowering. The photocycle of the receptor involves aZ/E photoisomerization around a double bond of its phyto-chromobilin (PΦB) chromophore (Figure 1), directing thephotoconversion between a physiological inactive red formcalled Pr to a physiological active far-red form called Pfr.

1

PhytochromeAabsorbs in theUV-visible range, showing twoprominent bands, the Soret band in the blue region and the Qband in the red region.2,3 The Soret band normally absorbsnear the 380 nm, but the Q band is variant and specific foreach chromophore, for example, in the Pr of the plant phyto-chrome, this band has its maximum at around 666 nm.3,4

According to the pioneering work ofWagner et al. showingthe crystallographic structure in proteobacteria,5 the Pr formof the biliverdin (BV) chromophore adopts a ZZZssa confor-mation (C5-Z, C10-Z, C15-Z, C5-syn, C10-syn, C15-anti). In thecase of the cyanobacterial phytochrome, theoretical calcula-tions based on time-dependent density functional theory6

(TDDFT) predicted satisfactorily a ZZZssa structure for itsphycocyanobilin (PCB) chromophore conformation,7 whichwas then confirmed by NMR solution experiments8 andcrystallographic9 structures. However, no X-ray or NMR struc-tural information is available for plant phytochrome, and thus,there is no consensus about which structure is adopted by itsPΦB chromophore in the holoprotein. On the one hand, asemicyclic ZZZssa structure, as in proteobacteria, is supportedby sequence identity;1a,10 on the other hand, a stretchedZZZasa conformation is proposedbasedon resonanceRaman(RR) evidence11-14 (Figure 1), and it has been adopted in themost recent computational studies of the phytochrome sys-tem.15,16 In this Letter, we elucidate which conformer should

be found in plant phytochromes by means of calculating theelectronic absorption spectra of both possible conformations,as well as that of the cyclic solution structure. The apoproteinismostly transparent, not absorbing in the UV-vis, except forsome aromatic residues such as tyrosine and tryptophan,which together generate the so-called protein band at 280nm, that is, at around 100 nm to the UV side with respect theSoret band of the chromophore. Therefore, an efficient pro-cedure consists of treating the chromophore alone with a fullquantumdescription (TDDFT in our case)while the surround-ing environment can be modeled in a much simpler way, forinstance, with continuum models.7 Such an approach is, forexample, suggested in a recent review on the theoreticaldescription of biomolecular spectroscopy by Neugebauer,17

who points out the necessity to keep fixed parts of thechromophore at the crystal structure geometry, that is, con-sidering implicitly the geometry imposed by the surroundingapoprotein. This treatment is a good shortcut to the moredemanding one of sampling the ensemble of structuresbelonging to the conformational space;18 moreover, it ispreferred over the typical relaxation of the chromophore invacuo since the lattermethod converges to a geometry, whichbeing out of the conformations accessed by the system,delivers overestimated excitation energies.7

As a template for PΦB in the semicyclic ZZZssa model, weuse either the X-ray structure of the BV chromophore found inthe Pr form of the bacteriophytochrome ofDeinococcus radio-durans (PDB: 2O9C)19 or the Pr formof the PCB chromophorefound in the cyanobacterial Cph1 phytochrome from thecyanobacterium Synechocystis 6803 (PDB: 2VEA).9 For thestretched ZZZasa model, we use the PCB found in the R-84

Received Date: December 19, 2009Accepted Date: January 28, 2010


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subunit of the X-ray structure of the C-phycocyanin (a light-harvesting antenna system) from the cyanobacteriumSynechoccus elongatus (PDB: 1JBO).20 This latter choice ismotivated by the fact that the C-phycocyanin has the samechromophore but a different function, namely, to capturephotons and transport them very efficiently to the photo-synthetic reaction centers. In order to preserve the crys-tallographic conformations but still allow for some refinementof the bond distances and angles, the former three chromo-phore backbones were also optimized at the B3LYP/6-31G*level of theory,21 keeping the dihedrals frozen. The modelZZZsss for PΦB in solution was constructed by rotatingthe single bond C14-C15 of the ZZZssa (BV template) modeland then optimizing the structure at the B3LYP/6-31G* levelof theory21 in vacuo. A Hessian was calculated to ensurethat a true minimum was found. In all of these models, the

cysteine linkage was replaced with a hydrogen and thepropionic acid side chains on the rings B and C were notconsidered as they are not part of the π-conjugated sys-tem and they have no effect on the calculations.7 The hy-drogens were added and then relaxed together with theethyl and vinyl side chains of the rings A and D, respectively,taking into account the structural differences between theBV, PCB, and PΦB structures (Figure S1 of Supporting Infor-mation (SI)).

