EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA Y CRÓNICA DEL DETERGENTE NATURAL CLEANER

I. ANTECEDENTES NATURAL CLEANER es un detergente líquido concentrado de gran efectividad, formulado con poderosos agentes humectantes y detergentes que lo hacen apropiado para una gran variedad de operaciones de aseo en Industrias de Alimentos. Producto de su acción rápida y efectiva, su formulación de carácter neutro sin aroma, ni enmascarantes y su alta dilución de uso, lo hacen un efectivo agente de limpieza en recintos donde se procesan o preparan alimentos. NATURAL CLEANER forma una espuma estable que favorece la extracción y enjuague de la suciedad. Puede ser usado a través de traperos, esponjas y escobillas con acción mecánica; también puede ser aplicado por aspersión o chorro a través de máquina hidrolavadora. De acuerdo a sus fabricantes, NATURAL CLEANER se encuentra formulado para ser usado en instituciones en general, hospitales y clínicas, plantas de alimentos, casinos, restaurantes, colegios y universidades. NATURAL CLEANER se presenta como líquido viscoso cristalino, de suave aroma, con un pH de entre 8,5 y 8,7 y una densidad que oscila entre 1,050 y 1,070 g/cm3. Se presenta en envases de 20, 60 y 220 kilogramos. Se recomienda para su manipulación el uso de guantes de neopreno o nitrilo pues puede producir reacciones alérgicas en algunas personas. Evitar el contacto con los ojos, su ingestión y su inhalación. De acuerdo al fabricante, se recomienda guardar NATURAL CLEANER en envase cerrado, protegido de la humedad y fuentes de calor. Además, debe ser almacenado lejos de productos químicos de carácter ácido. Se estima su durabilidad en un año almacenado bajo estas condiciones. Se adjunta copia de la Hoja de Seguridad en Anexo 1 y Hoja Técnica en Anexo 2.

Con el objeto de evaluar la toxicidad de este producto, se procedió a efectuar un estudio de toxicidad aguda y crónica del producto. El método de Toxicidad Aguda está basado en la determinación del cálculo de la Concentración Letal al 50% o LC50 utilizando un microcrustáceo como indicador. De acuerdo a lo establecido por la NCh 2083 Of.1999 “Bioensayo de toxicidad aguda mediante la determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magna o Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera)”, única norma vigente en la actualidad en Chile para evaluar la toxicidad aguda de productos químicos. No obstante lo anterior, dado que este producto se requiere aplicar en agua marina, la Universidad de Valparaíso, a través de su Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología, ha estandarizado un Bioensayo de Toxicidad Aguda utilizando el copépodo intermareal Harpacticus littoralis (Crustacea, Copepoda). H. littoralis tiene una amplia distribución geográfica, hallándose descrito en el océano Atlántico, en sectores como la costa sur y oeste de Noruega (Sars, 1910), Helgoland, Mar del Norte (Klie, 1927), Irlanda (Farrán, 1913) y bahía Chesapeake (Wilson, 1932); en el océano Índico, lago Chilca, golfo de Bengala y en el océano Pacífico, isla de Pascua (Goddard, 2003). En Chile se encuentra en todo el litoral nacional, razón por la cual puede considerarse un organismo cosmopolita, requisito de suma importancia al seleccionar una especie de prueba para bioensayos. Además, debe destacarse que para evaluar toxicidad aguda

