EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y … · 13 RESUMEN Título: Evaluación de la actividad...
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1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y ANTIBACTERIANA DE DOS MOLÉCULAS AISLADAS DE CALEA PRUNIFOLIA. LISSETH DAMARIS MONTOYA DÍAZ KAREN TATIANA TORRES MEZA ANGIE DANIELA ZAMBRANO ARGUELLO UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO BUCARAMANGA 2018
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y ANTIBACTERIANA DE
DOS MOLÉCULAS AISLADAS DE CALEA PRUNIFOLIA.
LISSETH DAMARIS MONTOYA DÍAZ
KAREN TATIANA TORRES MEZA
ANGIE DANIELA ZAMBRANO ARGUELLO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
BUCARAMANGA
2018
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y ANTIBACTERIANA DE
DOS MOLÉCULAS AISLADAS DE CALEA PRUNIFOLIA
LISSETH DAMARIS MONTOYA DÍAZ
KAREN TATIANA TORRES MEZA
ANGIE DANIELA ZAMBRANO ARGUELLO
Trabajo de tesis
SERGIO YEBRAIL GÓMEZ RANGEL
JUANITA TREJOS SUAREZ
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
BUCARAMANGA
2018
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6
DEDICATORIA
La presente tesis está dedicada a nuestros padres, gracias por su apoyo, confianza
y amor para lograr este sueño.
A familiares, amigos y compañeros, ya que aportaron en un alto porcentaje a
nuestras ganas de seguir adelante en nuestra carrera profesional.
7
AGRADECIMIENTOS
Gracias, de corazón, a nuestros profesores, Sergio Yebrail Gómez Rangel y Juanita
Trejos Suarez por su paciencia, motivación y dedicación en este proyecto. Ha sido
un privilegio contar con su guía y ayuda.
Gracias a la Universidad de Santander por hacernos parte de ella, brindarnos las
herramientas necesarias para abrirnos las puertas hacia un mundo lleno de
conocimiento, así mismo a todos los docentes que brindaron sus conocimientos y
apoyos para lograrlo.
Gracias a nuestros padres por ser el principal motor de nuestros sueños, ser un
apoyo incondicional y creer en nosotras.
8
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................. 15
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 17
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................. 20
2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 25
3. OBJETIVOS .................................................................................................... 26
3.1. OBJETIVO GENERAL................................................................................. 26
3.2. OBJETIVOS Específicos ............................................................................. 26
4. ESTADO DEL ARTE ...................................................................................... 27
5. MARCO CONCEPTUAL ................................................................................. 33
5.1. Género Calea .............................................................................................. 33
5.2. Citotoxicidad en modelos in vitro ................................................................. 36
5.3. Microorganismos ......................................................................................... 38
5.4. MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ..... 45
5.5. Resistencia antimicrobiana .......................................................................... 46
6. METODOLOGÍA .............................................................................................. 500
6.1. Diseño de estudio ...................................................................................... 500
6.2. Muestra ..................................................................................................... 500
9
6.3. Hipótesis ...................................................................................................... 50
6.4. Materiales .................................................................................................. 500
6.5. Procedimientos ............................................................................................ 53
6.5.4. Ensayos antibacterianos y antifúngicos. ............................................... 55
7. RESULTADOS ................................................................................................... 57
7.1 Ensayos de toxicidad en células de mamífero ............................................. 57
7.2 Ensayo de toxicidad en glóbulos rojos ......................................................... 59
7.3 Ensayos antimicrobianos............................................................................ 600
8. ANÁLISIS DE RESULTADOS ............................................................................ 62
9. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 63
10. CONCLUSIONES ............................................................................................ 67
11. RECOMENDACIONES .................................................................................... 68
12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 69
10
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Microorganismos utilizados para los ensayos antimicrobianos 50
Tabla 2. Diseño del experimento de actividad inhibitoria, 54
Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (CIM) de las moléculas de Calea prunifolia
59
11
LISTA DE GRÁFICAS
Pág.
Gráfica 1. Porcentaje de viabilidad vs diferentes concentraciones de la molécula 1.
56
Gráfica 2. Porcentaje de viabilidad vs diferentes concentraciones de la molécula 2.
56
12
LISTA DE IMÁGENES
Pág.
Imagen 1. Calea prunifolia guía Ilustrada - Flora Cañón del río Porce, Antioquia 32
Imagen 2. Calea prunifolia (Ocaña norte de Santander) J calle 33
Imagen 3. Ensayo de citotoxicidad de glóbulos rojos 57
Imagen 4. Ensayo antimicrobiano 58
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RESUMEN
Título: Evaluación de la actividad antifúngica y antibacteriana de dos moléculas
aisladas de Calea prunifolia.
Autores: Lisseth Damaris Montoya Diaz
Karen Tatiana Torres Meza
Angie Daniela Zambrano Arguello
Palabras clave: Calea prunifolia, potencial inhibitorio, compuestos, potencial
toxico, hemólisis.
El estudio de moléculas aisladas de material vegetal, es de gran importancia para
obtener nuevos compuestos con potencial bioactivo y corroborar información de
conocimiento popular que se atribuyen a algunas plantas como propiedades
farmacológicas. En el presente trabajo se evaluó la actividad inhibitoria de dos
moléculas extraídas de Calea plunifloria sobre bacterias y hongos de interés clínico,
y su efecto citotóxico en células de mamífero y glóbulos rojos humanos.Las
moléculas mostraron mayor actividad contra Candida albicans y Candida glabrata
con una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de 1.56 ug/ml. Sin embargo, al
estudiar la inhibición contra bacterias solo se encontró actividad contra
Streptococcus pneumoniae con CMI de 12.5 ug/ml. Además del potencial inhibitorio,
se encontró bajo potencial tóxico líneas celulares epiteliales Vero con
Concentraciones Citotóxicas 50% (CC50) de 228.9 ug/ml y 241.4 ug/ml para la
molécula 1 y 2 respectivamente; teniendo en cuenta estos valores y la CMI
reportada, se puede inferir un índice de selectividad de 146.7 y 154.7 para cada
molécula. En ensayos de Glóbulos rojos humanos no se evidenció toxicidad
asociada a hemólisis en ninguna de las concentraciones estudiadas.
Los resultados sugieren una actividad promisoria antibacteriana y antimicótica en
cepas de Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619), Candida albicans (ATCC
22972) y Candida glabatra (ATCC 90030) demostrando el potencial bioactivo de las
14
moléculas. Así mismo, se proponen trabajos complementarios para definir el
mecanismo de acción en modelos in vivo y continuar con la búsqueda de otras
moléculas con potencial antimicrobiano a partir de plantas del género Calea spp.
15
ABSTRACT
Title: Evaluation of the antifungal and antibacterial activity of two molecules isolated
from Calea prunifolia.
Authors: Lisseth Damaris Montoya Diaz
Karen Tatiana Torres Meza
Angie Daniela Zambrano Arguello
Key words: Calea prunifolia, inhibitory potential, compounds, toxic potential,
hemolysis
The study of isolated molecules of plant material is of great importance to obtain new
compounds with bioactive potential and corroborate popular knowledge information
that is attributed to some plants as pharmacological properties. In the present work,
the inhibitory activity of two molecules extracted from Calea plunifloria was evaluated
on bacteria and fungi of clinical interest, and their cytotoxic effect on mammalian
cells and human red blood cells.
The molecules showed higher activity against Candida albicans and Candida
glabrata with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) 1.56. However, when
studying the inhibition against bacteria, only activity against Streptococcus
pneumoniae with CMI of 12.5 was found. In addition to the inhibitory potential, low
toxic potential was found with 50% Cytotoxic Concentrations of 228.9 ug / ml and
241.4 ug / ml for molecule 1 and 2 respectively; taking into account these values
and the reported MIC, a selectivity index of 146.7 and 154.7 can be inferred for each
molecule. In tests of human red blood cells, no toxicity associated with hemolysis
was evidenced in any of the concentrations studied.
The results suggest a promising antibacterial and antifungal activity in strains of
Streptococcus pneuminiae (ATCC 49619), Candida albicans (ATCC 22972) and
Candida glabatra (ATCC 90030) demonstrating the bioactive potential of the
molecules. Likewise, complementary works are proposed to define the mechanism
16
of action in in vivo models and continue with the search for other molecules with
antimicrobial potential from plants of the genus Calea spp.
17
INTRODUCCIÓN
Las infecciones bacterianas continúan siendo un problema de gran importancia en
salud pública. Escherichia coli (15,9%) es el patógeno más importante en la
infección nosocomial, seguido de Staphylococcus aureus (15,9%) y Enterococcus
spp (9,6%)1. En Colombia, para el primer semestre del 2018 el SIVIGILA reporta
63.687 casos de enfermedad diarreica aguda y 1.075 casos de infección respiratoria
aguda grave de los cuales 100 casos son de mortalidad por EDA y 441 casos de
mortalidad por IRA2.
En la actualidad se encuentran disponibles varios antimicrobianos para el
tratamiento de estas infecciones. No obstante, durante los últimos años la
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha manifestado la gran preocupación que
ha surgido al observar la pérdida de eficacia de los antibióticos utilizados para su
tratamiento3.
La resistencia a los antimicrobianos en un problema de salud pública mundial. Datos
publicados por la Organización Mundial de la Salud sobre la vigilancia de la
resistencia a los antibióticos indican altos niveles de resistencia en infecciones
bacterianas graves tanto en países de ingresos altos como en los de ingresos bajos.
Entre las bacterias con mayor resistencia se encuentran Escherichia coli, Klebsiella
1 CANTÓN, Rafael y RUIZ, Patricia. Infecciones causadas por bacterias grampositivas multirresistentes (Staphylococcus aureus y Enterococcus spp) En: Enferm Infecc Microbiol Clin. 2013. vol. 31, no. 8, p. 543–551. 2 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. “Morbilidad por Enfermedad Diarreica Aguda”. Disponible en: http://www.ins.gov.co/buscador-eventos/BoletinEpidemiologico/2018%20Bolet%C3%ADn%20epidemiol%C3%B3gico%20semana%2035.pdf 3 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Resistencia a los antimicrobianos. Disponible en Internet: http://origin.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/es/
18
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Salmonella
spp4.
Este fenómeno se ha asociado con el uso indiscriminado, irracional e incompleto de
estos fármacos, y ha permitido el crecimiento de microorganismos multirresistentes,
los cuales pueden causar fallo o prolongación de los tratamientos, complicaciones
clínicas, e incluso podrían resultar en la muerte del paciente. Esto ratifica la
necesidad manifiesta de la OMS para la búsqueda de nuevas estrategias de
tratamiento de las enfermedades causadas por microorganismos resistentes3.
Como búsqueda de una solución a la resistencia antimicrobiana se ha reconocido
la medicina tradicional como un gran bloque de conocimiento para la atención
primaria en salud; el hecho de que un gran número de la población sigue acudiendo
a ella, propone la necesidad continuar y potenciar la tendencia en la investigación
de nuevos fármacos a partir de productos naturales, dado que aún los productos
naturales siguen aportando nuevos principios activos. Colombia posee una gran
biodiversidad entre las cuales se destaca la diversidad floral, donde un gran número
de especies de plantas han sido utilizadas tradicionalmente con fines medicinales.
Un ejemplo de esto es la Calea prunifolia, una planta ampliamente distribuida en
Colombia, con la cual otro autores han demostrado actividad biológica como anti-
inflamatorio en modelos animales5,6.Además, otras especies del género Calea spp
4 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Datos recientes revelan los altos niveles de resistencia a los antibióticos en todo el mundo”. Internet: https://www.who.int/mediacentre/news/releases/2018/antibiotic-resistance-found/es 5 GÓMEZ, Milton y GIL, Juan. Topical Anti-Inflammatory Activity of Calea prunifolia HBK (Asteraceae) in the TPA Model of Mouse Ear Inflammation. En: J. Braz. Chem. Soc. 2011. vol. 22, no. 12, p. 2391-2395. 6 PUEBLA, Pilar. et al. Polar Compounds Isolated from the Leaves of Calea prunifolia H.B.K. and their Anti-Adrenergic Related Vasodilator Activity. En: J. Braz. Chem. Soc. 2011. vol. 22, no. 12, p. 2281-2285.