The excitation energies and associated oscillator strengthswere calculated for eight states with TD-B3LYP. Since TD-DFTis less basis-set-dependent than post-Hartree-Fock meth-ods,22 a medium size basis set with polarization, 6-31G(d),has been chosen.22 The calculations have been performedwith the Gaussian03 set of programs.23 To mimic the effectof the surrounding environment, we used the polari-zable continuum model (PCM)24 with a dielectric constantof 4.0 for the ZZZssa and ZZZasa models (as previouslysuggested in refs 25 and 26) and with the dielectric constantof water for the ZZZsss model in solution. As reviewed in ref17, continuum models with a proper dielectric constantrepresent the average electrostatic interaction with the apo-protein in a reasonable manner, except for specific interac-tions with surrounding residues, which are not taken intoaccount in this work. The theoretical absorption spectrawere generated by convoluting Gaussian functions using theGaussSum2.127 program and a full width of 4000 cm-1 athalf-maximum.

The obtained TDDFT spectra shown in Figure 2 reproducewell the experimental spectroscopic bands,2,4,19,28-30 withthe Soret band in the blue region and the Q band in the red

Figure 1. Phytochromobilin (PΦB) models for ZZZsss, ZZZssa,and ZZZasa conformers.

Figure 2. TDDFT absorption UV-vis spectra for the phytochromobilin in the conformations PΦB-ZZZsss (a), PΦB-ZZZssa from the BVtemplate (b), PΦB-ZZZssa from the PCB template (c), and PΦB-ZZZasa (d).


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region (Table 1). In all cases, the Q band is mainly composedof a HOMO to LUMO transition, whereas in the Soret band,there are fourmain orbitals involved in the transitions, that is,the HOMO-1, HOMO, LUMO, and LUMOþ1 (see Figure 3and Table S1 of SI). These same four orbitalswere found in theSoret band of the cyanobacterial phytochrome,7 in analogywith the four-orbitalmodel ofGouterman for the Soret band inporphyrins.31

Two spectra are obtained for the semicyclic ZZZssa con-former, depending on the underlying template, either BV(Figure 2b) or PCB (Figure 2c). In the spectrum based onBV, theQ band absorbing at 664 nm is in excellent agreementwith the experimental Q band absorption value of 666 nm. Inthe spectrum based on PCB, the Q band absorbs at 688 nm,that is, it shows a bathochromic shift of 24 nm, which canbe explained by looking at the template structures. The ringD of BV is tilted by 44� over the plane formed by the otherthree pyrrol rings19 (Figure 4A), while in the PCB, it is tiltedonly 26� (Figure 4B).9 The latter arrangement achievesbetter conjugation within the π system, thus lowering theexcitation energy and inducing the concomitant bathochro-mic shift in the spectrum. It has been suggested that the

difference in the torsional angle of the ring D of both crystalscan be explained by the lack of one domain (PHY domain)in the X-ray structure of the phytochrome with BV, whichcould destabilize the ring D in BV.32 Hypothetically, bothpositions of the ringD could be accessed at room temperatureby torsional movement in solution. However, if we assumea different torsion of the ring D between proteobacteriaand cyanobacteria, in view of the better approximation of664 versus 688 nm compared to the experimental value of666 nm, our results would suggest that PΦB adopts a con-formation similar to that of BV in proteobacteria and not likePCB in cyanobacteria. This conclusion is not so clear if oneanalyzes the excitations obtained using partially optimizedgeometries. As seen from the values in parentheses in Table 1,the excitation energies of the constraint geometries for PΦB-ssa (BV template) and PΦB-asa are blue-shifted with respectto those of the unrefined crystal structures. With values of633 and 619 nm, it is not straightforward to assign the Q bandof PΦB to the ssa or asa conformer. Moreover, taking intoaccount that the Q band obtained for the crystal of the ZZZasaconformer (Figure 2d) is blue-shifted only by 24 nm withrespect to that of the ZZZssa structure, a stretched structurecannot be unequivocally discarded.