con disponibilidad de pequeños volúmenes de producto, es necesario contar con especies que puedan ser evaluadas con esta exigencia, lo que no puede hacerse, por ejemplo, con peces (e.g. el “baunco” Girella laevifrons) y megacrustáceos (como el “camarón de roca“ Rhynchocinetes typus), en los cuales se requiere grandes volúmenes de muestra para evaluar en pruebas preliminares y definitivas de bioensayos. Cabe recordar que la Concentración Letal al 50% o LC50 se define como la concentración del producto a la cual el 50% de los organismos utilizados usados en los ensayos sobrevive en un tiempo determinado (24 ó 48 horas). La concentración es ajustada preliminarmente por un primer ensayo. Estos ensayos preliminares sirven para ajustar el rango de concentraciones en donde se hallaría el valor de LC50, mientras que las pruebas siguientes, finales, permiten establecer el punto final. De acuerdo a la actual normativa vigente, el “nivel de toxicidad” se deriva del valor LC50 a las 48 h (LC50-48 h). No obstante lo anterior, también se determinó en esta ocasión el valor LC50 a las 96 h (LC50-96 h). En tanto, los bioensayos de Toxicidad Crónica permiten evidenciar diferentes respuestas como: conducta, fecundidad, desarrollo, bioacumulación, etc. Se expresan como EC50 (concentración que provoca un efecto en el 50% de los estadíos u organismos ensayados), luego de un tiempo determinado (minutos u horas). Se estima que la toxicidad crónica puede causar efectos tóxicos acumulativos o efectos carcinogénicos, mutagénicos o teratogénicos en el ser humano. Se han evaluado varias especies y estadíos de estas especies para efectuar ensayos de toxicidad crónica. Una de las especies más utilizada han sido estadíos larvales y postlarvales de equinodermos, por constituir los estadios más sensibles de su ciclo de vida (Bellas et al., 2005). Se han realizado bioensayos de fertilización y embrionación evaluando el efecto de diversas sustancias químicas en el agua y sedimentos en diferentes especies de erizos marinos: Arbacia spatuligera (Valenciennes, 1846), Paracentrotus lividus Lamarck, 1816), Psammechinus miliaris (Gmelin, 1778), Sphaerechinus granularis (Lamarck, 1816), Tripneustes gratilla (Linnaeus, 1758) y Loxechinus albus (Olivos, 1994, Larrain et al., 1999; Ghirardini et al., 2001; Coteur et al., 2003; Vásquez, 2003; De Nicola et al., 2004; Pesando et al., 2004; Bellas et al., 2005). No obstante, también el Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología de la Universidad de Valparaíso, ha estandarizado un Bioensayo de Toxicidad Crónica utilizando el copépodo intermareal Harpacticus littoralis (Crustacea, Copepoda). En el presente Informe Técnico se evalúa la toxicidad crónica del desinfectante NATURAL CLEANER sobre la conducta natatoria, movilidad en periópodos y anténulas de Harpacticus littoralis.

Fotografía 1. Detalle de Harpacticus littoralis.

II. MATERIALES Y MÉTODOS II.1 EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE NATURAL CLEANER

Ensayos de Toxicidad Aguda Los ensayos fueron efectuados de acuerdo a lo establecido y recomendado por las normativas internacionales de APHA (1989), USEPA (1993, 1995) e ISO 6341:1996 (E) y las normativas nacionales NCh 2083 Of.1999 “Bioensayo de toxicidad aguda mediante la determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magna o Daphnia pulex (Crustacea, Cladocera)” y NCh426/2, NCh2313/5, NCh411/2 y NCh411/3, utilizando la especie tipo Harpacticus littoralis. A continuación se detalla el procedimiento.

Almacenamiento de las Muestras Las muestras de NATURAL CLEANER fueron proporcionadas por el cliente. Éstas fueron guardadas en contenedores sellados a temperatura ambiente hasta su uso. Antes de comenzar el bioensayo las muestras fueron ambientadas a una temperatura de 20º C.

Equipamiento Las pruebas de toxicidad se efectuaron en placas de Petri de vidrio de 40 ml. Cada una de las placas fueron bombeadas con microdifusores, asegurando la buena oxigenación y distribución uniforme de este gas a través de toda la placa antes de comenzar los ensayos. Durante las pruebas y previo a ellas, la temperatura del agua se mantuvo a 20º C.

Reactivos Se utilizaron todos los reactivos necesarios de calidad p.a. (grado analítico). Como agua de prueba y agua de cultivo se utilizó agua reconstituida, es decir, agua para análisis Clase 4 (NCh426/2) a la cual se le adicionó sales inorgánicas de grado analítico.

