EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADORA DE FENOL POR
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1 EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADORA DE FENOL POR Pseudomonas fluorescens P4 INMOVILIZADA EN SOPORTES ORGANICOS PARA EL DESARROLLO POSTERIOR DE UN SISTEMA BIOANALITICO ANNETH JOHANNA RODRÍGUEZ AMADOR CAMILO ALBERTO TORRES OBREGÓN PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C 2001
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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADORA DE FENOL POR
Pseudomonas fluorescens P4 INMOVILIZADA EN SOPORTES
ORGANICOS PARA EL DESARROLLO POSTERIOR DE UN SISTEMA
BIOANALITICO
ANNETH JOHANNA RODRÍGUEZ AMADOR
CAMILO ALBERTO TORRES OBREGÓN
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C
2001
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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADORA DE FENOL POR
Pseudomonas fluorescens P4 INMOVILIZADA EN SOPORTES
ORGANICOS PARA EL DESARROLLO POSTERIOR DE UN SISTEMA
BIOANALITICO
ANNETH JOHANNA RODRÍGUEZ AMADOR
CAMILO ALBERTO TORRES OBREGÓN
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE MICROBIOLOGOS
INDUSTRIALES
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C
2001
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1. INTRODUCCIÓN
El fenol es uno de los componentes del alquitrán de hulla y se forma durante la
descomposición natural de materiales orgánicos. No obstante, la mayor parte
del fenol presente en el medio ambiente es de origen antropogénico, teniendo
como fuentes potenciales las industrias de plásticos fenólicos y caprolactama,
los gases de escape, la quema de leña, el humo de los cigarrillos, la
degradación del benceno por influencia de la luz y los derivados del benceno y
del fenol, que mediante una conversión in vivo, pueden constituir una fuente de
exposición humana endógena al fenol (WHO, 1994).
Las aguas residuales con compuestos fenólicos provenientes de la industria
farmacéutica, petroquímica y química resultan ser altamente tóxicas y
potencialmente cancerígenas para plantas y animales, y los métodos más
utilizados para su eliminación comprenden procesos físicos y químicos, entre
los que se tienen las técnicas conocidas como adsorción a carbón activado,
extracción con solventes, y oxidación química (Zhou & Fang, 1999).
Por otra parte, se han estudiado tratamientos biológicos, tanto oxigénicos como
anoxigénicos, para la remediación de suelos, lodos, aguas y aire contaminados
con fenol. Los procesos anaerobios son muy lentos, frente a la degradación
microbiana oxigénica aplicada a matrices acuosas que presenta ventajas, tanto
económicas como operacionales, sobre los procesos físicos y químicos. Para
este tipo de tratamiento se ha reportado principalmente el uso de reactores con
células inmovilizadas, con los que se logran remociones superiores al 99,9%
(Mora, et al, 1998).
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Microorganismos como bacterias, levaduras y algas han sido frecuentemente
utilizados en la biodegradación, principalmente a bajas concentraciones. Entre
estos se destacan los géneros Bacillus sp, Comamonas testosteroni,
Alcaligenes sp, Streptomyces sp, Trichosporon sp, Candida sp, Ochramonas sp
y el mejor estudiado de todos, Pseudomonas sp capaces de degradar una
amplia variedad de compuestos aromáticos. (Poh, et al, 1999).
El aprovechamiento de las rutas metabólicas presentes en el género
Pseudomonas sp. con respecto a la utilización de compuestos monoaromáticos
tóxicos, hace apropiado su uso como elemento receptor de biosensores
diseñados para detectar xenobióticos. (Reshetilov, et al; 1996). La investigación
en este campo y en particular sobre el diseño de biosensores basados en
células microbianas vivas se torna muy importante para el desarrollo de
sistemas de monitoreo ambiental.
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2. MARCO TEORICO
Los avanzados procesos de desarrollo industrial y la síntesis e implementación
de diversos compuestos químicos tóxicos, con fines agrícolas, han generado un
deterioro importante en las condiciones ambientales, de los cuerpos de agua y
otros ecosistemas. Sin embargo paralelamente se ha incentivado la necesidad
del establecimiento de alternativas que permitan principalmente cumplir con el
monitoreo, control y remediación de las condiciones ambientales.
La búsqueda de nuevas posibilidades, como la utilización de microorganismos
autóctonos, capaces de detectar contaminantes y recuperar ecosistemas
alterados por la presencia de compuestos xenobioticos, se ha convertido en la
herramienta actual de aplicación.
2.1 BIOSENSORES
Los biosensores son instrumentos analíticos que a partir de la inducción de
mecanismos biológicos generan señales eléctricas, que permiten su
cuantificación. Este sistema incorpora un material biológico (tejidos,
microorganismos, organelos, células receptoras, enzimas, anticuerpos, ácidos
nucléicos, etc.), o un bioanálogo, dentro de un transductor físico-químico o en
un microsistema de transducción, con caracterización óptica, electroquímica,
piezoeléctrica, termoeléctrica o magnética. (Walker, 1997).
El material biológico es el elemento bioreceptor que genera una señal como
resultado de su interacción con el compuesto de interés; esta señal es luego
amplificada y alimenta un sistema que procesa los datos y presenta
posteriormente los resultados. (Sorochinskii & Kurganov, 1997).
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El modelo de biosensor consta de varias partes interconectadas. La reacción
biológica se realiza habitualmente en estrecho contacto con el transductor
físico, lo que asegura que la mayor parte de la reacción bioquímica sea
detectada. (figura 1). Los biosensores son mecanismos libres de reactivos que
poseen una alta especificidad y selectividad; facilitando por lo tanto un rápido
desarrollo en esta línea de investigación. (Sorochinskii & Kurganov, 1997).
El uso de moléculas biológicas activas como parte de biosensores se debe a su
alta sensibilidad y por lo tanto, su gran poder discriminatorio, siendo estas
características, su principal ventaja frente a marchas analíticas convencionales.
Así, son capaces de detectar determinados compuestos en mezclas complejas,
frente a otros materiales de similares estructuras que pudiesen estar presentes
en concentraciones parecidas o mayores a las de la molécula de interés.
(Walker, 1997).
Figura 1. Biosensor básico
(Sorochinskii & Kurganov, 1997)
Figura 1 BIOSENSOR BASICO
(Ziegler, C, Wolfgang, G, 1998) Analito
Membrana semipermeable
Bioreceptor Transductor de la señal biológica
Amplificador Medidor Eléctrico
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2.2 APLICACIONES
Estos mecanismos analíticos son empleados para diversos propósitos como por
ejemplo en el diagnóstico clínico, el control de procesos industriales, producción
de alimentos, el control de procesos de fermentación, la producción de
cosméticos, así como el control de calidad y seguimiento. La industria militar
esta interesada en su utilización como detectores de explosivos, gases que
afectan el sistema nervioso, y toxinas microbianas. (Walker, 1997).
El uso de biosensores en estudios medioambientales esta dirigido
principalmente a la detección de la polución y control de la misma, pues permite
la medición de cantidades en concentraciones mínimas, trazas, de una
sustancia en particular, por ejemplo un desecho industrial, en una mezcla
compleja que resulta de un proceso determinado. (Wiseman, 1991)
2.3 REACCION BIOLOGICA
Un factor importante en todos los biosensores es la superficie detectora. Esta
consiste normalmente en una capa delgada de material biológico activo en
estrecho contacto con el transductor físico.
En algunos casos el material puede estar unido covalentemente a la superficie
pero normalmente forma parte de una delgada membrana que recubre la
superficie detectora.
Generalmente, la conversión de un proceso biológico en una señal electrónica
es más eficiente cuando es mínima la distancia entre el lugar donde la reacción
biológica sucede y el lugar donde la transducción electrónica ocurre. Es
importante para retener actividad bioquímica que el material biológico no se
pierda en las soluciones a analizar. (Wiseman, 1991)
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2.4 BIOSENSORES ELECTROQUIMICOS
Los biosensores electroquímicos incluyen los biosensores amperométricos, que
determinan las corrientes eléctricas asociadas con los electrones invo lucrados
en los procesos redox; los biosensores potenciométricos que usan electrodos
selectivos para ciertos iones los cuales determinan cambios en la concentración
de los iones escogidos (Ej. iones H+), y los biosensores conductimétricos que
determinan cambios en la conductancia relacionados con variaciones en el
ambiente iónico de las soluciones.(Walker, 1997).
Biosensores Amperométricos
Las reacciones redox catalizadas por enzimas pueden formar la base de la
mayoría de los biosensores si la corriente de electrones redox se puede
determinar. En condiciones normales, se aplica una tensión constante entre dos
electrodos y la corriente se determina, debido a la reacción de los electrodos
(Walker, 1997).
Se utilizó este principio se basa el primer y más sencillo biosensor, este se usó
para la determinación de glucosa fundamentado en el electrodo de oxígeno
según Clark. (figura 2). Entre el cátodo central de platino y el ánodo circundante
de Ag/AgCl se aplica una tensión potencial de 0.6 voltios. El oxígeno molecular
disuelto se reduce en un cátodo de platino y se cierra el circuito mediante una
solución saturada de cloruro de potasio.(Mattiason & Bjôrnsson, 2000).
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El compartimento del electrodo esta separado del biocatalizador por una fina
membrana de plástico, permeable solo para el oxígeno, y a menudo hecha de
teflón. Una membrana que es permeable solo a moléculas de bajo peso
molécular, incluyendo los reactivos y los productos, mantiene próximo el
biocatalizador al electrodo. Las técnicas para mantener el elemento bioreceptor
en un sitio determinado son abundantes. (Mattiason & Bjôrnsson, 2000).
2.5 INMOVILIZACION
Usualmente la inmovilización produce un aumento en la estabilidad del receptor
la cual se correlaciona directamente con un incremento en la reproducibilidad
de la respuesta del biosensor. Además, la inmovilización del elemento biológico
permite que el biosensor sea usado repetidamente, reduciendo por lo tanto los
costos de cada medición. (Sorochinskii & Kurganov, 1997).
Para la inmovilización de receptores biológicos se usan en biosensores
métodos como adsorción dentro de un soporte neutro o sobre la superficie de
Figura 2. Electrodo de Oxígeno según ClarK-Lyons (Mattiason & Bjôrnsson, 2000).
Cátodo (Pt) Ánodo (Ag)
Electrodo de O2
Membrana de Teflon
Membrana de Diálisis
Microorganismo Inmovilizado
Electrolito
Buffer Fosfato
Anillo –o- plástico
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un detector sensible; atrapamiento entre la superficie detectora y una
membrana o una red sintética (nylon); incorporación dentro de una matriz
polimérica; entrecruzamiento con agentes bifuncionales, y enlace covalente
hacia la superficie receptora. (Sorochinskii & Kurganov, 1997).
El interés en la fijación de células microbianas sobre o en ciertos polímeros
insolubles se debe a la necesidad de desarrollar biotecnologías prolongadas y
continuas que requieran una concentración máxima de un biocatalizador (por
unidad de volumen), una máxima protección de las células de los efectos
nocivos del medio, y un mínimo consumo de energía. (Fedorov, et al; 1999).
2.5.1 Inmovilización por atrapamiento
Este método consiste en atrapar células y enzimas en una malla rígida que les
impide invadir el medio líquido y paralelamente permite la difusión de los
sustratos y productos. Esta técnica ha sido ampliamente difundida para la
inmovilización celular, los soportes usados son conocidos como geles entre los
que se encuentran, agar-agar, k-carragenina, colágeno, gelatina, triacetato de
celulosa, poliacrilamida, alginatos, resina epóxica, poliéster, poliestireno y
poliuretano.(Martínez, 2000; Chibata, et al, 1986).
El proceso de inmovilización puede hacerse en uno o dos pasos, en el primero
se inmoviliza una gran cantidad de células atrapadas en el gel dando diversas
formas tales como perlas, cubos, o membranas de acuerdo al uso. El tamaño
del poro es tan pequeño que no permite que los compuestos de alto peso
molecular salgan al medio y los de peso molecular bajo, sustratos y productos
como fluyan fácilmente a través de ellos. (Martínez, 2000).
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2.5.1.1 Atrapamiento en Alginato de Calcio
El alginato es un copolímero lineal de ácido D- manurónico y L- gulurónico, este
puede ser gelificado por iones multivalentes tales como calcio y aluminio. Pero
para la inmovilización de células, comúnmente el alginato se emplea con
soluciones de cloruro de Ca2+, como agente gelificante del alginato de sodio, en
una concentración de 0.05 - 2 M y el rango de las perlas formadas puede estar
entre 0.1- 5 mm de diámetro.
El peso molecular del alginato, puede variar por su composición química debido
al porcentaje de ácido manuronico y guluronico en residuos que presente.(figura
3). En soluciones puede ser usado en concentraciones que varían entre 0.5 y
10%, al igual que emplearse a temperaturas entre 0° y 80°C.(Chibata, et al,
1986).
2.5.1.2 Atrapamiento en Agar-agar
El agar- agar es extraído a partir de ciertas macroalgas rojas marinas, y es el
agente solidificante comúnmente más usado para medio bacteriológicos. Se
encuentra formado por dos polisacáridos, agarosa (agente gelificante) y
agaropeptina encontrándose este último en una proporción del 60%.
Figura 3. Estructura del Alginato de Sodio (Smidsrφd & Gudmund, 1990).
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Entre las propiedades más importantes del agar, se incluyen el no ser
enzimáticamente degradado por muchas especies bacterianas; ser estables por
encima de 65°C o más; permanecer en fase líquida hasta no ser enfriados a
una temperatura de 40°C; y poseer un alto grado de transparencia. (Gerhardt,
1994).
Se emplea en diferentes concentraciones que varían entre 2 y 4% p/v y se
diluye en el medio indicado dependiendo del tipo de célula. La inmovilización en
agar protege a las células no solamente de los efectos tóxicos (lo cual aumenta
el potencial de biodegradabilidad por parte del biocatalizador), sino también de
los efectos inhibitorios de los metabolitos (lo cual permite al cultivo funcionar
bajo condiciones de acumulación de productos que inhiben su actividad).
(Fedorov, et al; 1999).
2.6 FENOL
Fenol es el nombre especifico del monohidroxibenceno C6H5OH, y el nombre
genérico de cualquier compuesto que contiene uno o varios hidroxilos (OH)
unidos a un anillo aromático. Es conocido también como ácido carbólico,
hidroxibenceno, ácido fenólico, ácido fenílico, benzafenol, fenolbenceno, ácido
bencenolcarbólico, óxido benceno, monofenol, ácido fénico, fenol alcohol,
fenilhidroxido.(figura 4)
Estructura Química
C6H6O
Figura 4.Estructura Química del fenol (WHO,1994)
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El fenol es un compuesto cristalino blanco, que se funde a 41°C en un líquido
incoloro, que hierve a 182°C. Su peso molecular es de 94.114 g / L. Tiene un
olor característico. Se emplea principalmente en la fabricación de resinas
fenólicas por combinación con formaldehído y es importante su uso como
intermediario en la fabricación de medicamentos, colorantes, hormonas
vegetales, etc. (KirK, et al, 1991).
2.6.1 Propiedades Físicas y Químicas
Constantes: Punto de solidificación 40.9°C ; Punto de ebullición 181.75°C,
densidad 1.05760; presión de vapor, log10 P=7.84376-2043.0/(t+230.1); calor de
fusión 25.37 Kcal / mol; calor de combustión 732 Kcal/mol.
