EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LIPÓLISIS DE Geotrichum ...
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1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LIPÓLISIS DE Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica EN ACEITE DE ORIGEN VEGETAL Y EFLUENTE GRASO DE ORIGEN ANIMAL MAIRA FERNANDA PÉREZ GAMEZ UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO VALLEDUPAR, CESAR 2019
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LIPÓLISIS DE Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica EN ACEITE DE ORIGEN VEGETAL Y EFLUENTE GRASO
DE ORIGEN ANIMAL
MAIRA FERNANDA PÉREZ GAMEZ
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
VALLEDUPAR, CESAR
2019
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LIPÓLISIS DE Geotrichum candidum y
Yarrowia lipolytica EN ACEITE DE ORIGEN VEGETAL Y EFLUENTE GRASO
DE ORIGEN ANIMAL
MAIRA FERNANDA PÉREZ GAMEZ
DIRECTORA
ROSANGELA PÉREZ SALINAS
MAGISTER EN MICROBIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE BACTERIÓLOGA Y
LABORATORISTA CLÍNICO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
VALLEDUPAR- CESAR
2019
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4
Valledupar – 2019
DEDICATORIA
A Dios, por ser mi guía y sostén a lo largo de mi vida, por ayudarme en los momentos
difíciles y regalarme un sinfín de momentos de alegría.
A mis padres, por ser mi motivo para continuar siempre, por ser el motivo por el cual
no desfallezco nunca y ser siempre su orgullo. A quienes en vida me dieron los
mejores momentos y enseñanzas de mi vida, todo mi amor para ellos.
A mis tíos Ludmila y Ricardo, quienes me han ayudado a lo largo de estos años a
realizarme como profesional, pero sobre todo como persona, quienes me abrieron
las puertas de su hogar y me regalaron una familia y dos hermanas que amo y que
siempre han estado para mí.
A mi familia y amigos, por estar en mi vida siempre, por apoyarme, aconsejarme y
no dejarme sola bajo ninguna circunstancia.
A mi directora Rosangela Pérez, por su paciencia, entrega y compromiso para poder
realizar este proyecto.
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AGRADECIMIENTOS
Primeramente, agradecerle a Dios, por permitirme llegar a este momento tan
importante de mi vida; Por haberme dado la fuerza, sabiduría y perseverancia para
vencer y afrontar todas las pruebas y enseñarme infinidad de cosas a lo largo del
camino. Sin él esto no hubiera sido posible.
A mis Padres, Ángela y Fernando, Por su infinito amor, por enseñarme y corregirme
siempre, por ser mí guía y velar siempre por mi bienestar y felicidad. Aunque ya no
estén físicamente, siempre serán mi motivación y sé que su amor permanece
conmigo.
Mi familia y amigos por estar siempre, por su amor e incondicionalidad.
A mi directora Rosangela Pérez por su gran ayuda, por guiarme y transmitir sus
conocimientos para poder realizar este trabajo.
Finalmente, a la Universidad de Santander por formarme como profesional y
permitirme usar las instalaciones para poder llevar a cabo este proyecto.
¡GRACIAS!
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TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 16
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................. 17
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA.................……………………………..18
1.1.1.FORMULACIÓN DEL PROBLEMA .......................................................... 18
1.2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................... 18
2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 20
2.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 20
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................... 20
3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 21
3.1. ANTECEDENTES ....................................................................................... 21
3.2. BASES TEÓRICAS ..................................................................................... 22
3.2.1. Aceites y grasas .................................................................................. 22
3.2.2. Aceite vegetal ...................................................................................... 22
3.2.3. Aceite vegetal de palma. ..................................................................... 22
3.2.4. Grasas animales .................................................................................. 23
3.2.5. Efluente graso...................................................................................... 23
3.2.6. Ácidos grasos ...................................................................................... 23
3.2.7. Hidrólisis .............................................................................................. 23
3.2.8. Microorganismos lipolíticos. .............................................................. 23
3.2.9 Género Geotrichum. ............................................................................. 23
3.2.10. Género Yarrowia. ............................................................................... 24
3.2.11. Lipasas. .............................................................................................. 24
3.2.12. Lipasas de Yarrowia lipolytica ......................................................... 25
3.2.13 YLLIP2 ................................................................................................. 25
3.2.14.YLLIP7 y YLLIP8 ................................................................................. 25
3.2.15. Lipasas de Geotrichum candidum ................................................... 25
7
3.2.16. Método de ensayo en placa para la hidrólisis de la actividad lipasa
........................................................................................................................ 25
3.2.17. Técnica de extracción Soxhlet…………………………………………..26
3.3. BASES LEGALES ...................................................................................... 27
4. HIPÓTESIS ....................................................................................................... 28
4.1. Hipótesis Investigativa .............................................................................. 28
4.2. Hipótesis Nula ............................................................................................ 28
5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 29
5.1. CLASIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ................................................ 29
5.2. POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA .................................................. 29
5.2.1. Criterios de inclusión y exclusión ..................................................... 29
5.3. SISTEMA DE VARIABLES ......................................................................... 30
5.4. DISEÑO METODOLÓGICO ........................................................................ 31
6. RESULTADOS .................................................................................................. 35
7. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 43
8. CONCLUSIONES .............................................................................................. 45
9. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 46
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 47
ANEXOS ................................................................................................................ 50
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Operacionalización de las variables .................................................... 30
Tabla 2. Composición Medio de Agua de Sales (sw al 30%) ............................ 32
Tabla 3. Degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen animal
utilizando EEC Geotrichum candidum ............................................................... 37
Tabla 4. Degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen animal
utilizando EEC de Yarrowia lipolytica ................................................................ 37
Tabla 5. Degradación de ácidos grasos en aceite de origen vegetal de palma
utilizando Geotrichum candidum ....................................................................... 39
Tabla 6. Degradación de ácidos grasos en aceites de origen vegetal de palma
utilizando Yarrowia lipolytica .............................................................................. 40
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reactivación de Geotrichum candidum (A) y Yarrowia
lipolytica (B)…………………………………………………………………...31
Figura 2. Biomasa fúngica de Geotrichum candidum (A) y Yarrowia
lipolytica (B)...………………..………………………………………………..32
Figura 3. (A) Hidrólisis de G. candidum sobre el sustrato Tween 80 a las
17 horas de incubación. (B) Hidrólisis de G. candidum sobre el sustrato
Tween 80 a las 48 horas de incubación………………………35
Figura 4. (A) Hidrólisis de Y. lipolytica sobre el sustrato Tween 80 a las
17 horas de incubación. (B) Hidrólisis de Y. lipolytica sobre el sustrato
Tween 80 a las 48 horas de incubación………………………………….36
Figura 5. Degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen
animal por Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica………………38
Figura 6. Análisis de varianza de una sola vía para efluente graso de
origen animal…………………………………………………………………..38
Figura 7. Gráfico degradación de ácidos grasos en efluente graso de
origen animal por Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica………39
Figura 8. Degradación de aceite de origen vegetal de palma por
Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica……………………………..40
Figura 9. Análisis de varianza de una sola vía para aceite vegetal de
palma………………..…………………………………………………………..41
Figura 10. Gráfico degradación de ácidos grasos en aceite vegetal de
palma por Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica………………41
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LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Resultados de los análisis para la determinacion de ácidos grasos
............................................................................................................................... 50
Anexo B. Evidencias fotográficas ...................................................................... 54
Anexo C. Reactivación de la cepa…………………………………………………..54
Anexo D. Desprendimiento de biomasa……………………………………………54
Anexo E. Agitación en shaker para obtener EEC………………………………...54
Anexo F. Centrifugación del EEC…………………………………………………...54
Anexo G. Centrifugación del EEC…………………………………………………..54
Anexo H. Filtración por membrana………………………………………………....54
Anexo I. EEC de Geotrichum candidum y EEC de Yarrowia lipolytica………55
Anexo J. Absorbancia del EEC……………………………………………………...55
Anexo K. Preparación del medio YNB para método de ensayo en placa…....55
Anexo L. Muestras de aceite de origen vegetal y efluente graso de origen
animal…………………………………………………………………………………….56
Anexo M. Desprendimiento y pesaje de biomasa de los M.O………………….56
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GLOSARIO
Aceite vegetal: Triglicérido extraído de una planta
Ácidos grasos: biomolécula de naturaleza lipídica formada por una larga cadena
hidrocarbonada lineal, de diferente longitud o número de átomos de carbono, en
cuyo extremo hay un grupo carboxilo
Cepas ATCC: Son microorganismos certificados para el control de calidad en
microbiología y es utilizado en disciplinas como la clínica, alimenticia, farmacéutica,
cosmética o ambiental. Sus características genotípicas y fenotípicas garantizan la
identidad del microorganismo.