19
han demostrado su potencial como antimicrobiano7, acaricida8, leishmanicida9,
antifúngico y tripanicida10, entre otros. Este trabajo pretende determinar la
capacidad inhibitoria de moléculas obtenidas a partir de la planta Calea prunifolia
sobre bacterias y hongos de interés clínico en humanos.
7 MENDES DO NASCIMENTO, Andrea. et al. Antimicrobial activity of extracts and some compounds from Calea platylepis. En: Fitoterapia. 2004. vol. 75, p. 514–519. 8 SARDÁ RIBEIRO, Vera. et al. Effect of Calea serrata Less. n-hexane extract on acetylcholinesterase of larvae ticks and brain Wistar rats. En: Veterinary Parasitology. 2012. vol. 189, p. 322– 326. 9 LIMA, Tamires. et al. Chromenes from leaves of Calea pinnatifida and evaluation of their leishmanicidal activity. En: Revista Brasileira de Farmacognosia. 2015. vol. 25, p. 7–10. 10 MENDES DO NASCIMIENTO, Andréa. Et al. Trypanocidal and antifungal activities of p-hydroxyacetophenone derivatives from Calea uniflora (Heliantheae, Asteraceae). En: Journal of pharmacy and pharmaology. 2004. vol. 56, p. 663–669.
20
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las infecciones microbianas constituyen una de las principales formas de
enfermedad en humanos. Se estima que alrededor 90% de las enfermedades
infecciosas humanas críticas son causadas por Acinecthobater baumanni,
Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli, Sthapylococcus aureus, Salmonella spp
y Steptococcus pneumonie11. En Colombia, anualmente se reportan al sistema de
salud una gran cantidad de casos asociados a infecciones microbianas. A cierre del
año 2016 se reportaron: 429 casos de meningitis bacteriana: en donde el 35,2%
fueron ocasionadas por Streptococcus pneumoniae, 120 719 registros de consultas
externas y urgencias por infección respiratoria aguda, 76.915 casos de enfermedad
diarreica aguda y 51.467 casos de enfermedades transmitidas por alimentos12.
Para el año 2017, la OMS comparte la lista de “Patógenos prioritarios” resistentes a
los antibióticos, las denominadas “12 familias de bacterias más peligrosas para la
salud humana”. La lista se divide en tres categorías teniendo en cuenta la
patogenicidad en humanos y la alta resistencia ante los antibióticos usados de
rutina. Sobre este criterio la OMS ha solicitado trabajos de investigación en
búsqueda de nuevos antibióticos. Bajo esta clasificación las bacterias se dividen en
prioridad crítica: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, familia
Enterobacteriaceae; elevada: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus,
Helicobacter pylori, Salmonellae, Neisseria gonorrhoeae y media: Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae y Shigella spp13.
11 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. La OMS publica la lista de las bacterias para las que se necesitan urgentemente nuevos antibióticos [comunicado de prensa en línea] (2017-02-27). Disponible en Internet: http://www.who.int/es/news-room/detail/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed. 13 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Lista OMS de patógenos prioritarios para la I+D de nuevos antibióticos”. Disponible en Internet: http://www.who.int/es/news-room/detail/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed
21
En el año 2018, los datos publicados por la misma Organización sobre la vigilancia
de la resistencia a los antibióticos indican que los niveles de resistencia a algunas
infecciones bacterianas graves son elevados tanto en los países de ingresos altos
como en los de ingresos bajos. Entre las bacterias con mayor Resistencia se
encuentran: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y
Streptococcus pneumoniae, seguidas de Salmonella spp4.
Otro grupo microbiano de interés en salud pública además de las bacterias son los
hongos causantes de micosis superficiales, cutáneas y subcutáneas. Las micosis
han mostrado cambios epidemiológicos debido a las modificaciones en las
condiciones ambientales, la distribución de los agentes etiológicos, el
envejecimiento de la población, el aumento de las terapias inmunosupresoras y de
enfermedades como el VIH. La forma más frecuente de infección por hongos en
humano son las micosis superficiales siendo la onicomicosis la patología más
prevalente en humanos14. En las últimas décadas se ha producido un crecimiento
global de infecciones fúngicas nosocomiales las cuales van en aumento en
consecuencia de avances en la medicina con tratamientos más eficaces pero muy
agresivos. En consecuencia el resultado de las Enfermedades Fúngicas Invasoras
(EFIs) se presentan como un conjunto afecciones causantes de una
morbimortalidad de gran impacto en la medicina actual. La lista de los
microorganismos causantes de EFIs aumenta diariamente, sin embargo, Candida
spp, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jirovecii y Aspergillus spp son los
patógenos mayormente implicados. Para el género Candida el 95-97% de todas las
EFI producidas por levaduras de este género están causadas por solo 5 especies:
Candida albicans, C. glabrata,C. parapsilosis, C. tropicalis y C. krusei15. Estudios
epidemiológicos realizados a nivel nacional han demostrado agentes causales de
14 MEJÍA ARANGO, María. et al. Estudio etiológico y epidemiológico de las micosis cutáneas en un laboratorio de referencia – Antioquia – Colombia. En: CES Medicina. Enero-Junio, 2013. vol. 27, no. 1. 15 MORENO, Xiomara. Epidemiologia de las enfermedades fúngicas invasoras. En: Acta Científica de la Sociedad Venezolana de Bioanalistas Especialistas. 2014. vol. 17, no. 2, p. 75-80.
22
onicomicosis hubo un predominio de levaduras (40,7 %), principalmente especies
de Candida. En el 38 % se aislaron dermatofitos y en 14 % mohos no dermatofitos
(31) en Cali y en otro estudio realizado en Medellín se encontró predominio del
compromiso en uñas de pies, siendo en estos más frecuentes el T. rubrum (17,5
%), Candida parapsilosis (16,7 %), Fusarium spp. (13,8 %), T. mentagrophytes (11,5
%) y Scytalydium dimidiatum (Natrassia spp.) (10,1 %). Mientras que en las manos
los principales agentes fueron especies de Candida, con predominio de C. albicans
(23,4 %), seguidos de C. parapsilosis (20,8 %), C. tropicalis (7,5 %), C. guilliermondii
(4,8%) y otras especies no determinadas de Candida (12,4 %)16.
En las últimas décadas se han logrado avances significativos para obtener
sustancias químicas o biológicas con potencial antimicrobiano que sean menos
tóxicas para el ambiente y el hombre. Esto ha despertado gran interés en la
obtención de productos de origen natural que contribuyan al desarrollo de nuevos
fármacos. En la actualidad se encuentran disponibles varios antimicrobianos para
el tratamiento de estas infecciones. No obstante, durante los últimos años la
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha manifestado la gran preocupación que
ha surgido al observar la pérdida de eficacia de los antibióticos utilizados para su
tratamiento. Este fenómeno se ha asociado con el uso indiscriminado, irracional e
incompleto de estos fármacos, y ha permitido el crecimiento de microorganismos
multirresistentes, los cuales pueden causar fallo o prolongación de los tratamientos,
complicaciones clínicas, e incluso podrían resultar en la muerte del paciente17.
El panorama actual nos muestra como resultado medicamentos ineficaces,
infecciones persistentes en el organismo, riesgo alto de propagación a otras
personas, y cambios en la epidemiología de estas enfermedades. Desde hace
varios años se ha descrito que los mecanismos de resistencia adquirida y
17 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Resistencia a los antimicrobianos. [boletín informativo en línea] (2018-02-18). Disponible en Internet: http://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/resistencia-a-los-antimicrobianos.
23
transmisible son los más importantes y consisten fundamentalmente en la
producción de enzimas bacterianas o fúngicas que inactivan los antibióticos o en la
aparición de modificaciones que impiden la llegada del fármaco al punto diana o en
la alteración del propio punto diana18. Esto ratifica la necesidad manifiesta de la
OMS para la búsqueda de nuevas estrategias de tratamiento de las enfermedades
causadas por microorganismos resistentes19.
La OMS ha reconocido la medicina tradicional como un gran bloque de conocimiento
para la atención primaria en salud y el hecho de que un gran número de la población
sigue acudiendo a ella. Es necesario continuar y potenciar la tendencia en la
investigación de nuevos fármacos a partir de productos naturales, dado que aun los
productos naturales siguen aportando nuevos principios activos. Se estima que solo
un 10% de las 250,000 plantas identificadas a escala mundial han sido examinadas
para explotar su potencial médico y económico20.
El uso de compuestos naturales ha sido una tradición milenaria en la humanidad.
Los seres humanos utilizan infusiones, o extracto de planta para curar molestias,
como los dolores estomacales, cefaleas, gripes, entre otros. Aún en la actualidad,
las plantas naturales continúan siendo el “remedio para todo” de muchas familias21.
Colombia posee una gran biodiversidad entre las cuales se destaca la diversidad
floral, donde un gran número de especies de plantas han sido utilizadas
tradicionalmente con fines medicinales. Un ejemplo de esto es la Calea prunifolia,
de la cual se ha demostrado actividad biológica como anti-inflamatoria y
antidrenergico-vasodiltador. Además, otras especies del género Calea spp han
18 DAZA PÉREZ, R. Resistencia bacteriana a antimicrobianos: su importancia en la toma de decisiones en la práctica diaria. En: Inf Ter Sist Nac Salud. 1998. vol. 22, no. 3, p. 57-67. 19 GIRALDO QUINTERO, Sara. et al. Descripción del uso tradicional de plantas medicinales en mercados populares de Bogotá, D.C. En: Nova. Mayo, 2015. vol. 13, no. 23, p. 73-80. 20 PUERTAS, Miguel, TOBON, Julián y ARANGO Victor. Kalanchoe daigremontiana Raym.-Hamet. & H. y su potencial uso como fuente de antioxidantes y colorantes naturales. En: Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2014. vol. 19, no.1, p. 61-68. 21 CONCHA, Rodrigo. Gestión Clínica para el Manejo Apropiado de Antibióticos. En: Rev Chil Salud Pública. 2016. vol. 20, no. 1, p. 45-52.
24
demostrado su potencial como antimicrobianos7, acaricidas8, leishmanicida9,
antifúngico y tripanicida10, entre otros.
Este trabajo pretende investigar la capacidad inhibitoria de moléculas obtenidas a
partir de la planta Calea prunifolia sobre bacterias y hongos de interés clínico en
humanos, que a futuro permita estudios en la búsqueda de nuevos fármacos.
25
2. JUSTIFICACIÓN
La búsqueda de nuevos medicamentos es una necesidad hoy en día en el mundo.
La OMS solicita que esta línea de investigación se active en todos los grupos
alrededor del mundo para contrarrestar las actuales dificultades del tratamiento
contra microorganismos.
Este trabajo pretende investigar si moléculas de origen natural pueden abrir la
puerta hacia un nuevo modelo de tratamiento de las enfermedades infecciosas. Esta
fuente de compuestos supone las siguientes ventajas: mayor accesibilidad al
medicamento, bajo el supuesto que siendo una planta colombiana, esta podría ser
cultivada fácilmente y estar a mayor alcance para la población en el país; la baja
toxicidad, por ser compuesto natural se esperaría que por su naturaleza tengan más
afinidad con modelos biológicos, y en consecuencia fueran mucho más efectivos sin
el riesgo de efectos secundarios en el organismo; menor costo para los pacientes,
dado que sería probable que debido a su amplia distribución fuese mucho más fácil
su obtención y distribución lo que aminoraría los costos.