Organismos de Prueba Se utilizó la especie Harpacticus littoralis (Crustacea, Copepoda) (Fotografía 1). Los especímenes adultos del copépodo intermareal fueron capturados en el sector litoral intermareal de la Concesión Marítima de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales de la Universidad de Valparaíso. Los organismos capturados fueron mantenidos en recipientes 15 días antes de comenzar las pruebas. Si durante este tiempo la tasa de muerte excede el 10%, el batch total de organismos es reemplazado. Durante esta etapa los microcrustáceos fueron alimentados con microalgas regularmente. Una vez aclimatados, se utilizaron especímenes neonatos de no más de 24 horas de edad de tercera generación. Los organismos utilizados fueron separados de sus correspondientes cultivos madres manualmente dentro de las 24 horas de nacidos en un volumen

máximo de 1 ml de agua de dilución. Durante los bioensayos los organismos dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

Número de Organismos, Volumen de Líquido y Concentraciones de Producto En los Ensayos Preliminares realizados para determinar el intervalo de concentración de la muestra en la que se debía efectuar el ensayo definitivo, se utilizaron 20 ejemplares por placa (la densidad no debe ser superior a 5 organismos por 10 ml). Se prepararon 6 diluciones preliminares del producto, considerando su concentración base: 1,0 – 10 – 100– 1.000 – 10.000 – 40.000 ppm, más un control negativo. Este último se preparó utilizando agua de dilución en igual volumen al de las soluciones de prueba, inoculando en éste igual número de organismos por especie (20). Después de 24, 48 y 96 h de incubación, se registró el intervalo de concentración en que se obtiene el 0% y el 100% de inmovilización. Se consideraron inmovilizados los organismos que después de una leve agitación de las placas, son incapaces de desplazarse aunque muevan sus antenas, durante un período de observación de 15 segundos. No obstante lo anterior, en todas las concentraciones los organismos murieron en un 100%. Producto de lo anterior, se ajustaron las concentraciones entre 1,0 y 5,0 ppm en progresión geométrica: 1,0 – 1,49 – 2,23– 3,32 – 5,0 ppm, más un control negativo. En este caso sólo en la concentración de 1,0 ppm hubo mortandad parcial de los ejemplares. Se volvieron a ajustar concentraciones geométricas, buscando algún intervalo de concentraciones donde apareciera mayor número de organismos vivos. Finalmente, se ajustaron las concentraciones a los siguientes rangos geométricos: 0,10 – 0,18 – 0,32– 0,56 – 1,0 ppm. Estas fueron las concentraciones ensayadas en las pruebas definitivas. Los Ensayos Definitivos se realizaron para determinar el porcentaje de organismos inmovilizados para diferentes concentraciones de la muestra y su correspondiente LC50 a las 48 y 96 h. Este corresponde a la estimación de la concentración del producto que inmoviliza al 50% de los organismos en 48 y 96 horas, expresada en porcentaje de muestra o en mg/l (ppm). En los ensayos definitivos se utilizaron las concentraciones que en el ensayo preliminar presentaron entre 0% (o cercano a este porcentaje) y 100% de inmovilización. En total se utilizaron 5 concentraciones finales, calculadas en progresión geométrica: 0,10 – 0,18 – 0,32– 0,56 – 1,0 ppm, más un control negativo. Para cada concentración se inocularon 20 organismos, divididos en tres réplicas para cada especie. Luego se incubaron por 24, 48 y 96 h a 20° C y se contabilizaron los organismos sobrevivientes. Finalmente se registró la concentración de oxígeno disuelto en la placa de menor concentración de muestra, en el que todos los organismos resultaron inmovilizados.

Determinación del LC50 Para la determinación del LC50, dado los resultados obtenidos, se utilizó el diagrama de decisión de la Figura 1, concluyendo que se calcularía este parámetro utilizando tanto el método del Probit como el método gráfico. Para facilitar los cálculos, se utilizó el software suministrado por la US Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program, versión 1.5. El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. dosis dentro del marco de la regresión.

Figura 1. Árbol de decisión para determinar método a utilizar en el cálculo del LC50.