Extracto enzimático crudo: Mezcla de las enzimas liberadas previo a un proceso
de lisis celular
Efluente graso: Desecho líquido con altos niveles de grasas, que son emitidos por
industrias después de procesos de elaboración de productos lácteos
Hidrólisis: Descomposición de sustancias orgánicas por acción del agua
Lipasas: Enzimas cuya función principal es catalizar la hidrólisis de triacilglicerol a
glicerol y ácidos grasos libres.
Tween 80: son ésteres del polioxietilen sorbitano, o polisorbato 80 es un surfactante
hidrofílico, se utiliza para la emulsificación de aceite en agua, dispersión o
solubilización de aceites.
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LISTA DE ABREVIATURAS
EEC: Extracto Enzimático Crudo
R1: Repetición 1
Sw: Medio Agua de Sales
Rpm: Revoluciones por minuto
M.O: Microorganismo
Hrs: Horas
D.O: Densidad óptica
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RESUMEN
Título: Evaluación de la actividad de lipólisis de Geotrichum candidum y Yarrowia
lipolytica en aceites de origen vegetal y efluentes grasos de origen animal
Autor: Maira Fernanda Pérez Gámez
Palabras Claves: Geotrichum candidum, Yarrowia lipolytica, Hidrólisis, Lipólisis,
Lipasas, Efluentes grasos, Aceites vegetales, Extracto Enzimático Crudo (EEC),
Biomasa.
Descripción: Según su origen los aceites usados pueden clasificarse en dos
grandes fuentes: aceites industriales de desecho y aceites de origen vegetal o
animal. Los agentes vegetales son oriundos de plantas y procesados por la industria
oleaginosa para su consumo doméstico o industrial, estos luego de ser usados se
convierten en aceite de desecho. El tratamiento biológico de efluentes grasos ha
cobrado tanta importancia que se ha hecho imprescindible en los planes de
tratamientos; sin embargo, requiere de la búsqueda de microorganismos con
potencial lipolítico para el tratamiento. Las lipasas forman parte de una de las
familias de enzimas más utilizadas en la industria por su gran versatilidad. Estas
enzimas hidrolizan triglicéridos en condiciones acuosas, pero también pueden
participar en reacciones de esterificación y transesterificación en presencia de
solventes orgánicos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad de lipólisis
de Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica en aceites de origen vegetal y
efluentes grasos de origen animal.
Se realizó un estudio de tipo experimental, las variables (concentración, tiempo,
sustrato e hidrólisis) y los resultados se analizaron por medio de los programas
estadísticos MATLAB y Excel 2016. Se obtuvo el extracto enzimático crudo (EEC)
Mediante la fermentación en medio líquido. Se realizó la evaluación cualitativa de la
capacidad de hidrólisis de G. candidum y Y. lipolytica mediante el método de ensayo
en placa para la hidrólisis de la actividad lipasa. La determinación de la velocidad
de degradación mediante la técnica de extracción soxhlet.
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Los porcentajes de degradación donde para efluente graso fueron de un 7.88% por
parte de Y. lipolytica y 0.17% para G. candidum y en el aceite vegetal se obtuvo
1.93% y 0.09%, respectivamente. Deduciendo de esto que la mayor degradación se
presentó en el efluente graso de origen animal por parte de ambos
microorganismos.
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ABSTRACT
Title: Evaluation of the lipolysis activity of Geotrichum candidum and Yarrowia
lipolytica in oils of vegetable origin and fatty effluents of animal origin
Author: Maira Fernanda Pérez Gámez
Keywords: Geotrichum candidum, Yarrowia lipolytica, Hydrolysis, Lipolysis,
Lipases, Fatty effluents, Vegetable oils, Raw Enzyme Extract (EEC), Biomass.
Description: Depending on their origin, used oils can be classified into two main
soucers: industrial waste oils and of vegetable or animal origin. The plant agents are
native to plants and processed by the oil industry for domestic or industrial
consumption, these after being used become waste oil. The biological treatment of
fatty effluents has become so important that it has become essential in treatments
plans; however, it requires the search for microorganims with lipolytic potential for
treatment. Lipases are part of one of the most used enzyme families in the industry
for their great versatility. These enzymes hydrolyze tryglicerides under aqueous
conditions, but they can also participate in esterification and transesterification
reaction in the presence of organic solvents. The objective of this work was to
evaluate the activity of lipolysis of Geotrichum candidum and Yarrowia lipolytica in
oils of vegetable origin and fatty effluents of animal origin.
An experimental study was carried out, the variables (Concentration, time, substrate
and hydrolysis) and the results were analyzed through the statistical programs
MATLAB and Excel 2016. The crude enzyme extract (CEE) was obtained by
fermentation in liquid medium. The qualitative evaluation of the hydrolysis capacity
of G. candidum and Y. Lipolytica was carried out by the plaque test method for the
hydrolysis o flipase activity. The determination of degradation rate by means of the
soxhlet extraction technique.
The degradation percentages where for fatty effluents were 7.88% by Y. lipolytica
and 0.17% for G. candidum and in vegetable oil it was obtained 1.93% and 0.09%,
respectively. Deducing from this that the greatest degradation occurred in the fatty
effluent of animal origin by both microorganisms.
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INTRODUCCIÓN
Según su origen los aceites usados pueden clasificarse en dos grandes fuentes:
aceites industriales de desecho y aceites de origen vegetal o animal. Se pueden
identificar tres tipos principales de aceites industriales de desecho: aceite industrial
(aceite hidráulico, lubricante de motores, aceite de corte). En cambio, los agentes
vegetales son oriundos de plantas y procesados por la industria oleaginosa para su
consumo doméstico o industrial, estos luego de ser usados se convierten en aceite
de desecho (1).
El tratamiento biológico de efluentes grasos ha cobrado tanta importancia que se ha
hecho imprescindible en los planes de tratamientos; sin embargo, requiere de la
búsqueda de microorganismos con potencial lipolítico para el tratamiento (2).
Yarrowia lipolytica tiene una gran importancia en estudios biotecnológicos y con
amplios campos de investigación como la secreción de proteínas, biogénesis de
peroxisomas, dimorfismo, altas cantidades de almacenamiento de lípidos y
degradación de sustratos hidrofóbicos. Las lipasas de esta producen reacciones de
hidrólisis y en condiciones de baja actividad de agua son capaces de llevar a cabo
reacciones no hidrolíticas: esterificaciones, transesterificaciones o
interesterificaciones (3).
Geotrichum candidum presenta una capacidad excepcional de expresar y excretar
proteínas, junto con sus características fisiológica, bioquímica y genética ha
permitido explotar su inmenso potencial para la producción de lipasa (4).
Las lipasas forman parte de una de las familias de enzimas más utilizadas en la
industria por su gran versatilidad. Estas enzimas hidrolizan triglicéridos en
condiciones acuosas, pero también pueden participar en reacciones de
esterificación y transesterificación en presencia de solventes orgánicos, por lo que
es muy importante tener en cuenta su estabilidad en estas condiciones. Las
esterasas, son menos conocidas, aunque comparten propiedades con las lipasas
ya que también participan en reacciones de hidrólisis (medio acuoso) y reacciones
de esterificación en presencia de alcoholes (5).