To get additional information, we shall use the ratio of theoscillator strengths of theQbandover the Soret one, or the so-called Q/S index, to discriminate between both conformers.Q/S indexes have been invoked in the literature for a longtime, first, using semiempirical methods, as in the work ofChae and Song33 andWagni�ere et al.34,35 (see also the reviewby Scheer36), and later experimentally in vitro using synthe-sized adducts of tetrapyrrole locked in different conforma-tions.37,38 Afterward,Q/S indexeswere revisited throughAM1semiempirical studies.39,40 In our calculation of theQ/S ratios,we have also included the cyclic conformer (Figure 2a) be-sides the semicyclic and stretched ones.

Table 1 collects the calculated and experimental2,4,19,28-30

absorptionmaxima togetherwith the experimental33,35,40-42

and TDDFTQ/S ratios. Aswe can see, the calculatedQ/S ratiosreproduce qualitatively the experimental ones, keeping the

Table 1. Calculated TDDFTAbsorption Maxima (in nm) and Q/S Ratiosa

absorption maxima Q/S

model exptl.b TDDFT exptl.c TDDFTd

BV-sss 377, 696,710e 383, 712 0.29f 0.26

PCB-sss 375, 692 368, 675 0.33, 0.43 0.37

PΦB-sss 386, 700 384, 701 0.34

BV-ssa 380, 702 417, 712 2.69g 1.99

PCB-ssa 380, 659 394, 661 1.17 2.28

PΦB-ssa 380, 666 395h (382)h, 664h (633)h, 410i (382)i, 688i (611)i 1.36, 1.45 2.12h (2.02)h, 2.36i (1.90)i

PCB-asa 380, 618 385, 614 4.1 5.26

PΦB-asa 398 (383), 640 (619) 5.27 (4.26)aValues in parentheses correspond to structures refined with a constraint optimization (frozen dihedrals). b Taken from refs 2, 4, 19, and 28-30.

cTaken from refs 33, 35, and 40-42. dDielectric constant ε=4.0 for ssa and asa conformations and ε=78.4 for sss conformation. eQbandmaximumfor the protonated Biverdin dimethyl ester (BVEHþ) in solution corresponding to the helically coiled conformation according to Braslavsky et al.28 fThisvalue is obtained as an average of the oscillator strengths of the two peaks contributing to the Q and S bands, respectively.33 gThis value is likely to beoverestimated since it is obtained42 as the ratio between the heights of the Q and S bands and not the areas below the bands, that is, the oscillatorstrength. hThese values have been obtained using the BV template. i These values have been obtained using the PCB template.

Figure 3. HOMO-1, HOMO, LUMO, and LUMOþ1 orbitals in-volved in the TDDFTabsorption spectrum given in Figure 2b.


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same trend; the lowest Q/S values are found for the cyclicconformers. Moreover, the higher the Q/S value the morestretched the conformer. With this in mind, it is straightfor-ward to assign that the experimental indexes of 1.36 and 1.45found in plant phytochrome35,41 must correspond to theZZZssa conformation since the calculated ratio for ZZZssa(2.12 or 2.02) is closer to experiment than the calculated onefor the ZZZasa conformer (5.27 or 4.26). This fact suggeststhat the PΦB chromophore in plant phyochrome shouldadopt the semicyclic structure ZZZssa and not the stretchedstructure ZZZasa, as predicted by RR spectroscopy and calcu-lations performed on fully relaxed chromophores.11-14 Suchearly studies suggested that the phytochrome chromophorein cyanobacteria and in plants should both have the sameconformation, being this the stretched ZZZasa.13,14 A recentreport claims that only by the explicit consideration ofthe apoprotein environment, which keeps the crystallo-graphic conformation, RR predictions can be reconciledwith the ZZZssa structure found in the crystal of the cyano-bacterial phytochrome.43 Our calculations, especially thosedone in unrelaxed X-ray geometries, are then consistent withthese findings, and most importantly, they consolidate theproposal of Lagarias et al. of a ZZZssa conformation based onsequence alignment studies.1a,10 The TDDFT spectra predictwell the experimental values in phytochrome, even thoughthe expansion with Gaussians has often the inconvenience oflosing the identification of band shoulders. An improvedspectrum can be obtained either by dealing with vibronicstates44 or sampling an ensemble with molecular dynamicsand TDDFT.18

SUPPORTING INFORMATION AVAILABLE Structuraldifferences between the BV, PCB, and PΦB structures, electronicexcitations of the PΦB-ssa conformation, and Cartesiancoordinates of the phytochromobilin models. This material isavailable free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

AUTHOR INFORMATION

Corresponding Author:*To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected] (R.A.M.); [email protected] (L.G.).