II.2 EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD CRÓNICA DE NATURAL CLEANER

Ensayos de Toxicidad Crónica Los ensayos fueron efectuados de acuerdo a lo establecido y recomendado por las normativas internacionales de APHA (1989), USEPA (2001, 2002) y NCh426/2, NCh2313/5, NCh411/2 y NCh411/3. A continuación se detalla el procedimiento.

Almacenamiento de las Muestras Las muestras del producto NATURAL CLEANER fueron proporcionadas por el cliente y almacenadas y ambientadas igual que para el ensayo agudo antes descrito.

Equipamiento Las pruebas de toxicidad se efectuaron en placas de Petri de vidrio de 40 ml. Cada una de las placas fueron bombeadas con microdifusores, asegurando la buena oxigenación y distribución uniforme de este gas a través de toda la placa antes de comenzar los ensayos. Durante las pruebas y previo a ellas, la temperatura del agua se mantuvo a 20º C.

Reactivos Se utilizaron todos los reactivos necesarios de calidad p.a. (grado analítico). Como agua de prueba y agua de cultivo se utilizó agua reconstituida, es decir, agua para análisis clase 4 (NCh426/2) a la cual se le adicionó sales inorgánicas de grado analítico.

Organismos de Prueba: Recolección Los organismos de H. littoralis fueron recolectados en las pozas de la zona intermareal del área de Montemar, Valparaíso (33°S), en la Concesión Marítima de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales de la Univeraidad de Valparaíso, extrayéndose los de mayores tamaños. Los ejemplares se extrajeron mediante pipetas Pasteur, principalmente en los lugares con presencia del alga Chaetomorfa linum, ya que los copépodos intermareales harpactícidos son generalmente de características fitófilas (Goddard, 2006). Los ejemplares fueron depositados en un recipiente de plástico conjuntamente con anfípodos y otras especies de copépodos.). Durante los bioensayos los organismos dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

Selección En el Laboratorio de Bioensayos y Biotecnología de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales de la Universidad de Valparaíso, mediante lupa Zeiss®, se separaron los ejemplares de H. littoralis, considerando su morfología y color café - rojizo característicos. Se depositaron en una cápsula de petri que contenía 40 ml de agua de mar filtrada. Los organismos capturados fueron mantenidos en recipientes 15 días antes de comenzar las pruebas. Si durante este tiempo la tasa de muerte excede el 10%, el batch total de organismos es reemplazado. Durante esta etapa los microcrustáceos fueron alimentados con microalgas regularmente. Una vez aclimatados, se utilizaron especímenes neonatos de no más de 24 horas de edad de tercera generación. Los organismos utilizados fueron separados de sus correspondientes cultivos madres manualmente dentro de las 24 horas de nacidos en un volumen máximo de 1 ml de agua de dilución. Durante los bioensayos los organismos

dejaron de alimentarse y se mantuvieron sin aireación y en oscuridad, a una temperatura de 20º C.

Bioensayos Para la realización del experimento se utilizaron 20 cápsulas de petri, las cuales contenían 40 ml de agua de mar reconstituida. En 5 de ellas (y sus respectivas réplicas) se depositaron diferentes concentraciones del producto NATURAL CLEANER: 0,10 – 0,18 – 0,32– 0,56 – 1,0 ppm, respectivamente (Tabla 1). Luego de 10 minutos, se depositaron 20 ejemplares de H. littoralis por cada cápsula. Pasadas 96 horas se observaron los organismos, mediante lupa y microscopio Zeiss. Se consideró como parámetros la presencia de organismos vivos o muertos, movilidad, forma de las anténulas y estado de los periópodos.

Tabla 1 Diseño de experimento (Bioensayo), utilizando diferentes concentraciones de

NATURAL CLEANER.

Número de cápsula/Tiempo (h)

Concentración Final de NATURAL CLEANER (ppm)

0,10 0,18 0,32 0,56 1,0

1 - 96

2 - 96

3 - 96

4 - 96

* Cada cápsula contiene 40 mL de agua de mar reconstituida y 20 ejemplares de H. littoralis.