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA
Se conoce que, en la actualidad, los alimentos fritos gozan de una popularidad cada
vez mayor y son aceptados por personas de todas las edades, pero no se tiene
conciencia de que el aceite no debe ser reutilizado en la elaboración de alimentos,
debido principalmente a que una vez este es sometido a temperaturas elevadas, el
mismo genera dioxinas, un agente cancerígeno muy agresivo, y uno de los químicos
que tienen la dudosa fama de pertenecer a la docena sucia de contaminantes
orgánicos. Por otro lado, constituye un residual extremadamente riesgoso que se
desecha sin contar con ningún tratamiento previo que cumpla con las normas de
vertimientos, esto trae consigo la contaminación del agua, además su infiltración
hacia los suelos causa graves deterioros en los mismos, con su consecuente
repercusión en las fuentes subterráneas de agua y los cultivos (6).
La mala disposición de cualquier tipo de desecho ocasiona un impacto ambiental
sobre el agua, aire y/o tierra. En particular, la contaminación del recurso agua es
producido por el vertido de contaminantes en forma de químicos inorgánicos
(ácidos, sales, fertilizantes, metales pesados, etc.) y orgánicos (petróleo, gasolina,
aceites, grasas, solventes orgánicos, etc.). Los aceites son una gran fuente de
contaminación de las aguas y provienen generalmente de vertidos de desagües
domésticos (7).
El aceite luego de usado, aunque resulta un residuo biodegradable, presenta
dificultad para su disposición final, generalmente termina en el suelo y el agua a
través de las redes cloacales domiciliarias. Cuando es vertido al sistema cloacal los
aceites se adhieren a las paredes de las cañerías contribuyendo a la disminución
de sus diámetros con la consecuente pérdida de rendimiento del sistema (8). Si la
liberación de aceites y grasas es a un medio acuático, afectan el intercambio
gaseoso. Así, estas sustancias, una vez entran en el medio acuático, se difunden
por la superficie reduciendo la oxigenación a través de la interface aire-agua y la
actividad fotosintética, ya que adsorbe la radiación solar, disminuyendo así, además
la producción interna de oxígeno disuelto trayendo como consecuencia muerte de
la fauna (9).
Muchos efluentes industriales requieren pre tratamiento para remover las
sustancias incompatibles antes de descargarlos a los sistemas de alcantarillado.
Los lípidos (representados mayoritariamente por aceites, grasas y ácidos grasos
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de cadena larga) son componentes orgánicos importantes en aguas residuales
que significan un gran problema en el tratamiento y como contaminante de los
ecosistemas acuáticos (10).
Los principales constituyentes de los lípidos (aceites y grasas) residuales son los
aceites vegetales y las grasas animales usados en restaurantes y procesos
industriales; que se componen de triglicéridos y ácidos grasos libres (11).
Teniendo en cuenta lo referenciado anteriormente, con este trabajo se quiso dar
respuesta a la siguiente pregunta.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Qué porcentaje de degradación tendrá Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica
frente al aceite vegetal y el efluente graso y que impacto genera esto a nivel
ambiental?
1.2 JUSTIFICACIÓN
Debido al gran impacto que las grasas y aceites pueden generar a nivel salud por
los compuestos que estos liberan luego de ser alterados por recalentamiento y a
nivel ambiental cuando estos son vertidos a los desagües, se hace necesario
evidenciar la actividad lipolítica de los hongos Geotrichum candidum y Yarrowia
lipolytica, ya que son hongos lipolíticos que serían una opción al momento de pensar
en un tratamiento para los daños causados por estos residuos. Se pretende evaluar
el porcentaje de degradación, determinando que tan efectivas son las enzimas
lipasas que produce Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica, cuantificando en
que intervalo de tiempo posee una mayor efectividad en la degradación de grasas
y aceites. Contrastando también un ensayo cualitativo, en donde se utiliza Tween
80 como sustrato.
Las lipasas son enzimas que han emergido como catalizadores clave en la
biotecnología, debido a sus propiedades multifacéticas (especificidad, estabilidad,
pH y temperatura) tienen una gran variedad de aplicaciones industriales. Su
aplicación se da en industrias tales como: la de alimentos, cosméticos y perfumes,
del papel, la textil y en la de pesticidas (12).
19
Las lipasas son sintetizadas por los microorganismos preferencialmente en
presencia de inductores como son los lípidos. Estas moléculas y otras sustancias
presentes en los residuos agroindustriales permiten el crecimiento de los
microorganismos y actúan como sustancias inductoras para la producción de
lipasas microbianas. Hoy en día los procesos desarrollados en la industria que son
catalizados por enzimas son mucho más numerosos, debido a que presentan una
serie de ventajas frente a los catalizadores no biológicos convencionales (13).
Se ha demostrado que los aceites naturales como el aceite de soya, los ácidos y
ésteres grasos como los jabones, los esteroles como el colesterol, las sales biliares
y detergentes se comportan como inductores y por ello son ampliamente utilizados
para la producción de lipasas microbianas. Se ha encontrado que los niveles de
producción de lipasas microbianas varían significativamente entre las diferentes
especies de microorganismos, por ello es indispensable la presencia de una fuente
de carbono de naturaleza lipídica (14).
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2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad de lipólisis de Geotrichum candidum y Yarrowia
lipolytica en aceite de origen vegetal y efluentes grasos de origen animal
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener el extracto enzimático crudo de Geotrichum candidum y
Yarrowia lipolytica por fermentación en medio líquido.
Evaluar la capacidad hidrolítica de Geotrichum candidum y Yarrowia
lipolytica por el método de ensayo en placa para la hidrólisis de la
actividad lipasa.
Determinar la degradación en aceites de origen vegetal y efluentes
grasos de origen animal utilizando Geotrichum candidum y Yarrowia
lipolytica mediante la técnica de determinación de Ácidos grasos.
21
3. MARCO TEÓRICO
3.1. ANTECEDENTES
Se llevó a cabo un estudio el cual tenía como objetivo investigar el análisis
cualitativo de la producción de lipasas y esterasas. El análisis primario usando
Tween 80 pudo ser llevado a cabo identificando la formación de un halo de color
claro alrededor de aquellas cepas con un resultado positivo. Para el análisis
específico de actividad lipolítica y de esterasas, las cepas que fueron productoras
de esterasas dieron un resultado positivo solamente en las placas con tributirina
como sustrato, y aquellas productoras de lipasas dieron positivo en ambos
sustratos. Los resultados positivos se consideraban cuando un halo de color
amarillo se presentaba alrededor del inoculo a las 48 horas de incubación (15).
Se realizó un análisis de la actividad lipolítica y de esterasas, de una colección de
cepas de Yarrowia lipolytica donde se aisló y caracterizó de forma preliminar una
cepa de un hongo silvestre productor de lipasas. El aislamiento se efectuó a partir
de un cultivo in vitro de células de zarzamora. El hongo seleccionado se cultivó en
un medio selectivo para microorganismos productores de lipasas. La temperatura
de incubación fue de 22-23°C. Se consideró la presencia de hongos lipolíticos por
la generación de halos transparentes alrededor de la colonia. Debido a que
macroscópicamente presentaba las características de un hongo perteneciente al
género Penicillium se decidió favorecer su crecimiento resembrándolo en un medio
de Dextrosa Sabouraud, se observó durante siete días por la técnica de microcultivo
se pudo confirmar que el hongo aislado pertenecía al género Penicillium sp (16).