ACKNOWLEDGMENT L.G. acknowledges the financial supportfrom the Deutsche Forschungsgemeinschaft (GO 1059/2-1), andR.A.M. acknowledges the Grants from CONICYTand BECAS CHILE.

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A Lactam-Lactim Tautomerism Involved in the Pr/Pfr

Interconversion of Phytochrome

Journal: The Journal of Physical Chemistry Letters

Manuscript ID: jz-2010-013467

Manuscript Type: Letter

Date Submitted by the Author:

28-Sep-2010

Complete List of Authors: Matute, Ricardo; Universidad de Chile, Facultad de Ciencias, Departamento de Quimica Soto-Delgado, Jorge; Universidad Técnica Federico Santa María, Departamento de Química González, Leticia; Friedrich-Schiller-Universität Jena, Institut für Physikalische Chemie Contreras, Renato; Universidad de Chile, Departamento de Química

ACS Paragon Plus Environment

Submitted to The Journal of Physical Chemistry Letters

A Lactam-Lactim Tautomerism Involved in

the Pr/Pfr Interconversion of Phytochrome

Ricardo A. Matute,*,† Jorge Soto-Delgado,‡ Leticia González,§ and Renato Contreras†

† Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile;

‡ Departamento de Química, Universidad Técnica Federico Santa María, Casilla 110-V, Valparaíso,

Chile; and § Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4,

07743 Jena, Germany

E-mail: [email protected]

Title Running Head: Tautomerism in the Phytochrome Interconversion

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mailto:[email protected]

Abstract

Phytochromes show a strong bathochromic shift in the forward phtotoconversion process from Pr to Pfr,

which could be explained by a lactam-lactim tautomerism occurring after the initial photoisomerization.

Theoretical calculations using time-dependent density functional theory on molecular models for the

biliverdin chromophore of bacteriophytochrome allow to assign such bathochromic shift to a lactam-

lactim tautomerism on ring A but not on ring D of their open tetrapyrrole structure. Moreover, the

predicted Q-band absorption peak for the ZZEssa structure of Pfr with lactim tautomer in ring A is in

excellent agreement with the experimental value. In addition, a mechanistic analysis delivers the

transition states for the intramolecular non-dissociative mechanism of lactam-lactim tautomerism on

ring A and on ring D, being energetically favoured the tautomerization on ring A, but with an energy

barrier still high enough to be overpass. In contrast, the transition state for the lactam-lactim

tautomerism on ring A through a mechanism catalyzed by one water molecule is energetically viable.

Keywords: Phytochrome, Biliverdin, Phycocyanobilin, Tautomerism, TDDFT.

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In plants, there are different photoreceptors regulating its development and metabolism, and

between them the phytochrome has acquired particular interest since it is involved in

photomorphogenic responses triggered by specific-wavelength incident light, for instance, the shade

avoidance as a sensing mechanism for the growth process directed by the presence of neighbor plants

competing for the sunlight.1 Another important photomorphogenic responses regulated by phytochrome

include germination, phototropism, and flowering.2 Thus, this photoreceptor is a suitable target for

biotechnology; in fact, there are several studies in that direction, among them the work by the group of

Quail about a light-switchable phtyochrome-based promotor system3 and the recent published work

concerning phytochrome-mediated protein translocation to the nucleus.4 Despite these advances on

phytochrome biotechnology, the photoconversion mechanism of phytochrome is still unclear.

The phytochrome photocycle (Figure S1 of Supporting Information (SI)) is a switching process

between the two photoconvertible forms, namely Pr and Pfr, which absorb the red and far-region region

of the UV-Visible spectrum, respectively.2 Since the resolution of the first crystallographic structure for

the Pr form of phytochrome,5 some other X-ray structures have been reported6-8, including a Pfr

structure for a bacterial phytochrome,8 which together have shed light on the photoreceptor structure,

motivating new proposals for the underlying photoconversion mechanism. In this work, we assess from

a theoretical perspective the possible participation of a lactam-lactim tautomerism in such mechanism.