Es de resaltar que este trabajo pretende estudiar la capacidad inhibitoria de las
moléculas contra diferentes grupos microbianos. Esto se considera un valor
agregado al proyecto, dado que sería muy provechoso lograr que un mismo
compuesto o fármaco pudiese tener actividad contra más de un microorganismo
distinto, que además de las ventajas descritas antes, facilitaría la dosificación y la
adherencia en los pacientes.
26
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
● Evaluar la actividad antifúngica y antibacteriana de dos moléculas aisladas
de Calea prunifolia.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Determinar la citotoxicidad producida por la moléculas de Calea prunifolia en
una línea celular epitelial, y en glóbulos rojos.
● Determinar la actividad antifúngica de las moléculas aisladas sobre cepas de
Candida albicans y Candida glabrata.
● Determinar la actividad antibacteriana de las moléculas aisladas sobre cepas
de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus y Acinetobacter baumannii.
27
4. ESTADO DEL ARTE
Asteraceae es una de las familias donde se encuentran algunas de las plantas
medicinales más empleadas ya que poseen propiedades antiparasitarias,
antiinflamatorios, antigripales, diuréticas, antipiréticas, espasmolíticas,
cicatrizantes, acciones antibióticas entre otras para el tratamiento de enfermedades.
Además, posee una amplia distribución en el continente americano desde México
hasta el Brasil, su diversidad puede atribuirse a sus excelentes mecanismos de
dispersión y a su capacidad para adaptarse a diferentes condiciones ecológicas22.
Uno de los géneros dentro de esta familia es Calea donde se reportan
aproximadamente 262 especies ampliamente distribuidas a nivel territorial
creciendo en diferentes climas y zonas tropicales del continente americano23. Entre
este género se encuentran varias especies como: Calea uniflora,C. prunifolia, C.
patylepis, C.peruviana,C. clematidia, C pinnatifida, C. americana, entre otras. Con
grandes y variados usos por las diferentes actividades farmacológicas que poseen
como: antiinflamatorias, antimicrobianas, antiulcerantes, antitripanosómicas,
antiamebianas24 25 26.
En Colombia este género se encuentra ampliamente distribuido gracias a los
diferentes pisos térmicos en el país, lo cual es de gran alcance y fácil manejo para
la realización de estudios con esta planta. En los últimos años se han demostrado
22 ARANGUREN, Anairamiz. MORILLO, Gilberto y FARIÑAS, Mario. Distribución geográfica y clave de las especies del género oritrophium (Kunth) cuatrec. (asteraceae). En: Acta Botánica Venezuelica. 2008. vol. 31, no. 1. 23 GÓMEZ BARRERA, Milton. Determinación de actividad anti-inflamatoria de sesquiterpenlactonas aisladas de Calea peruviana y Calea prunifolia. Tesis de maestría en Farmacología. Bogotá D.C.: Universidad Nacional de Colombia. 2010. 24 BORGES DEL CASTILLO, J. et al. Salvadorian compositae. II. Juanislamin and lactones from Calea urticifolia 2,3-epoxy-juanislamin, two new sesquiterpenic. En: Journals of natural products. 1998. vol. 44, no. 3, p. 348- 350. 25 STEINBECK, Cristoph. et al. Identification of Two Chromenes from Calea serrata by Semiautomatic Structure Elucidation. En: J. Nat. Prod. 1997. vol. 60, p. 627-628. 26 OBER, Alfonso. URBATSCH, Lowell y FISCHER, Nikolaus. Guaianolides and chromenes from Calea species. En: Phytocemistry, 1985. vol. 24, no. 4, p. 795-199.
28
algunas de estas investigaciones con diferentes géneros de Calea entre estos Calea
prunifolia las cuales han demostrado que posee propiedades vasodilatadoras-
antidrenergicas, antiinflamatorias, entre otras.
Los primeros estudios realizados con la planta se reportaron en tres especies de
Calea; C. berteriuna, C. soliduginea y C. prunifolia. Encontraron compuestos
conocidos como: flavonoide acacetina, heliangolide modificado calbertolide C, un
nuevo guaianolide y desacyl- & tiglylsubcordatolide A, este estudio solo estuvo
limitado a la búsqueda de compuestos químicos en las plantas para posteriores
trabajos con estos27.
Flach y colaboradores evaluaron la actividad antifúngica de Calea clematidea en
cepas de Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton
rubrum, Epidermophytom flocosum, Mycrosporum gypseum, Microsporum canis y
Microsporum nanum, con extractos oleicos de las hojas de la planta mostrando
moderada actividad antifúngica con un (MIC > 3.57 mg/mL) con el derivado del
aceite el clemateol de (MIC > 1.52 mg/dL) y alcohol (MIC > 2.82 mg/dL)28. El mismo
potencial fue demostrado por Mendes y colaboradores evaluando la actividad
antimicrobiana de extractos de diclorometano de hojas, flores, raíces y compuestos
aislados de Calea patylepis demostrando que los extractos de diclorometano
mostraron actividad antimicrobiana, los compuestos aislados como: -4α, 7b-
aromadendranediol, benzofurans euparin, caleprunin B y euparone demostraron un
espectro de acción más amplio que inhibe el crecimiento de diversas cepas de
microorganismos tanto bacterianos como fúngicos, por otro lado el compuesto
sesquiterpeno no mostró inhibición contra todos los microorganismos y el
compuesto caleprunin A mostraron actividad antifúngica contra las cepas de
27 FERREIRA, Zenaide. et al. Structural clarification of germacranolides from Calea species. En: Phymchemisay. 1980. vol. 19, p. 1481-1484. 28 FLACH, Adriana. Chemical Analysis and Antifungal Activity of the Essencial Oil of Calea clematidea. En: Planta Med. 2002. vol. 68, p. 836-838.
29
dermatofitos. La mayoría de los compuestos mostraron valores de MIC de 500
µg/mL. Durante este año, los mismos autores evaluaron la actividad tripanocida y
antinfúngica de extractos de diclorometano obtenidos de Calea uniflora, estos
extractos mostraron una mayor actividad tripanocida, lisando el 99% de los parásitos
y solo mostró una zona de inhibición para dos dermatofitos (Trichophyton rubrum y
Trichophyton mentagrophytes)7.
Yamada y colaboradores utilizaron las hojas de Calea urticifolia (170 g) las cuales
se extrajeron con acetona para obtener un extracto bruto (9,8 g). Demostraron que
las hojas de Calea urticifolia posee diversas propiedades biológicas, tales como
actividades citotóxicas, antibacterianas y antifúngicas. Se aislaron cinco
heiangólidos, ocho derivados de isoeugenol y un derivado de floroglucinol de la
planta. Dicha actividad citotóxica se evaluó frente a células de leucemia humana
las cuales se mantuvieron con medio RPMI que contenía suero bovino fetal al 10%
a 37ºC en CO2 al 5%. La citotoxicidad se evaluó mediante el método MTT lo cual
dio como resultado una viabilidad en concentración del 50% además el componente
4 de Calea lactona C y 2,3-epoxijuanisulamina revelaron una actividad citotóxica
más potente que la partenolida. Los compuestos 5, 6 y 7 se identificaron como
Calea D y el compuesto 3 como Calealactona B. Concluyeron que estos
compuestos tienen un uso potencial para el tratamiento gástrico (úlceras)29. Onzaga
y colaboradores demostraron mecanismos de acción inducidos por el extracto
etanólico y la fracción flavonoide acetilada de C. prunifolia la cual disminuyo en
función de la dosis (5-75 mg/kg iv) sin afectar la frecuencia cardiaca de las ratas
Wistar, el extracto de la fracción flovoide relajaron los anillos de la aorta contraídos
con KCl (80nM) y fenilefrina (1µM) con valores de CI 50 de 35 y 67 µg/mL, y 34 y
66 µg/mL30. Dos años más tarde con Calea zacatechichi una planta utilizada por los
29 YAMADA, Masashi. Et al. Germacranolides from Calea urticifolia. En: Phytochemistry. 2004. vol. 65, p. 3107–3111. 30 ONZAGA, Ingrid, RINCON, Javier y GUERRERO, Mario. Perfil vasodilatador del extracto y la fracción flavonoide acetilada obtenida de Calea prunifolia HBK. En: Colombia Médica. 2008. vol. 39, no. 1.
30
indígenas Chontales del estado mexicano de Oaxaca para la oniromancia. Wu y
colaboradores tomaron las partes secas y en polvo de C. zacatechichi (1,4 kg) a
temperatura ambiente con metanol por percolación con el fin de aislar varias
lactonas sesquiterpénicas conocidas de esta especie las cuales fueron: Calaxin y
ciliarin, los germacranólidos, 1β-acetoxyzacatechinolide, l-oxozacatechinolide,
caleocromos A y B y las caleicinas I y II. Los compuestos se identificaron por sus
estructuras químicas y la literatura. Los compuestos 2-6 eran lactonas
sesquiterpénicas conocidas y se determinaron sus fórmulas moleculares por
HRESIMS el compuesto 1, denominado calealactona D, que se obtuvo en forma de
cristales incoloros y el compuesto 2 (calealactona C) demostraba citotoxicidad
contra las células U937 de la leucemia humana (IC50 1.0 μM). Además, mostró una
actividad antibacteriana débil contra Mycobacterium (IC50 44,0 μM), mientras que
los compuestos 1-6 no mostraron actividad antifúngica y antibacteriana. Finalmente,
se dedujo que la hierba se emplea contra desórdenes gastrointestinales31.
Seguido Gómez y colaboradores estudiaron la actividad anti-inflamatoria de
metabolitos secundarios de Calea prunifolia y C.peruviana a partir de un extracto
etanólico de sus hojas, las serquiterpenlactonas presentes en estos extractos donde
el compuesto 1 (3.3 mg) arroja un 58% de inhibición similar a la indometacina, lo
cual lo propone como un nuevo modelo biológico de investigación con capacidad
anti-inflamatoria32. Puebla y colaboradores realizaron estudios, evaluando el efecto
de compuestos en Calea prunifolia, para desempeñar un papel como anti-
adrenérgico. Como resultado se obtuvo gran desempeño anti-adrenérgico por parte
del compuesto glucósido diterpenoide de la planta6. En este año se evaluó la
actividad antiinflamatoria tópica de la planta donde 2 moléculas derivados de p-
hidroxiacetofenona mostraron modulación de las enzimas COX y LOX implicadas
en la síntesis de prostaglandinas, dando como resultado el evento inflamatorio
31 WU, Hankui. Et al. Antileishmanial Germacranolides from Calea zacatechichi. En: Planta Med. 2011. vol. 77, p. 749–753. 32 MARCHETTI, Gabriela. et al. The anticancer activity of dichloromethane crude extract obtained from Calea pinnatifida. En: Journal of Experimental Pharmacology. 2012. vol. 4, p. 157–162.