La solubilidad del fenol en agua, por encima de 65.3°C en todas las
proporciones se debe al grupo hidroxilo y por debajo de 65.3°C se forman dos
capas, una rica en fenol y otra rica en agua. El fenol es muy soluble en éter
etílico, alcohol etílico, ácido acético, glicerol, anhídrido sulfuroso líquido y
benceno y menos soluble en hidrocarburos alcánicos. (KirK & Othmer, 1991)
2.6.2 Reacciones
Químicamente, el fenol se caracteriza por la influencia mutua del grupo fenilo y
del hidroxilo. El grupo fenilo negativo comunica ligera acidez al hidroxilo, por
consiguiente el fenol reacciona con las bases para formar sales (llamadas
fenóxidos, fenolatos, o fenatos). Muchas de estas sales especialmente las de
sodio y potasio son solubles en agua, y son todas fácilmente descompuestas
por el dióxido de carbono.
El fenol es fácilmente oxidado y convertido en gran variedad de productos, entre
ellos derivados dihídricos y polihídricos (pirocatecol, hidroquinona, pirogalol,
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etc.) y derivados de difenil (difenoles o bifenoles, dibenzofuranos) y productos
de descomposición, según el agente oxidante y las condiciones. (KirK &
Othmer, 1991).
2.6.3 Fuentes y fabricación
El fenol se forma de la descomposición de muchos compuestos oxigenados; se
encuentra dentro de los productos de la descomposición natural de las
proteínas y de la descomposición térmica de hulla, la madera y los esquistos
bituminosos. De igual forma esta presente en aceites del craking del petróleo, y
se forma en la producción de aceites por hidrogenación de la hulla o por
oxidación del benceno. La descomposición de las cadenas laterales de un feno l
sustituido (cresol) bajo la influencia del hidrógeno produce fenol.
2.6.4 Determinación Analítica del Fenol
Las técnicas analíticas más importantes para la detección de fenol son la
cromatografía de gas (GC) en combinación con un detector de llama ionizante
(FID), y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), en combinación con
un detector de luz ultravioleta (UV).
La identificación de fenol por GC/FID ha sido mejorada por la reacción de los
fenoles con bromuros o pentafluorobencilbromuros, y el uso de detectores de
captura electrónica y la detección usando HPLC puede ser mejorada por la
reacción con p-nitrobenceno diazonio tetrafluoroborato, para formar azo
derivados.
Los límites de detección de estas técnicas en aguas es de aproximadamente
0.2 µg/L, según lo reportado por la US Enviromental Protection Agency (EPA,
1998).
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Otra técnica analítica reportada es la reacción colorimétrica del fenol con la 4-
aminoantipirina, en presencia de ferrocianuro de potasio, para formar un tinte de
antipirina. El límite de detección de esta técnica para muestras de agua, previa
destilación ha sido reportada como 1µg/L (WHO, 1994).
2.6.5 Transporte y Distribución en el Medio ambiente
Las principales emisiones de fenol van al aire, de tal forma que la mayor parte
del fenol existente en la atmósfera se degrada por reacciones fotoquímicas,
frente a los dihidroxibencenos, los nitrofenoles y los productos de ruptura del
anillo aromático, con una vida media estimada entre 4 y 5 horas. Una menor
parte desaparecerá del aire por deposición hídrica o precipitación (lluvia). Se
cree que el fenol es móvil en el suelo, pero el pH puede influir en el transporte y
la reactividad.
2.6.6 Propiedades fisiológicas y Riesgos para la salud
El fenol se absorbe fácilmente por todas las vías de exposición y una vez entra
en contacto con el organismo, la sustancia se distribuye rápidamente a todos
los tejidos conjugandose principalmente con ácido glucorónico y el ácido
sulfúrico y, en menor medida, se hidroxila en pirocatequina e hidroquinona.
También se conjuga con los fosfatos y la formación de metabolitos reactivos
(4,4-bifenol y difenoquinona) se ha demostrado en estudios in vitro con
neutrófilos y leucocitos humanos activados.
El hígado, los pulmones y la mucosa gastrointestinal constituyen los sitios más
importantes del metabolismo fenólico. Como efectos sistémicos se incluyen
disrítmias, acidosis metabólica, hiperventilación, disnea, insuficiencia renal
aguda, lesiones renales, orinas oscuras, metahemoglobinemia, trastornos
neurológicos, (incluidas convulsiones), choque cardiovascular, coma y muerte.
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La dosis mínima reportada como causante de muerte en el ser humano es de
4.8 g por ingestión; y la muerte se produce en menos de 10 minutos. (WHO,
1994).
Durante mucho tiempo se ha reconocido la posibilidad de envenenamiento por
inhalación de los vapores de fenol, pero no se han reportado casos mortales
relacionados con esta vía de exposición. Los síntomas que se asocian a la
inhalación de fenol consisten entre otros en anorexia, pérdida de peso, dolor de
cabeza, vértigo, salivación y orinas oscuras. (WHO, 1994).
La excreción por la orina es la principal vía de eliminación del fenol, en los
animales y el hombre. La tasa de excreción urinaria varía en función de la dosis,
de la vía de administración y la especie. Una menor parte se excreta a través de
las heces y del aire expirado. (WHO, 1994).
Los niveles ambientales básicos y exposición humana son inferiores a 1µg /m3.
Los niveles urbanos y suburbanos oscilan entre 0.1 y 8 µg /m3. El humo de
cigarrillo y los alimentos ahumados constituyen la fuente más importante de
exposición al fenol. (WHO, 1994).
2.6.7 Efectos en los seres vivos y el medio ambiente
En bacterias, hongos y protozoarios los valores de la CE50 que presentaron
inhibición del crecimiento oscilaron entre 244 y 1600 mg de fenol / L , con un
umbral de toxicidad de 64 mg de fenol / L. Así mismo es tóxico para organismos
superiores de agua dulce siendo los valores más bajos de la CL50 la C50, para
crustáceos y peces de 3 y 7 mg de fenol / L. Los factores de bioconcentración
del fenol en diversos tipos de organismos acuáticos son en general muy bajos
(<1-10 mg/kg), aunque se han notificado algunos valores más altos (hasta
2200 mg/kg). (WHO, 1994).
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2.6.8 Transformación en el medio ambiente
El fenol presente en el agua y el suelo puede degradarse por reacciones
abióticas, así como por actividad microbiana, dando lugar a una gama de
compuestos, siendo los más importantes el CO2 y el Metano.
La proporción entre la degradación general y la biodegradación del fenol esta
determinada por múltiples factores, como la concentración, la aclimatación, la
temperatura y la presencia de otros compuestos. (WHO, 1994).
2.6.8.1 Degradación Abiótica
El fenol puede reaccionar en el aire con radicales hidroxilo (OH) o nitro (NO3), y
sufrir otras reacciones fotoquímicas para formar dihidroxibencenos, nitrofenoles,
y productos provenientes del clivaje del anillo aromático. Absorbe la luz a una
longitud de onda de 290-330 nm, y por lo tanto podría fotolisarse, pero también
reacciona con radicales de peróxido e hidróxido producidos fotoquímicamente
en aguas iluminadas por la luz solar, o con iones de nitrato en soluciones
acuosas diluidas para formar dihidroxibencenos, nitrofenoles, nitrosofenol, y
nitroquinona.(WHO, 1994).
2.6.8.2 Degradación Biótica
Las bacterias juegan un papel importante en la degradación de fenol en suelos,
agua, y aunque el número de bacterias capaces de utilizar fenol es usualmente
un porcentaje pequeño de la población total presente, en un ecosistema, la
repetida exposición al contaminante puede causar la adaptación de cepas
capaces de utilizar éste como sustrato. (WHO, 1994).
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El fenol puede ser convertido por bacterias aeróbicas hasta CO2, y bajo
condiciones anaeróbicas hasta CO2 y CH4. Productos como benzoato, catecol,
cis – cis muconato, β- cetoadipato, succinato y acetato han sido identificados
como intermediarios en la degradación del fenol. (Smith,1990; Kibret, et al,
2000; Arai & Kudo, 1998).(figura 5).
La biodegradación de compuestos aromáticos puede ser considerada de cierto
modo como una parte de los procesos normales del ciclo del carbono y una
forma de remover los contaminantes de origen antropogénico del medio
ambiente. (Smith,1990).
2.7 BIODEGRADACION DEL FENOL
Para muchos de los microorganismos que crecen en condiciones normales, una
pequeña cantidad de oxígeno es derivado a partir del O2. Este elemento puede
ser obtenido a partir del agua, CO2, u otros compuestos orgánicos.
Figura 5. Reacciones Involucradas en la biodegradación de Fenol (Semple, et al, 1999)
Fenol
Dioxigenasa
Benceno
(dioxigenasa dehidrogenosa) Catecol
cis,cis Ácido Mucónico
Catecol 1,2 dioxigenasa
Catecol 2,3 dioxigenasa
Semialdehído 2-hidroximuconico
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Sin embargo, para los microorganismos que crecen sobre sustratos altamente
reducidos (hidrocarburos) o algunos compuestos clorados, el ataque primario
sobre el sustrato es usualmente llevado a cabo por enzimas denominadas
oxigenasas, las cuales involucran la incorporación de O2 a las moléculas,
haciendo que, una porción significativa del O2 total en las células puede ser
derivado del oxígeno molecular.
Ha sido estimado que para el crecimiento de bacterias sobre metano como
única fuente de carbono, más del 30% del oxígeno celular total se deriva del O2
proveniente de la acción de la enzima metano monoxigenasa. El producto final
de las reacciones catalizadas por oxigenasas son compuestos hidroxilados o
carbonilicos, los cuales son normalmente más solubles en el agua que otros
compuestos relacionados. (Kibret, et al, 2000; Arai & Kudo, 1998).
Se conocen dos clases de oxigenasas; estas son las monoxigenasas que
incorporan un átomo de oxígeno al sustrato orgánico mientras que el segundo
átomo de oxígeno es utilizado para formar agua. Las dioxigenasas incorporan
ambos átomos de oxígeno dentro de los sustratos, y participan en el
metabolismo oxidativo de una amplia variedad de químicos de gran significado
ambiental, agrícola y farmacéutico.
Varios de los sustratos ampliamente reconocidos por esta clase de enzimas
pertenecen a los hidrocarburos aromáticos y alifáticos tanto de origen
endobiótico como xenobiótico.
2.7.1 Dioxigenasas
Existen dos tipos de dioxigenasas diferenciandose por los requerimientos en
cofactores reducidos como NADPH o NADH; hidroxilación de los sustratos, y
rompimiento o clivaje del anillo.
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Las dioxigenasas son muy importantes en el proceso de iniciación de la
biodegradación de una variedad de compuestos nitroaromáticos y clorados así
como también hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH’s). Su principal
sustrato parece estar derivado del petróleo y lignina como una de sus mayores
fuentes de compuestos aromáticos en el ambiente, en el caso de la lignina, una
reserva de compuestos fenólicos. Varios de estos compuestos son primero
degradados a catecol o protocatecuato por oxigenasas (tanto monoxigenasas
como dioxigenasas) y los intermediarios son metabolizados por un tipo de
dioxigenasas especializadas en el clivaje del anillo, las cuales los conducen a β-
cetoadipato o 2-ceto-4-hidroxivalerato, los cuales entran luego al ciclo de los
ácidos tricarboxílicos.
Las dioxigenasas bacterianas dependientes de NAD(P)H son sistemas
multienzimáticos que están constituidos de dos a cuatro subunidades
dependiendo del sustrato y de la fuente de la enzima. Cada subunidad puede
contener de uno a dos átomos de hierro como grupos prostéticos y se encargan
de la transferencia de electrones a partir de la reducción equivalente de NADH
o NADPH; y de la hidroxilación o funciones enzimáticas. Estas enzimas son las
responsables de la cis – dihidroxilación de un compuesto aromático para formar
un cis-dihidrodiol, haciendo que se pierdan las propiedades de aromaticidad en
el producto.
Los cis –hidrodioles producidos a partir de las dioxigenasas hidroxiladoras del
anillo son convertidas por la enzima dihidrodiol dihidrogenasa hasta catecol.
Este paso remueve dos hidrógenos del cis-dihidrodiol para restaurar la
naturaleza aromática en el diseño del anillo y produce un derivado
dihidroxilado. La reacción posee un requerimiento para NAD oxidado, y el
NADH utilizado en la reacción de hidroxilación es regenerado. En
consecuencia, el producto es susceptible al rompimiento del anillo por un tipo
de dioxigenasas especializadas.
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Los compuestos aromáticos dihidroxilados, con grupos hidroxilo en posición
orto (catecol) o en posición para (gentistato), pueden ser clivados por
dioxigenasas encargadas de la ruptura del anillo. De estos dos tipos de sustrato
las forma más común y fácil de degradar es la estructura del catecol, debido a
que sus grupos hidroxilo se encuentran próximos uno del otro. Todas estas
enzimas poseen hierro, el cual participa en la catálisis en el sitio activo,
además, no requieren de un cofactor a diferencia del otro tipo de dioxigenasas.
El clivaje del catecol o del protocatecuato puede ocurrir de dos formas, cada
una con un mecanismo catalítico diferente y el rompimiento puede ocurrir entre
dos grupos hidroxilos (orto o intradiol clivaje) o entre dos grupos hidroxilos que
se encuentren próximos uno del otro (meta o extradiol clivaje).
2.7.1.1 Orto Clivaje
Este tipo de clivaje intradiol, ocurre entre los dos grupos hidroxilo adyacentes.
La reacción representativa de esto es provista por la catecol 1,2 dioxigenasa y
3,4 protocatecuato dioxigenasa. Estas enzimas contienen un ion férrico ( Fe+3),
como grupo prostético.
El clivaje intradiol de catecol genera cis-cis- ácido mucónico, el cual es
metabolizado para formar un intermediario mayor el β-cetoadipato, este último
compuesto es integrado dentro del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
Las enzimas del orto clivaje para catecol son especificas para el sustrato ya
que no pueden transformar protocatecuato o catecoles clorinados. Estos
últimos son transformados por las enzimas modificadas de la ruta orto .
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2.7.1.2 Meta clivaje
Este tipo de clivaje extradiol, ocurre próximo a uno de los dos grupos hidroxilo.
La reacción representativa es proporcionada por la 2,3 -catecol dioxigenasa, 2,3
-protocatecuato dioxigenasa y 4,5-protocatecuato dioxigenasa, enzimas que
contienen un ion ferroso (Fe+2) como grupo prostético y estan codificadas por
genes usualmente de origen plásmidicos. Catecoles con sustituyentes alquil son
usualmente transformados por la ruta meta. El clivaje extradiol del catecol
produce 2-hidroximuconico semialdehído. Este producto sufre posteriores
reacciones en el metabolismo que lo conducen a formar el intermediario clave,
2-ceto-4-hidroxivalerato el cual es eventualmente metabolizado para formar
acetoacetato, piruvato y acetaldehído.(figura 6).
23
Figura 6. Biodegradación del fenol - Meta clivaje
(Smith M.R, 1990)
Figura 6. Meta clivaje del anillo de fenol
(Smith, 1990)
4-Oxalocrotonato
Piruvato
Fenol
(Fenol monoxigenasa)
Catecol
(Catecol 2,3-dioxigenasa)
24
2.7.2 Monoxigenasas
Esta clase de enzimas insertan un átomo de oxígeno molecular al sustrato, y el
otro átomo se integra a una molécula de agua. Las monoxigenasas son más
abundantes que las dioxigenasas, además su acción es más compleja y pueden
catalizar varios tipos diferentes de reacciones de inserción de oxígeno.