Determinación del EC50 Para la determinación del EC50, se utilizó el diagrama de decisión de la Figura 1, concluyendo que se calcularía este parámetro utilizando el método del Probit antes descrito.

III. RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA Y CRÓNICA

III.1 RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA DE NATURAL

CLEANER a) Ensayos Finales en H. littoralis Los resultados de los ensayos finales en H. littoralis se detallan en la Tabla 2. Se adicionó a las concentraciones seleccionadas, las del Control Negativo.

Tabla 2

Resultados de los ensayos finales de toxicidad aguda para NATURAL CLEANER en H. littoralis. Los resultados se expresan como número de organismos inmovilizados y

mortalidad (%).

Número de Placas Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Control

Concentración 0,10 0,18 0,32 0,56 1,0 0,0

Réplica 1 - 24 Hrs. 3 (15%) 5 (25%) 8 (40%) 10 (50%) 12 (60%) 0 (0%)

Réplica 2 - 24 Hrs. 2 (10%) 3 (15%) 7 (35%) 10 (50%) 13 (65%) 0 (0%)

Réplica 3 - 24 Hrs. 2 (10%) 4 (20%) 8 (40%) 12 (60%) 13 (65%) 0 (0%)

% Mortalidad Promedio 11,7 20,0 38,3 53,3 63,3 0,0 Número de Placas Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Control

Concentración 0,10 0,18 0,32 0,56 1,0 0,0

Réplica 1 - 48 Hrs. 4 (20%) 5 (25%) 10 (50%) 13 (65%) 14 (70%) 0 (0%)

Réplica 2 - 48 Hrs. 3 (15%) 8 (40%) 11 (60%) 12 (60%) 16 (80%) 0 (0%)

Réplica 3 - 48 Hrs. 2 (10%) 5 (25%) 11 (60%) 13 (65%) 16 (80%) 0 (0%)

% Mortalidad Promedio 15,0 30,0 56,7 63,3 76,7 0,0

Número de Placas Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Control

Concentración 0,10 0,18 0,32 0,56 1,0 0,0

Réplica 1 - 96 Hrs. 4 (20%) 9 (45%) 14 (70%) 16 (80%) 17 (85%) 0 (0%)

Réplica 2 - 96 Hrs. 3 (15%) 8 (40%) 14 (70%) 15 (75%) 18 (90%) 0 (0%)

Réplica 3 - 96 Hrs. 6 (30%) 8 (40%) 13 (65%) 15 (75%) 18 (90%) 0 (0%)

% Mortalidad Promedio 21,7 41,7 68,3 76,7 88,3 0,0

c) Cálculos de LC50 48 y 96 h en H. littoralis El programa Probit arrojó los siguientes resultados para el test de X2 a las 48 horas utilizando H. littoralis: Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0,436 Chi - Square for Heterogeneity = 7,815 (tabular value at 0,05 level) Los parámetros de la curva resultante fueron los siguientes: μ = - 0, 456978

= 0,571280

Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 5,799920 0,23688 (5,335626; 6,264214) Pendiente 1,750456 0,400889 (0,964714; 2,536197)

En la Tabla 3 se detallan los resultados de los cálculos de las LC50 - 48 horas en H. littoralis para el producto NATURAL CLEANER:

Tabla 3 Concentraciones Letales (LC) – 48 h obtenidas de los ensayos de toxicidad aguda

para NATURAL CLEANER utilizando H. littoralis. Los resultados se expresan en ppm.

Punto Concentración Expuesta (ppm)

LC 1.00 0,016

LC 5.00 0,040

LC 10.00 0,065

LC 15.00 0,089

LC 50.00 0,349

LC 85.00 1,365

LC 90.00 1,884

LC 95.00 3,039

LC 99.00 7,447

De estos resultados se desprende que el LC50 48 h para NATURAL CLEANER determinada a través del método Probit es de 0,349 ppm. Para el caso de los bioensayos a las 96 horas en H. littoralis, se obtuvieron los siguientes resultados para el test de X2: Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0,549 Chi - Square for Heterogeneity = 7,815 (tabular value at 0,05 level) Los parámetros de la curva resultante fueron los siguientes: μ = -0, 643838

= 0, 501253 Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 6,284457 0,268185 (5,758814; 6,810100) Pendiente 1,995001 0,421811 (1,168250; 2,821751)

En la Tabla 4 se detallan los resultados de los cálculos de las LC50 - 96 horas en H. littoralis para el producto NATURAL CLEANER.