31
disminuido. Los autores concluyeron, que los compuestos aislados de Calea
prunifolia modificados sintéticamente podrían mejorar la actividad anti-inflamatoria
con el objetivo de lograr un compuesto activo y seguro. Seguido de Gómez,
González y colaboradores registraron actividad antiinflamatoria de Calea prunifolia
y C. americana los fracciones terpenicas de los extractos de estas plantas mostraron
una actividad antinflamatoria significativa en un edema auricular inducido por TPA
(acetato de tetradecanoilforbol) 33. Al año siguiente se demostró el potencial
acaricida contra larvas de Rhipicephalusortiz microplus y R.sangineus de extractos
n-hexano de Calea serrata, mostrándose una inhibición significativa a una
concentración de 3 y 6 mg/mL del compuesto con una reducción de la actividad
acetilcolinesterasa (AChE) en áreas homogenizadas del cerebro de ratas Wistar y
actividad acaricida del 80 al 100% en larvas Rhipicephalus con concentraciones de
3,12 y 6.25 mg/mL, finalmente los investigadores proponen el enfoque de este
compuesto en enfermedades como Alzheimer, Parkinson, Miasteria gravis y
acaricidas. Hallazgos como los de Marchetti y colaboradores reportaron actividad
anticáncer con extractos de diclorometano crudo (DCE) obtenidos de Calea
pinnatifida, donde la actividad anticáncer fue determinada por la reducción relativa
de peso y volumen del tumor en las ratas, con concentraciones de 100 mg/kg de
DCE el cual fue administrado de forma intra peritoneal como tratamiento cada 48
horas inhibiendo el 66.7% el peso relativo del tumor 32. Avella y colaboradores
evaluaron el efecto cardiovascular en ratas y demostraron que la fracción butanólica
de las hojas de Calea prunifolia produce efectos vaso relajantes en el músculo liso
de la rata y efectos hipotensores en ratas anestesiadas33. Para el año 2015, Lima y
colaboradores se evaluaron la actividad leishmanicida, analizaron una fracción de
hojas de C. pinnatifida con el fin de determinar sus componentes químicos y evaluar
si estos poseían actividad leishmanicida, lo que resultó en el aislamiento y la
caracterización de cuatro cromenos conocidos: 6-acetil-7-hidroxi-2,2-
33 AVELLA, María. et al. Effects of the butanol-containing fraction from leaves of Calea prunifolia H.B.K. on blood pressure and smooth muscle responses of Wistar rats. En: Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm., 2014. vol. 43, no. 2, p. 284-299.
32
dimetilcromeno (1), 6-acetil-7-metoxi -2,2-dimetilcromeno (2), 6- (1-hidroxietil) -7-
metoxi-2,2-dimetilcromeno (3) y 6- (1-etoxietil) -7-metoxi-2,2-dimetilcromeno,
demostrando que los compuestos 2 y 3 presentaban actividad leishmanicida
moderada9.
Un año más tarde Salaga y colaboradores evaluaron los efectos
neurofarmacológicos y efectos antinociceptivos del extracto acuoso de la planta
mexicana Calea zacatechichi y sugirieron que dicho extracto tiene efectos
neurofarmacológicos insignificantes in vivo y reduce la percepción del dolor
abdominal, observaron que el extracto acuosos de la planta no afectó las funciones
neurológicas básicas o la ansiedad y el comportamiento exploratorio en ratones
después de la administración oral y efecto antinociceptivo significativo en el modelo
de dolor abdominal34. Recientemente Rivera y colaboradores, analizaron infusiones
de Calea ternifolia, las cuales demostraron controlar los niveles de glucosa
desempeñando actividad anti hiperglutamica efectiva35. En este mismo año Salvan
da Rosa y colaboradores, evaluaron los efectos antiinflamatorios de extractos y
compuestos obtenidos a partir de C. uniflora, demostrando que esta planta posee
importantes efectos antiinflamatorios, incluyendo la inhibición de la migración de
leucocitos y la reducción del grado de exudación. Además sugirieron que estos
compuestos tienen el potencial de convertirse en nuevos compuestos para el
desarrollo futuro de fármacos antiinflamatorios36.
34 SALAGA, Maciej. et al. Neuropharmacological characterization of the oneirogenic Mexican plant Calea zacatechichi aqueous extract in mice. En: Metab Brain Dis. Junio, 2016. vol. 31, no.3, p. 631-41. 35 ESCANDÓN RIVERA, Sonia. et al. Anti-Hyperglycemic Activity of Major Compounds from Calea ternifolia. En: Molecules. 2017. vol. 22, no. 289. 36 SALVAN DA ROSA, Julia. et al. Calea uniflora Less. attenuates the inflammatory response to carrageenan-induced pleurisy in mice. En: International Immunopharmacology. 2017. vol. 42, p. 139–149.
33
5. MARCO CONCEPTUAL
5.1. GÉNERO CALEA
Calea es un género botánico perteneciente a la familia de las asteráceas, la cual
comprende alrededor de 291 especies descritas. Son plantas ampliamente
distribuidas en el mundo, crecen en diferentes pisos climáticos y varias zonas
tropicales, desde México hasta Brasil, hace tiempo estos países han considerado
estas plantas como promisorias y de amplio uso debido al gran potencial bioactivo
donde se les atribuyen como: antiinflamatorias, antimicrobianas entre otras37.
5.1.1. Calea prunifolia.
5.1.1.1. Descripción. Calea, deriva del griego “calos”, bello, posiblemente alude a
los capítulos florales; prunifolia, del nombre Prunus (género de Rosáceas) y folium,
-ii n. = hoja; por la similitud de sus hojas con las de algunas especies de este género
de plantas38.
Es un arbusto de 1.5 a 3.5 metros de altura en promedio, pero puede llegar hasta
los 5 metros con ramas y láminas ásperas. Sus hojas simples, opuestas, decusadas,
margen dentado, envés con pubescencia blanquecina y nerviación prominente,
37 ROBS y GREEMN. “5.3.Calea prunifolia lamina XXII”. Internet: http://bibdigital.rjb.csic.es/Imagenes/Ff(8)MUT_Fl_Exp_Bot_N_Gra_48/MUT_Fl_Exp_Bot_N_Gra_48_070.pdf 38 HIGUITA, David. et al. Calea prunifolia Kunth. “Guía Ilustrada Flora Cañón del río Porce, Antioquia. EPM”. Internet: https://www.epm.com.co/site/Portals/Descargas/2015/rio_porce/Guia_Ilustrada_canon_de_rio_Porce_Antioquia_Flora.pdf Imagen 1, HIGUITA David et al. Calea prunifolia Kunth. [Fotografía] Guía Ilustrada Flora Cañón del río Porce, Antioquia. EPM E.S.P. Universidad de Antioquia, Herbario Universidad de Antioquia - Medellín, Colombia. 264 p. 2014. Imagen 2, GÓMEZ Milton. Calea Prunifolia [Fotografía] Determinación de actividad anti-inflamatoria de sesquiterpenlactonas aisladas de Calea, Bogotá. Universidad Nacional De Colombia, 23 p. 2010, Tomada en Ocaña, Norte de Santander, J Calle.
34
sésiles o con pecíolos cortos. Sus flores dispuestas en conjunto naciendo
agrupadas de un mismo tallo, con colores que van desde amarillo pálido hasta
anaranjado39
Imagen 1, Flores de la planta Calea prunifolia Tomado de:
http://www.biovirtual.unal.edu.co/es/colecciones/result/species/Calea%20prunifolia
/plants/.
39 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. “Colecciones herbarios Calea prunifolia”. Internet:
http://www.biovirtual.unal.edu.co/es/colecciones/result/species/Calea%20prunifolia/plants/
35
Imagen 2. Calea prunifolia (Ocaña norte de Santander)
5.1.1.2. Distribución geográfica. Nativa de América tropical, se distribuye desde
Costa Rica hasta Ecuador. En Colombia, se distribuyen en bosques húmedos entre
0 y 1500 metros de altitud, según las colecciones de los herbarios de la Universidad
Nacional de Colombia con Calea prunifolia se registra una amplia distribución en
departamentos como: Caldas, Cundinamarca (Cerro de la Conejera), Chocó,
Santander (Cañón de Chicamocha), Valle del cauca, Norte de Santander, Tolima,
Huila, Antioquia, Nariño (región biogeográfica del páramo), Cauca y Archipiélago de
San Andrés, Providencia y Santa Catalina utilizandose en medicina popular para el
tratamiento de la hipertensión arterial, la fiebre alta y la malaria40.
40 CASTRO DIAZ, Sandra Liliana. Evaluación de la actividad citotóxica de extractos y fracciones de
Isertia laevis empleando líneas celulares derivadas de tumores humanos. Trabajo de grado de Bióloga. Bogotá D.C.: Pontificia Universidad Javeriana. 2006.
36
5.2. CITOTOXICIDAD EN MODELOS IN VITRO
La toxicidad celular se explica como una alteración de las funciones celulares
básicas la cual lleva a un daño que puede ser detectado. Diferentes autores han
desarrollado diferentes pruebas in vitro para determinar efectos tóxicos producido
por compuestos y fármacos empleando modelos experimentales como cultivos
primarios y órganos aislados como líneas celulares establecidas41.
Los ensayos más conocidos y validados son, la reducción del MTT el ensayo de
captación del rojo neutro, el enlazamiento al azul de kenacid, ensayo de viabilidad
con azul de tripano y ensayos de citotoxicidad en glóbulos rojos.
5.2.1. Ensayo de MTT. Uno de los métodos más empleados en pruebas de
citotoxicidad in vitro con la ventaja que es un método efectivo y cuantitativo a
diferencia de otros métodos colorimétricos que son cualitativos, y el cual se utilizó
en este trabajo. Este ensayo mide la función metabólica de las células presentes en
un cultivo tras la exposición a un compuesto. Es método colorimétrico el cual mide
la formación de un compuesto coloreado proporcional a la reacción mitocondrial de
las células viables El Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT)
es un colorante amarillo pálido, captado y reducido por las células viables a
formazán mediante la enzima succínico deshidrogenasa mitocondrial42. Finalmente,
la reducción de formazán por las células es cuantificada por espectrofotometría a
una longitud de onda de 540 nm.
41 ESCOBAR, Linamaría. RIVERA, Augusto y ARISTIZÁBAL, Fabio. Estudio comparativo de los
métodos de resazurina y MTT en estudios de citotoxicidad en líneas celulares tumorales humanas. En: Revista de la facultad de química farmacéutica. 2010. vol. 17, no. 1, p. 2145-2660 42 ARENCIBIA, Daniel. ROSARIO, Luis y CURVECO, Dayisell. “Principales ensayos para determinar
la citotoxicidad de una sustancia, algunas consideraciones y su utilidad”. Internet: https://www.sertox.com.ar/img/item_full/19003.pdf
37
5.2.2. Ensayo de captación del rojo neutro. Este método evalúa la toxicidad
generada por un compuesto a corto o largo tiempo dada por la liberación de rojo
neutro en consecuencia a la pérdida celular.
Este ensayo se emplea para medir células vivas por captación del colorante rojo
neutro (Básico rojo 5, Toluene red), Las células viables captan el colorante mediante
transporte activo y lo integran al lisosoma mientras que las células no viables no lo
hacen. Seguido el colorante es incorporado, las células son lavadas y fijadas. El
colorante incorporado es liberado de las células utilizando una solución etanólica
ácida. La liberación del colorante al medio indica la pérdida de la viabilidad por
acción del compuesto que se evalúa ya que solo las células viables son capaces de
retenerlo en su interior43. La cantidad de rojo neutro incorporado por la célula a
través de endocitosis es proporcional a la viabilidad celular y cuantificada mediante
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
5.2.3. Ensayo de enlazamiento al azul de kenacid. A través del enlazamiento al
azul de kenacid, otra técnica empleada para la determinación de citotoxicidad, se
exponen las células al colorante el cual es retenido por estas y se enlaza a
proteínas44. Este ensayo mide el contenido de proteínas totales mediante
proliferación celular, por lo tanto, al afectar el crecimiento celular, se reduce el
número de células en el cultivo y la concentración de proteínas presentes constituye
un índice de toxicidad44. Por último, se determina la cantidad de azul de kenacid
retenido por las células mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 570
nm y se cuantifica el porcentaje de inhibición del crecimiento celular.
43ACEVEDO FERNÁNDEZ, Juan José. Modelos in vitro para la evaluación y caracterización de
péptidos bioactivos. Disponible en Internet: (http://www.omniascience.com/monographs/index.php/monograficos/article/download/38/6) 44 CORTIJO PALACIOS, Libia. Evaluación de la citotoxicidad de una nueva diazocina en la Línea
Celular LNCaP. Tesis de Maestría en Neuroetiologia. México: Universidad Veracruzana, 2013.
