EVALUACIÓN DE NUEVAS SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS …

EVALUACIÓN DE NUEVAS SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA

LA DETECCIÓN DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y

AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BUCARAMANGA, SANTANDER

2018

EVALUACIÓN DE NUEVAS SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA

LA DETECCIÓN DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS

MARIA ANGELICA SANMIGUEL TARAZONA

Trabajo de grado

presentado como requisito para optar al título de

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

DIRECTOR

WILFREDO VALDIVIESO QUINTERO, Msc.

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y

AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BUCARAMANGA, SANTANDER

2018

I

DEDICATORIA

A Dios por haberme permitido llegar a este punto y concederme salud,

sabiduría y perseverancia para lograr mis objetivos.

A mis padres María E. Tarazona y Carlos Sanmiguel, por ser el pilar

fundamental de mi vida, ellos quienes han sido mi guía y mi apoyo

incondicional, han formado una persona llena de valores y buenos

principios, capaz de hacer todo lo que se proponga, gracias por darme una

carrera profesional para mi futuro, todo esto se lo debo a ustedes.

A mi abuela Angelica Reyes de Sanmiguel, quien me ha cuidado por

siempre y se ha preocupado por mí.

A mi hermano Andrés Sanmiguel por sus consejos y apoyo.

II

AGRADECIMIENTOS

El autor expresa sus más sinceros agradecimientos a:

El director del presente trabajo de grado MSc. Wilfredo Valdivieso, por

brindarme la oportunidad de ser parte de su grupo de trabajo y poder

vincularme a su semillero, por instruirme sobre biología molecular, por

compartirme sus conocimientos, por su acompañamiento, dedicación,

sabiduría, disponibilidad, asesoría, por tenerme paciencia, confianza y

creer en mí. Por ser un excelente ser humano y gran profesional.

El MSc. Miguel Suarez y MSc. Nohora Juliana Rueda por la ayuda brindada

para poder revelar los resultados del trabajo de grado y por los consejos.

El semillero MicroMol por acogerme y ofrecerme la oportunidad de

aprender sobre biología molecular. A los integrantes del semillero

Candelaria y Alejandra por enseñarme, ayudarme y apoyarme.

El semillero Mikrosostenible por impulsarme a investigar, y por haberme

ayudado a obtener habilidades en el área de la microbiología.

A mis compañeros y amigos Nathalia, Juliana, María Cristina, Diego y

Edgar por brindarme su amistad y apoyo. A los docentes que depositaron

sus conocimientos y creyeron en mí.

A la Universidad de Santander por permitirme el desarrollo de mi trabajo de

grado, y poder contar con la disposición de instalaciones, equipos,

materiales y reactivos.

III

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN _________________________________________ 1

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA _________________________ 4