Tabla 4 Concentraciones Letales (LC) – 96 h obtenidas de los ensayos de toxicidad aguda

para NATURAL CLEANER utilizando H. littoralis. Los resultados se expresan en ppm.

Punto

Concentración Expuesta (ppm)

LC 1.00 0,015

LC 5.00 0,034

LC 10.00 0,052

LC 15.00 0,069

LC 50.00 0,227

LC 85.00 0,751

LC 90.00 0,997

LC 95.00 1,516

LC 99.00 3,328

De estos resultados se desprende que el LC50 96 h para NATURAL CLEANER determinada a través del método Probit es de 0,227 ppm.

d) Validez de los Resultados De acuerdo a lo requerido por la normativa actual los resultados son considerados válidos ya que:

- La concentración de oxígeno disuelto en las placas de menor concentración de muestra en el que todos los organismos resultaron inmovilizados a las 24, 48 y 96 horas, fue de 8,27; 8,12 y 7,93 mg/l (>2 mg/l), respectivamente, para H littoralis.

- El porcentaje de inmovilización de los controles para ambas especies fue menor al 10% (0% a las 24, 48 y 96 h).

III.2 RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS DE TOXICIDAD CRÓNICA DE NATURAL CLEANER

a) Mortalidades Los resultados de las mortalidades observadas se detallan en la Tabla 5. Estos resultados representan los promedios a las 96 horas de ensayo.

Tabla 5 Mortalidad de los ejemplares de H. littoralis expuestos a diferentes concentraciones de

NATURAL CLEANER por 96 horas.

Número de Placas 0,10 ppm 0,18 ppm 0,32 ppm

Concentración NATURAL CLEANER (ppm) Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas

Réplica 1 16 4 11 9 5 15

Réplica 2 18 2 10 10 5 15

Réplica 3 18 2 10 10 7 13

Réplica 4 15 5 12 8 8 12

Promedio 16,7 3,3 10,8 9,2 6,3 13,7

Número de Placas 0,56 ppm 1,0 ppm Control (0,0 ppm)

Concentración NATURAL CLEANER (ppm) Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas

Réplica 1 3 17 2 18 20 0

Réplica 2 5 15 3 17 20 0

Réplica 3 4 16 2 18 20 0

Réplica 4 4 16 3 17 20 0

Promedio 4 16 2,5 17,5 20 0

b) Observaciones

Concentración 0,10 ppm – 96 h Se observaron 17 ejemplares vivos en promedio y 4 muertos (promedio). Los ejemplares vivos presentaron una natación lenta, aunque sin problemas de movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

Concentración 0,18 ppm – 96 h Se observaron 11 ejemplares vivos en promedio y 9 muertos (promedio). Los ejemplares vivos presentaron una escasa natación con signos de pérdida de movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

Concentración 0,32 ppm – 96 h Se observaron 6 ejemplares vivos en promedio y 14 muertos (promedio). Los ejemplares vivos presentaron una natación muy lenta, con evidentes problemas de movilidad en periópodos y anténulas. Como en las otras concentraciones, los muertos se encontraban totalmente inmóviles, con abdomen y anténulas curvadas.

Concentración 0,56 ppm - 96 h La situación de los ejemplares de esta concentración fue muy similar a los sometidos a 0,32 ppm. Los 4 ejemplares vivos (promedio) presentaron una natación muy lenta, con escasa movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos no presentaban movilidad alguna, abdomen y anténulas curvadas, setas de periópodos rígidas y adheridas unas con otras.