38
5.2.4. Ensayo de viabilidad con azul de tripano. Este evalúa la viabilidad de
células por exclusión de captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células
vivas con membranas íntegras. Es considerado como un método de exclusión de
células no viables, ya que al estar afectada la permeabilidad de la membrana celular
hay tinción de la célula. Esto permite contar células excluyentes del colorante
(viables) como también células teñidas (no viables). El recuento puede ser realizado
manualmente observándose bajo el microscopio haciendo uso de un hemocitómetro
de Neubauer. Es un método económico que requiere sólo una pequeña fracción de
células y es utilizado generalmente para determinar la concentración de células
(número células/ml) en cultivos44. Además no es necesario para realizar conteos
simples de células, sin embargo, es imprescindible para diferenciar entre las células
muertas de las vivas con membranas íntegras.
5.2.5. Ensayo de hemólisis en glóbulos rojos. Es una prueba que consiste en
exponer el glóbulo rojo a diferentes concentraciones de unas moléculas que
potencialmente puede alterar la membrana del glóbulo rojo, provocando la
presencia o ausencia de hemólisis, por consiguiente, si dicha alteración ocurre
habría lisis y se observará con coloración en el sobrenadante del ensayo.
Una de las ventajas del uso de este ensayo es que indicará que tan dañinas podrían
ser las moléculas en caso de estar en contacto con las células de la sangre. Esta
actividad se evaluó midiendo la cantidad de hemoglobina del sobrenadante usando
un espectrofotómetro a una longitud de onda l=500 nm.
5.3. MICROORGANISMOS
5.3.1. Familia Enterobacteriaceae. Son microorganismos Gram negativos que se
caracterizan por ser bacilos no o móviles o móviles por flagelos peritricos, no
39
esporulados, reducen los nitratos (algunos), anaerobios y son oxidasa negativa.
Habitan principalmente en el tubo digestivo, aunque también se pueden encontrar
en diversos ambientes como el agua, suelo, las plantas y en la microbiota intestinal
normal de muchos animales incluyendo el hombre. Tienen la capacidad de colonizar
además del tubo digestivo, la orofaringe, el aparato genitourinario y la piel45.
5.3.1.1. Patógenos específicos.
- Escherichia coli. Es un bacilo Gram negativo que habita normalmente en el
intestino de animales incluyendo el hombre. Se caracteriza bioquímicamente por ser
indol positivo, fermentador de lactosa y manitol, lisina descarboxilasa y producir gas
a partir de glucosa. Se transmite al hombre principalmente por el consumo de
alimentos contaminados, como productos de carne picada cruda o poco cocida,
leche cruda, y hortalizas y semillas germinadas crudas contaminadas46.
Las cepas de E. coli causantes de diarrea se ha clasificado en seis patotipos: E.
coli enteropatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica (EHEC),
enteroinvasiva (EIEC), con adherencia difusa (DAEC) y enteroagregativa (EAEC).
Escherichia coli enterotoxigénica es la causa más común de deshidratación por
diarrea en niños de menos de dos años y es la principal causa de la diarrea del
viajero, son cepas productoras de toxinas causantes de diarreas secretoras.
Escherichia coli enteropatógeno es una causa importante de diarrea en neonatos
en países subdesarrollados, se caracteriza por producir diarrea exudativa debido a
que provoca una lesión en la mucosa intestinal. Escherichia coli enteroinvasora
producen un cuadro disentérico ya que tiene la capacidad de invadir y destruir el
epitelio intestinal, es de gran importancia en niños de seis meses de edad.
Escherichia coli enterohemorrágica se encuentra asociada con brotes causados por
45 PUERTA GARCÍA, A. y MATEOS RODRÍGUEZ, F. Enterobacterias. En: Medicine. 2010. vol. 10, no.51, p. 3426-31. 46 BROOKS, Geo. et al. JAWETZ, MELNICK Y ADELBERG. Microbiología médica. 25ª ed. México,
D.F.: McGraw Hill, 2011.
40
alimentos en países desarrollados, causa diarrea con sangre, colitis hemorrágica y
el síndrome urémico hemolítico y púrpura trombocitopénica47,48.
Es el microorganismo de mayor interés clínico debido a que se encuentra asociado
a una gran variedad de enfermedades como gastroenteritis, diarrea del viajero,
colitis hemorrágica y síndrome hemolítico urémico (SHU). Es el patógeno causante
con mayor frecuencia de infecciones de vías urinarias. Los síntomas y signos
consisten en polaquiuria, disuria, hematuria y piuria. La infección del sistema
urinario puede ocasionar bacteriemia con signos clínicos de septicemia46.
- Género Klebsiella. Las especies que se aíslan con mayor frecuencia son K.
pneumoniae y Klebsiella oxytoca. Son bacilos encapsulados no móviles que habitan
normalmente en el suelo y agua. Se pueden encontrar en las superficies mucosas
de mamíferos y en los seres humanos es capaz de colonizar la nasofaringe y el
tracto gastrointestinal49.
Se asocia principalmente a neumonías adquiridas en la comunidad y nosocomiales,
también puede producir infecciones de heridas, de partes blandas y del aparato
urinario. Las neumonías por las distintas especies de Klebsiella se caracterizan por
causar destrucción necrótica de los espacios alveolares, la formación de cavidades
y la producción de esputos hemoptísicos50.
47MOLINA LÓPEZ, José. “Escherichia coli diarrogénica”. Internet:
(http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/escherichia-coli.html). 48 FARFÁN GARCÍA, Ana Elvira. et al. Mecanismos de virulencia de Escherichia coli enteropatógena.
En: Rev Chilena Infectol. 2016. vol. 33, no. 4, p. 438-450 49 LÓPEZ VARGAS, Jaime Alberto y ECHEVERRI TORO, Lina María. K. pneumoniae: ¿la nueva
“superbacteria”? Patogenicidad, epidemiología y mecanismos de resistencia. En: IATREIA. Junio, 2010. vol. 23, no. 2. 50 MURRAY, Patríck. ROSENTHAL, Ken y PFAÜER, Michael. Microbiología médica. 5ª ed. España:
ELSEVIER. 2007
41
- Género Salmonella. Son bacterias Gram negativas móviles no esporuladas y
anaerobias facultativas. Se caracterizan por fermentar glucosa y manosa, producir
H2S y no ser fermentador de lactosa ni sacarosa. Se encuentra ampliamente
distribuido en el medio ambiente puede colonizar a casi todos los animales,
incluyendo aves, reptiles, ganado, roedores, animales domésticos, aves y el ser
humano51.
En el hombre se encuentra principalmente asociado a enfermedades como fiebres
tifoideas y gastroenteritis, aunque también puede producir bacteremias y
septicemias. La fiebre tifoidea es una enfermedad sistémica que se caracteriza por
la aparición de fiebre progresiva asociada a diarrea o estreñimiento. La
gastroenteritis es la forma clínica más frecuente de Salmonelosis, se produce por la
ingestión de alimentos o aguas contaminadas son sintomatología de náuseas,
vómitos, fiebre y diarreas no sanguinolentas52.
5.3.2. Género Acinetobacter. Son cocobacilos Gram negativos que se caracterizan
por ser aerobios estrictos, catalasa positiva y oxidasa negativa. La mayoría de las
especies se encuentran en el ambiente e incluso hacen parte de la microbiota
normal de la piel humana. Acinetobacter baumanii es la especie más representativa
de este género siendo el más frecuente en infecciones intrahospitalarias como
neumonías, sepsis y meningitis; también se encuentra asociado a infecciones de
piel y tejidos blandos, infecciones de heridas e infecciones del tracto urinario53. La
característica más importante de este microorganismo radica en la capacidad de
adquirir resistencia a múltiples antimicrobianos y por ende producir tasas elevadas
51 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Salmonella (no tifoidea)”. Internet: http://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/salmonella-(non-typhoidal) 52 JURADO JIMÉNEZ, R. et al. Fiebre tifoidea y otras infecciones por salmonellas. En: Medicine. 2010. vol.10, no. 52, p. 3497-501. 53 VANEGAS MÚNERA, Johanna Marcela. RONCANCIO VILLAMIL, Gustavo y JIMÉNEZ
QUICENO, Judy Natalia. Acinetobacter baumannii: importancia clínica, mecanismos de resistencia y diagnóstico. Revista CES MEDICINA Volumen 28 No. 2 Julio - Diciembre / 2014
42
de mortalidad (26-68%)54. Los mecanismos de resistencia que posee son los
siguientes: betalactamasas de espectro extendido (BLEE), metalo-beta-lactamasas,
alteraciones de las proteínas ligadoras de penicilina, disminución de la
permeabilidad de la membrana externa, mutación de los sitios blanco e inactivación
de los sitios por enzimas modificantes55.
5.3.3. Género Staphylococcus. Los estafilococos son cocos Gram positivos que
se caracterizan por presentarse en agrupaciones que asemejan racimos de uva,
producen catalasa, fermentan lentamente muchos carbohidratos y producen ácido
láctico. Las especies de mayor relevancia clínica son S. aureus, S. epidermidis y S.
saprophyticus50.
5.3.3.1. Staphylococcus aureus. Es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo,
se caracteriza por ser coagulasa positiva. La colonización más frecuente por S.
aureus es la mucosa nasal, el hombre puede ser portador. Se asocia principalmente
con pacientes con hemodiálisis, diabéticos, pacientes con lesiones cutáneas,
sujetos infectados con VIH y adictos a las drogas56. Es el agente etiológico de
diversas patologías como infecciones cutáneas, intoxicación alimentaria, síndrome
de la piel escaldada, síndrome del shock tóxico, artritis séptica, bacteriemia,
empiema, endocarditis, osteomielitis y neumonía55.
5.3.3.2. Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus epidermidis pertenece al
grupo de estafilococos coagulasa negativos, Hace parte de la microbiota normal de
piel llegando a producir infecciones en esta y anexos. Está asociado con cuadros
clínicos como bacteriemia, endocarditis, heridas quirúrgicas, infecciones del tracto
54 HERNÁNDEZ TORRES, A. Acinetobacter baumanii multirresistente: situación clínica actual y
nuevas perspectivas. Rev Esp Quimioter 2010; 23(1):12-19 55 DÍAZ JIMÉNEZ, Virginia. Acinetobacter baumannii: actualidades. Revista de Enfermedades
Infecciosas en Pediatría Vol. XXIII Núm. 92. 56 CERVANTES GARCÍA, Estrella. GARCÍA GONZÁLEZ, Rafael y SALAZAR SCHETTINO, Paz
María. Características generales del Staphylococcus aureus. Rev Latinoam Patol Clin Med Lab 2014; 61 (1): 28-40
43
urinario, infecciones oportunistas de los catéteres, anastomosis, prótesis y
dispositivos de diálisis peritoneal46.
5.3.4. Streptococcus pneumoniae. S. pneumoniae también conocido como
neumococo es un coco Gram positivo encapsulado en forma de lanceta, se
caracteriza por producir alfa hemolisis en agar sangre y presentar sensibilidad a la
optoquina. Es un patógeno humano que coloniza la bucofaringe, y puede llegar a
diseminarse a pulmones, senos paranasales y oído medio. Se encuentra asociado
frecuentemente a enfermedades como neumonía, meningitis, endocarditis, otitis
media y sinusitis46.
5.3.5. Género Candida. Este género se encuentra constituido por levaduras de
desarrollo unicelular agrupando a más de 150 especies. Estos microorganismos son
parte de la flora normal en el hombre ya que se encuentran ubicadas en piel,
mucosas y aparato gastrointestinal57.