The lactim-lactam tautomerism is the cyclic equivalent to the amide-imidic acid tautomerism

(Figure 1A), where the lactam tautomer has the keto form next to a protonated nitrogen, whereas the

lactim tautomer has the enol form next to an unprotonated nitrogen.9 A quick revision of the structure

for the Pr form of biliverdin (Figure 1B) is enough for determining the two locations where the

tautomerism could be achieved, i.e., either in the pyrrol ring A or in the pyrrol ring D. Assuming that a

tautomerism is occurring thermally after the primary photoinduced process, we could consider the

plausible combination of the tautomers for both rings in the Pfr product. Thus, the Figure 1C shows the

models selected as the hypothetical Pfr form for the biliverdin in bacteriophytochrome: di-lactam model,

lactim in ring A model, lactim in ring B model, and di-lactim model; which henceforth in the text will

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be referred as DITAM, TIM-A, TIM-B, and DITIM, respectively. We worked on these models to build

up their theoretical electronic absorption spectra predicted by the time-dependent density functional

theory (TDDFT),10 looking for the structural basis that could explain the bathochromic shift suffered by

the phytochrome upon the interconversion from the Pr to the Pfr form, clearly focusing on the carbonyl

group.

Another issue that we consider pertinent to address is related to the studies conducted by the

group of Matysik,11,12 in which they used 13C-NMR spectroscopy to resolve the situation of the carbons

in the Phycocyanobilin (PCB) of cyanobacterial phytochrome in its Pfr form. In one of such studies,

they found that both carbonyls of the chromophore (ring A / ring D) should be in the keto form, 11 thus

discarding the possibility of tautomerism occurrence, what was also pointed out in the recent review by

Gärtner.13 With this in mind, we performed NMR shielding calculations on PCB to compare the

chemical shifts with the ones reported by the mentioned reference.11

Figure 1. Selected molecular structures. A. Representation of a Lactam-Lactim tautomerism for a simple model B. Biliverdin in the Pr form of bacteriophytochrome. C. Biliverdin models for the Pfr form: (a) DITAM: di-lactam tautomer of biliverdin. (b) TIM-A: biliverdin with lactim in ring A and lactam in ring D. (c) TIM-D: biliverdin with lactim in ring D and lactam in ring A. (d) DITIM: di-lactim tautomer of biliverdin.

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The theoretical absorption spectra for the Pfr models (Figure 2) reproduce two absorption bands:

the Q-band on the red region and the Soret band on the blue region, but henceforth we will only focus

on the former due to its sensitivity to changes on the chromophore structure. Therefore, when analyzing

the Q-band for each Pfr model, we note that DITAM and TIM-D have similar maxima, with 735 nm for

DITAM and 731 nm for TIM-D (Figures 2A and 2C), whereas DITIM and TIM-A have both an

additional bathochromic shift of ca. 20 nm, with 750 nm for DITIM and 747 nm for TIM-A (Figures 2D

and 2B), which are in excellent agreement with the 749 nm14 or 750 nm6-15 reported for the Pfr form of

bacteriophytochrome. Then, the bathochromic shift for the di-lactim model (DITIM) is the product of

the tautomerism in ring A because no shift is observed for TIM-D when compared with the reference di-

lactam model (DITAM). These results suggest that the lactam-lactim tautomerism could generate the

required bathochromic shift upon Pfr formation, but what is interesting is that such red-shift is ring

dependant, i.e., it is only induced when lactim is formed on ring A.

Figure 2. Theoretical absorption spectra from TDDFT calculations for the Pfr model of biliverdin shown in Figure 2. (a) Ditam: di-lactam tautomer of biliverdin. (b) Tim-A: biliverdin with lactim in ring A and lactam in ring D. (c) Tim-D: biliverdin with lactim in ring D and lactam in ring A. (d) Ditim: di-lactim tautomer of biliverdin.

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From above, we have TDDFT spectra suggesting that the Pfr form could be either lactim in ring

A (TIM-A model) or lactim in rings A/D (DITIM models). With this in mind, we turn now to

complementary information provided afer assessing different mechanisms of tautomerism, i.e., we look

for the associated transition states (TS) through DFT calculations.

First, we run the analysis for the lactam-lactim tautomerism involving either ring A or ring D,

separately. Thus, we can assess whether the tautomerism is energetically favoured in one ring over the

other, considering for that purpose the intramolecular non-dissociative mechanism described by Lledós

and Bertrán16 (see Scheme 1).

The barriers that have to be overpass during the intramolecular non-dissociative mechanism

from lactam to lactim were calculated through a single point calculation for each TS structure: TSA for

the tautomerism on ring A and TSD for the tautomerism on ring D (Figure 3). Hence, when comparing

the structures and energies, we get an energy difference of 7 kcal/mol between them. Such analysis

indicates unambiguously that TSA is energetically favoured (Figure 3A). Therefore, these results are in

agreement with the description of the absorption spectra from the models with the lactim tautomer on

ring A (TIM-A and DITIM), suggesting altogether that the photoconversion of phytochrome is likely to

occur via a lactim-lactam tautomerism on ring A and not on ring D of the bilin. Nevertheless, the energy

barrier of 48 kcal/mol for TSA is still high enough to be overpass, indicating that an intramolecular

process is not viable; rather, a catalyzed mechanism should take place.