Debido a que las monoxigenasas oxidan dos sustratos estas también son
llamadas oxidasas de función mixta. Algunas de ellas pueden hidroxilar
sustratos por lo que se les conoce también como hidroxilasas. (figura 7).
Varias reacciones llevadas a cabo por monoxigenasa han sido identificadas de
la siguiente manera:
R-H+NAD(P)H+O2 R-OH+NAD(P)+H2O
Las monoxigenasas bacterianas pueden hidroxilar compuestos aromáticos,
especialmente si el sustrato se encuentra sustituido. Al igual que con las
dioxigenasas, la formación de compuestos aromáticos con dos grupos
hidroxilos es un prerequisito para el clivaje oxidativo del anillo. (Arai & Kudo,
1998).
Si el sustrato aromático inicial posee solamente un grupo hidroxilo, la adición
de otro grupo OH, puede producir catecol, el cual es más apropiado para el
rompimiento del anillo. Estas enzimas incorporan un nuevo grupo hidroxilo en la
posición orto, adyacente al hidroxilo existente, para formar catecol y
protocatecuato respectivamente. Otras hidroxilasas también catalizan
Figura 7. Reacción General de las Monoxigenasas (Poh, et al, 1999)
25
reacciones de hidroxilación en la posición para, como por ejemplo la 3-hidroxi
benzoato hidroxilasa, la cual se encarga de generar gengistato o hidroquinona.
(Smith, 1990).
Las monoxigenasas bacterianas pueden hidroxilar anillos aromáticos teniendo
mecanismos catalíticos que difieren de las monoxigenasas eucarióticas, debido
a que no son capaces de formar intermediarios de óxidos de fenol.
2.8 FACTORES QUE INFLUYEN LA BIODEGRADACION DE COMPUESTOS
AROMATICOS
2.8.1 Factores físicos y químicos
Los hidrocarburos del petróleo pueden ser divididos en cuatro clases que
incluyen; saturados, aromáticos, asfalténicos (fenoles, ácidos grasos, cetonas,
ésteres y porfirinas), y las resinas (piridinas, quinolina, carbazoles, sulfóxidos y
amidas).
Difieren también en su suceptibilidad al ataque microbiano y son catalogados de
acuerdo a su peso molecular siendo los hidrocarburos de bajo peso molecular
más susceptibles a la biodegradación que los de alto peso molecular.
La heterogeneidad composicional del petróleo y de sus productos refinados
posee una influencia general sobre la tasa de biodegradación tanto del aceite
como de sus fracciones componentes. (Leahy & Colwell, 1990).
La mayoría de los hidrocarburos al entrar en contacto con ecosistemas
acuáticos, debido a fuentes antropogénicas, tienden a formar películas sobre la
superficie del agua y depósitos al borde de las orillas que conllevan al deterioro
del ambiente. La dispersión de los hidrocarburos en la columna de agua en
forma de emulsiones aumenta el área superficial del mismo y por lo tanto se
26
hace más disponible para la degradación microbiana. Sin embargo, grandes
cantidades de emulsiones pueden provocar una baja relación superficie /
volumen, inhibiendo así la biodegradación.
En ecosistemas terrestres los hidrocarburos están caracterizados por un
movimiento vertical a través del suelo, a diferencia de la distribución horizontal
asociada con la formación de capas que se presenta en ecosistemas acuáticos.
La infiltración de esta clase de compuestos en el suelo previene la pérdida por
evaporación de hidrocarburos volátiles, lo cual puede ser tóxico para los
microorganismos.
La materia orgánica e inorgánica particulada puede reducir, por absorción, la
toxicidad inherente a los componentes del petróleo, pero la absorción y
adsorción de estos a sustancias húmicas probablemente contribuya a la
formación de residuos persistentes. (Leahy & Colwell, 1990).
2.8.2 Concentración del Hidrocarburo
Las tasa de captación y mineralización de varios compuestos orgánicos por
poblaciones microbianas en ambientes acuáticos es proporcional a la
concentración del compuesto, generalmente de acuerdo a la cinética de
Michaelis- Menten. (Duarte, 1998). La cinética michaeliana ha sido probada
para la captación y oxidación del tolueno, fenol y compuestos aromáticos de
peso molecular bajo y una alta solubilidad acuosa, pero no es aplicable a
hidrocarburos con alto peso molecular y baja solubilidad en el agua. Esto
demuestra una correlación entre la solubilidad del compuesto y la tasa de
biodegradación del mismo. (Leahy & Colwell, 1990).
27
2.8.3 Temperatura
La temperatura influye sobre la degradación de hidrocarburos por su efecto
sobre la naturaleza física y composición química del mismo, la tasa del
metabolismo de los microorganismos para la degradación de estos compuestos,
y la composición de la comunidad microbiana. A bajas temperaturas la
viscosidad de los hidrocarburos aumenta, la volatilización se reduce y la
solubilidad en el agua aumenta. La tasa de degradación generalmente,
disminuye con la disminución de la temperatura; se cree que esto es el
resultado primario de la disminución de la tasa de actividad enzimática, o el
efecto Q10. (Atlas & Bartha, 1993). Altas temperaturas aumentan la tasa de
metabolización del hidrocarburo al máximo, típicamente en un rango de
temperatura entre 30-40°C. (Leahy & Colwell, 1990).
2.8.4 Oxígeno
Los pasos iniciales en la degradación de hidrocarburos alifáticos, cíclicos y
aromáticos por bacterias y hongos implican la oxidación del sustrato por
oxigenasas, por el cual el O2 es requerido. Las condiciones aeróbicas por lo
tanto son requeridas para las rutas de oxidación microbiana de hidrocarburos
en el medio ambiente. Condiciones de oxígeno limitado normalmente no se
presentan en los niveles superiores de la columna de agua en los ambientes
marinos y de aguas superficiales. Los sedimentos acuáticos, sin embargo, son
generalmente anóxicos, excepto por una delgada capa en la superficie del
sedimento. La disponibilidad de oxígeno en suelos depende de la tasa de
consumo de oxígeno microbiano, el tipo de suelo, si este se encuentra
sobresaturado de agua y de la presencia de sustratos utilizables que pueden
provocar escasez del oxígeno disuelto.
28
La concentración de oxígeno ha sido identificada como una variable que limita
la tasa de biodegradación de hidrocarburos en el suelo y de gasolina en aguas
terrestres. (Leahy & Colwell, 1990).
2.8.5 Nutrientes
La liberación de hidrocarburos a ambientes acuáticos puede contener baja
concentración de nutrientes inorgánicos, lo que frecuentemente produce
relaciones excesivamente altas de carbono/nitrógeno o carbono/fósforo, o
ambos, lo cual es desfavorable para el crecimiento microbiano. (Leahy &
Colwell, 1990).Se ha establecido muy bien que la disponibilidad del fósforo y del
nitrógeno limita la degradación microbiana de hidrocarburos en toda clase de
ecosistemas acuáticos (Singirtsev & Fedorov, 2000; Leahy & Colwell, 1990) y
un ajuste de las relaciones carbono/nitrógeno/fósforo por la adición de estos
componentes en forma de fertilizantes oleofílicos, puede estimular la
biodegradación de los hidrocarburos (Kirbret, et al, 2000). Sales inorgánicas de
nitrógeno y fósforo son efectivas en sistemas adiabáticos, pero tienden a
perderse en experimentos de campo. (Leahy & Colwell, 1990).
2.8.6 Salinidad
La concentración de sal, en un ambiente determinado establece condiciones de
limitación para el crecimiento de las poblaciones microbianas, ya que
deben poseer características de halofílicidad para lograr el desarrollo donde el
Aw es muy bajo. (Singirtsev & Fedorov, 2000; Leahy & Colwell 1990).
2.8.7 Actividad del agua
La actividad del agua o potencial del agua en suelos, puede estar en un rango
de 0.0 a 0.99, en contraste con ambientes acuáticos, en los cuales la actividad
del agua es estable en un valor cercano a 0.98. (Bossert & Barta, 1984). La
29
degradación de hidrocarburos en ecosistemas terrestres puede ser limitada por
la disponibilidad del agua para el crecimiento y metabolismo microbiano.
2.8.8 pH
El pH del suelo puede ser altamente variable en un grado de 2.5 en suelos con
residuos provenientes de la actividad minera hasta 11.0 en desiertos alcalinos.
(Bossert & Barta, 1984). Muchas bacterias heterotróficas y hongos se favorecen
con un pH cercano a la neutralidad, siendo los hongos más tolerantes a
condiciones ácidas; así mismo, se presenta una influencia negativa a pHs
extremos, sobre la población de microorganismos encargada de la degradación
de los hidrocarburos.
2. 9 MECANISMOS DE ADAPTACION A SOLVENTES ORGANICOS
Desde la Revolución Industrial, la producción y uso de compuestos químicos se
incremento excesivamente. Como consecuencia todo clase de desechos son
producidos y liberados al medio ambiente, llegando a la biosfera como resultado
de procesos de producción, perdidas durante su almacenamiento o accidentes
de evaporación. Por lo tanto el uso de tratamientos biológicos para la remoción
de estos compuestos tóxicos se convierte en una alternativa promisoria.
(Ramos, et al, 1997).
Diferentes procesos moleculares y bioquímicos pueden generar una respuesta
adaptativa en la comunidad microbiana. El primero es la inducción de enzimas
especificas en miembros de una comunidad microbiana resultando en un
aumento de la capacidad degradativa observada en el total de la comunidad.
Otro proceso es el desarrollo de una subpoblación específica de una comunidad
capaz de captar y metabolizar el sustrato y por ultimo se puede involucrar la
selección de mutantes los cuales han adquirido especificidad enzimatica
30
alterada o nuevas actividades metabólicas. Este proceso selectivo requiere de
un tiempo de adaptación mucho más largo que los dos procesos anteriores.
La principal función de la membrana celular de los microorganismos es la de
formar una barrera permeable, que regule el paso de solutos entre la célula y
exterior. Las propiedades de barrera de la membrana citoplasmatica son de
especial importancia para la transducción de la energía de la célula. El mayor
daño causado por solventes orgánicos en la membrana celular es el deterioro
de sus funciones vitales, como por ejemplo la pérdida de iones, metabolitos,
lípidos y proteínas, la disipación del gradiente de pH y potencial eléctrico o la
inhibición de proteínas de membrana, seguido a su vez por la lisis celular y
muerte. (Poh, et al, 1999).
2.9.1 Adaptación a Fenol
Una característica importante de clasificación de los solventes, e hidrocarburos
es el coeficiente de partición. El logaritmo del coeficiente de partición en una
mezcla definida de octanol / agua (Log Pow ), es comúnmente usado como
medida de la lipofilicidad de un solvente. Siendo valores entre 1.5 y 3.0
extremadamente tóxicos para los microorganismos.
Solventes aromáticos con un log Pow ., por debajo de 4.0 tales como benceno,
(log Pow 2.0), estireno (log Pow 3.6), xileno (log Pow 3.2), y tolueno (log Pow
2.5),son acumulados en la membrana citoplasmática de las bacterias causando
desorganización de la estructura de la membrana celular y el deterioro en el
cumplimiento de las funciones vitales de la membrana. Diferentes especies de
Pseudomonas, aisladas han sido capaces de crecer medios mínimos con altas
concentraciones de solventes orgánicos tóxicos,como tolueno, estireno, y para-
xileno; (Ramos, et al, 1997; Poh, et al, 1999).
31
La tolerancia a hidrocarburos aromáticos ha involucrado el planteamiento de los
tres posibles mecanismos relacionados con la respuesta bacteriana frente a
estos químicos tóxicos: a)Metabolización de hidrocarburos tóxicos, los cuales
pueden por su transformación puede convertirse en compuestos no tóxicos,
gracias a la inducción o represión de un grupo determinado de enzimas . b)
rigidificación de la membrana celular por vía de la alteración en la composición
de fofolípidos, es decir desarrollo de nuevas capacidades metabólicas.
c)Transformación de compuestos tóxicos en un proceso dependiente de
energía.
El estado inicial del daño causado por muchos solventes orgánicos sobre la
célula bacteriana es la unión y penetración a los lípidos de la membrana,
afectando la fluidez de la membrana, pero las bacterias responden alterando la
composición de los fosfolípidos de la membrana. (Ramos, et al, 1997; Semple,
et al, 1999).
Existen dos mecanismos mayores en respuesta a la acción del fenol, y
consisten en el cambio de la composición ácido graso- unido a ester y por lo
tanto la fluidez de la membrana. Se presenta isomerización cis/trans, de ácidos
grasos como respuesta a corto plazo; y el cambio en el porcentaje de ácidos
grasos saturados-insaturados como respuesta a largo plazo por la exposición a
solventes. Además el porcentaje de cadenas larga a cadenas cortas de ácido
graso puede ser alterado para regular la fluidez de la membrana.(Junker &
Segura, 1999).
El incremento de los ácidos grasos insaturados trans, es una respuesta común
a los cambios de temperatura y a la exposición a solventes. (Junker & Segura,
1999).
32
2.10 Pseudomonas sp
Las bacterias de género Pseudomonas sp, pertenecen a la Familia I
Pseudomonaceae y microscópicamente corresponden a un bacilo Gram
negativo, que mide entre 0.5-1.0 µm de diámetro por 1.5-5.0 µm de longitud,
con motilidad gracias a uno o varios flagelos polares; quimiorganotrofos, que
utilizan como aceptor terminal de electrones al oxígeno, aerobios estrictos,
aunque en algunos casos el nitrato puede ser empleado como aceptor alterno
de electrones, permitiendo así su crecimiento en condiciones anoxigénicas. Su
crecimiento se presenta a un rango de temperatura que va desde 4°C hasta
43°C, siendo su temperatura óptima 30°C. Catalasa positivos, y usualmente
oxidasa positivos. (Palleroni, 1994).
Muchas especies acumulan poli-β-hidroxibutirato como material de reserva,
fuente de carbono, el cual aparece como inclusiones. (Gerhardt, 1994).
Pseudomonas sp, se caracteriza principalmente por la producción de pigmentos
solubles, fluorescentes (pioverdina) y piocianina en medios que contienen bajos
cantidad de hierro. La fluorescencia varía desde blanco hasta azul-verdoso, la
cual es detectada por medio de radiaciones UV, a una longitud de onda de 365
nm.(Montie, 1998).
Pseudomonas fluorescentes saprofíticas son muy comunes en suelos y en la
rizósfera de las plantas, donde parecen tener un efecto estimulante sobre el
crecimiento de las mismas. Esto se debe en parte a la inhibición de lo
organismos patógenicos de las plantas, por la escasez del hierro, aunque la
utilización del complejo hierro- sideróforo por parte de la planta puede estar
también involucrada.(Montie, 1998).
33
2.10.1 Mecanismos de Degradacion
Pseudomonas sp, juega un papel importante en el medio ambiente que implica
la degradación de químicos tóxicos naturales y hechos por el hombre;
se caracteriza por poseer plásmidos que promueven su resistencia a
antibióticos, metales pesados, y xenobioticos, como es el caso de P.
aeruginosa. Pero a su vez promueven la transferencia de información genética
entre los diferentes grupos taxonómicos de bacterias.