Las especies de Candida crecen generalmente en medios aerobios con pH entre
2.5 a 7.5 y una temperatura entre 25 a 37°C creciendo como levaduras ovales en
gemación con un tamaño entre 3 a 10 µm, forman pseudohifas cuando estas
continúan creciendo, no se desprende generando células alargadas constreñidas
con tabiques. Los agentes causales más comúnmente involucrados en micosis
sistémicas en el hombre son: C. albicans,C. glabatra, C. parasilopsis C. dubliniensis
C. tropicalis y Candida guillermondii58.
5.3.5.1. Candida albicans. C. albicans es la especie más patógena dentro del
género Candida, es el principal agente etiológico aislado en infecciones fúngicas
57 Washington C. et al. Koneman Diagnóstico microbiológico: Texto y Atlas en color. 6ª Ed. Estados
Unidos.Panamericana 2012,482 p. 58 ARENAS Guzmán, Roberto. Micología Médica Ilustrada. Universidad Nacional Autónoma de
México. Capítulo 20. Pág. 218.
44
humanas, y relacionada con mayor frecuencia en infecciones a nivel de mucosas:
cavidad oral y genitourinaria59.
Entre las características de C. albicans es un hongo dimórfico, se desarrollándose
de forma distinta según la temperatura de crecimiento, como levadura, normalmente
a 37ºC en el huésped, y como hongo de aspecto filamentoso, a 25ºC en la
naturaleza60.
Pertenece al filo Ascomycota y su reproducción es asexual por gemación. En su
forma de levaduriforme presenta un aspecto de células ovaladas o redondeadas, de
3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños grupos, mientras que, en forma
de hongo filamentoso, las células se alargan y tomando la apariencia de filamentos,
pseudohifas o pseudomicelio. El dimorfismo le permite evadir los mecanismos de
defensa relacionados con la inmunidad celular del huésped. Macroscópicamente,
en agar Sabouraud crece formando colonias blancas, blandas, cremosas y lisas60
5.3.5.2. Candida glabatra. Candida glabrata, se consideraba un organismo fúngico
comensal relativamente no patógeno de los tejidos de la mucosa humana.
Inicialmente fue clasificada como Cryptococcus glabratus (1917) y posteriormente
reclasificada como Torulopsis glabrata (1938). Se aísla con mayor frecuencia como
agente de candidiasis vaginal, o en micosis graves en pacientes
inmunodeprimidos61.
En las mujeres afectadas de vaginitis, C. glabrata corresponde a la especie más
predominante después de C. albicans (Instituto municipal de investigación médica).
59 ARENAS Guzmán, Roberto. Micología Médica Ilustrada. Universidad Nacional Autónoma de
México. 60 QUINDOS, Guillermo. Micología Clínica. 2 Ed. Madrid.Elsevier.2015, Capítulo 6. 61 TORRES RODRÍGUEZ, Josep. MORERA, Yolanda y LÓPEZ, Olga. Candida glabrata: UN
PATÓGENO EMERGENTE. https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/micologia/cglabra.pdf
45
Además, se asocia a falla terapéutica por su mayor resistencia a fluconazol, y que
posee factores de virulencia, por lo que debe ser estudiada hasta precisarse su
especie en el laboratorio. En el agar dextrosa Sabouraud, C. glabrata forma
colonias brillantes, de color crema, que son relativamente indistinguibles de las de
otras especies de Cándida, excepto por su tamaño relativo, que es bastante
pequeño.
5.4. MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
5.4.1. Método de dilución. Es el método/técnica que se usa habitualmente para
determinar cuantitativamente la actividad in vitro de los antimicrobianos. Se basa en
la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de
concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio
de cultivo (caldo o agar). Consiste en preparar diluciones del antimicrobiano
utilizando un medio de cultivo ya sea liquido o sólido, se inocula el microrganismo
en estudio y posteriormente se incuba. Transcurrido el tiempo de incubación se
realiza la lectura determinando que concentración logra la inhibición del
microrganismo. La ventaja de las pruebas de microdilución en caldo es que permiten
obtener un resultado cuantitativo, indicando la cantidad necesaria de determinado
fármaco para inhibir al microorganismo investigado62.
5.4.2. Método de difusión. El método más empleado es el ensayo de difusión en
disco. Consiste en colocar un disco de papel impregnado de un antimicrobiano en
la superficie de un medio en donde está sembrado el microorganismo en estudio,
posterior a la incubación se mide el halo de inhibición que rodea el disco. El halo
de inhibición se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración
mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución. Para obtener la CMI se
62 PICAZO, Juan. “Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos”. Internet: (https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia11.pdf)
46
debe medir el halo y extrapolarlo en una línea de regresión que expresa la relación
entre el logaritmo de la concentración mínima inhibidora en las pruebas de dilución
y el diámetro de las zonas de inhibición en las pruebas de difusión62.
5.5. RESISTENCIA ANTIMICROBIANA
La resistencia a antimicrobianos es definida por la OMS como “fenómeno por el cual
un microorganismo deja de ser afectado por un antimicrobiano al que anteriormente
era sensible” (OMS). Como resultado los microorganismos, sean bacterias, virus,
hongos o parásitos, sufren cambios que hacen que los medicamentos utilizados
para tratar las infecciones dejen de ser eficaces63.
5.5.1. Tipos de resistencia.
5.5.1.1. Resistencia natural o intrínseca. La resistencia natural o intrínseca es
propia de cada familia, especie o grupo bacteriano y un mecanismo determinado de
manera genética y sin correlación a la dosis del antibiótico64.
5.5.1.2. Resistencia adquirida. La resistencia adquirida es una característica
propia de una especie bacteriana, que por naturaleza es sensible a un antibiótico
pero debido a alguna modificacion genéticamente ya sea por mutación o por
adquisición de genes de resistencia otorgados por plásmidos, transposones e
integrones. La resistencia bacteriana a los antimicrobianos es amplia de este modo
se habla de resistencia en tres niveles: mecanismos resistencia individuales,
63 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. “Resistencia a los antimicrobianos”. Internet:
http://www.who.int/topics/antimicrobial_resistance/es/ 64 VIGNOLI, R. et al. “Principales mecanismos de resistencia antibiótica”. Internet:
(http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Principalesmecanismosderesistenciaantibiotica.pdf)
47
resistencia poblacional y resistencia poblacional en microorganismos que están
produciendo una infección65.
5.5.1.3. Resistencia individual. En la resistencia individual hay una interacción
molecular entre una célula bacteriana con toda su maquinaria genética y metabólica
y un antibiótico determinado. En este tipo de resistencia se encuentran distintas
herramientas con las que cuenta una bacteria para evitar la acción del antibiótico,
refiriéndose a maquinaria genética como los genes. Estos codifican enzimas
capaces de romper distintos antibióticos y se encuentra naturalmente codificado en
el cromosoma del microorganismo66.
5.5.1.4. Resistencia poblacional. Este tipo de resistencia representa el
comportamiento in vitro de una población bacteriana enfrentada a una
concentración determinada de un antibiótico, por un período de tiempo determinado.
Resistencia poblacional en microorganismos que están produciendo una
infección
En esta resistencia se habla de la eficacia terapéutica y juegan otros factores, como
el sitio de infección, las propiedades farmacocinéticas del antibiótico donde se
encuentran incluidas la dosis, el estado inmunológico del paciente, el tamaño del
inóculo bacteriano66.
5.5.2. Mecanismos de resistencia. La gran mayoría de los mecanismos de
resistencia pueden agruparse en 3 categorías64:
1. Inactivación del antibiótico por modificación o hidrólisis
65 AYALA, Franco y SARMIENTO, Luis. Enfermedades infecciosas en ginecología y obstetricia. 1ª
ed. Bogotá. 2018. 66 CENTRÓN, Daniela. “Antibióticos”. Internet: https://docplayer.es/22001506-Antibioticos-dra-
daniela-centron-uba-conicet.htmlhttps://docplayer.es/22001506-Antibioticos-dra-daniela-centron-uba-conicet.html
48
2. Presencia de bombas de eflujo o disminución de la concentración intracelular del
antibiótico por disminución de la entrada de las moléculas del antibiótico.
3. Modificación del sitio blanco de acción.
5.5.2.1. Inactivación del antibiótico. Este tipo de resistencia puede darse por
mecanismos como: Inactivación por hidrolisis e inactivación de transferencia por un
grupo químico64.
5.5.2.2 Inactivación por hidrólisis. Es el tipo de mecanismo más común de
resistencia adquirida y es determinado por la producción de enzimas que hidrolizan
el antibiótico. Uno de los ejemplos más representativos son las betalactamasas:
penicilinasa, cefalosportinas, AmpC, Betalactamasas de espectro extendido BLEE,
Klebsiella pneumoniae carbapenemasas KPC, New metallobetalactamase NDC
estas enzimas inactivan el antibiótico hidrolizando el anillo betalactamico64.
5.5.2.3 Inactivación de transferencia por un grupo químico. En este mecanismo
se da una inactivación por impedimento estérico que causan modificaciones
químicas del antibiótico e impiden su llegada al sitio blanco.
5.5.2.4. Disminución de la concentración a nivel celular
Permeabilidad reducida: En este tipo de mecanismo la bacteria es capaz de
reducir el número de canales por donde ingresa el antibiótico, dadas por porinas
OmpF y OmpC y resistencias a los carbapenémicos.
Bombas de eflujo: Las bombas de eflujo se encuentran en la membrana celular y
allí llevan a cabo la internalización y expulsión de los antimicrobianos. Estas bombas
proveen resistencia antimicrobiana tanto en bacterias Gram positivas como en Gram
negativas. Este tipo de resistencia de eflujo de antibióticos es mediado por proteínas
transmembranales. En el caso de las bacterias Gram negativas involucra también
49
componentes en la membrana interna, periplásmica, externa. Estas proteínas
forman canales que exportan activamente a un agente antimicrobiano fuera de la
célula tan rápido como entra, confiriendo resistencia a antimicrobianos como:
cloranfenicol, betalactámicos, tetraciclinas y quinolonas67
5.5.2.5. Modificación de los blancos. La modificación o alteración del sitio de
unión del antimicrobiano se traduce en una pérdida de la afinidad y por ende le
impide ejercer su acción. La modificación de un aminoácido genera un blanco
diferente y así disminuye la afinidad de unión por el antimicrobiano.
5.2.5.6 Modificación en el blanco molecular por mutaciones: Se reportan
diferentes mecanismos entre los cuales diferentes bacterias poseen copias de
genes que actúan sobre el antibiótico. Es el caso de Modificación de PBP ( penicilin
- binding - protein): es un complejo enzimático que permite la síntesis del
peptidoglicano, compuesto de pared celular de bacterias principalmente
grampositivas. Si se produce la mutación del sitio de unión al antimicrobiano como
los betalactámicos, estos no pueden actuar y se genera resistencia al
antimicrobiano.
5.2.5.7 Modificación y protección del blanco molecular. En este mecanismo
existe una modificación ribosoma en donde genes como: ermA y ermB modifican el
sitio activo del ribosoma mediante metilación, mecanismo importante en la
resistencia a macrólido, lincosamidas, y estreptograminas (MLS) por metilación de
la subunidad 23s ribosomal.
67 CALDERÓN ROJAS, German y AGUILAR ULATE, Leidy. Resistencia antimicrobiana:
microorganismos más resistentes y antibióticos con menor actividad. Revista Médica de Costa Rica y Centroamerica LXXIII (621) 757 - 763, 2016.
50
6. METODOLOGÍA
6.1. DISEÑO DE ESTUDIO
Se realizó un estudio de tipo descriptivo en donde se evaluó la efectividad de dos
moléculas aisladas de Calea prunifolia como agentes antifúngicos y antibacterianos
en cepas de referencia. El proyecto se llevó a cabo en la Universidad de Santander
UDES sede Bucaramanga, en laboratorios de investigación biomédicas y
biotecnológicos LIBB
6.2. MUESTRA
Se seleccionaron microorganismos de interés clínico como: Escherichia coli,
Salmonella enteritidis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y
Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis y Streptococcus pneumoniae, Candida albicans, y
Candida glabrata. La cantidad de cepas incluidas correspondió a la disponibilidad
presupuestal del proyecto. Así mismo, se incluyeron cepas de importancia clínica.