Se realizó un estudio cuya finalidad era aislar microorganismos de aguas residuales
contaminadas con grasas y determinar la producción de lipasa extracelular, esto se
logró utilizando p-nitrolfenilpalmitato. Para el estudio se utilizaron distintos métodos
entre los cuales como principal estaba el aislamiento del microorganismo, se realizó
una siembra por extensión en superficie, las cepas seleccionadas fueron purificadas
por siembra en medio de cultivo solido GEN a 30°c por 24hrs en caso de las
bacterias y los hongos en medio PDA a 25°-35°C por 72 hrs, posteriormente cada
aislamiento se triplico en microtubos con caldo conteniendo glicerol al 40% y
almacenados a -20°C. Para evaluar la actividad enzimática en los aislamientos se
realizó detección de la actividad lipolítica en medio FAM+aceite de oliva. Los
resultados que arrojó este estudio fueron un total de 149 microorganismos aislados,
de los cuales 37 mostraron actividad lipolítica y a una cepa que se le denomino
22
CCEI-1 Serratia marcescens fue la que tuvo mayor actividad lipolítica a pH alcalino
y temperatura de 30°C (17).
En otro estudio se analizó la producción de lipasa en cultivo sumergido por cuatro
cepas de hongos filamentosos lipolíticos, utilizando aceite de soja como única fuente
de carbono y energía. Se obtuvieron concentraciones de biomasa entre 12 y 20
mg/mL, con rendimientos de crecimiento entre 0,65 y 1,08, indicando que la
composición del medio y la fuente de carbono utilizada resultaron adecuadas. La
actividad enzimática lipolítica fue evaluada a pH 4.8 y 7, observándose dos picos de
actividad enzimática, a las 48 y 120 h, respectivamente. Las cepas seleccionadas
con mayor actividad enzimática a las 48 h fueron a pH 4,8 las ML5-32 y ML6-35
(580 and 584 U/L, respectivamente) y a pH 7,0 la MS2-8 (545 U/L), las que
presentan resultados apropiados para continuar con su estudio para su potencial
aplicación industrial (18).
3.2 BASES TEÓRICAS
3.2.1 Aceites y grasas Son productos alimenticios aptos para el consumo humano,
constituidos por glicéridos de ácidos grasos, de origen vegetal o animal,
obtenidos mediante un proceso industrial. Podrán contener pequeñas
cantidades de otros lípidos, tales como fosfátidos, de constituyentes
insaponificables y de ácidos grasos libres naturalmente presentes en las
grasas o aceites. Las grasas son sólidas o semisólidas a temperatura
ambiente, mientras que los aceites son líquidos a temperatura ambiente (19).
3.2.2 Aceite vegetal Proceden de las semillas de varios árboles tropicales y se
caracterizan por su bajo punto de fusión, debido principalmente a la
disposición de los ácidos grasos en las moléculas de triacilglicerol (20).
3.2.3 Aceite vegetal de palma. El aceite de palma se extrae del mesocarpio del
fruto de la semilla de la palma africana (Elaeis guineensis) a través de
procedimientos mecánicos. Está constituido por una mezcla de ésteres de
glicerol (triglicéridos) y es fuente natural de carotenos y vitamina E (21).
Los ácidos grasos insaturados que constituyen los triglicéridos del aceite de
palma son el oleico (36-44%) y el linoleico (9-12%). También posee los
ácidos saturados palmítico (39.3-47.5%) y esteárico (3.5-6%) (21).
23
3.2.4 Grasas animales Este grupo está constituido por las grasas de animales
domésticos, las cuales contienen cantidades elevadas de ácidos grasos C16
y C18 y riquezas intermedias de ácidos insaturados, dominados por el ácido
oleico y el linoleico; poseen además pequeñas cantidades de ácidos grasos
de número impar de átomos de carbono. Estas grasas también contienen
cantidades apreciables de triacilgliceroles totalmente saturados (20).
3.2.5 Efluente graso. Conocido como lactosuero o suero de leche, un
subproducto liquido obtenido después de la precipitación de la caseína en la
elaboración del queso. El lactosuero contiene hidratos de carbono en forma
de lactosa, agua, lípidos, minerales como el calcio, hierro, magnesio, fosforo,
zinc, entre otros y vitaminas como tiamina, niacina, entre otras (22).
3.2.6 Ácidos grasos Con este término se conoce cualquier ácido monocarboxílico
alifático que pueda liberarse por hidrólisis de las grasas naturales (23).
3.2.7 Hidrólisis La hidrólisis de los enlaces éster de los lípidos se produce por
acción enzimática o por calentamiento en presencia de agua y tiene por
consecuencia la liberación de ácidos grasos (23).
3.2.8 Microorganismos lipolíticos. Los microorganismos con un alto potencial
para producir lipasas pueden ser encontrados en diferentes hábitats,
principalmente en desechos o residuos de aceites vegetales empleados en
la elaboración de frituras, industrias de productos lácteos, suelos
contaminados con aceites y alimentos deteriorados. A partir de estos nichos
se han aislado bacterias, hongos filamentosos, levaduras y Actinomycetos,
entre los que sobresalen los géneros Pseudomonas sp, Bacillus sp,
Rhodococcus sp, Staphylococcus sp, Rhizopus sp, Mucor sp, Candida sp,
Aspergillus y Geotrichum sp por su capacidad para producir lipasas
extracelulares, facilitando de esta manera, la recuperación de estas enzimas
a partir del medio de cultivo (13).
3.2.9 Género Geotrichum. Las especies de este género son consideradas como
hongos filamentosos levaduriformes y están englobadas dentro del filo
Ascomycota, que constituye la división o filo más grande del reino fungi. Las
colonias de tipo levaduriforme son colonias de color crema o blanquecino,
hialinas, de textura cremosa, producen abundantes artrosporas y
generalmente tiene escaso crecimiento y escasa actividad proteolítica, una
temperatura óptima de crecimiento de entre 22 y 25°C. Las colonias de tipo
moho son colonias filamentosas, de color blanco y textura más pulverulenta
o algodonosa con predominio de hifas vegetativas y pocas artrosporas, con
alta actividad proteolítica, rápido crecimiento a una temperatura óptima de
25-30°C y cierta actividad alcalinizante. Posee varias enzimas responsables
de la lipolisis, resultando en una producción importante de precursores de
24
compuestos volátiles aromáticos, como los alcoholes, los ácidos grasos, las
metilcetonas, las lactonas y los ésteres, en cuanto a su actividad proteolítica,
libera aminoácidos a partir de la caseína y está principalmente involucrado
en la ruptura de péptidos en productos más pequeños de degradación,
liberando aminoácidos que son precursores de compuestos (24).
3.2.10 Género Yarrowia. Es un hongo ascomiceto dimorfico, que presenta
características fisiológicas, metabólicas y genómicas específicas, que la
diferencian de la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae. Estas
propiedades han llevado a varios grupos de investigación a utilizar esta
levadura como modelo de conocimiento básico. Gracias al desarrollo de
herramientas genéticas avanzadas, se ha logrado un progreso significativo
en la comprensión de procesos biológicos específicos. La levadura Yarrowia
lipolytica ha desarrollado mecanismos muy eficaces para descomponer y
utilizar sustratos hidrófobos. Se considera una levadura oleaginosa, en
función de su capacidad para acumular grandes cantidades de lípidos. La
finalización de la secuenciación del genoma Y. lipolytica y la existencia de
herramientas adecuadas para la manipulación genética han permitido utilizar
la función metabólica de esta especie para aplicaciones biotecnológicas (25).
3.2.11 Lipasas. Las lipasas y esterasas, conocidas colectivamente como “enzimas
lipolíticas” se caracterizan por su habilidad para hidrolizar cadenas de lípidos
largas y cortas esterificadas al glicerol. La especificidad de estas enzimas se
relaciona directamente con el microorganismo que las produce, por lo cual
existen lipasas no específicas; es decir, aquellas que pueden realizar la
hidrolisis del triglicérido en cualquiera de sus posiciones, obteniendo
productos intermediarios como diglicéridos y monoglicéridos (15).