2.10.1.1 Plásmidos Degradativos
Estos microorganismos presentan un metabolismo versátil, en donde algunas
actividades catabólicas son especificadas por genes de plásmidos designados,
plásmidos degradativos. Estos plásmidos se presentan naturalmente y pueden
ser transmisibles o no. (Montie, 1998).
Los plásmidos degradativos específicos involucran un grupo de genes
relacionados con la biodegradación de compuestos orgánicos tales como
hidrocarburos alifáticos y aromáticos, alcaloides y compuestos aromáticos
clorados. (Montie, 1998).
2.10.1.2 Plásmido TOL (pWW0)
El plásmido TOL representa un grupo de plasmidos que se encargan de la
degradación especifica de hidrocarburos tales como meta, orto, para- xileno,
tolueno, 1,2,4 – Trimetilbenceno, 3 –etiltolueno, y sus correspondientes
alcoholes y ácidos derivados.
El huésped natural del plásmido TOL es Pseudomonas putida mt-2, la cual fue
aislada en 1959 por K. Hosokawa en Japón en un medio enriquecido y
suplementado con m- toluato.
34
El tamaño de pWW0 es de 117 Kb y contiene dos operones, uno que codifica
para enzimas oxidativas del xileno/ tolueno o toluato/ benzoato y otro para
enzimas involucradas en la degradación futura de estos compuestos hasta
intermediarios que lleguen al ciclo de los ácidos tricarboxílicos; su expresión es
controlada por dos genes reguladores denominado xy/R y xy/S. (Montie, 1998).
2.10.1.3 Pseudomonas fluorescens
Esta especie presenta todas las características del género Pseudomonas, tiene
un diámetro celular de 0.7-0.8 mm, una longitud celular de 2.3 -2.8 mm, posee
un número de flagelos mayor de 1, crece a una temperatura óptima entre 25 y
30°C, produce pioverdina pero no piocianina. Produce levano a partir de la
fermentación de la sucrosa, crece bien a 4°C, pero no lo hace a 41°C, es
oxidasa positivo, no hidroliza la acetamida, prueba que permite su
diferenciación de otras especies como la Pseudomonas aeruginosa.
Esta especie se encuentra en el suelo y agua, a partir de los cuales puede ser
aislada posteriormente en medios enriquecidos que contienen varias fuentes de
carbono y ser incubadas aerobicamente; las cepas de biovars denitrificantes
pueden ser enriquecidas en medios similares que contengan nitrato e
incubadas bajo condiciones anaerobicas. (Palleroni, 1994).
P. fluorescens, produce un exolípido el cual es un peptidolípido llamado
viscosina, este compuesto es inusual en los demás géneros y su función
primaria es la de promover la extensión de la bacteria a lo largo de la superficie
de la planta colonizada. La viscosina es de naturaleza amínica y grasa, ya que
contiene L-leucina, D-serina, L- isoleucina, D-valina y treonina, al igual que un
ácido graso que le da su característica hidrofóbica. (Montie, 1998).
35
El hierro es un oligoelemento importante requerido por Pseudomonas, debido a
que es un potenciador redox, ya que esta relacionado con muchas, si no todas
las funciones biológicas primarias que debe cumplir la célula como por ejemplo:
el transporte electrónico, biosíntesis de ácidos nucleicos, fijación de nitrógeno.
(Montie,1998).
36
3. JUSTIFICACION
Este estudio pretende, desde una perspectiva biotecnológica, servir de punto de
partida para el desarrollo de algunas alternativas existentes en cuanto al
monitoreo y cuantificación de la contaminación, con el propósito de justificar a
su vez el diseño de programas que tomen medidas relacionadas con la
reducción de agentes de polución presentes en el medio ambiente y que
resultan tóxicos para el mismo.
Se ha notificado una larga serie de efectos adversos en el ser humano
resultantes de la exposición al fenol por vía cutánea, oral e intravenosa,
reportando como dosis mínima causante de la muerte 4.8 g por ingestión, pero
no se han reportado casos mortales relacionados por inhalación. (WHO, 1994).
Métodos modernos de tipo biotecnológico usados para la protección del medio
ambiente contra la contaminación tecnogénica, emplean varios
microorganismos con capacidad para degradar compuestos xenobióticos, lo
que plantea una oportunidad para hacer uso de estos mecanismos biológicos
en los elementos receptores de biosensores diseñados para detectar esta clase
de contaminantes.
Los biosensores microbianos constituyen un modo viable en el desarrollo de
mecanismos analíticos diseñados para detectar xenobióticos en ecosistemas
acuáticos. Con respecto a la implementación de estos sistemas, es necesario
llevar a cabo pruebas de fijación de células microbianas sobre soportes de
inmovilización insolubles con el objeto de establecer el cumplimiento de
requisitos que los hagan apropiados para adaptarlos al transductor físico que
conforma el biosensor. La matriz de inmovilización debe ser compatible con
varios tipos de células, no reaccionar con estas y ser capaz de absorber una
37
cantidad suficientemente grande de células microbianas en el elemento
receptor, manteniendo su viabilidad y actividad bioquímica en un nivel
suficientemente alto. (Reshetilov, et al, 1996; Semenchuk, et al, 2000).
El desarrollo de trabajos entorno a esta idea hace necesario la implementación
de nuevas tecnologías aplicadas al monitoreo del medio ambiente. Por esta
razón el presente estudio servirá de modo preliminar en el montaje posterior de
estas herramientas analíticas, haciendo énfasis en la elección de soportes de
inmovilización apropiados para el desarrollo de elementos bioreceptores,
además de servir como plataforma para estudios posteriores aplicados a la
biorremediación de ecosistemas
38
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la capacidad degradadora de fenol por Pseudomonas fluorescens P4
inmovilizada en polímeros orgánicos.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Realizar con la cepa de Pseudomonas fluorescens P4 aisladas y
caracterizadas en trabajos anteriores ensayos que estimulen la
utilización del fenol como fuente de carbono y energía en un medio
definido.
• Desarrollar ensayos de biodegradación que permitan establecer la
máxima eficiencia de utilización del fenol por parte de la bacteria libre e
inmovilizada en soportes orgánicos.
• Evaluar los soportes de inmovilización, agar-agar y alginato de calcio,
con base en pruebas de solubilidad, biodegradabilidad y de difusibilidad,
con el fin de establecer condiciones óptimas para el posterior desarrollo
de un elemento bioreceptor.
39
5. METODOLOGIA
5.1. LOCALIZACIÓN
El desarrollo de este trabajo se llevó a cabo en las instalaciones de los
Laboratorios de Microbiología Ambiental y el de Biotecnología Aplicada,
adscritos al Departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad
Javeriana. Los análisis químicos se realizaron en los laboratorios del
Departamento de Química de esta misma entidad.
5.2. ANÁLISIS QUÍMICOS
Para la determinación de fenol se siguieron los procedimientos analíticos
ofrecidos en el Standard Methods for Examination of Water and Wastewater,
método 5530, homologable a los protocolos de la US Environmental Protection
Agency (EPA), método 9065.
El método 5530, utiliza la técnica colorimétrica de la 4- aminoantipirina, la cual
determina cuantitativamente el fenol, los fenoles sustituidos en posición orto y
meta, y bajo condiciones apropiadas de pH, los fenoles sustituidos en posición
para en los que el sustituyente pertenece a los grupos carboxilo, halógeno,
metóxilo o ácido sulfónico. Este método no determina los fenoles sustituidos en
posición para en donde los sustituyentes son alquilos, arilos, grupos nitro,
benzoilos, nitrosos o aldehídos. (APHA, et al, 1992).
5.2.1 Método Fotométrico Directo 5530
5.2.1.1 Fundamento
Los compuestos fenólicos reaccionan con 4- aminoantipirina en presencia de
ferricianuro de potasio a pH 7,9 ± 0.1 para formar un tinte estable de antipirina
coloreado. Esto obedece a que el fenol se convierte en un derivado
40
iminoquinónico enlazado a la 4 – aminoantipirina. (Korenman, & Sarataev,
1998). Este fenómeno puede evidenciarse como la muestra la figura 8
NN
C C
CH3C
H3C
O
NH2
4-Aminoantipirina
OH
Fenol
N
K3Fe(CN)6
pH 7,9
C
N C
CH3C
H3C N
O4-Iminoquinona-2,3-dimetil-1-fenil-3- pirazolina
Figura 8.Reacción de la 4- aminoantipirina con el fenol. (Korenman, 1998)
La cantidad de color producido es una función del material fenólico contenido
en la muestra. Este tinte se mantiene en solución y se mide su absorbancia a
una longitud de onda dependiendo del método seleccionado.
5.2.1.2 Interferencias
Antes de llevar a cabo la cuantificación del fenol por este método, se debió
realizar un procedimiento preeliminar de limpieza de la muestra en el cual se
destilaron los fenoles de impurezas volátiles. Se hizo frente a interferencias
tales como bacterias degradadoras de fenol, sustancias oxidantes, reductoras y
valores de pH alcalino, mediante la acidificación de la muestra a pH 4,0.
Los agentes oxidantes, tales como el cloro y los detectados por la liberación del
yodo al acidificar en presencia de yoduro de Potasio (KI), deben ser eliminados
por la adición de sulfato ferroso (FeSO4) en exceso. (EPA, 1986).
41
5.2.1.3 Selección del Método
El método de la 4- aminoantipirina se puede presentar de dos maneras: 1) la
técnica de extracción con cloroformo, la cual posee una sensibilidad máxima y
es adaptable a muestras de agua que contengan menos de 1 mg fenol/ L.
Concentra el color en una solución no acuosa y posteriormente se mide su
absorbancia a 460 nm. 2) otra forma de ejecución es el método fotométrico
directo, en el cual se mantiene el tinte en una solución acuosa y su absorbancia
es medida a una λ de 500 nm. (Korenman, 1998).
Este último procedimiento se eligió como método de ensayo, ya que
proporciona un limite de detección acorde con las concentraciones manejadas
en este trabajo, las cuales corresponden a un rango de 2.5 mM hasta 20 mM
de fenol ACS.
El manejo de la muestra para determinar cuantitativamente fenol por esta
técnica se llevó a cabo realizando una limpieza previa, con el objeto de
concentrar el fenol y eliminar microorganismos o fenoles sustituidos, posibles
agentes causales de interferencias. Por esta razón se requiere destilar un
volumen de muestra con concentraciones de fenol conocidas para separarlo de
impurezas no volátiles. Dado que la volatilización del fenol es gradual, el
volumen de destilado debe igualar el de la muestra original.
El pH de la muestra fue ajustado a 4,0 con solución de H3PO4 utilizando un
medidor potenciométrico de pH (QuiKcheK pH meter, Model 106), y
posteriormente ésta se pasó a un sistema de destilación, todo de vídrio,
constituido de un aparato destilador de vídrio borosilicato (Quickfit C1/11) y un
condensador Graham (Corning N° 3360). Se destilaron 25 mL de muestra
original, la cual fue tratada con 0.625 mL de NH4OH 0.5 N, se ajustó el pH a 7.9
± 0.1con una solución de Buffer fosfato pH 6.8, luego se le adicionó 0.25 mL de
42
una solución de 4 aminoantipirina al 2% y posteriormente se trató con 0.25 mL
de una solución de ferricianuro de potasio.
Una vez mezclada la muestra y después de 15 minutos en reposo, se procedió
a pasarla a microplacas de titulación, (96 pozos), para realizar su lectura a 500
nm, en MultisKan MCC/340 P versión 2.33.
El cálculo del contenido de fenol presente en las muestras provenientes de las
lecturas fotométricas se hizo utilizando una curva de calibración construida a
partir de una solución patrón y sus respectivas diluciones contra un blanco sin
fenol. Se tomó como solución patrón una concentración de 20 mM y a partir de
esta se prepararon diluciones hasta alcanzar un título de 1.25 X 10 4 mM. Una
vez preparadas las diluciones se trataron con los reactivos propios del método
de la 4-aminoantipirina y luego se determinó fotométricamente por
espectrofotometría a 500 nm la correlación existente entre las concentraciones
de fenol y la absorbancia específica para cada una de ellas. (Figura. 10).
5.3 CONDICIONES DE CULTIVO DEL MICROORGANISMO
5.3.1. Obtención de la cepa
La bacteria Pseudomonas fluorescens P4 previamente aislada y caracterizada
bioquímicamente a partir del sistema acuoso del Humedal de la Conejera
(Calderón, et al 1999; Martínez, 2000), fue obtenida del banco de cepas del
Laboratorio de Microbiología Ambiental, donde estaba conservada por medio de
liofilización. Esta fue resuspendida en caldo BHI (Merck, Darmstatd, 1994),
(anexo 1), con el propósito de recuperarla. Las células fueron cultivadas en un
erlenmeyer de 250 mL e incubadas por 24 horas a 30°C, con una agitación
constante de 150 rpm. Posteriormente fueron recogidas para su siembra en
Agar King B (anexo 1), con el objeto de realizar un aislamiento selectivo.
43
5.3.2 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)
Esta es una técnica que permite evaluar el crecimiento de un microorganismo o
el grado de inhibición del mismo cuando se enfrenta a un rango de
concentraciones preestablecidas de un compuesto en particular. Esta técnica
permite utilizar un medio sólido, lo cual hace posible trabajar a la vez con
diferentes concentraciones del compuesto sin que estas se alteren durante el
proceso.(Hernández, et al; 2000).
Para la ejecución de este método se preparó un medio de cultivo sólido( Agar
Nutritivo, anexo 1) el cual se esterilizó y sirvió en cajas de petri.
En condiciones de esterilidad se sembró la bacteria Pseudomonas fluorescens
P4 masivamente y luego se dispuso sobre la superficie del medio 4 anillos de
plástico (pitillos) con 50 µL de fenol a diferentes concentraciones.
Posteriormente los anillos fueron sellados con parafina para evitar así fugas del
compuesto por el carácter volátil del mismo. Las cajas fueron incubadas a 30°C
± 0.1 por un periodo de 24 horas, transcurrido este tiempo se cuantificaron los
diámetros de los halos obtenidos alrededor de los anillos en mm. (Gauze,
1967).
Las concentraciones evaluadas de fenol se mantuvieron en un rango que va de
0.7 M a 8 M (0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1, 2, 4 y 8 M). Aplicadas debido a
una serie de ensayos previos realizados con concentraciones por debajo de
este rango los cuales resultaron en el crecimiento normal de la cepa.
(Mordocco, et al, 1999).
5.3.3 Ensayos de adaptación a una fuente de carbono
Una vez la cepa fue recuperada, se sometió a pruebas de adaptabilidad para el
consumo de fenol como única fuente de carbono específica. Para tal fin la cepa
debió ser inoculada en un medio mineral de sales mínimas (MM), conocido
44
como M9 (Heinaru, et al, 2000) (anexo 1). Ensayos paralelos con fenol y
glucosa fueron realizados con el objeto de determinar la inducción que ejercen
estos dos sustratos sobre el crecimiento microbiano en el proceso de
adaptación. El crecimiento sobre fenol a 2.5 mM fue valorado en primera
instancia y a la par se evaluó el crecimiento sobre relaciones de fenol y
glucosa. Estas fuentes carbonadas fueron añadidos al medio las siguientes
concentraciones: en el primer ensayo de adaptación se adicionó glucosa al 1%
p/v con fenol a 2.5 mM y en el segundo la concentración de glucosa fue de
0.5% p/v mientras que la de fenol se mantuvo a una concentración de 2.5 mM.