6.3. HIPÓTESIS
Los resultados obtenidos mostrarán que al menos una de las dos moléculas tendrá
potencial inhibitorio contra bacterias u hongos usados en este estudio.
6.4. MATERIALES
6.4.1. Moléculas. Estas moléculas previamente obtenidas en la Universidad del
Quindío fueron extraídas de hojas secas y molidas de Calea prunifolia y se realizó
una extracción etanólica a temperatura ambiente y vacío, se usó gel de sílice 60
51
para todas las separaciones junto con cromatografía de capa fina. Las moléculas
fueron aisladas y liofilizadas y enviados a la Universidad de Santander UDES para
su uso en pruebas antimicrobianas (Particularidades fisicoquímicas de las
moléculas no están disponibles aun debido a que se encuentran otros estudios en
proceso y de nombre confidencial).
6.4.2. Preparación de las moléculas. Las moléculas fueron recibidas en liofilizados
con masas reportadas de 98.7 mg para la molécula 1 y 25 mg para la molécula 2
las mismas fueron resuspendidas en DMSO para lograr una homogenización plena
de cada liofilizado. Las moléculas se diluyeron en medio DMEM a concentración
final de 4935 µg/ml para la molécula 1 y 12500 µg/ml para la molécula 2. Esta
dilución garantizo una concentración final de DMSO fuera inferior al 5%.
6.4.3. Microorganismos. Para la evaluación de la actividad antibacteriana y
antifúngica se seleccionaron microorganismos de interés clínico como: Candida
albicans, Candida glabrata, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Los microrganismos fueron
mantenidos en medios de cultivo estándar en el laboratorio de Investigaciones
Biomédicas y Biotecnológicas LIBB del programa de Bacteriología y Laboratorio
clínico Universidad de Santander. En la tabla 1 se listan los microorganismos
usados en el presente estudio.
52
Tabla 1. Microorganismos utilizados para los ensayos antimicrobianos
Nombre del Microorganismo Referencia de la cepa
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli ATCC BAA 2340
Kebsiella pneumoniae ATCC 1705
Kebsiella pneumoniae ATCC 2146
Salmonella entérica subsp. Entérica serovar enteritidis
ATCC 31194
Acinetobacter baumannii ATCC 19606
Candida albicans ATCC 22972
Candida grabata ATCC 90030
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
6.4.4 Solución de Rezasurin. El rezasurin es un indicador de óxido-reducción
utilizado para evaluar el crecimiento celular que varía de azul a rosa cuando se
reduce a resolufin por acción de las oxido reductasa dentro de las células viables.
La solución de rezasurin se preparó agregando 1,5 mg por 100 mL de agua
destilada estéril y se mezcló en un vortex la solución.
6.4.5. Células de mamífero. Se usaron líneas epiteliales Vero (Riñón de mono
verde africano) cultivadas en el laboratorio de Investigaciones Biomédicas y
Biotecnológicos LIBB, en condiciones estándar mantenidas en medio DMEM
suplementado con 10% de suero bovino fetal incubadas a 37°C en la atmósfera con
5 % de CO2. Estas células fueron utilizadas para realizar los ensayos de
citotoxicidad de las moléculas por el método de MTT.
53
6.4.6. Eritrocitos humanos. Se utilizaron glóbulos rojos (GR) humanos O+
provenientes de sangre obtenida de una donante femenina sana con hematocrito
de 42%. Los glóbulos rojos fueron lavados 3 veces con solución salina previamente
a su uso para ser usados en los ensayos de actividad hemolítica en eritrocitos
humanos.
6.5. PROCEDIMIENTOS
6.5.1. Ensayos de toxicidad. Los experimentos se realizaron con el fin de
determinar el potencial citotóxico de las dos moléculas aisladas de Calea prunifolia.
Esta medición se realizó en células de mamífero por el método colorimétrico MTT y
en glóbulos rojos humanos por ensayo de actividad hemolítica, descritos a
continuación.
6.5.2. Ensayos de toxicidad en células de mamífero. Se evaluó el potencial
citotóxico de las moléculas mediante el método colorimétrico empleando el
compuesto 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 bromuro difeniltetrazolio (MTT) que es
reducido por las deshidrogenasas mitocondriales de células viables a formazan, que
como producto de la reacción se observa de color púrpura. Cuanto mayor sea la
concentración de formazan, se interpreta como mayor actividad metabólica, y en
consecuencia, mayor viabilidad celular.
Brevemente 10.000 células vero sembradas 48 horas antes fueron sometidas a 8
concentraciones diferentes de cada molécula (800 µg/mL , 400 µg/mL, 200 µg/mL,
100 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL, 12.5 µg/mL, 6.25µg/mL),posteriormente incubadas
24 horas a 37°C con atmosfera de 5% de CO2 .Luego se agregó a cada pozo 20µL
de MTT a una concentración de 5 mg/ml y se incuba durante 4 horas a 37°C. El
sobrenadante fue retirado y los cristales de formazan fueron resuspendidos
agregando 100 µL de DMSO en cada pozo con agitación continua durante 10
minutos, seguido la placa fue leída a u na longitud de onda de 540 nm. Los ensayos
54
fueron realizados en dos placas por triplicado, como control positivo se usaron
células sin tratamiento, como control negativo el porcentaje de muerte celular fue
calculado al comparar la absorbancia de la molécula analizada con la absorbancia
del control de crecimiento. Se estimó la concentración inhibitoria 50 (CI50)
entendido como concentración de un compuesto necesaria para reducir el
crecimiento de la población de células en un 50% calculado por regresión lineal.
6.5.3. Ensayo de toxicidad en glóbulos rojos. Este ensayo determina la actividad
lítica en eritrocitos humanos cuando están en contacto con las diferentes
concentraciones de las moléculas (400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL,
25 µg/mL, 12,5 µg/Ml, 6,25 µg/Ml, 3,12 µg/mL y 1,56 µg/mL) con el fin de determinar
si se presenta algún daño en la membrana del eritrocito. Esta actividad se cuantifica
midiendo la cantidad de hemoglobina del sobrenadante usando un
espectrofotómetro. La concentración de hemoglobina del sobrenadante es
proporcional a la cantidad de hemolisis que se presenta.
Brevemente, se partió de la toma de sangre de glóbulos rojos humanos con citrato
de sodio al 3,2% se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos, descartando el
plasma. Posteriormente, los glóbulos rojos fueron lavados tres veces con SS. Se
prepararon suspensiones de los glóbulos rojos al 4 % en SS. Las placas se
incubaron a 37 ºC durante 2 horas, centrifugándose posteriormente a 3500 rpm
durante 30 segundos. El contenido de hemoglobina en el sobrenadante se
determinó en un lector de placas de ELISA a 550 nm. Para el control positivo se
utilizó tritón x-100 y para el control negativo se utilizó SS, a ninguno de los controles
se le añadió las moléculas.
El porcentaje de hemólisis se estimó comparando la absorbancia del tratado versus
los glóbulos rojos sin tratamiento.
55
6.5.4. Ensayos antibacterianos y antifúngicos.
6.5.4.1. Preparación del cultivo. Las cepas Escherichia coli, Kebsiella
pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Salmonella enteritidis, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Candida albicans
y Candida glabrata fueron reactivadas previamente en caldo Mueller Hinton para la
preparación del inóculo. El inóculo se preparó utilizando una suspensión de
microorganismo que a 530 nm mostraran una densidad óptica entre el rango de 0,5
a 1,0 Abs. Esto correspondía a un número esperado de 5x106 UFC/Ml.
6.5.4.2. Preparación de las placas de microdilución. Las placas se prepararon
en condiciones totalmente asépticas, y sometidas a luz UV durante 1 hora antes de
su utilización para eliminar cualquier rastro de contaminación que pueda afectar el
resultado del ensayo. La reacción se llevó a cabo en un volumen total de 120 µL
donde los microorganismos fueron expuestos a diferentes concentraciones de las
moléculas se usaron solución de rezasurin como indicador óxido-reducción; la placa
fue incubada a 37°C durante 24 horas. Como controles se usaron: medio de cultivo
y rezasurin (control negativo), microorganismo con antibacteriano/antimicótico de
referencia (fluconazol para hongos a 200 mg/mL, amoxicilina para bacterias Gram
positivas a 250 mg/5mL y ciprofloxacina para bacterias Gram negativas a 5mg/5mL)
y bacteria con medio de cultivo sin inhibidores (control positivo). Los ensayos fueron
realizados por duplicado.
La mezcla de reacción utilizada para los ensayos antimicrobianos se describe en la
tabla 2.
56
Tabla 2. Diseño del experimento de actividad inhibitoria.
Control negativo
Control positivo
Antibiótico Volumen de moléculas
Molécula 1 Molécula 2
Molécula 1 - - - 50µL
Molécula 2 - - - - 50µL
Antibiótico - - 50µL - -
Microorganismo - 10µL 10µL 10µL 10µL
Medio Mueller Hinton
50µL 50µL 50µL 50µL 50µL
Rezasurin 20µL 10µL 10µL 10µL 10µL
Solución salina 0.9%p/v
50µL 50µL - -
* Volumen final: 120 µL
57
7. RESULTADOS
7.1 ENSAYOS DE TOXICIDAD EN CÉLULAS DE MAMÍFERO
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad en células de mamífero fueron
realizados mediante el método colorimétrico MTT. Con estos ensayos de MTT se
logró calcular la CC50 de las dos moléculas analizadas observándose un efecto
dosis respuesta. Se encontró una CC50 para la molécula 1 de 228.9 µg/mL
mostrada en la gráfica 1 y de 241.1 µg/ml para molécula 2 en la gráfica 2.
De acuerdo a los resultados obtenidos se consideró que las dos moléculas poseen
bajo potencial tóxico debido a la CC50 reportada. Esta apreciación está soportada
en el hecho de que en la literatura varios autores arbitrariamente han considerado
que una CC50 >100 µg/ml indica un gran potencial no tóxico del compuesto
evaluado, como indicador de actividad de muestras vegetales y estudios
demuestran relación directa con toxicidad in vivo68 69 70. Lo que posiciona a las
moléculas evaluadas en este proyecto con un CC50 de gran potencial no tóxico ya
que ambas moléculas superan la CC50 estimada como no tóxica propuesta por
varios autores.
68BAYALA B, et al. Anticancer activity of essential oils and their chemical components - a review. Am J Cancer Res. 2014; 4(6): 591-607. 69 STASHENKO E, JARAMILLO B y MARTÍNEZ J. Comparison of different extraction methods for the analysis of volatile secondary metabolites of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, grown in Colombia, and evaluation of its in vitro antioxidant activity. J Chromatogr A. 2004; 1025(1):93-103. 70 STASHENKO E, et al .Chromatographic and mass spectrometric characterization of essential oils and extracts from Lippia (Verbenaceae) aromatic plants. J Sep Sci. 2013; 36(1):192-202.
58
Gráfica 1. Porcentaje de viabilidad celular vs diferentes concentraciones de la
molécula 1.
Gráfica 2. Porcentaje de viabilidad celular vs diferentes concentraciones de la
molécula 2.
59
7.2 ENSAYO DE TOXICIDAD EN GLÓBULOS ROJOS
En los resultados obtenidos de los ensayos de toxicidad de glóbulos rojos se
observó ausencia de hemólisis en todas las concentraciones evaluadas, dicha
hemólisis determinada por lo valores de absorbancia en la detección de
hemoglobina. Esto sugirió que la membrana del eritrocito no sufriría ninguna
alteración estructural que facilite la hemólisis del glóbulo rojo.