Además de las funciones biológicas que tiene en bacterias, hongos, plantas
y animales, las lipasas han recibido atención debido a su función como
biocatalizadores en numerosos procesos industriales incluyendo áreas como
aceites y ácidos grasos, detergentes, panificación, elaboración de queso,
limpieza de superficies, entre otros (15).
3.2.12 Lipasas de Yarrowia lipolytica Se ha reportado que Yarrowia lipolytica
produce tres lipasas extracelulares, YLLIP2, YLLIP7 Y YLLIP8. Dichas
enzimas presentan diferente especificidad por sustratos que van desde
ésteres de ácidos grasos de cadena corta, mediana y larga. La lipasa YLLIP2
mostró la mejor actividad con metil mirisatato (C14), indicando la preferencia
de la lipasa por cadenas largas. YLLIP7 Y YLLIP8 mostraron mayor afinidad
por p-nitrofenil caproato (C6) y p-nitrofenil caprato (C10) respectivamente
(26).
25
3.2.13 YLLIP2 Es la principal lipasa extracelular secretada por esta levadura.
YLLIP2 es expresada como una proteína de 301 aminoácidos de 38 kDa. La
estructura cristalina de YLLIP2 adopta un plegamiento típico α/β hidrolasa
observado para las lipasas de la familia de las lipasas fúngicas. La lámina β
central está formada por nueve cadenas β y cinco hélices α que están
empacadas a los dos lados de la lámina. La estructura de YLLIP2 es
altamente homologa a las estructuras conocidas de las lipasas de la familia
fúngica (lipasas de Thermomyces lanuginosa, Rhizopus niveus y Rhizomucor
miehl) (26).
3.2.14 YLLIP7 y YLLIP8 A pesar de que la mayor actividad extracelular resulta de
YLLIP2, las lipasas YLLIP7 y YLLIP8 son parcialmente secretadas por
Yarrowia lipolytica. Tanto YLLIP7 como YLLIP8 están asociadas
principalmente a la pared celular. Aunque, podían ser fácilmente liberadas
por el lavado de las células con amortiguador de fosfato (26).
3.2.15 Lipasas de Geotrichum candidum Se ha evidenciado que Geotrichum
candidum posee dos lipasas extracelulares, denominadas GCLI y GCLII. Sin
embargo, presenta mayor importancia la GCLII ya que ha proporcionado
información con respecto a la naturaleza de la maquinaria catalítica de las
lipasas. Ambas lipasas difieren en propiedades biocatalíticas entre sustratos,
lo que sugiere que pueden emplearse para diferentes aplicaciones (27) (28).
3.2.16 Método de ensayo en placa para la hidrólisis de la actividad lipasa Es
un método que se desarrolló para el ensayo en placa para determinar la
actividad lipasa. Tween 80 se usó como sustrato con victoria Blue B, rojo de
metilo o rodamina como indicador. La actividad lipolítica se determinó
mediante la formación de la zona de intensificación del color indicador
después de 24 horas. Se puede ver una representación lineal cuando la
concentración de la enzima se representa contra el diámetro de la zona de
intensificación. Con esta técnica, se puede realizar un cribado primario de
microorganismos lipolíticos mediante la formación de zonas de
intensificación alrededor de las colonias y micelios (29).
3.2.17 Técnica de extracción soxlhet La técnica más importante de separación se
basa en el reparto selectivo del soluto entre dos fases no miscibles, que
pueden ser una acuosa y una orgánica. La distribución del soluto entre las
dos fases inmiscibles es un fenómeno de equilibrio que se describe por medio
26
de la ley de distribución, cuya constante de equilibrio se denomina coeficiente
de distribución o coeficiente de reparto. Las constantes de distribución
permiten calcular la concentración del soluto que permanece en una solución
después de un número de extracciones y permiten determinar la manera más
eficiente de realizar una separación por extracción. Es importante tener en
cuenta que las sustancias iónicas y los compuestos orgánicos polares,
estarán en mayor proporción en la fase acuosa, mientras que los compuestos
orgánicos no polares, estarán en mayor proporción en la fase orgánica (30).
27
3.3 BASES LEGALES
NTC 431 de 2017, El objeto de la presente norma es establecer los
requisitos que debe cumplir y los métodos de ensayo a los cuales debe
someterse el aceite de palma africana (Elaies guineensis) (31).
RESOLUCIÓN 2154 DE 2012 MINISTERIO DE SALUD Y PROTECCIÓN
SOCIAL, por la cual se establece el reglamento técnico sobre los
requisitos sanitarios que deben cumplir los aceites y grasas de origen
vegetal o animal, que se procesen, envasen, almacenen, transporten,
exporten, importen y/o comercialicen en el país, destinados para el
consumo humano y se dicten otras disposiciones (16).
LEY 091 DE 2015 EXPEDIDA POR LA CÁMARA, por la cual se
establecen las condiciones de disposición final segura de los aceites
lubricantes usados, de los aceites industriales usados y de los aceites de
fritura usados en el territorio nacional y se prohíbe la combustión de los
mismos o su reutilización parcial o total sin tratamiento de transformación
(32).
28
4. HIPÓTESIS
4.1 HIPÓTESIS INVESTIGATIVA
Si los hongos Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica son sometidos a un
análisis por medio de la determinación de ácidos grasos usando como sustrato
aceite de origen vegetal y efluente graso de origen animal, se podría evidenciar en
este tratamiento un porcentaje significativo de actividad lipolítica.
4.2 HIPÓTESIS NULA
Si los hongos Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica son sometidos a un
análisis por medio de la determinación de ácidos grasos usando como sustrato
aceite de origen vegetal y efluente graso de origen animal, no se evidenciaría en
este tratamiento un porcentaje significativo de actividad lipolítica.
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. CLASIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación es de tipo experimental ya que se evalúa la actividad
enzimática (lipasas) presente en Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica,
teniendo en cuenta las variables establecidas.
Para este análisis se utilizaron medidas de tendencia central como el promedio y la
desviación estándar. Teniendo en cuenta los resultados de las pruebas enzimáticas
cuantitativas se realizó un análisis estadístico de varianza (ANOVA) con una prueba
de comparaciones de medias de correlación lineal de Pearson, con el fin de
seleccionar los tratamientos que presentaron mayor actividad enzimática. Los
resultados que presentaron homogeneidad de varianzas fueron analizados con la
prueba de comparación de Tukey, con una prueba de comparaciones de medias.
En todos los análisis estadísticos se utilizaron los programas MATLAB y Excel 2016.
5.2. POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA
La población está conformada por hongos lipolíticos de los géneros Geotrichum
candidum y Yarrowia lipolytica.
La muestra fueron dos cepas ATCC: Yarrowia lipolytica ATCC 9773 y Geotrichum
candidum ATCC 34614, donado por el cepario de micología de la Universidad de
Santander campus Valledupar.
10 litros de Aceite vegetal de palma sin utilizar y 10 litros de efluente graso derivado
de la producción de queso mozzarella obtenido de una empresa de lácteos de la
ciudad de Valledupar.
5.2.1. Criterios de inclusión y exclusión
5.2.1.1. Criterios de inclusión
Aceite vegetal de palma
Aceite animal (efluente graso)
30
5.2.1.2. Criterios de exclusión
Bacterias y hongos no lipolíticos
Aceite de almendra, coco, oliva
5.3. SISTEMA DE VARIABLES
Variable Independiente: Tiempo de exposición.
Variables dependientes: Concentración y sustrato.
Tabla 1. Operacionalización de las variables
Variable Definición Nivel de medición
Criterio de clasificación
Sustrato Sustancias utilizadas como
base por su contenido lipídico, para la evaluación de la degradación de ácidos grasos.
Cualitativo Nominal
Aceite de origen vegetal y efluente graso de origen
animal
Concentración Cantidad de moléculas de
sustrato.
Cuantitativo discreto
27637- aceite vegetal
79022- efluente graso
Hidrólisis
Generación de un halo de color claro que se forma tras
el efecto hidrolítico de las enzimas de los
microorganismos en estudio.