Un tercer ensayo fue realizado con glucosa ausente en el medio M9, siendo la
principal fuente de carbono el fenol a una concentración de 5 mM,
proporcionando así una confirmación de la adaptabilidad de la cepa. Estas
pruebas se llevaron a cabo con la finalidad de lograr una adaptación gradual de
la cepa a solventes orgánicos de naturaleza aromática. (Arai & Kudo 1998;
Bandhyopadhyay, 1999).
En cada ensayo se verificó el crecimiento microbiano en el medio y la remoción
de fenol por parte de la cepa. El crecimiento del microorganismo fue
monitoreado por medición de la densidad óptica del medio de cultivo a 540 nm
en un espectrofotómetro Lambda 12 Perkin-Elmer y la remoción de fenol por el
método colorimétrico (APHA, et al, 1992)
5.3.4 Verificación de la adaptación
De acuerdo con los resultados obtenidos con las pruebas de adaptabilidad al
fenol a una concentración de 5 mM se realizaron dos repeticiones bajo las
mismas condiciones de cultivo, esto ayudó al microorganismo a acondicionarse
más rápidamente al compuesto monoaromático.
45
5.4 ENSAYOS DE BIODEGRADACIÓN CON CELULAS LIBRES
La dinámica de biodegradación de fenol con células libres de Pseudomonas
fluorescens P4 se realizó para establecer condiciones de crecimiento y la
actividad microbiana frente a esta clase de compuestos tóxicos, además de
medir el grado de remoción por parte de la cepa en estado libre frente a un
estado inmovilizado.
En este ensayo la bacteria Pseudomonas fluorescens P4, capaz de crecer
sobre fenol a concentraciones de 2.5 mM hasta 20 mM fue usada para valorar
la captación de este compuesto como única fuente de carbono y energía. La
remoción de este areno fue estudiada en un medio de cultivo líquido de sales
mínimas M9 (Heinaru, et al , 2000; Semenchuk, et al, 2000), contenido en
erlenmeyers de 1 litro de capacidad, cuyo volumen de trabajo fue de 200 mL,
del cual se extraían muestras cuyo fin era el de monitorear por métodos
analíticos la desaparición del fenol por acción biótica en el medio.
Se evaluaron concentraciones iniciales de 2.5 mM y 20mM de fenol, ya que se
requiere establecer hasta que punto puede llegar a remover el microorganismo
a concentraciones por debajo de lo reportado en estudios previos (Arai & Kudo,
1998; Bandhyopadhyay, et al , 1999; Mordocco, et al, 1999).
El medio de sales mínimas M9 se mantuvo a un pH de 7.0; luego fue inoculado
con una dosis de células libres precultivadas de 33 X104 UFC/mL, obtenidas por
el método de conteo en placa por superficie en medio sólido M9.
Posteriormente el cultivo fue incubado a 30°C y agitado en un shaker rotatorio a
140 –170 rpm, durante 72 horas, tomando muestras cada 8 horas para
determinación de fenol residual.
46
La cinética de crecimiento del microorganismo de prueba se llevó a cabo en
tubos tapa rosca de 16 X 150 mm que contenían medio mínimo M9, inoculado y
con una concentración de fenol de 2.5 mM en el primer ensayo y de 20 mM en
el segundo. Los tubos se mantuvieron bajo las mismas condiciones de cultivo
que en los erlenmeyers y se tomaron muestras cada 2 horas a las cuales se les
medía la cinética de crecimiento por espectrofotometría a una longitud de onda
de 540 nm.
Ensayos en caldo nutritivo con un contenido de glucosa al 1% p/v fueron
conducidos con el objetivo de valorar el crecimiento en un medio no selectivo
como referencia frente al crecimiento en un medio definido (M9).
Pruebas de crecimiento en condiciones de fermentación discontinua fueron
llevados a cabo en un reactor de 1 litro de capacidad con el fin de establecer la
correlación existente entre la remoción biológica del fenol y la producción de
biomasa relacionada con la creación de un flujo de carbono a partir de este
compuesto (figura 9).
En estos ensayos el proceso se evaluó en medio mineral M9 y en caldo nutritivo
con glucosa al 1% p/v, como control de crecimiento. La concentración inicial de
fenol fue de 20 mM. El preinóculo empleado en esta fermentación fue tomado
del final de la fase exponencial de crecimiento del microorganismo mantenido
en medio mineral M9 a un volumen de 100 mL contenido en un erlenmeyer de
500 mL, bajo condiciones de agitación de 140-170 rpm, y una temperatura de
30°C ± 0.1, durante un período de incubación de 72 horas. La concentración del
inóculo fue de 15 X 104 UFC/ mL, obtenido por la técnica de recuento en placa,
en superficie.
47
A la par de los ensayos con un componente biológico, se realizaron controles
abióticos para ambos medios, para ello se optó por el uso de controles sin
inocular. Este tratamiento se hace necesario para diferenciar el comportamiento
del compuesto de prueba presente en un sistema biológico frente a un
tratamiento abiótico, que puede ser atribuido a la actividad microbiana.(Burlage,
et al, 1998).
5.5 EVALUACIÓN DE SOPORTES DE INMOVILIZACIÓN
Agar-agar y alginato de calcio fueron evaluados con el objeto de establecer en
cuál de ellos se presenta un mayor índice de remoción de fenol por parte de la
bacteria inmovilizada, además de determinar cuál es el más adecuado para el
diseño posterior de un biosensor amperométrico.
5.5.1 Pruebas Preliminares de Estabilidad
5.5.1.1 Pruebas de Solubilidad
La solubilidad de los geles de alginato y agar-agar fue evaluada en agua
destilada (control), y soluciones con diferentes concentraciones de fosfato de
sodio, fosfato de potasio, citrato y lactato.
Figura 9. Fermentación discontinua 1 L en medio M9 con fenol 20 mM.
Fuente: los autores
48
Se procedió a preparar agar-agar al 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5% y 4.0%
relación p/v al igual que en alginato de sodio. El agente gelificante, CaCl2, para
este último soporte se mantuvo a una concentración de 0.2 M, ya que en
estudios previos ha sido reportado este valor como óptimo para la valoración de
la biodegradación de fenol. ( Bandhyopadhyay, et al , 1999).
Estos soporte fueron dejados en cajas de petri en conjunto con un agente de
desequilibrio estructural para determinar con esto el efecto físico-químico
imperante en la interacción. Las cajas fueron mantenidas a temperatura
ambiente y se vigiló el comportamiento de los soportes por un periodo de 15
días. (Emily, et al, 1996).
5.5.1.2 Pruebas de Biodegradabilidad
Se debe determinar la biodegradabilidad de los soportes sobre la base de la
utilización del polímero como única fuente de carbono y energía por parte de la
bacteria, con el objeto de proporcionar datos que permitan establecer la
durabilidad de la matriz en aplicaciones futuras.
La bacteria fue sembrada en superficie en cajas de petri que contenían los dos
geles e incubadas a temperatura ambiente durante un período de tiempo de 15
días. La biodegradabilidad se determinó por la aparición de zonas hidrolizadas
del medio o por la aparición de crecimiento en el mismo. Las pruebas se
hicieron por quintuplicado y se valoraron concentraciones de agar- agar y
Alginato de calcio de 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%.
5.5.1.3 Pruebas de Difusibilidad
El coeficiente de difusión de fenol en los dos soportes se estimó por el método
descrito por Fedorov, et al, 1999. Se elaboró un pozo en la placa del soporte y
se le adicionó un volumen de 50 µL fenol a una concentración por debajo de la
CMI (20 mM), luego se valoró la tasa de difusión por la medición de la distancia
49
cubierta por la solución transcurrida 1 hora. La línea de demarcación fue
determinada por tinción con una aplicación consecutiva de 4-aminoantipirina
0.04%, hidróxido de amonio 0.05% y ferricianuro de potasio 0.16%.
5.6. ENSAYO DE REMOCIÓN DE FENOL CON CELULAS INMOVILIZADAS
La tasa de remoción del fenol fue escogida para comparar la dinámica de
biodegradación en las matrices poliméricas. Para ello se hicieron ensayos con
bacterias inmovilizadas en los soportes, los cuales se llevaron a cabo en
erlenmeyers de 500 mL con un volumen de trabajo de 100 mL de medio mineral
líquido M9 que contenía una concentración inicial de fenol de 20 mM. El medio
se inoculó con bacterias inmovilizadas de Pseudomonas fluorescens P4 en
agar-agar y alginato de calcio, con una concentración de células libres de 107
células/mL. El medio inoculado se mantuvo en agitación constante a 150-170
rpm y en incubación a 30°C durante 48 horas. El soporte con células
inmovilizadas ocupó aproximadamente un 10% del volumen del medio. Se
tomaron muestras periódicas de la solución para evaluar la concentración final
de fenol por el método colorimétrico.
5.7. DISEÑO ESTADÍSTICO
Todos los ensayos realizados se desarrollaron por quintuplicado con el fin de
obtener un número de datos representativos para la aplicación del análisis
estadístico, de Scheffe de comparación de medias, con el que se determinó los
niveles de varianza.
El análisis de varianza encuentra diferencias o similitudes entre los
componentes de un mismo efecto, es decir el comportamiento de la cepa frente
a las diferentes concentraciones de fenol. En los ensayos de determinación de
la concentración mínima inhibitoria (CMI), pruebas de adaptación de la cepa,
50
ensayos de biodegradación y evaluación de soportes se realizó estimación de
medidas de tendencia central con la que se obtuvieron valores que al ser
relacionados determinaron las mejores condiciones para estos ensayos.
H0: µµ crecimiento en medio con fenol ≥≥ µµ crecimiento en el medio control
≠≠
H1: µµ crecimiento medio con fenol ≤≤ µµ crecimiento en el medio control
51
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 ANALISIS QUIMICOS
La curva de calibración realizada reveló que existe concordancia entre la
concentración de fenol y las absorbancias obtenidas en la prueba.(figura 10). La
gráfica presenta un coeficiente de correlación de 0.999 y una pendiente de
0.0083 e intercepto de 0.0020.
Figura 10. Curva de calibración Método colorimétrico para determinación de fenol en
medio líquido.
A b s o r b a n c i a a 4 9 2 n m v r s c o n c e n t r a c i ó n
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0
Concen t rac i ón f eno l (mM)
Abs
orba
ncia
52
6.2. MORFOLOGIA DEL MICROORGANISMO
6.2.1 Aislamiento del Microorganismo
Después de 24 horas de realizada la siembra, se presentó el crecimiento de
colonias, azul verdosas, brillantes, cremosas, de borde liso, e irregular (figura
11), con fluorescencia, bajo luz ultravioleta, en agar King B. A partir de las
cuales se realizó la coloración de Gram con la que se determinó su
característica de bacilo Gram negativo.
Figura 11. Crecimiento en Agar King B
Fuente: los autores
Investigaciones realizadas hacia el uso de bacterias del género Pseudomonas
sp. en el montaje y diseño de biosensores microbianos para el monitoreo
ambiental se han enfocado inicialmente sobre las características de crecimiento
de esta cepa microbiana en varios sustratos (Reshetilov, et al, 1996; König, et
al, 1996; Bachman, 1999; Semenchuk, et al, 2000; Wise, et al, 2000), entre los
cuales cabe destacar compuestos orgánicos xenobióticos como el fenol y otras
sustancias de naturaleza monoaromática.
53
La elección de la bacteria Pseudomonas fluorescens P4 para el desarrollo de
este trabajo obedeció a que este género microbiano posee las enzimas
involucradas en la degradación de hidrocarburos aromáticos, especialmente
arenos y asfaltenos, según ha sido reportado en varios trabajos. (König, et al,
1996; Heinaru, et al, 2000). El aprovechamiento de esta característica hace
apropiada a la cepa para el desarrollo de respuestas bioquímicas que pueden
ser transformadas a señales asociadas con cambios en la resistencia eléctrica
de un medio acuoso que contiene un compuesto fisiológicamente activo en
particular.
La cepa, aislada y caracterizada en trabajos anteriores (Calderón, et al, 1999;
Martínez, 2000), fue obtenida del Humedal de la Conejera, un ecosistema que
ha sido severamente modificado por causa de la contaminación generada por
prácticas antropogénicas y por ende un sitio donde se favorecen la creación de
hábitats microbianos expuestos de forma directa al contacto con sustancias
tóxicas. Esta condición establece criterios de selección natural, ya que propicia
el desarrollo de ciertos grupos de microorganismos capaces de soportar y
sustentar su crecimiento a expensas de esta clase de compuestos.
6.2.2 Aislamiento en Agar King B adicionado con fenol
A partir del agar King B, en el que se consiguió el aislamiento de Pseudomonas
sp, se realizaron pases por triplicado a agar King B, adicionado con diferentes
concentraciones de fenol. Las concentraciones fueron 2.5 mM, 5.0mM, 10mM,
20 mM, 30mM, 40mM y 50mM. En todos los medios se presentó crecimiento y
desarrollo de pigmentos fluorescentes, a las 24 horas de realizada la siembra e
incubación a 37°C. (figura 12, 13).
Debido a no presentarse modificación en las características de crecimiento de
la cepa se probaron nuevas concentraciones, desde 60mM hasta 120mM, en
54
las cuales se presentó el crecimiento de igual manera, ausente de variaciones
en el tiempo de aparición de las colonias.
Figura 12. Crecimiento en agar King B adicionado con fenol 50 mM
Fuente: los autores
Figura 13. Crecimiento en agar King B adicionado con fenol 40 mM
Fuente: los autores
55
6.2.3 Aislamiento en medio M9 adicionado con fenol
El medio M9 de sales mínimas, adicionado con fenol como única fuente de
carbono fue probado para confirmar la adaptación de la cepa a la utilización de
este compuesto aromático como fuente de carbono y energía. Estos ensayos
iniciaron con la adición de fenol en una concentración de 2.5mM y finalizaron
con 120mM. En este medio el crecimiento y desarrollo de colonias pequeñas,
blancas y de borde definido, se presentó solo hasta ocho días después de
haber realizado la siembra. (figura 14).
Figura 14. Aislamiento en agar M9 con fenol 5.0 mM
Fuente: los autores
56
6.3 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA
A partir de la siembra masiva en superficie,( 0.1 ml del microorganismo a una
concentración de 12x103 UFC/mL) en agar nutritivo y probando 3
concentraciones de fenol por caja y un control, se determinó la concentración
en la cual hay inhibición al crecimiento del microorganismo. (Tabla 1)(figura 15).
Establecer una concentración mínima capaz de inhibir el crecimiento de la
bacteria Pseudomonas fluorescens P4 en un medio que contenga fenol es
importante ya que permite determinar la estabilidad del elemento bioreceptor
durante el análisis periódico de muestras y además determina el tiempo de vida
útil del mismo, mediante la valoración de la señal de respuesta del biosensor
frente a muestras de concentración desconocida de fenol que puede ser
represiva frente al crecimiento del microorganismo.
Tabla 1. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION MÍNIMA
INHIBITORIA
Concentración Halo de inhibición de crecimiento (milímetros)
8.0 M 41 42 47 38 38
4.0 M 38 36 35 38 35
2.0 M 30 31 30 34 32
1.5 M 28 24 30 30 28
1.0 M 24 17 25 15 10
950 mM 24 29 27 23 26
900 mM 25 22 27 30 25
850 mM 27 24 25 25 22
800 mM 0 0 0 0 0
700 mM 0 0 0 0 0
Fuente: Los autores
57
La evaluación de concentraciones que variaban entre 700 mM y 8 M
proporcionó el valor al cual la bacteria dejó de crecer produciendo halos de
inhibición por encima de los 14 mm. La concentración a la cual el
microorganismo presentó estas características fue 850 mM, de tal forma que se
estableció que Pseudomonas fluorescens P4 tolera concentraciones hasta de
800 mM de fenol donde no presentó halos de inhibición, lo cual representa un
buen índice de tolerancia hacia esta clase de compuestos.