Cabe resaltar que se observaron las células al microscopio óptico después de
realizada la experimentación, en esta observación se encontró que los glóbulos
rojos tratados con las moléculas sufrieron una deformidad sugestiva de crenación;
por lo tanto, esto propondría que las moléculas no indujeron hemólisis; pero si un
cambio de osmolaridad que favoreció el fenómeno observado.
Imagen 3, Ensayo de citotoxicidad de glóbulos rojos
Filas: A, B, C, D Molécula 1 (Concentraciones de las moléculas de Calea prunifolia.) E, F, G, H Molécula 2 (Concentraciones de las moléculas de Calea
prunifolia.). Columnas: 10: Control positivo, 11: Control negativo.
60
7.3 ENSAYOS ANTIMICROBIANOS
Para evaluar el crecimiento celular se utilizó la solución de rezasurin que varía de
azul a rosa cuando se reduce a resolufin por acción de las óxido reductasa dentro
de las células viables, con la adición de rezasurin se realizó una descripción
cualitativa de la concentración mínima inhibitoria y correspondió a aquella en donde
se observó la variación de color azul a rosa (indicador de viabilidad). Las moléculas
presentaron efecto inhibitorio contra los dos hongos evaluados en este estudio
(Candida albicans y Candida glabrata), las moléculas de Calea prunifolia inhibió el
crecimiento fúngico a una concentración de 1,56 µg/mL. Con respecto a las
bacterias solo se encontró inhibición contra Streptococcus pneumoniae a una
concentración de 12,5 µg/mL. Por otro lado, las moléculas no mostraron inhibición
en las otras cepas a las diversas concentraciones estudiadas (Tabla 3).
Las moléculas de Calea prunifolia mostraron una buena actividad inhibitoria contra
hongos con una MIC de 1,56 µg/mL mostrando un índice de selectividad de 146.7,
el cual indica las veces en que es posible concentrar la molécula sin que se
produzca un efecto citotóxico.
Imagen 4, Ensayo antimicrobiano
Filas: A y B Staphylococcus epidermidis ATCC 14990. C y D Streptococcus
pneumoniae ATCC 49619. E y F Candida albicans ATCC 22972. G y H Candida glabrata ATCC 90030. Columnas: 1: Control negativo, 2: Control positivo, 3:
Antibiótico, 4-12: Concentraciones de las moléculas de Calea prunifolia.
61
Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (CIM) de las moléculas de Calea
prunifolia.
Microorganismo CMI (µg/mL)
Molécula 1 Molécula 2
Candida albicans ATCC 22972 1,56 1,56
Candida glabrata ATCC 90030 1,56 1,56
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 12,5 12,5
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 -- --
Staphylococcus aureus ATCC 25923 -- --
Acinetobacter baumannii ATCC 19606 -- --
Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 2146 -- --
Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705 -- --
Escherichia coli ATCC BAA 2340 -- --
Escherichia coli ATCC 25922 -- --
Pseudomonas aeruginosa ATCC 49619 -- --
Salmonella entérica subsp. Entérica
serovar enteritidis ATCC 31194
-- --
--Sin actividad demostrada a concentración de 400 µg/mL
62
8. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Los resultados de viabilidad celular se expresaron como porcentaje (%) de células
según la siguiente relación: densidad óptica de células tratadas por cien dividido en
la densidad óptica de células control.
La CC50 se calculó por análisis de regresión usando el promedio de las mediciones
realizadas en cada concentración de las moléculas.
Las concentraciones inhibitorias de las moléculas en estudio se informan de manera
descriptiva por la variación de color en el ensayo como fue descrito en el método.
63
9. DISCUSIÓN
El uso de compuestos naturales para el tratamiento de enfermedades ha sido tema
de interés desde muchas décadas atrás. El panorama actual de resistencia de
microorganismos a antibióticos ha generado la búsqueda de nuevas estrategias de
tratamiento para estos microorganismos usando moléculas obtenidas de plantas.
Para esto es necesario continuar y potenciar la tendencia en la investigación de
nuevos fármacos a partir de estos productos.
En este estudio se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica de dos moléculas
extraídas de hojas secas y molidas de C. plunifloria. Las moléculas mostraron mayor
actividad contra Candida albicans y Candida glabrata. Sin embargo, al estudiar la
inhibición contra bacterias solo se encontró contra Streptococcus pneumoniae.
La falta de actividad de las moléculas contra las bacterias Gram negativas se puede
explicar desde diferentes puntos de vista. Primero, es posible que su acción frente
a estos microorganismos fuera impedida por su estructura morfológica, dado que
presentan una membrana externa compuesta por lipopolisacárido que les
proporciona una barrera efectiva contra la entrada de antibióticos71, en este caso
contra la entrada de las moléculas. Según Nikaido72 73, la resistencia de las bacterias
Gram negativas a menudo se ha atribuido por completo a la presencia de la barrera
de la membrana externa, ya que la presencia de lipopolisacáridos disminuye la
velocidad de difusión transmembrana de los solutos lipófilos y los canales de porinas
disminuyen la penetración incluso de pequeños solutos hidrófilos. Otros autores
indican que la baja permeabilidad de la membrana externa y el sistema de
71 PÉREZ CANO, Héctor Javier y ROBLES CONTRERAS, Atzín. Aspectos básicos de los mecanismos de resistencia bacteriana. En: Revista Médica MD. Febrero-Abril, 2013. vol. 4, no. 3. 72 NIKAIDO, Hiroshi. Multidrug Efflux Pumps of Gram-Negative Bacteria. En: Journal of Bacteriology. Octubre, 1996. p. 5853–5859 73NIKAIDO, Hiroshi. Bacterial resistance to antibiotics as a function of outer membrane permeability. En: Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1988. vol. 22, p. 17-22.
64
transportadores de membrana como las bombas de eflujo, deben actuar en conjunto
para lograr la excreción activa de los agentes antibacterianos74. Adicionalmente, la
disminución en la expresión o la pérdida de las porinas genera resistencia a agentes
antibacterianos hidrófilos debido a que estas moléculas ingresan a la bacteria a
través de estas proteínas75. Debido a su estructura química anfipática, estas
moléculas podrían ingresar a la bacteria por medio de los canales de porinas o
difusión transmembrana como fue descrito por Nikaido 72, 73. Sin embargo, se
esperaría que ingresara más fácilmente por los canales de porinas.
Por otra parte, se puede sugerir que estas bacterias Gram negativas expresan otros
mecanismos de resistencia que pueden estar implicados en la acción de las
moléculas, fenómeno que ha sido ampliamente descrito. En la literatura se reportan
diferentes modelos de resistencia bacteriana; sin embargo, intentar explicar la baja
efectividad inhibitoria de las moléculas por estos modelos requiere de estudios
posteriores que incluyan diseños experimentales para inferir mecanismos de acción.
La literatura ha reportado que la actividad inhibitoria de un determinado compuesto
depende de la cepa empleada. Mendes y colaboradores demostraron que diversas
moléculas obtenidas de Calea platylepis tuvieron actividad antibacteriana contra
cepas de referencia de Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,
Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli; estos autores demostraron que la
inhibición fue diferente incluso en cepas de la misma especie7. Fue de particular
interés que dentro de las cepas donde Mendes y colaboradores no encontraron
inhibición, coincidieron con cepas del presente estudio con las cuales tampoco se
encontró actividad. Esto podría sugerir que aunque el resultado del presente trabajo
no fue efectivo con las cepas bacterianas incluidas, esto no significa que las
moléculas no tengan efecto en otras cepas de importancia clínica.
74 MARCHETTI, M. ERRECALDE, J. y MESTORINO. N. Resistencia bacteriana a los antimicrobianos ocasionada por bombas de eflujo. Impacto en la multirresistencia. En: Analecta Vet. 2011. vol. 31, no. 1, p. 40-53. 75 NIKAIDO, Hiroshi. Molecular Basis of Bacterial Outer Membrane Permeability Revisited. En: Microbiology and molecular biology reviews, December, 2003. p. 593–656.
65
La actividad antifúngica ha sido demostrada por estos autores, donde los
compuestos evaluados tuvieron efecto frente a Candida albicans, Candida
parapsilosis, Candida glabrata y Trichophyton mentagrophytes con una MIC de 500
µg/mL7. Estos mismos autores demostraron en otro estudio el potencial antifúngico
contra Candida sp y dermatofitos, además de la actividad antitripanocida10. Los
trabajos realizados por Davicino76 y colaboradores demostraron que el uso de
compuestos naturales han tenido potencial antifúngico contra algunos patógenos de
importancia clínica como Candida sp, y Aspergillus niger. Es importante recalcar
que en el presente estudio la inhibición del crecimiento de los hongos evaluados se
logró con solo 1,56 µg/mL (MIC), lo cual propone un gran potencial antifúngico.
Debido a este potencial, es importante incluir otras cepas de hongos en futuros
estudios.
Además del potencial inhibitorio de las moléculas de Calea prunifolia, cabe resaltar
el bajo potencial tóxico encontrado en los modelos celulares estudiados. Se
realizaron ensayos in vitro los cuales permitieron evaluar la actividad citotóxica de
las moléculas mediante ensayos de MTT en línea celular Vero y hemólisis en
glóbulos rojos humanos. Los ensayos de MTT demostraron actividad citotóxica total
para las dos moléculas a una concentración de 400 ug/ml, y CC50 de 228.9 ug/ml
y 241.4 ug/ml para la molécula 1 y 2 respectivamente; teniendo en cuenta estos
valores y la CMI reportada, se puede inferir un índice de selectividad de 146.7 y
154.7 para cada molécula (relación entre toxicidad y capacidad inhibitoria), lo que
confirma la necesidad de continuar su estudio como potencial antimicrobiano a
futuro.
Los ensayos en glóbulos rojos se utilizaron como un modelo de toxicidad en células
primarias humanas. En este ensayo fueron extraídos de un individuo sano y puestos
76 DAVICINO, Roberto. et al. Actividad antifúngica de extractos de plantas usadas en medicina popular en Argentina. En: Rev. Perú. biol. Diciembre, 2007. vol. 14, no. 2, p. 247-251.
66
en contacto con las moléculas de interés a diferentes concentraciones. La presencia
de hemólisis indicaría daño en la membrana celular del glóbulo rojo. En este trabajo,
es de resaltar que a ninguna concentración se encontró hemólisis, aunque se
observó una deformidad sugestiva de crenación cuando se usaron altas
concentraciones de las moléculas; este fenómeno podría asociarse a variaciones
de la osmolaridad en el ensayo y como consecuencia, pérdida de la flexibilidad de
la membrana que evita su lisis.
A pesar de los resultados favorables en los ensayos de toxicidad, se sugiere que
estos indicadores se evalúen en diferentes líneas celulares, dado que ha sido
demostrado que la actividad citotóxica depende del modelo evaluado. Además, es
importante recalcar la necesidad de evaluar estas moléculas en otras cepas
microbianas para definir el alcance de su potencial inhibitorio.
67
10. CONCLUSIONES
Las moléculas de estudio demostraron potencial inhibitorio promisorio contra
hongos de interés clínico, además la actividad contra bacterias no fue muy
eficaz, sin embargo, deben incluirse otras cepas para validar este hallazgo.
Las moléculas presentan baja toxicidad en los modelos celulares estudiados;
se sugiere incluir otros modelos de líneas celulares primarias humanas.
68
11. RECOMENDACIONES
Los resultados del presente trabajo sugieren estudiar el potencial citotóxico de las
moléculas en un panel de líneas celulares distintas. Definir la actividad
antimicrobiana de una molécula debe realizarse incluyendo diferentes cepas de la
misma especie.
Las moléculas de este trabajo deberían seguirse estudiando en futuros estudios,
donde además se pudiera incluir modificaciones estructurales que debiera mejorar
su actividad biológica.
69
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