Cualitativo
discreto
Positivo- negativo
Tiempo Intervalo de tiempo definido
para el proceso de degradación
Cuantitativo continuo
12 horas 24 horas 36 horas 48 horas
31
5.4. DISEÑO METODOLÓGICO
ETAPA I: Obtención del EEC de Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica
Reactivación y conservación de las cepas
Las cepas de Geotrichum candidum ATCC 34614 y Yarrowia lipolytica ATCC
9773 fueron activadas metabólicamente por triplicado por siembra masiva en cajas
de Petri con agar Papa Dextrosa (PDA) a 27°C por 5 días (26).
Obtención de Biomasa fúngica
El inoculo se ajustó por turbidez a escala 3 de MacFarland, para ello se realizó
desprendimiento de biomasa y se adicionó en solución salina hasta alcanzar la
turbidez del control 3 de la escala MacFarland. Posteriormente se tomó 1ml de la
suspensión de esporas y se sembró en un Erlenmeyer con 30ml de agar PDA y se
dejó incubar a 25° C por 5 días
Para obtener la biomasa fúngica de Yarrowia lipolytica y Geotrichum candidum se
adicionaron 20ml de solución salina a cada Erlenmeyer y con un hisopo estéril se
hizo el barrido sobre la superficie de las colonias, el sobrenadante se transfirió a
frascos Scott de 500ml estériles. Todo anterior se realizó por duplicado con cada
una de las cepas en estudio (26).
Obtención del extracto enzimático crudo
La biomasa obtenida de Yarrowia lipolytica y Geotrichum candidum se adicionó
a un litro del medio de cultivo Agua de sales (SW al 30%) ver Tabla 2,
respectivamente, el medio de cultivo inoculado se fracciono en 5 frascos Scott de
200ml con el objetivo de facilitar la agitación en un shaker a 200 rpm, se dejó incubar
por 8 horas a 25°C.
32
Tabla 2. Composición Medio de Agua de Sales (sw al 30%)
Cloruro de sodio al 5% 240g/L
Cloruro de magnesio hexahidratado 30g/L
Sulfato de magnesio heptahidratado 35g/L
Cloruro de potasio 7g/L
Bromuro de sodio 0.8g/L
Bicarbonato de sodio 0.2g/L
Cloruro de calcio dihidratado 0.5g/L
Agua destilada 226ml
El EEC de Yarrowia lipolytica y Geotrichum candidum se centrifugó a 5000 rpm
durante 5 minutos en tubos falcom de 15ml con el objetivo de reforzar la lisis celular
y la liberación enzimática, seguidamente se filtró en un embudo con membranas de
acetato de celulosa de 0.45 mm donde se obtuvo la suspensión final del EEC (26).
(Ver anexo H)
Se determinó la viabilidad de la suspensión de esporas midiendo la Densidad óptica
(DO) en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 620 nm, y se ajustó a una
absorbancia de 1.5 para garantizar una cantidad de enzimas viables de 7.5 x
1018 UFC/ml (26). Todo lo anterior se realizó por duplicado con cada uno de los
hongos de este estudio (26). (Ver anexo J)
ETAPA II: Evaluación de la capacidad hidrolítica de Geotrichum candidum y
Yarrowia lipolytica
Determinación de la hidrólisis por medio de la actividad lipasa de Geotrichum
candidum y Yarrowia lipolytica
La actividad hidrolítica se determinó por el método de ensayo en placa, utilizando el
medio de cultivo YNB (Yeast Nitrogen Base) adaptado para este estudio, como
sustrato se le adicionó 2% de Tween 80 y como indicador de actividad lipolítica
0.01% de rojo de metilo y se sirvió en cajas de Petri (15).
Se preparó una suspensión de esporas con una turbidez de 3 de la escala de
MacFarland de Yarrowia lipolytica y Geotrichum candidum, respectivamente,
posterior a esto, en cada caja se inoculó con 30µl de la suspensión de esporas en
tres puntos diferentes (10µl en cada punto), se incubó a 25 °C por 48 horas y se
realizó lectura visual por la presencia de halos de hidrólisis alrededor del punto de
33
siembra y medición a las 17 y 48 horas de incubación por duplicado con cada hongo.
Como control negativo se utilizó una cepa de Candida albicans (15).
Se considera positiva la presencia de un halo claro alrededor del punto de siembra.
ETAPA III: Determinación de la degradación de ácidos grasos en aceite de
origen vegetal de palma y efluentes grasos de origen animal utilizando
Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica
Preparación de las muestras para degradación de aceites de origen vegetal
de palma
Se realizó el montaje de un lote de 8 muestras, las cuales se dividieron en dos
grupos: muestra y repetición 1 (R1), se pesaron 50 gr de biomasa de Geotrichum
candidum y Yarrowia lipolytica en un vidrio de reloj y se adicionaron en 450 ml de
aceite vegetal respectivamente en frascos de vidrio esmerilado de 500 ml y se
tomaron cortes de tiempo de 12, 24, 36 y 48 horas a 25 °C con pH de 6.0 para
determinación de ácidos grasos. Como control se tomaron 500 ml de aceite vegetal.
Preparación de las muestras para degradación de ácidos grasos en
efluentes grasos de origen animal
Se realizó el montaje de un lote de 8 muestras, las cuales se dividieron en dos
grupos: muestra y repetición 1 (R1), se tomaron 50 ml de EEC de Geotrichum
candidum y Yarrowia lipolytica y se adicionaron en 450 ml de efluente graso de
origen animal con un pH ajustado a 6,5 en frascos de vidrio esmerilado de 500 ml
tica respectivamente (26). Se tomaron cortes de tiempo de 12, 24, 36 y 48 horas a
25 °C para determinación de ácidos grasos. Como control se tomaron 500 ml del
efluente graso.
Determinación de la degradación en aceites de origen vegetal de palma y
efluentes grasos de origen animal mediante la técnica de extracción
Soxhlet.
La velocidad de degradación se determinó teniendo en cuenta los tiempos de corte
de 12, 24, 36 y 48 horas a 25 °C tanto para aceite de origen vegetal como para
efluentes grasos de origen animal, teniendo en cuenta los mg/l de ácidos grasos
presentes en las muestras frente a los mg/l presentes en los controles (26).
34
Las muestras se remitieron al laboratorio BIOINDALAMB en Valledupar para la
determinación de los ácidos grasos mediante la técnica de extracción Soxhlet.
El equipo utilizado fue el Extractor Soxhlet BÜCHI B-810.
35
6. RESULTADOS
Activación de las cepas y producción de biomasa de G. candidum y Y.
lipolytica.
Se realizó la activación de las cepas de G. candidum y Y. lipolytica mediante el
repique por siembra masiva teniendo crecimiento a los 5 días a temperatura
ambiente, donde se evidenció total crecimiento de las cepas.
Figura 1. Reactivación de Geotrichum candidum (A) y Yarrowia lipolytica (B)
En la siembra de G. candidum y Y. lipolytica en Erlenmeyer, se obtuvo un
crecimiento a los 5 días, a Temperatura ambiente, donde se observaba una capa
blanca en la superficie que correspondía a la biomasa de cada microorganismo; se
realizó el desprendimiento de esta con solución salina y posterior a eso fue sometida
a agitación por 8 horas.
Figura 2. Biomasa Fúngica de Geotrichum candidum (A) y Yarrowia lipolytica
(B)
A B
A B
36
Obtención del extracto enzimático crudo
Se logró la obtención de 800 ml EEC de G. candidum y Y. lipolytica
respectivamente, a partir de un proceso de fermentación en el medio de cultivo Agua
de sales (SW al 30%). En este EEC se encuentra contenido el pull de enzimas
lipasas que actuaran en el proceso de degradación de los ácidos grasos.