Scheme 1. Reaction mechanism for the intramolecular non-dissociative tautomerization.

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Figure 3. Transition state structures associated to the intramolecular non-dissociative mechanism for the lactam-lactim tautomerism on ring A (A: TSA) and on ring D (B: TSD) of BV. Below the structures are the corresponding energy barriers and imaginary frequencies.

The tautomerization of 2-piridone/2-hydroxypyridine has been proposed to occur via an

intramolecular non-dissociative mechanism in gas phase but catalyzed by water molecules in aqueous

solution.16-18 On the same basis, one could speculate that within a protein environment the chromophore

should behave as in aqueous solution, with the tautomerization reaction being catalyzed with one or

more water molecules.

Assessing the catalyzed mechanism on BV with a water molecule in the vicinity of the nitrogen

and oxygen of ring A, we found the TS labeled as TS-1wc, whose structure is shown in Figure 4A. In

this structure the water molecule is acting as a bifunctional catalyst in an intermediate cyclic structure,

in reminiscence to the mechanism described for 2-piridone by Field and Hillier.18 The energy barrier for

TS-1wc is 19 kcal/mol, which can be overcome at room temperature. Therefore, a lactam-lactim

tautomerism for BV through a mechanism catalyzed by one water molecule is reasonable and viable.

Moreover, when comparing the TS-1wc structure with the chromophore situation within the protein, as

it is indeed done when comparing to BV in the crystallographic structure of bacteriopytochrome

considering both the Pr19 and Pfr8 form, we think immediately in the so-called "pyrrole water" as the

bifunctional catalyst. This can be better appreciated if we compare the distances to the water oxygen for

the hydrogen-free structure of TS-1wc (Figure 4B) against the distances to the crystallographic water

oxygen for BV in the Pr19 (Figure 4C) and in the Pfr8 form (Figure 4D).

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Figure 4. Biliverdin structures. A. Transition state structure associated to the non-dissociative mechanism catalyzed by one water molecule for the lactam-lactim tautomerism on ring A of BV. Below the structure are the corresponding energy barriers and imaginary frequencies. B. Hydrogen-free structure for TS-1wc. C. BV in the Pr form of the x-ray structure of bacteriophytochrome (Ref. 19) centered on the “pyrrole water”. D. BV in the Pfr form of the x-ray structure of bacteriophytochrome (Ref. 8) centered on the “pyrrole water”.

So far everything leads us to believe that the chromophore undergoes lactam-lactim tautomerism

on ring A when passing from Pr to Pfr form. However, we still need to discuss the apparent

contradiction of our results with those of Matysik and co-workers.11 Theoretical NMR shielding using

the gauge independent atomic orbital (GIAO)20 approach could be useful in this respect, despite the fact

that it cannot reproduce quantitatively the experimental values since these are measured within the

protein environment of the PCB chromophore. We used two levels of theory for this purpose: B3LYP/6-

311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d) and mPW1PW91/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d), considering the

systematic linear correction suggested by Aliev et al.21 for the former (Table S5 of SI).

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Figure 5. GIAO-based NMR shieldings for selected carbons of the phycocyanobilin chromophore of cyanobacterial phytochrome. Blue values: B3LYP/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d). Red values: mPW1PW91/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d). Values in parenthesis: experimental NMR shifts form Ref. 11. (a) DITAM: di-lactam tautomer of biliverdin. (b) TIM-A: biliverdin with lactim in ring A and lactam in ring D. (c) TIM-D: biliverdin with lactim in ring D and lactam in ring A. (d) DITIM: di-lactim tautomer of biliverdin.

The Figure 5 shows the Pfr models for the PCB chromophore together with the 13C-NMR shifts

predicted by the GIAO for the two levels of theory mentioned above compared with the experimental

values in parenethesis.11 Despite the results with the B3LYP22 functional seems to be more ambiguous

than those using the mPW1PW91,23 it is possible to support the findings of the group of Matysik about a

lactam tautomer for the Pfr form of the chromophore.11 Nevertheless, it is known that the nature of the

tautomerism is quite sensitive to the environment conditions, e.g., in gas phase and in non-polar solvents

the lactim form predominates, whereas in aqueous solution and in polar solvents the lactam tautomer

predominates,18 but what is more interesting is that in solid state the lactam form is favoured. 24-27 Hence,

we suggest that the lactam form found by the group of Matysik11 is a consequence of the experimental

conditions, i.e., NMR in solid state.