Este hecho puede explicarse basados en la particularidad de las múltiples
respuestas que poseen las bacterias Gram negativas con respecto a la
interacción con solventes orgánicos, siendo el fenol uno de ellos.
La acción tóxica del fenol se encuentra siempre asociada con la pérdida de la
integridad citoplasmática del microorganismo. Esto causa una disrupción en la
transducción de la energía, perturbación de la función de la membrana como
barrera semipermeable, inhibición de las proteínas de membrana y la posterior
muerte de la célula. (Poh, et al, 1999).
En bacterias Gram negativas, un número de respuestas han sido descubiertas
con respecto al efecto de los solventes orgánicos, las cuales están dirigidas a la
rigidificación de la membrana celular y a la extrusión del químico tóxico. En un
número de cepas de Pseudomonas sp. una rápida respuesta a estos agentes
es la isomerización de lípidos cis-isómeros insaturados sintetizados
naturalmente, hasta trans-isómeros, una reacción catalizada por una isomerasa
Cti enlazada a la membrana. Una exposición a largo plazo de Pseudomonas sp,
E. coli y otros microorganismos a concentraciones subletales de solventes
frecuentemente conduce a un aumento en la cantidad total de fosfolípidos y a
una alta proporción de lípidos saturados de cadenas largas. Estos cambios van
acompañados de alteraciones a nivel de diferentes grupos de fosfolípidos.
58
Todas las variaciones van dirigidas hacia la rigidificación de la membrana
celular. (Poh, et al, 1999).
Figura 15. Determinación de la concentración Mínima inhibitoria
Fuente: los autores
Control
Control 4 M
2M 900 mM
Control 1.5 M
1 M
850 mM
Control 1 M
850 mM 800 mM
800 mM
Control
700 mM
750 mM
59
La extrusión de solventes ha sido un mecanismo muy utilizado por las bacterias
durante la historia evolutiva, como una medida de protección frente a diferentes
compuestos tóxicos. Para protegerse a sí mismas, han desarrollado variantes
que detoxifican y extraen estas sustancias. Este fenómeno conduce a la
persistencia de la resistencia multidrogas (MDR), el cual es sistema de flujo
unidireccional que cataliza la extrusión acti va de grandes cantidades de
compuestos estructural y funcionalmente no relacionados desde el citoplasma
bacteriano al medio externo. Algunas de las sustancias extraídas por este
sistema son xenobióticos, los cuales no se asemejan a los sustratos naturales
|específicos que las células han encontrado durante su evolución. (Junker &
Segura, 1999).
Otros datos disponibles también indican que las características físicas de los
compuestos (carga eléctrica, hidrofobicidad o amfipaticidad), más que su
estructura, pueden ser factores determinantes en la especificidad de estos
sistemas de extrusión multidrogas. (Paulsen, et al, 1996).
Estos mecanismos de resistencia son una garantía para valorar el uso de
biosensores amperométricos basados en células microbianas ya que le brindan
unas condiciones operacionales ideales al sistema con respecto a la magnitud
de la respuesta bioquímica generada por el microorganismo, la cual va a ser
poco afectada por la acción tóxica del solvente.
60
6.4 CONDICIONES DE CULTIVO
6.4.1 Prueba de Adaptación
El término “adaptación “ usado en reportes sobre biodegradación representa
una respuesta típica de una comunidad microbiana y de linajes microbianos
individuales frente a compuestos orgánicos e inorgánicos ajenos a un
ecosistema, que cumplen un papel de agentes selectivos al entrar en contacto
con los microorganismos. La habilidad de adquirir mecanismos de adaptación
para algunos compuestos orgánicos o de resistencia hacia los metales pesados
ha sido demostrada para bacterias utilizadas en pruebas in vitro. (Van der Meer,
et al, 1992).
Diferentes procesos bioquímicos y moleculares como la inducción de enzimas
específicas en miembros de una comunidad produce un aumento de la
capacidad degradativa observada en el total de la comunidad; la intervención de
otra clase de procesos metabólicos presentes en una subpoblación de una
comunidad microbiana, capaces de captar y metabolizar el sustrato; o la
adaptación y selección de mutantes, los cuales pueden causar una respuesta
adaptativa al contaminante. (Panikov, 1995).
Durante 28 días fueron tomadas muestras de medio M9 adicionado con fenol
2.5 mM e inoculado, doce muestras por día, para ser leídas por medio del
espectofotometro a una longitud de onda de 540 nm y así determinar el
aumento en la concentración celular. (Tabla 2 anexo 2) (Figura 16).
61
Figura 16.Prueba de adaptación de la P.fluorescens a medio M9
adicionado con fenol 2.5 mM
Fuente: los autores
El perfil de crecimiento de Pseudomonas fluorescens P4 mostró un período de
adaptación al medio muy prolongado de alrededor de 28 días. El fenol fue
consumido en el transcurso de este tiempo asociado a un aumento en la
densidad óptica del medio. Una vez obtenido el crecimiento a esta
concentración las células fueron recultivadas en un medio M9 fresco con una
concentración igual de fenol, obteniéndose una fase de adaptación mucho más
corta y un perfil de crecimiento del microorganismo de tan sólo 24 horas.
En presencia de fenol 2.5 mM las células crecieron exponencialmente
únicamente después del séptimo día de inoculado. (Figura. 16). Este período de
crecimiento lento puede ser atribuido a la aparición de un fenómeno
denominado “adaptación lag”, el cual hace referencia al tiempo que se requiere
para que se lleven a cabo cambios a nivel fisiológico en el sistema metabólico
de las células, en respuesta a un nuevo ambiente. La explicación clásica de
este tipo de fase lag involucra modificaciones en la regulación y producción de
enzimas y además, con relación al tamaño celular y en la composición de la
pared celular (Junker & Segura, 1999; Ramos, et al, 1997), así como también
0
0,1
0,2
0,3
0,4
1 3 5 7 1 0 1 3 1 5 1 8 2 0 2 5 2 8
Tiempo (d ías )
Ab
sorb
anci
a (5
40n
m)
Promed io de Abso rbanc ia Mues t r as
62
en las características genéticas. (Wang, et al, 1999; Singirtsev & Fedorov,
2000).
Con el fin de confirmar la adaptación del microorganismo, se repitió la curva de
crecimiento, en el mismo medio de cultivo e igual concentración de fenol y se
siguió durante 24 horas. (figura 17).
Figura 17. Confirmación de la adaptación a fenol 2.5 mM en el medio M9
Fuente: los autores
Una vez la cepa de Pseudomonas fluorescens P4 se adaptó al consumo de
fenol a 2.5 mM, se pudo evidenciar la aparición de otro tipo de fase lag
denominada “aclimatación aparente” (Wang & Loh, 1999). En esta etapa, el
fenol por sí mismo puede fácilmente inducir la activación de las enzimas
específicas para su propia degradación, obteniéndose por lo tanto un tiempo de
adaptación mucho más corto. (figura 17). En los resultados obtenidos se puede
estimar un tiempo de adaptación de 5 horas, a partir del cual se dio inicio a la
fase exponencial. La velocidad de crecimiento fue de 0.05 h-1, mayor que la
obtenida en la prueba de adaptación 0.02 h-1.
Esta observación es consistente con algunos reportes de literatura (Seker, et al,
1997; Arai & Kudo 1998; Wang & Loh, 1999), en los cuales la aclimatación de
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 24Tiempo (horas)
Abso
rban
cia (5
40 n
m)
Absorbancia Muestra
63
una comunidad microbiana a un sustrato en particular frecuentemente resulta
en la adaptación simultánea hacia algunas moléculas relacionadas
estructuralmente a partir de especies individuales que usualmente actúan sobre
varias sustancias análogas. Estudios realizados por, Van Shie & Young (1998),
indicaron que la adaptación de una comunidad microbiana al fenol como única
fuente de carbono condujo al incremento en la habilidad de los organismos para
degradar compuestos aromáticos relacionados estructuralmente, tales como 4-
clorofenol, m- aminofenol y m- cresol.
Ensayos con una fuente de carbono alterna presente en el medio de cultivo,
fueron se realizaron con el fin de establecer la inducción enzimática que estos
generaban. La glucosa sirvió probablemente como un sustrato de crecimiento
inductor de enzimas catabólicas presentes en la degradación cometabólica del
fenol.
A medida que se aumentaba la concentración de fenol en el medio, la
concentración de glucosa disminuía, brindando así una plataforma para el
crecimiento de la cepa cuando ésta se encontrara en presencia de fenol como
fuente de carbono. Khackmuss & Hellwig (1978), han sugerido que la enzima
fenol monooxígenasa en el género Pseudomonas sp. puede ser inducida por 4-
clorofenol o fenol, utilizando como cofactor NADH requerido para la
transformación inicial del fenol. Este cofactor puede ser eficientemente formado
por la oxidación de la glucosa.
Después de la aclimatación del microorganismo, acoplada a una pronta
oxidación de la glucosa, el NADH rápidamente es regenerado, facilitando en
consecuencia la transformación de fenol a intermediarios metabólicos más
fácilmente aprovechables. (Wang & Loh, 1999).
64
Cuando la glucosa fue añadida como único sustrato de crecimiento celular, el
sistema metabólico de la bacteria se modificó con el fin de oxidar glucosa en
presencia de fenol. La activación y regulación de un sistema enzimático
específico para tal propósito podría ser un proceso gradual, durante el cual
tanto la cinética de crecimiento y la utilización de fenol fue relativamente corto a
comparación de los ensayos de adaptación realizados en paralelo con fenol
como única fuente de carbono a 2.5 mM y 5 mM. Luego que el sistema
enzimático alcanzara un estado de adaptación completa, tras superar la
toxicidad del fenol, las células crecieron con más celeridad, y los cofactores
como el NADH necesarios para la degradación de este compuesto fueron
regenerados rápidamente, con un aumento concomitante en la tasa de
biodegradación. (figura 18).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
Abs
orba
ncia
(54
0 nm
)
Glucosa 1%+fenol 2,5 mM
Figura 18. Adaptación a fenol 2.5 mM en medio M9 inducido por glucosa al 1%
Fuente: los autores
65
6.5 CINETICA DE CRECIMIENTO
Durante 24 horas cada 2 horas se tomaron muestras de medio M9 (3 ml)
adicionado con fenol a una concentración de 5.0 y 20 mM e inoculado,
mantenido a 135 rpm y a una temperatura de 28°C, las cuales fueron leídas por
espectrofotometría, a una longitud de onda de 540 nm, para determinar la
concentración celular. (figura 19).(Anexo 2).
Figura 19.Cinetica de Crecimiento en Medio M9 adicionado con fenol 5 mM
Fuente: los Autores
El crecimiento del microorganismo en un medio con fenol 5 mM, luego de haber
sido mantenido en medio mineral y después de varios pases celulares, sin una
fase de adaptación prolongada, sugirió que la habilidad de la cepa adaptada
para crecer sobre fenol era estable e indicaba la aparición de cambios
genéticos ocurridos durante la incubación con este compuesto. En este ensayo
se presentó una fase de adaptación aparente, motivada por la adaptación
previa a la concentración de fenol 2.5 mM, lo que puede suponer la poca
duración del microorganismo en estado estacionario.
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (horas)
Abso
rban
cia 5
40 n
m
Absorbancia Blanco Absorbancia Muestra
66
Se puede apreciar una reducción considerable en el crecimiento de la cepa en
las horas 10 y 13, probablemente por causa de la acumulación de
intermediarios metabólicos que resultan de la degradación del fenol , los cuales
ejercen un efecto tóxico en las células. Hay que aclarar que al sustraer
volúmenes del medio para la determinación de otros parámetros relacionados
con la degradación del fenol, el gradiente de concentración del areno aumenta
con respecto al adicionado inicialmente. Esta situación se relaciona también con
la utilización del agua como sustrato por parte del microorganismo lo cual ejerce
un efecto de preconcentración del fenol en el medio.( figura 19).
El uso de concentraciones de fenol por debajo de 5mM es imprescindible si se
quiere hacer uso del microorganismo para propósitos analíticos, ya que una
completa biodegradación de este compuesto a niveles trazas podría definir las
características de sensibilidad y especificidad de un biosensor amperométrico,
además de fijar un limite de detección que lo haría homologable frente a otras
técnicas analíticas tradicionales. Basados en esta idea, la prueba de adaptación
a un sustrato específico permite desarrollar unas características de selectividad
apropiadas hacia el analito de interés, además de optimizar el poder
discriminatorio del componente biológico cuando se encuentre en presencia de
compuestos relacionados estructuralmente los cuales podrían interferir en la
lectura del sistema.
6.6 ENSAYOS DE BIODEGRADACION DEL FENOL CON CELULAS LIBRES
6.6.1 Cinética de crecimiento en medio M9 con Fenol 2.5 mM
Se estableció una curva de crecimiento de 96 horas, para Ps. fluorescens, en
un volumen de 200 mL, de medio M9 adicionado con fenol a una concentración
de 2.5 mM. Esta curva permitió determinar el aumento progresivo, de la
concentración celular, relacionado con la utilización directa del fenol presente
en el medio como fuente de carbono y energía. Los valores de absorbancia más
67
altos fueron obtenidos, a partir de la hora 56 hasta la 62. La agitación constante
del medio de cultivo, aseguró el cumplimiento de las condiciones de aireación,
necesarias para el buen desarrollo de los procesos metabólicos del
microorganismo. (figura 20).
La concentración de fenol, disminuyó a partir de la hora 8 y hasta la 32, lo cual
puede ser explicado como el período durante el cual se realizó la mayor
asimilación celular del fenol presente en el medio de cultivo, a su interior, para
posteriormente a lo largo del crecimiento, desarrollar reacciones metabólicas de
biodegradación de este compuesto. (figura 21).
Una vez culminada la curva se determinó de acuerdo a las mediciones
progresivas de la concentración de fenol el porcentaje final de remoción
realizado por el microorganismo y se obtuvo un valor de biodegradación de
fenol de 95.72%, indicando de esta manera el desarrollo altamente eficiente de
este proceso de fermentación y remoción efectiva.
0
0,1
0,2
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96Tiempo (horas)
Abso
rban
cia (5
40 n
m)
Absorbancia Blanco Absorbancia Muestra
Figura 20. Cinética de crecimiento en medio M9 con fenol 2.5 mM
Fuente: los autores
68
00,5
11,5
22,5
3
0 8 16 24 32 40 48 56 64Tiempo (horas)
Conc
entra
ción
feno
l Mm
Control Biótico
Figura 21. Biodegradación de fenol 2.5 mM
Fuente: los autores
6.6.2 Cinética de crecimiento en medio M9 con fenol 20 mM
Durante 72 horas fue seguida la curva de crecimiento de Ps. fluorescens P4,
realizando toma de muestra cada dos horas, por medio de la cual se evidenció
la utilización del fenol, como única fuente de carbono y energía en el medio de
cultivo M9 a un volumen de 200 mL. En esta curva las fases de crecimiento
fueron mucho más cortas que las desarrolladas a concentraciones menores,
(2.5 mM), y los valores máximos de la absorbancia, fueron obtenidos entre las
horas 32 a 36. (figura 22)
La concentración de fenol, presentó una disminución, a partir de la hora 8 hasta
la 48, pero luego ocurrió un incremento significativo en la hora 56, hecho que
puede ser atribuido a la concentración de la cantidad de este existente en el
medio debido a la disminución en el volumen, ya que cada 8 horas para su
determinación analítica era necesario extraer un volumen de 35 mL.