Evaluación de la capacidad hidrolítica de Geotrichum candidum y Yarrowia
lipolytica
Figura 3. A) Hidrólisis de G. candidum sobre el sustrato Tween 80 a las 17 horas de incubación. B) Hidrólisis de G. candidum sobre el sustrato Tween 80 a las 48 horas de incubación.
Fuente: Pérez, M. 2019
En la Figura 3 se observa la hidrólisis de G. candidum sobre el sustrato Tween 80
a las 17 y 48 horas de incubación, se considera positivo la presencia de un halo
claro alrededor del punto de siembra, en la Figura 3.A se observan los halos de
degradación de G. candidum con un diámetro de 1cm, 1.1cm y 1cm a las 17 horas
de incubación. En la Figura 3.B se puede observar que G. candidum logra realizar
una degradación de aproximadamente el 95% del sustrato a las 48 horas de
incubación. Nótese que casi la totalidad del medio de cultivo viro de color, indicando
un resultado positivo.
37
Figura 4. A) Hidrólisis de Y. lipolytica sobre el sustrato Tween 80 a las 17
horas de incubación. B) Hidrólisis de Y. lipolytica sobre el sustrato Tween 80
a las 48 horas de incubación.
Fuente: Pérez, M. 2019
En la Figura 4 se observa la hidrólisis de Y. lipolytica sobre el sustrato Tween 80 a
las 17 y 48 horas de incubación, se considera positivo la presencia de un halo claro
alrededor del punto de siembra, en la Figura 4.A se observan los halos de
degradación de Y. lipolytica con un diámetro de 1.1cm, 0.8cm y 1cm a las 17 horas
de incubación. En la Figura 4.B se puede observar que Y. lipolytica logro degradar
el 100% del sustrato a las 48 horas de incubación. Nótese que todo el medio de
cultivo viro de color, indicando un resultado positivo.
Determinación de la degradación en aceite vegetal de palma y efluente graso
de origen animal utilizando Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica
Tabla 3. Degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen animal utilizando EEC de Geotrichum candidum
TIEMPO
Control 12 hrs 24 hrs 36 hrs 48 hrs
mg/L A. GRASOS
27637 27598 27325 27200 27105
38
En la tabla 3 se muestra los ácidos grasos presentes en el efluente graso (Control)
y los mg/L presentes en las muestras tratadas con EEC de Geotrichum candidum
en los diferentes intervalos de tiempo evaluados. Se logró evidenciar una
disminución de 532mg/L que corresponde al 1,93 % del total de los ácidos grasos a
las 48 horas con respecto al control.
Tabla 4. Degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen animal utilizando EEC de Yarrowia lipolytica
TIEMPO
Control 12 hrs 24 hrs 36 hrs 48 hrs
mg/L A. GRASOS
27637 26019 25815 25645 25460
En la tabla 4 se muestra los ácidos grasos presentes en el efluente graso (Control)
y los mg/L presentes en las muestras tratadas con EEC de Yarrowia lipolytica en los
diferentes intervalos de tiempo evaluados. Se logró evidenciar una disminución de
2177mg/L que corresponde al 7,88 % del total de los ácidos grasos a las 48 horas
con respecto al control.
Figura 5. Degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen animal
por G. candidum y Y. lipolytica.
y = 160,4x - 71R² = 0,9372
y = 184,7x + 1440,5R² = 0,9988
0
500
1000
1500
2000
2500
12 24 36 48
G.candidum Y.lipolitica
mg
/l d
e ac
eite
deg
rad
ado
Tiempo (en Horas)
39
En la figura 5 se presenta una ecuación mediante la cual se deduce una relación
directamente proporcional (tendencia positiva). El correlacionador R2 es de 0.99, lo
que explica que mientras más se aproxime a 1 el resultado es óptimo, existiendo
una correlación entre la degradación de ácido graso presentes en el efluente en
función del tiempo de actividad de Y. lipolytica. En cuanto a G.candidum, este mismo
correlacionador es de 0.93 lo cual también indica una correlación entre la
degradación de ácido graso y el tiempo de actividad de este microorganismo.
Figura 6. Análisis de varianza de una sola vía para efluente graso de origen
animal.
En la figura 6, se observan los grados de libertad (df) con un total de 5, lo que
evidencia que el experimento fue bien controlado. El valor F esta en 0,15 lo cual
indica que fue óptimo. El valor de P= 0.7139 indica que no existe diferencia
significativa en la degradación del efluente graso por ambos microorganismos.
Figura 7. Gráfico degradación de ácidos grasos en efluente graso de origen
animal por G. candidum y Y. lipolytica
En la figura 7, la línea roja representa el promedio y las líneas verticales azules son
la desviación estándar, esto representa cuanto se desvían los datos del promedio.
40
El traslape que se presenta indica que no hay diferencia significativa entre los dos
microorganismos con relación a velocidad de degradación.
Tabla 5. Degradación de ácidos grasos en aceite vegetal de palma utilizando
Geotrichum candidum
TIEMPO
Control 12 hrs 24 hrs 36 hrs 48 hrs
mg/L A. GRASOS
79022 78994 78987 78961 78952
La tabla 5 muestra los ácidos grasos presentes en el aceite de origen vegetal
(Control) y los mg/L presentes en las muestras tratadas con Geotrichum candidum
en los diferentes intervalos de tiempo evaluados.
Se logró evidenciar una disminución de 70mg/L que corresponde al 0,09 % del total
de los ácidos grasos a las 48 horas con respecto al control.
Tabla 6. Degradación de ácidos grasos en aceite vegetal de palma utilizando Yarrowia lipolytica
TIEMPO
Control 12 hrs 24 hrs 36 hrs 48 hrs
mg/L A. GRASOS
79022 79004 79001 78892 78880
En la tabla 6 se muestra los ácidos grasos presentes en el aceite vegetal de palma
(Control) y los mg/L presentes en las muestras tratadas con Yarrowia lipolytica en
los diferentes intervalos de tiempo evaluados. Se logró evidenciar una disminución
de 142mg/L que corresponde al 0,17 % del total de los ácidos grasos a las 48 horas
con respecto al control.
Figura 8. Degradación de aceite de origen vegetal de palma por G. candidum
y Y. lipolytica
41
En la figura 8, la ecuación devela una relación directamente proporcional (tendencia
positiva) que con el tiempo decrece, típico de la actividad microbiana. El
correlacionador R2 es 0.86 lo cual indica que si existe correlación entre la
degradación del aceite vegetal de palma en función del tiempo de actividad para Y.
lipolytica.
Para G. candidum este mismo correlacionador es de 0.94, señala que presenta
ligeramente mayor correlación que la anterior, pero de hecho la significancia
estadística se evidencia con un análisis de varianza de una sola vía (figura 9).
Figura 9. Análisis de varianza de una sola vía para Aceite vegetal de palma.
La figura 9 nos muestra los grados de libertad (df) con un total de 5, lo que significa
que el experimento fue bien controlado. El valor F arrojó 0.63 lo cual es un valor alto
pero en general es aceptable. El valor de P= 0.4721 devela que no existe diferencia
y = 15,2x + 10,5R² = 0,9461
y = 40,2x - 3R² = 0,863
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
12 24 36 48
G.candidum Y.lipolitica
mg
/l d
e ac
eite
deg
rad
ado
Tiempo (en Horas)
42
significativa en la degradación del aceite vegetal de palma que realizan ambos
microorganismos.
Para ser significativo el valor de P debe ser <0.05.
Figura 10. Gráfica degradación de ácidos grasos en aceite vegetal de palma
por G. candidum y Y. lipolytica
En la figura 10, la línea roja del medio representa el promedio y las líneas verticales
representan la desviación estándar, es decir, cuanto se desvían los datos del
promedio. Si existe traslape entre los dos gráficos de caja, significa que no hay
diferencia significativa. Este gráfico es la ilustración de la figura 9.