Concentración 1,0 ppm – 96 h Los 3 ejemplares vivos (promedio) presentaron escasa natación (muy lenta), con problemas evidentes de movilidad en periópodos y anténulas. Los muertos no presentaban movilidad alguna, abdomen y anténulas curvadas, setas de periópodos rígidas y adheridas unas con otras. c) Cálculo de EC50 Los resultados de la Tabla 5 fueron utilizados para efectuar el cálculo del EC50. El análisis estadístico entregado por el programa Probit indica la siguiente información para las 96 horas:

2 para Heterogeneidad (calculado) = 1,274

2 para Heterogeneidad (valor tabulado a un nivel de 0,05) = 7,815

Por tanto, es posible utilizar el método de Probit paramétrico. Los detalles de la curva resultante fueron los siguientes: µ = -0, 643408

= 0, 474252 Parámetro Estimado Error Estándar LC (95%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Intercepto 6,356680 0,274583 (5,818497; 6,894863) Pendiente 2,108584 0,430305 (1,265185; 2,951982) Finalmente, en la Tabla 6 se detallan los resultados de los cálculos de las EC a las 96 horas.

Tabla 6 EC – 96 h obtenidas de los ensayos de toxicidad crónica para NATURAL CLEANER.

Los resultados se expresan en mg/l o ppm.

Punto

Concentración Expuesta (ppm)

EC 1.00 0,018

EC 5.00 0,038

EC 10.00 0,056

EC 15.00 0,073

EC 50.00 0,227

EC 85.00 0,705

EC 90.00 0,921

EC 95.00 1,370

EC 99.00 2,883

De lo anterior se desprende que el EC50 – 96 h para NATURAL CLEANER determinada a través de los bioensayos con H. littoralis de 0,227ppm.

IV. CONCLUSIONES Los estudios antes detallados permiten concluir:

Los bioensayos de toxicidad aguda utilizando H. littoralis para el compuesto NATURAL CLEANER determinaron un LC50 - 48 h para este compuesto de 0,349 ppm.

Los bioensayos de toxicidad aguda utilizando H. littoralis para el compuesto NATURAL CLEANER determinaron un LC50 - 96 h para este compuesto de 0,227 ppm.

Los bioensayos de toxicidad crónica utilizando H. littoralis para el compuesto NATURAL CLEANER determinaron un EC50 para este compuesto de 0,277 ppm. Este resultado es coherente con lo hallado en las pruebas agudas efectuadas (LC50 - 96 h), siendo en este caso ambas concentraciones concordantes.

De acuerdo a los resultados obtenidos, han de utilizarse todas las medidas indicadas en el acápite MODO DE EMPLEO de la Hoja Técnica de NATURAL CLEANER en el caso de utilizar este producto a concentraciones superiores al LC50 - 96 h y al EC50 calculados.

Los resultados obtenidos en los bioensayos crónicos y agudos reflejan claramente la capacidad detergente (súper concentrado) de NATURAL CLEANER, siendo recomendable para los ámbitos de aplicación entregados por el fabricante, es decir, detergente para la industria de alimentos de alimentos.

V. RESPONSABILIDAD DE LOS ENSAYOS Los ensayos y pruebas de laboratorio fueron realizados en el Laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales entre los días 10 de Marzo al 10 de Abril del 2010 bajo la dirección del profesor Dr. Humberto Díaz Oviedo (Ph. Cs. Ingeniería m. Biotecnología) y la ejecución del Sr. Luis Rodríguez Siclari, Ayudante de Laboratorio, quien además estuvo a cargo del acondicionamiento de los especimenes en la sala de acuarios de la Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales para los ensayos de toxicidad. El apoyo logístico para la realización de este estudio fue proporcionado por el Sr. Julio Jara, Coordinador Administrativo de la Facultad. Se entrega el presente informe a petición del interesado para ser presentado a quien corresponda.

VI. BIBLIOGRAFÍA CITADA Y CONSULTADA APHA (American Public Health Association). 1989. Toxicity Test Methods for

Aquatic Organisms, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17th ed., Washington, DC, Part 8000.

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Dr. Humberto Díaz O. Laboratorio de Bioensayos Facultad de Ciencias del Mar y de Recursos Naturales Universidad de Valparaíso

Viña del Mar, 09 de Abril de 2010