69
Los resultados obtenidos a partir del control mostraron una disminución en la
concentración presente en la hora 64 y hasta la 72 se mantuvo en el mismo
valor, esto puede ser explicado por factores abióticos como es la fotoxidación
del fenol, que puede causar cambio en su concentración por la generación de
especies diferentes. (figura 23)
El porcentaje de remoción de fenol realizado por el microorganismo en un
período de tiempo de 72 horas, fue de 95.05%, valor importante que indica la
asimilación del fenol como fuente de carbono y energía. Este porcentaje es
menor al obtenido en el ensayo anterior, es decir a una concentración de 2.5
mM, indicando que el gradiente de concentración puede afectar la capacidad de
degradación biológica a medida que este aumenta, siendo requerido un período
de tiempo más prolongado para la remoción total.
Figura 22. Cinética de crecimiento medio M9 con fenol 20 mM
Fuente: los autores
0
0,1
0,2
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Tiempo (horas)
Abso
rban
cia (5
40 n
m)
Absorbancia Blanco Absorbancia Muestra
70
Figura 23. Biodegradación de fenol 20mM
Fuente: los autores
5.6.3 Cinética de crecimiento en Caldo Nutritivo con glucosa al 1% como
control
La curva de crecimiento en caldo nutritivo con glucosa, se realizó durante 48
horas, tiempo durante el cual el microorganismo presentó las fases de
crecimiento bastante rápidas, una fase de adaptación de 6 horas, y una
logarítmica de 10 horas, produciendo el valor máximo de absorbancia a la hora
16, indicando que el microorganismo presenta un metabolismo más rápido para
las fuentes simples de energía, y se obtiene una concentración celular mayor en
un menor tiempo. (figura 24)
0
5
10
15
20
25
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72Tiempo (horas)
Conc
entra
ción
de fe
nol m
M
Control Biótico
71
Figura 24. Cinética de crecimiento en caldo nutritivo con glucosa al 1% p/v
Fuente: los autores
6.7 CULTIVO EN BATCH CON MEDIO M9 ADICIONADO CON FENOL EN
UNA CONCENTRACION DE 20 Mm
6.7.1 Cultivo discontinuo 1 L con fenol 20 mM
Según lo observado en este ensayo se puede establecer que el microorganismo
mostró una fase de adaptación corta a comparación de la estimada en
volúmenes de trabajo de 200 mL en medio líquido M9, por efecto del inóculo
inicial usado para empezar la fermentación, el cual fue tomado en fase
exponencial a partir de un precultivo mantenido con anterioridad en volúmenes
más bajos. Se pudo apreciar que la cepa en menos de 8 horas ya se había
alcanzado la fase logarítmica y se mantuvo en ella hasta la hora 32. Las
condiciones del cultivo controladas, agitación 133 rpm, temperatura 37°C y el
aumento en el volumen de trabajo ejercieron un efecto favorable sobre la
dinámica de crecimiento del microorganismo con respecto a los ensayos
realizados en volúmenes más pequeños. (figura 25)
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Tiempo (horas)
Abso
rban
cia (5
40 n
m)
Absorbancia Blanco Absorbancia Muestra
72
Figura 25. Cultivo en batch. Medio M9 adicionado con fenol 20 mM
Fuente: Los autores
El porcentaje de biodegradación del fenol por parte del microorganismo
fue de 99.50%, en un período de 48 horas. Siendo el proceso más
efectivo en la remoción, comparado con el llevado a cabo en erlenmeyers
con 200 mL de medio M9. (figura 26).
figura 26.Cultivo en batch biodegradación de fenol 20 mM en medio M9
Fuente: los autores
0
0,1
0,2
0,3
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)
Abso
rban
cia
Absorbancia blanco
0
5
10
1520
25
0 8 16 24 32 40 48
Tiempo (horas)
Conc
entra
ción
de fe
nol M
m
Control Biótico
73
Al igual que las cinéticas de crecimiento de volumenes menores, se utilizó como
control glucosa al 1%p/v. Por medio de la cual se estableció la actividad
metabólica del microorganismo.
Figura 27. Cultivo en Batch. Caldo nutritivo con glucosa 1% p/v
Fuente: los autores
6.8 EVALUACIÓN DE SOPORTES DE INMOVILIZACIÓN
6.8.1 Pruebas de biodegradabilidad
Durante 3 semanas se incubaron las cajas, que contenían concentraciones de
agar- agar de 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5% y 4.0% con el fin de
confirmar la resistencia de su estructura al ataque microbiano. No se
presentaron alteraciones de sus características, indicando de esta manera sus
cualidades para ser empleado como soporte de inmovilización. De igual manera
se ensayaron concentraciones de Alginato de calcio de 2%, 3% y 4%.(Tabla 6).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
Tiempo (horas)
Ab
sorb
anci
a (5
40 n
m)
Absorbancia Muestras Absorbancia Blanco
74
Tabla 6. Prueba de biodegradabilidad de los soportes
Agar – Agar Alginato de Calcio Tiempo
(días) 1% 1.5% 2% 2.5% 3% 3.5% 4% 2% 3% 4%
0 - - - - - - - - - -
7 - - - - - - - - - -
14 - - - - - - - - - -
21 - - - - - - - - - -
- ausencia de crecimiento o desarrollo de colonias
Fuente: los autores
En los experimentos realizados en torno a este aspecto no se encontró
degradación o zonas de hidrólisis causadas por el crecimiento de
microorganismos que pudiesen sustentar su crecimiento con base a los
constituyentes de alguno de los dos soportes evaluados. Esto no significa que
los geles no sean biodegradables por otros microorganismos, tan sólo que la
bacteria Pseudomonas fluorescens P4 no posee los mecanismos biosintéticos
para aprovechar los componentes orgánicos del soporte como una fuente de
sustratos asimilables. Otra explicación con respecto a la biodegradabilidad de
agar-agar y alginato de calcio, hace énfasis en la disposición física de las
moléculas que conforman estas dos matrices poliméricas, conformándose de
forma intrincada y de poca accesibilidad a una degradación microbiana. Sin
embargo, ha sido reportado que en ambientes marinos se pueden encontrar
varios organismos superiores como los moluscos, cianofíceas y rotíferos,
además de microorganismos como hongos y bacterias, que poseen enzimas
degradadoras de alginato y carragenina. (Emily, et al, 1996).
La realización de esta clase de pruebas permite predecir el comportamiento del
soporte de inmovilización cuando se someta de modo continuo al análisis de
muestras con una población microbiana mixta que pueda atentar contra la
integridad de la matriz y en consecuencia afectar el funcionamiento del
75
biosensor, de forma que pueda causar el escape de las células inmovilizadas,
lecturas erróneas, baja selectividad hacia el analito de interés por interferencia o
simplemente provocar interacciones microbianas antagónicas que puedan
conducir a la muerte del microorganismo inmovilizado.
6.8.2 Prueba de solubilidad
La solubilidad del alginato de calcio al 2%, 3% y 4% y de agar-agar al 1.5%,
2%, 2.5%, 3%, 3.5% y 4% fue evaluada en diferentes concentraciones de
soluciones que se reportan como destabilizadoras de soportes orgánicos.
K2HPO4 al 0.03% y Na2HPO4 al 0.06%, citrato al 1%, 2% y 2.5%, lactato al 0.5%
y 1% han sido utilizados en trabajos anteriores (Speirs, et al, 1995; Emily, et al,
1996; González & Bashan, 1998; Bandhyopadhyay, et al, 1999), como
soluciones que atentan contra la estabilidad química de polímeros de naturaleza
agárica.
Tabla 7. Pruebas de evaluación de la solubilidad del agar-agar
Citrato Lactato SOPORTE
K2HPO4
0.03%
Na2HPO4
0.06% 1% 2% 2.5% 0.5% 1%
Agar-agar 1.5% Insoluble Insoluble - - - - -
Agar- agar 2.0% Insoluble Insoluble - - - - -
Agar-agar 2.5% Insoluble Insoluble - - - - -
Agar–agar 3.0% Insoluble Insoluble - - - - -
Agar-agar 3.5% Insoluble Insoluble - - - - -
Agar-agar 4.0% Insoluble Insoluble - - - - -
- insoluble
Fuente: los autores
76
Tabla 8.Pruebas de evaluación de la solubilidad del Alginato de calcio
Citrato Lactato
SOPORTE
K2HPO4
0.03%
Na2HPO4
0.06% 1% 2% 2.5% 0.5% 1%
Alginato de Calcio 2% Soluble Soluble + + + + +
Alginato de Calcio 3% Soluble Soluble + + + + +
Alginato de Calcio 4% Soluble Soluble + + + + +
+ Soluble
Fuente: los autores
De acuerdo con lo obtenido en estos ensayos en relación a los geles de
alginato de calcio se puede establecer que la solubilidad presentada frente a las
diferentes soluciones es debida a que este tiende al intercambio de iones
monovalentes con bivalentes, lo cual provoca fácilmente la disolución del
polímero en el medio. En los ensayos contra iones fosfatos se evidencia la
sensibilidad del alginato por la disrupción de la membrana debido a la
solubilidad mucho más baja del fosfato de sodio y de potasio.
Concentraciones elevadas de estos compuestos pueden causar la inactivación
de los microorganismos inmovilizados debido a la interacción del calcio con la
pared celular.(Bachmann, 1999). Otro factor que favorece la solubilidad es la
relación baja de ácido gulurónico manejado en la prueba, el bajo contenido de
este constituyente puede inducir una alta porosidad lo cual aumenta la tasa de
difusión para sustratos, productos y el escape de las células inmovilizadas. Este
aspecto desfavorece totalmente la aplicación de matrices poliméricas basadas
en alginato de calcio para la formación de un elemento bioreceptor en el diseño
de biosensores microbianos. El comportamiento de esta matriz frente a
compuestos quelantes como el citrato y el lactato fue muy parecido al obtenido
con los fosfatos, esto se debe al secuestro de los iones de calcio que se
encuentran enlazados al ácido gulurónico que conforma la red interna del gel.
77
De acuerdo con lo expuesto se sugiere utilizar alginatos con un contenido de
bloques de ácido gulurónico alto (NG›1›10), los cuales pueden proporcionar
una mejor estabilidad al soporte y hacerlo menos susceptible de ataque por
sales y agentes quelantes. La tasa de difusión con esta clase de alginatos debe
ser evaluada con relación al tamaño de la perla.
Con respecto al agar-agar, se puede explicar su insolubilidad frente a las
sustancias probadas por la naturaleza de sus constituyentes. La agarosa, uno
de los componentes del polisacárido tiende a mantener mejor la estabilidad del
soporte cuando la fuerza iónica aumenta en el medio y el pH se encuentra por
fuera del rango de neutralidad. (Gerhardt, 1994). Estas condiciones se ven
favorecidas por la presencia de intercambiadores iónicos en la solución y de
ácidos disueltos como el lactato y el citrato. La agarosa y la agaropectina
presentes en el agar-agar, a diferencia del ácido gulurónico presente en el
alginato, no presenta afinidad hacia cationes mono y bivalentes, por lo que al
mantenerse en soluciones con compuestos quelantes no se disuelven y su
estabilidad química no se ve afectada.
6.8.3 Pruebas de difusibilidad
Por medio de esta prueba se comprobó, la penetrabilidad del fenol a través de
los soportes en sus diferentes concentraciones. (Fedorov, et; al, 1999). (Tabla
9, 10) (figura 28,29,30)
78
Tabla 9. Pruebas de Difusibilidad
PRUEBAS DE DIFUSIBILIDAD DE LOS SOPORTES
FENOL 5 mM
Tiempo
(horas) Agar-Agar Alginato de Calcio
2% 2.5% 3% 4% 2% 3% 4%
Tasa de difusión (mm /hora) 0.15 0.125 0.125 0.112 0.114 0.125 0.087
Tasa de difusión mm/24 horas 3.7 3.0 3.0 2.7 2.75 3.0 2.1
Fuente: los autores
Tabla 10. Pruebas de Difusibilidad
PRUEBAS DE DIFUSIBILIDAD DE LOS SOPORTES
FENOL 20mM
Tiempo
(horas) Agar-Agar Alginato de Calcio
2% 2.5% 3% 4% 2% 3% 4%
Tasa de difusión milímetros/h 0.15 0.125 0.125 0.112 0.112 0.125 0.083
Tasa de difusión (mm /24 hora) 3.2 3.0 3.0 2.7 2.7 3.0 2.0
Fuente: los autores
La estimación de la tasa de difusión de fenol en agar-agar y alginato demostró
que el gradiente de concentración del areno (20 mM) por el cual las células se
permiten degradar el sustrato tóxico bajo unas condiciones más suaves que en
contacto directo con el medio líquido no puede ser reproducido en estos dos
soportes. La tasa de difusión de fenol en agar-agar fue de 0.15 mm/h, siendo
este valor el más alto correspondiente a una concentración del 2%, obtenido
79
entre un rango de 2-4% y comparado con las concentraciones manejadas con
el alginato de calcio las cuales estuvieron bajo un mismo gradiente. (tabla 10).
El conocimiento de las características de difusión de los dos soportes apoya de
modo significativo la influencia que posee la matriz de inmovilización, por medio
de procesos de sorción, sobre la remoción de compuestos monoaromáticos
llevada a cabo por la cepa Pseudomonas fluorescens P4.
Figura 28. Prueba de Difusibilidad Figura 29. Prueba de Difusibilidad en En Agar agar Alginato al 2% Fuente: los autores Fuente: los autores
Figura 30. Prueba de Difusibilidad enAgar agar al 2%
Fuente: los autores
4% 2% 2.5%
80
Durante el transcurso de esta prueba se puede apreciar que a medida que
disminuye la concentración del agar-agar la tasa de difusión del fenol aumenta,
esto puede estar asociado a la porosidad del soporte siendo el tamaño del poro
en el agar mucho más abierto a concentraciones bajas que a un gradiente
mucho mayor.
A diferencia de lo obtenido en agar, la prueba realizada sobre alginato de calcio
muestra diferencia en los resultados obtenidos siendo la concentración de
soporte al 3% la que presenta una mayor tasa de difusibilidad. Este hecho
puede estar asociado, al igual que con el agar, al tamaño de poro y a
interacciones electrostáticas provocadas por la carga negativa de este polímero
(Cinar & Leslie, 2001), favoreciendo de cierto modo la resistencia difusional
frente al fenol. Enmarcado en la relación del tamaño de poro con el efecto de
difusión sobre el alginato ha sido reportado en trabajos anteriores (Emily, et al,
1996), que el entrecruzamiento de iones de calcio con el gel puede influir sobre
el tamaño del poro cuando se encuentra a concentraciones entre 0.05 M y 0.2
M.( Cinar & Leslie, 2001; Emily, et al, 1996).
Como una consideración final se debe hacer claridad con respecto a que la tasa
de difusión depende en gran medida del gradiente de concentración probado
sobre el sustrato de la naturaleza de la sustancia.