7. DISCUSIÓN
43
De acuerdo a la metodología y los resultados obtenidos, se pudo evidenciar que las
cepas de Yarrowia lipolytica ATCC 9773 y Geotrichum candidum ATCC 34614
tuvieron la capacidad de hidrolizar los lípidos presentes en el sustrato Tween 80, lo
cual se hizo manifiesto por el viraje de color que presento el medio de cultivo
producto de la disminución de pH por la liberación de ácidos grasos durante la
hidrólisis.
Un estudio similar realizado por Magdaleno (15), utilizando una cepa Yarrowia
lipolytica, se encontró que la levadura era capaz de hidrolizar los lípidos presentes
en el medio formando halos alrededor de los puntos de siembra, como indicador de
actividad lipolítica utilizaron rojo de metilo. Pedroza (17) reporta en su estudio la
formación de halos claros usando tributirina y rodamina B que produce fluorescencia
en el medio, ambos como indicadores de actividad lipasa.
Se pudo evidenciar que Yarrowia lipolytica presentó mayor actividad hidrolítica que
Geotrichum candidum, debido a que Y. lipolytica al ser una levadura posee una tasa
de crecimiento muchos más rápida que le permite liberar con mayor velocidad su
maquinaria enzimática, lo cual se reflejó en el viraje total de medio de cultivo a las
48 horas de incubación, G. candidum a pesar de ser un hongo micelial tuvo buena
respuesta enzimática mostrando aproximadamente un 95% de degradación del
medio.
En cuanto a la degradación, ésta investigación demostró que los dos
microorganismos degradaron ácidos grasos en ambos sustratos, obteniendo un
mejor rendimiento por parte de Y. lipolytica tanto en el efluente graso de origen
animal como en el aceite de origen vegetal de palma.
Los porcentajes de degradación por parte de Y.lipolytica son de 7.88% y 0.17%,
para efluente graso y aceite vegetal de palma respectivamente. Mientras que para
G. candidum son del 1.93% y 0.09% respectivamente.
El rendimiento de Y. lipolytica puede deberse a las tres enzimas lipasas que esta
posee, YLLIP2, YLLIP7 Y YLLIP8 en comparación con G. candidum con las lipasas
I y II. Esto concuerda con estudios realizados por Posso et al (26) en donde la
actividad de las lipasas que posee Y. lipolytica degradaron el 83% de ácidos grasos
contenidos en el efluente graso de origen animal, mientras que Maldonado (27)
obtuvo resultados de la actividad lipolítica de G. candidum hasta las 72 horas,
teniendo un rendimiento estable hasta las 48 horas donde se había degradado el
20% de los ácidos grasos.
44
Estudios realizados por De Guevara (33) indican que las lipasas fúngicas son las
más utilizadas en tratamientos con contenido graso, debido a su menor costo y su
mayor estabilidad operacional. Siendo esto una alternativa promisoria respecto a
los resultados obtenidos, ya que se encuentra un porcentaje considerable en la
degradación habiéndose tomado intervalos de horas. El estudio en comparación
muestra una mayor degradación en cortes de 15 a 30 días, en donde se logra una
disminución de los ácidos grasos en desechos contaminados con aceite vegetal.
Esta investigación concluye que no hubo una significancia estadística en los
tratamientos experimentales, pero se demostró mediante los grados de libertad y el
valor estadístico F que los experimentos fueron bien controlado, tanto en el efluente
graso de origen animal como en el aceite vegetal de palma.
El rendimiento de ambos microorganismos en efluente graso fue mejor, esto puede
deberse a la composición química del aceite ya que este está formado por ácidos
grasos insaturados, monoinsaturados y poliinsaturados, siendo el primero con el
mayor porcentaje y el último con la menos proporción en la composición química de
estos.
El aceite vegetal se forma por triglicéridos y ácidos grasos, que poseen TG oleicos
y linoleicos, compuestos con la configuración cis los cuales son isómeros de los
ácidos grasos trans, en los que -H se disponen uno a cada lado del doble enlace.
La prueba de comparación de medias de Tukey (95%) no detectó diferencia
estadística (P>0,05), pero sí numérica, en la determinación cuantitativa de la
actividad lipolitica de los experimentos en las 48 horas de lectura. Esto sugiere que
este tiempo de lectura en esta investigación es suficiente para determinar la
actividad enzimática de los experimentos, expresada en rendimiento de
degradación de ácidos grasos.
45
8. CONCLUSIONES
El estudio permitió demostrar que Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica
presentan actividad de lipólisis en aceite vegetal de palma y efluente graso de origen
animal, siendo este último el sustrato en donde hacen un mejor aprovechamiento
los microorganismos. Demostrando así su utilidad en futuros procesos de
tratamiento en efluentes grasos y/o trampas de grasas industriales con
microorganismos biológicos eficientes.
La capacidad de hidrólisis evidenció que ambos microorganismos son capaces de
degradar lípidos, obteniendo un resultado positivo. Estudios anteriores confirman lo
expuesto, ya que Y. lipolytica contiene tres lipasas extracelulares de gran alcance
al igual que G. candidum que posee dos lipasas extracelulares, las cuales han sido
purificadas y usadas en procesos biotecnológicos, teniendo un resultado favorable,
lo que hace que sean microorganismos de interés para su utilización.
Los porcentajes de degradación son de 7.88% Para Yarrowia lipolytica y 1.93%
para Geotrichum candidum, en efluente graso, siendo esto contrastado con otros
estudios en donde Y. lipolytica obtiene una mayor efectividad esto debido a las
lipasas extracelulares que la componen, que actúan a niveles superiores,
degradando a mayor escala.
Los porcentajes de degradación en el aceite vegetal de palma son de 0.09% y
0.17% para Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica, respectivamente.
Para el análisis de la actividad lipolítica en aceite vegetal, se hizo necesario usar el
microorganismo directamente, ya que por ser el EEC con composición acuosa y
debido a que no hay relación hidrofílica entre estas sustancias, la opción para
determinar su actividad fue inocular el microorganismo directamente.
46
9. RECOMENDACIONES
Extender la exposición de Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica a un
intervalo más amplio de horas y/o días, y así comparar los resultados con los
obtenidos en esta investigación.
Realizar otros trabajos enfrentando variables como pH, concentraciones e intervalos
de horas más amplios, con el fin de saber en dónde tienen mejor comportamiento
Geotrichum candidum y Yarrowia lipolytica, apuntando a que estos dos
microorganismos sean una alternativa promisoria para el tratamiento de las fuentes
hídricas en donde terminan los desechos con contenido lipídico.
Purificar la enzima para caracterizar la función e interacciones específicas de las
lipasas en procesos biotecnológicos, para que sea esta directamente la que actué
en los procesos y resulte un tratamiento con una mayor efectividad.
Realizar una prueba piloto haciendo un mix de Yarrowia lipolytica y Geotrichum
candidum para evaluar la efectividad de estas en la degradación de tratamientos a
base de lípidos.
47
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50
ANEXOS
Anexo A. Resultados de los análisis para la determinacion de ácidos grasos
51
52
53
54
Anexo B. Evidencias fotográficas
C.Reactivación de la cepa D.Desprendimiento biomasa
E.Agitación en Shaker para obtener EEC F.Centrifugación del EEC
G.Centrifugación del EEC H.Filtración por membrana
55
I.EEC de Geotrichum candidum- EEC de Yarrowia lipolytica
J.Absorbancia del EEC
K.Preparación de medio YNB para método de ensayo en placa
56
L.Muestras de aceite de origen vegetal y efluente graso de origen animal
M.Desprendimiento y pesaje de biomasa de M.O
![Redalyc.CONTROL POSCOSECHA DE Geotrichum citri-aurantii EN ... · CONTROL POSCOSECHA DE Geotrichum citri-aurantii EN LIMÓN MEXICANO (Citrus aurantifolia [Christm.] Swingle) MEDIANTE](https://static.fdocuments.es/doc/165x107/5e302ab84e43e210ab09caa1/poscosecha-de-geotrichum-citri-aurantii-en-control-poscosecha-de-geotrichum.jpg)