In summary, the lactam-lactim tautomerism on ring A of the chromophore induces a

bathochromic shift consistent with the Pr/Pfr interconversion; the mechanism catalyzed by one water

molecule is energetically viable; and the NMR in solid state should not discard the occurrence of

tautomerism.

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Computational Methods

The biliverdin models for Pfr were constructed using as template the crystal structure for the Pfr

reported by the group of Moffat.8 The hydrogens are not resolved, so they were placed according to the

molecular structures depicted in Figure 1C. For the TDDFT10 calculations we have used the unrelaxed

crystal geometry, since it has been previously demonstrated that it predicts properly the experimental

values.28,29 Hence, for these calculations the added hydrogens were previously optimized at B3LYP/6-

31G(d) level of theory22 in vacuo keeping frozen the rest of the atoms. The BV models (Figure 1C) do

not consider the propionic side-chains of the pyrrol rings B and C because i) they do not affect the

excitation calculations as they are not part of the conjugated system, and ii) because their interaction

with the pyrrole nitrogens during full geometry optimization cause an undesirable distortion in the

resulting structure.

We have used the hybrid functional B3LYP22 with a 6-31G(d) basis set for TDDFT calculation.

The excitation energies and associated oscillator strengths were calculated using the Linear Response

formulation of the TDDFT as implemented10 in the Gaussian03 package30. The calculations have been

done with TD-B3LYP/6-31G(d) over eight roots, where the surrounding environment has been

represented with a polarizable continuum model (PCM)31 using a dielectric constant of 4.0 to account

for the average electrostatic interaction between the bilin chromophore and the apoprotein, as it has been

recommended in the review by Neugebauer.32 The vertical excitations were convoluted with Gaussian

functions considering a full width of 4000 cm-1 at half-maximum for the generation of the theoretical

absorption bands using the GaussSum2.2 program.33

The mechanistic analysis was carried out with the B3LYP exchange-correlational functional,22

together with the standard 6-31G(d) basis set. The optimizations used the Berny analytical gradient

optimization method.34,35 All calculations were achieved with the Gaussian03 suite of programs.30 The

stationary points were characterized by frequency in order to verify that the TS structures had an only

one imaginary frequency. The intrinsic reaction coordinate (IRC)36 path was traced to check the energy

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profiles connecting each transition structure to the two associated minima corresponding to reactants

and products.

In the NMR Shielding calculations, the model structures were fully optimized in vacuo using

DFT with the hybrid generalized gradient approximation (GGA) functional B3LYP22 and the 6-31G(d)

basis set. The 13C atomic chemical shielding tensors (σ) were computed for each optimized structure at

the density functional level using the gauge independent atomic orbital (GIAO)20 formalism with the

6-311+(2d,p) basis set. Two exchange-correlation functionals were assessed, namely, B3LYP22 and

mPW1PW91.23 Isotropic atomic chemical shifts (δ) in units of ppm for both levels of theory, i.e.,

B3LYP/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d) and mPW1PW91/6-311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d), were

computed as differences between the 13C atomic isotropic shieldings of the models and the carbon atoms

of the reference tetramethylsilane (TMS). The linear scaling correction of Aliev et al.,21 which is

implemented to correct specifically systematic errors associated with the GIAO B3LYP/6-

311+(2d,p)//B3LYP/6-31G(d) level of theory, was used on the computed 13C-NMR chemical shifts

according to the following relationship: δscalc = 0.95 δcalc + 0.30, where δcalc and δscalc are the

calculated and the linearly scaled values, respectively.

Acknowledgment. We thank to Dr. N.C. Rockwell and Prof. J.C. Lagarias (Department of Molecular

and Cell Biology at University of California, Davis) for the interesting discussion on some of the ideas

of this work; L.G. acknowledges the financial support from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (GO

1059/2-1); J.S.D. acknowledges project 130922 from USM.; and R.A.M. acknowledges the Grants from

CONICYT and BECAS CHILE.