6.9 ENSAYO DE REMOCIÓN DE FENOL CON CELULAS INMOVILIZADAS
La inmovilización de microorganismos por incorporación en una matriz
polimérica ha demostrado tener un efecto significativo sobre la fisiología e
intensidad en el metabolismo de la célula. (Fedorov, et al, 1999). Por ejemplo,
se generan cambios en las propiedades de la membrana celular, en la
composición de las proteínas y en la permeabilidad. Tales modificaciones
81
pueden ser atribuidas a cambios en los parámetros físico-químicos en el medio
por acción del proceso de inmovilización.(Mordocco, et al, 1999).
De acuerdo con los resultados obtenidos en este ensayo se pudo comprobar un
aumento en el nivel de biodegradación del fenol con células de Pseudomonas
fluorescens P4 inmovilizadas en agar-agar al 2% (figura 31).
0
5
10
15
20
25
0 8 16 24 32 40 48
Tiempo (horas)
Fen
ol
(mM
)
control biótico
Figura 31. Biodegradación de fenol por P. fluorescens inmovilizada en agar – agar 2%
Fuente: los autores
El soporte orgánico de alginato de calcio no ofreció esta posibilidad debido a la
disolución de las perlas en el medio de sales mínimas en donde fueron
mantenidas (figura 32). La concentración inicial de fenol, valorada en 20 mM,
fue utilizada como parámetro de comparación para la remoción de este
compuesto en células libres e inmovilizadas, convirtiéndose este último sistema
en el más apropiado para tal fin.
Este hecho se demostró en un tiempo de 48 horas en el cual la bacteria
Pseudomonas fluorescens P4 inmovilizada en agar-agar al 2% fue capaz de
utilizar el fenol como fuente de carbono en un medio de sales mínimas M9
82
hasta alcanzar una concentración final de 8.75 X 10 –3 mM, esto equivale a un
porcentaje de degradación biótica del 99.99%
Figura 32. Disolución de las perlas de Alginato de calcio
Fuente: los autores
El control abiótico no presentó variaciones significativas durante el desarrollo de
esta prueba por lo que se establece que la difusibilidad del soporte aporta muy
pocas características de sorción en presencia del compuesto monoaromático y
que la volatilización del fenol se ve desfavorecida por la utilización de una
concentración baja del mismo, muy soluble en el medio líquido de sales
mínimas M9. El fenol en particular presenta una solubilidad acuosa de 82,000
ppm (Burlage, et al, 1998), este hecho apoya lo expuesto anteriormente.
El aprovechamiento y tolerancia del fenol por parte de la cepa inmovilizada en
agar-agar al 2% puede ser atribuido al efecto “cubierta” que ejerce el soporte
sobre las células, el cual se cree, es el responsable de la protección celular y
del incremento de su actividad degradadora. (Fedorov, et al, 2000 ). Existen
además otras explicaciones a cerca de este fenómeno, en las cuales se plantea
que algunas de las células pertenecientes a una microcolonia pueden ser
diferenciadas y variar en su morfología, propiedades y funciones. Este hecho
puede, por lo tanto, provocar la creación de nuevas condiciones en la
83
microcolonia que causan alteraciones en la fisiología de la población bacteriana.
La inmovilización en agar protege a éstas no solamente de los efectos tóxicos
del solvente, sino también de los efectos inhibitorios causados por la
acumulación de metabolitos. Esta condición, por lo tanto permite al cultivo
funcionar bajo condiciones de exigencia fisiológica.
84
7. CONCLUSIONES
1. La cepa Pseudomonas fluorescens P4 realizó la utilización de fenol
como única fuente de carbono en un medio de cultivo definido, razón
por la cual se vuelve apropiada para llevar a cabo ensayos de
biodegradación sobre compuestos monoaromáticos.
2. La resistencia del microorganismo a concentraciones de fenol por
debajo de 0.7 M hace adecuado su uso en procesos biotecnológicos
de remediación de ecosistemas con problemas de contaminación y
además ofrece la posibilidad real de usar la cepa bacteriana para
propósitos analíticos relacionados con el monitoreo de muestras
ambientales.
3. La valoración comparativa de dos geles orgánicos (agar-agar y
alginato de calcio), para fines de inmovilización de la bacteria
Pseudomonas fluorescens P4, reveló que los geles de agar-agar
proveen una alta eficiencia en los procesos de captación biológica de
fenol a comparación del alginato de calcio, además de ejercer un
efecto protector sobre las células.
4. La inmovilización en agar-agar cumple con los principales
requerimientos para matrices de soporte en la elaboración de un
elemento bioreceptor para uso bioanalítico.
85
8. RECOMENDACIONES
− Realizar pruebas de biodegradación con otras fuentes de carbono de
naturaleza fenólica, con el objeto de ampliar el rango de detección hacia
géneros de compuestos relacionados estructuralmente y así propiciar el
desarrollo de multisensores biológicos.
− Llevar a cabo ensayos de actividad enzimática mediante el uso de
extractos libres de células, con el fin de optimizar los experimentos de
inducción secuencial al fenol.
− Realizar pruebas que permitan determinar los cambios que se presentan
en la membrana celular del microorganismo causados por exposición a
fenol.
− Evaluar la resistencia y actividad degradadora del microorganismo frente
a otra clase de contaminantes orgánicos no fenólicos que puedan
interferir a nivel bioquímico y físico-químico en la puesta en marcha de
un biosensor.
− Identificar los mecanismos moleculares por los cuales la bacteria
Pseudomonas fluorescens P4 se adapta a una fuente de carbono
específica y es inducida para la utilización de nuevos compuestos.
− Mantener un monitoreo constante sobre la tasa de consumo de oxígeno
por parte de la cepa en el proceso de remoción biológica de fenol.
− Probar otras metodologías analíticas con un límite de detección por
debajo del usado en este trabajo con el propósito de homologar
86
resultados frente a la respuesta generada por un biosensor microbiano
de tipo amperométrico.
− Diseñar y desarrollar una solución de calibración acorde con las
características del electrodo a utilizar y con las del soporte de
inmovilización del microorganismo.
− En relación con el material empleado para conformar el elemento
bioreceptor de un biosensor se sugiere evaluar otra clase de geles
poliméricos de tipo orgánico, como la poliacrilamida y K- carragenina,
además de métodos de atrapamiento en membranas poliméricas.
− Se debe valorar la influencia del tamaño de la perla sobre la
transferencia de masa que se lleva a cabo durante la biodegradación de
fenol en el medio de cultivo.
− Evaluar diferentes soluciones que puedan actuar como agente
desestabilizante de la naturaleza del polímero empleado para la
inmovilización.
− Valorar la estabilidad de la señal de respuesta emitida por el biosensor a
diferentes concentraciones celulares y de fenol. Esto debe probarse tanto
en estado de mantenimiento como en estado operativo.
87
9. BIBLIOGRAFÍA
1. A.P.H.A, A.W.W.A, W.E.F. 1992. Standard Methods for Examination of
Water and Wastewater, Section 5530, 18th Ed. American Public Health
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TA441. Microbiol. 2000 Vol 146: 1705- 1715
4. Atlas R.M Bartha R. Biodegradation of petroleum in seawater: at low
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95
ANEXO 1
CALDO BHI
Composición g/L
z Extracto de cerebro, extracto de corazón y peptona 27,5
z D(+) glucosa 2,0
z Cloruro sódico 5,0
z Hidrógeno fosfato disódico 2,5
AGAR KING B
Composición g/L
z Proteosa- peptona 20.0
z Sulfato de magnesio 1.5
z Fosfato tripotásico –3-hidrato 1.8
z Agar-agar 10.0
z Aditivo: Glicerina 10.0
AGAR NUTRITIVO
Composición g/L
z Peptona de carne 5.0
z Extracto de carne 3.0
z Agar- agar 12.0
96
MEDIO MINERAL DE SALES MINIMAS M9
Composición g/L
z Na2HPO4 6.0
z K2HPO4 3.0
z NaCl 0.5
z NH4Cl 1.0
z MgCl2 0.1
z CaCl2 0.01
z FeSO4*7H2O 0.01
z Agar- agar 20.0
z Solución de elementos trazas g/L:
z MoO3 0.1
z ZnSO4.5H2O 0.7
z CuSO4.5H2O 0.05
z H3BO3 0.1
z CoCL2 6H2O 0.1
z NiSO4.7H2O 0.1
z MnSO4.5H2O 0.1
97
ANEXO 2
Tabla 2. Prueba de adaptación en medio M9 adicionado con fenol 2.5 mM
durante 28 días.
Tiempo M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9 M 10 M 11 M 12 Promedio
1 0.101 0.105 0.104 0.103 0.104 0.114 0.098 0.105 0.110 0.102 0.100 0.110 0.104
3 0.107 0.110 0.111 0.105 0.103 0.112 0.110 0.105 0.103 0.102 0.107 0.110 0.107
5 0.112 0.114 0.112 0.110 0.110 0.109 0.113 0.115 0.116 0.115 0.115 0.115 0.113
7 0.101 0.107 0.110 0.114 0.115 0.120 0.124 0.123 0.130 0.130 0.131 0.128 0.119
10 0.152 0.151 0.153 0.155 0.155 0.153 0.155 0.154 0.156 0.156 0.157 0.159 0.154
13 0.172 0.168 0.173 0.180 0.181 0.182 0.185 0.189 0.205 0.210 0.215 0.230 0.190
15 0.250 0.260 0.280 0.296 0.310 0.325 0.342 0.330 0.328 0.320 0.330 0.320 0.307
18 0.306 0.310 0.307 0.306 0.305 0.307 0.310 0.306 0.308 0.305 0.306 0.304 0.307
20 0.305 0.307 0.308 0.304 0.305 0.303 0.305 0.306 0.307 0.309 0.305 0.306 0.307
25 0.306 0.330 0.333 0.332 0.333 0.334 0.340 0.350 0.354 0.355 0.360 0.363 0.306
28 0.363 0.362 0.362 0.363 0.361 0.363 0.361 0.362 0.362 0.363 0.363 0.360 0.362
98
Tabla 3. Cinética de Crecimiento en M9 adicionado con fenol 5 mM
CINETICA DE CRECIMIENTO EN M9 ADICIONADO CON FENOL 5 mM
Tiempo Absorbancia (longitud 540 nm)
Hora Blanco
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
3
Muestra
4
Muestra
5 Promedio
0 0.044 0.069 0.077 0.045 0.062 0.062 0.063
1 0.044 0.063 0.074 0.088 0.063 0.064 0.070
2 0.044 0.064 0.053 0.058 0.069 0.064 0.061
3 0.044 0.063 0.061 0.062 0.080 0.064 0.066
4 0.044 0.079 0.072 0.066 0.074 0.070 0.072
5 0.044 0.052 0.072 0.078 0.076 0.070 0.069
6 0.044 0.047 0.075 0.077 0.075 0.080 0.078
7 0.044 0.070 0.076 0.076 0.075 0.080 0.075
8 0.044 0.045 0.044 0.044 0.042 0.041 0.043
9 0.044 0.074 0.041 0.044 0.050 0.045 0.050
10 0.044 0.060 0.051 0.050 0.042 0.044 0.049
11 0.044 0.082 0.044 0.057 0.056 0.045 0.056
12 0.044 0.100 0.060 0.076 0.069 0.080 0.077
13 0.044 0.046 0.044 0.043 0.043 0.044 0.044
14 0.044 0.051 0.042 0.047 0.046 0.050 0.047
15 0.044 0.049 0.042 0.042 0.044 0.044 0.044
16 0.044 0.045 0.045 0.047 0.049 0.050 0.047
17 0.044 0.046 0.040 0.045 0.045 0.050 0.045
18 0.044 0.043 0.046 0.050 0.043 0.042 0.044
19 0.044 0.049 0.046 0.045 0.046 0.040 0.045
20 0.044 0.055 0.049 0.060 0.057 0.045 0.053
21 0.044 0.051 0.052 0.053 0.047 0.051 0.051
22 0.044 0.050 0.049 0.048 0.047 0.046 0.048
23 0.044 0.039 0.037 0.030 0.029 0.032 0.033
24 0.044 0.025 0.020 0.020 0.021 0.022 0.021
99
Tabla 4. Cinética de Crecimiento Cultivo en Batch con Caldo Nutritivo
adicionado con Glucosa al 1% p/v
Tiempo Blanco Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Promedio
0 0.110 - - - -
2 0.110 0.119 0.119 0.116 0.118
4 0.110 0.100 0.099 0.097 0.098
6 0.110 0.106 0.106 0.104 0.105
8 0.110 0.178 0.184 0.182 0.181
10 0.110 0.498 0.504 0.502 0.501
12 0.110 0.828 0.816 0.820 0.821
14 0.110 0.900 0.918 0.908 0.908
16 0.110 0.920 0.922 0.904 0.915
18 0.110 0.920 0.926 0.880 0.908
20 0.110 0.910 0.890 0.884 0.894
22 0.110 0.916 0.918 0.912 0.915
24 0.110 0.912 0.922 0.946 0.926
26 0.110 0.932 0.980 0.970 0.960
28 0.110 0.954 0.954 0.932 0.946
30 0.110 0.942 0.948 0.952 0.947
32 0.110 0.956 0.978 0.952 0.962
34 0.110 0.998 0.986 1.002 0.995
36 0.110 1.002 0.999 1.002 1.001
38 0.110 1.074 1.089 1.090 1.084
40 0.110 1.090 1.085 1.094 1.089
42 0.110 1.095 1.098 1.096 1.096
44 0.110 1.100 1.105 1.104 1.103
46 0.110 1.135 1.150 1.160 1.148
48 0.110 1.125 1.120 1.110 1.118
50 0.110 1.120 1.135 1.120 1.125
52 0.110 1.100 1.080 1.020 1.066
54 0,110 0.981 0.979 0.980 0.980
56 0,110 0.902 0.903 0.910 0.905
58 0,110 0.815 0.798 0.795 0.802
100
Tabla 5. Cinética de Crecimiento Cultivo en Batch en medio M9 adicionado con
fenol 20 mM
CINETICA DE CRECIMIENTO
MEDIO M9 ADICIONADO CON FENOL 20 mM
Tiempo Blanco Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Promedio
0 0.156 - - - -
2 0.156 0.166 0.166 0.162 0.164
4 0.156 0.169 0.171 0.168 0.169
6 0.156 0.188 0.187 0.186 0.187
8 0.156 0.236 0.238 0.232 0.235
10 0.156 0.241 0.244 0.245 0.243
12 0.156 0.244 0.244 0.240 0.242
14 0.156 0.232 0.231 0.230 0.231
16 0.156 0.240 0.247 0.254 0.247
18 0.156 0.246 0.242 0.248 0.245
20 0.156 0.254 0.255 0.252 0.254
22 0.156 0.260 0.261 0.260 0.260
24 0.156 0.261 0.265 0.268 0.265
26 0.156 0.274 0.278 0.280 0.277
28 0.156 0.272 0.271 0.274 0.272
30 0.156 0.269 0.271 0.277 0.272
32 0.156 0.269 0.268 0.269 0.269
34 0.156 0.271 0.273 0.274 0.273
36 0.156 0.277 0.278 0.274 0.276
38 0.156 0.268 0.269 0.268 0.268
40 0.156 0.275 0.272 0.270 0.272
42 0.156 0.269 0.270 0.269 0.269
44 0.156 0.264 0.265 0.261 0.263
46 0.156 0.262 0.260 0.253 0.258
48 0.156 0.250 0.256 0.254 0.253
101