Supporting Information Available: Tables for the theoretical absorption spectra and NMR

shielding calculations; and cartesian coordinates for reactants and TS structures. This material is

available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

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Monday20,07

Room A Room B Room C

Opening

Keynote Lecture, Ahmed H. Zewail, USA

COFFEE BREAK

(S1) Photonics and Imaging (I) (S2) Photochromic Materials and Molecular Switches (S3) Gas Phase and Theory

IL1 (Javier Solis, Spain) IL2 ( Keitaro Nakatani, Japan) IL3 (Luis Bañares, Spain)

OC1 - Hiroshi Uji-i OC4 - Li-Zhu Wu OC7 - Alexey V. Baklanov

OC2 - Tsuyoshi Asahi OC5 - B. Seefeldt OC8 - Tatiana Domratcheva

OC3 - Thorben Cordes OC6 - A. Jorge Parola OC9 - Ricardo A. Matute

LUNCH

PL1, Michel Orrit, The Netherlands

(S4) Single Molecule Spectroscopy (S5) Photoinduced Electron and Charge Transfer (S6) Femto(bio)chemistry

IL4 (Maarten B.J. Roeffaers, Belgium) IL7 (Eric Vauthey, Switzerland) IL9 (Pascal Plaza, France)

OC10 - Dominik Wöll OC14 - Johanna Brazard OC19 - A. Weigel

OC11 - Sadahiro Masuo OC15 - Luis G. Arnaut OC20 - François-Alexandre Miannay

COFFEE BREAK

IL5 (Markus Sauer, Germany) IL8 (Franco Scandola, Italy) IL10 (Dongping Zhong, USA)

OC12 - Mike Heilemann OC16 - Anita Bruckner OC21 - P. Gilch

OC13 - Kei Murakoshi OC17 - S. Haacke OC22 - Michel Sliwg

IL6 (Boiko Cohen, Spain) OC18 - Eléna Ishow OC23 - Marcin Ziolek

Poster Session I

Reception

9:00

9:30

10:3011:00

11:30

11:50

12:10

12:30

14:00

14:45

14:55

15:25

15:45

16:0516:30

17:00

17:20

17:40

18:00

20:00

TIME-DEPENDENT DFT ON PHYTOCHROME CHROMOPHORES:

A WAY TO FIND THE RIGHT CONFORMER

Ricardo A. Matute,1 Renato Contreras,

1

Guillermo Pérez-Hernández,2 Leticia González

2

1Departmento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile,

Casilla 653, Santiago, Chile 2Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena,

Helmholtzweg 4, 07743 Jena, Germany

E-mail: [email protected] or [email protected]

A theoretical approach based on the time dependent density functional theory

(TDDFT) is implemented together with a polarizable continuum model for incorporating the

bulk effect of the surrounding environment to estimate the excitation energies for different

chromophores found in phytochrome. We realized that a crystallographic structure without

geometry optimization as template for the calculations is critical to account for the steric

effect of the apoprotein over the chromophore. Through an analysis of the theoretical

spectra we predicted that phycocyanobilin inside the cyanobacterial phytochrome Cph1

likely adopts a semicyclic conformation ZZZssa (C5-Z,syn;C10-Z,syn;C15-Z,anti) [1], which

was then confirmed experimentally from a crystallographic structure by x-ray

diffraction [2]. Analogously, we implemented the method to phytochromobilin, i.e. the

chromophore of plant phytochrome, with results that suggest a ZZZssa structure too.

Therefore, we assume that theoretical spectra based on TDDFT seems to give us a good way

to predict the right conformer. Furthermore, we assess the ratio of the spectral bands on the

theoretical spectra (Q-band over the Soret band or Q/S ratio) finding that the spectroscopic

Q/S index indeed is directly related to the conformational isomerism of the chromophore.

Acknowledgements: FONDECYT Grant Nº 1070715, the Doctoral Fellowships from

CONICYT, and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (GO 1059/2-1).

References [1]. R. A. Matute, R. Contreras, G. Pérez-Hernández, and L. González, J. Phys. Chem. B

2008, 112, 16253.

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August 8, 2009 Ricardo Matute, PhD Candidate Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Quimica Casilla 653 Santiago, Chile Dear Mr. Matute, I thank you for your poster presentation at the 9th International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors of Photosynthetic Organisms (ICTPPO) held at Asilomar Conference Center in Monterey, CA from July 26 to July 31, 2009. Your contribution to the meeting was most welcome and I am happy that we will be able to develop a research cooperation of mutual interest. Sincerely yours,

J. Clark Lagarias Paul K. and Ruth R. Stumpf Professor of Plant Biochemistry

ESTUDIO TEÓRICO DE LA ESTRUCTURA ELECTRÓNICA Y DE LOS...

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