3. JUSTIFICACIÓN _________________________________________ 6

4. HIPÓTESIS _____________________________________________ 7

5. OBJETIVOS ____________________________________________ 8

5.1 Objetivo general ________________________________________ 8

5.2 Objetivos específicos ____________________________________ 8

6. MARCO TEÓRICO _______________________________________ 9

6.1 Bacterias sulfato reductoras _______________________________ 9

6.2 Metabolismo de las BSR _________________________________ 10

6.3 BSR y su impacto en la Industria __________________________ 13

6.4 Afectación de las BSR en la Industria de Petróleo _____________ 15

6.4.1 Corrosión en sistemas de transporte. ___________________ 15

2.4.1.1 Sweet corrosión (CO2 corrosión). ___________________ 16

2.4.1.2 Corrosión ácida (corrosión H2S). ____________________ 17

2.4.1.3 Corrosión por oxigeno (O2). ________________________ 18

2.4.1.4 Corrosión de grietas. _____________________________ 18

2.4.1.5 Corrosión por erosión. ____________________________ 19

2.4.1.6 Corrosión galvánica. _____________________________ 19

2.4.1.7 Corrosión bajo tensión. ___________________________ 19

6.4.2 Corrosión inducida por microorganismos (MIC) o Biocorrosión.

______________________________________________________ 20

6.4.3 Clasificación de las BSR. _____________________________ 21

6.4.3.1 Desulfovibrionaceae. _____________________________ 21

6.4.3.2 Desulfobacteriaceae. _____________________________ 22

6.4.3.3 Gram negativas mesófilas. ________________________ 22

6.4.3.4 Gram positivas formadoras de esporas. ______________ 22

IV

6.5 Métodos para la detección de bacterias sulfato reductoras ______ 24

6.5.1 Microbiológicos. ____________________________________ 24

6.5.1.1 Técnica de número más probable (NMP). ____________ 24

6.5.1.2 Medio de cultivo BSR 10. _________________________ 24

6.5.1.3 Prueba BART. __________________________________ 25

6.5.2 Enzimáticos. _______________________________________ 26

6.5.2.1 Kit QuickChekTM BSR. ____________________________ 26

6.5.2.2 RapidChek® II SRB Test Kit. _______________________ 27

6.5.3 Basados en el ADN. _________________________________ 27

6.5.3.1 Lista de oligonucleótidos diseñados. _________________ 28

7. METODOLOGÍA ________________________________________ 32

7.1 Ubicación ____________________________________________ 32

7.2 Diseño del estudio______________________________________ 32

7.3 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos. ___ 32

7.3.1 Análisis en BLAST. __________________________________ 32

7.4 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA

utilizando PCR. ___________________________________________ 33

7.4.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 33

7.4.2 Extracción de ADN. _________________________________ 34

7.4.3 Detección molecular (gen 16s). ________________________ 34

7.4.3.1 Agua de producción. _____________________________ 35

7.4.4 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ____ 35

7.4.4.1 Prueba de amplificación con diferentes polimerasas. ____ 36

7.4.5 Condiciones base para la amplificación del gen dsrA. ______ 36

7.4.5.1 Temperaturas de hibridación y concentración de

oligonucleótidos. ______________________________________ 37

7.5 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 37

7.6 Límite de detección _____________________________________ 38

8. RESULTADOS _________________________________________ 39

8.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos _____ 39

V


utilizando PCR. ___________________________________________ 42


8.2.2 Detección molecular (gen 16s) ________________________ 43

8.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ________ 43

8.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de

oligonucleótidos. ________________________________________ 43



9. DISCUSIÓN ____________________________________________ 46

9.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos _____ 46


utilizando PCR. ___________________________________________ 48


9.2.2 Detección molecular (gen 16s) ________________________ 49

9.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ________ 50


oligonucleótidos. ________________________________________ 50



10. CONCLUSIONES _____________________________________ 54

11. RECOMENDACIONES _________________________________ 55

12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________ 56

13. ANEXOS ____________________________________________ 63

VI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Árbol de evolución de bacterias reductoras de sulfato basado en

la diversidad de rRNA 16S. Recuperado de: Wagner, et al (1998). _____ 9

Figura 2. Ruta del metabolismo del sulfuro descrita en las bases de datos

de KEEG. Recuperado de: KEGG PATHWAY (2018). ______________ 11

Figura 3. Esquema general de la ruta de desasimilativa del sulfato.

Recuperado de: Friedrich (2002). _______________________________ 12

Figura 4. Vínculos del sector petrolero en la economía nacional de

Colombia. Recuperado de: López et al, (2013).____________________ 14

Figura 5. Corrosión por picadura. Recuperado de: Popoola et al. (2013).

_________________________________________________________ 17

Figura 6. Tubería con corrosión acida. Recuperado de: Popoola et al.

(2013). ____________________________________________________ 17

Figura 7. Corrosión inducida por oxígeno. Recuperado de: Popoola et al.

(2013). ____________________________________________________ 18

Figura 8. Corrosión por grietas. Recuperado de: Popoola et al. (2013). 19

Figura 9. Corrosión causada por microorganismos. Recuperado de:

Popoola et al. (2013). ________________________________________ 20

Figura 10. Mecanismo de las bacterias sulfato reductoras en el acero.

Recuperado de: Makhlouf et al. (2018). __________________________ 21

Figura 11. Diferentes formas celulares de las bacterias sulfato reductoras.

Recuperado de: Sánchez (2005). _______________________________ 23

Figura 12. Controles positivos y negativo del medio de cultivo BSR.

Recuperado de: Aqualab (2015). _______________________________ 25

Figura 13. Dilución por extinción. Recuperado de: Aqualab (2015). ____ 25

Figura 14. Prueba BART. Recuperado de: (HACH, s.f.). ____________ 26

Figura 15. Kit QuickChekTM BSR. Recuperado de: (ANSAC, s.f.). _____ 26

Figura 16. Alineamientos múltiples locales de los oligonucleótidos

potenciales para amplificar el gen dsrA, con las secuencias de las BSR

VII

prevalentes en sistemas de producción y transporte de petróleo. Programa

Bioedit, algoritmo ClustalW. ___________________________________ 41

Figura 17. Formación de heterodímeros de los oligonucleótidos control. 41

Figura 18. Productos de la amplificación por PCR del gen 16S del ADN de

Desulfovibrio vulgaris. ________________________________________ 43

Figura 19. Optimización de condiciones de PCR para los oligonucleótidos

de referencia para el gen dsrA y los evaluados en este trabajo. _______ 43

Figura 20. Especificidad de oligonucleótidos evaluados. ____________ 44

Figura 21. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen

dsrA con los oligonucleótidos control. ___________________________ 45

Figura 22. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen

dsrA con los oligonucleótidos en evaluación. ______________________ 45

VIII

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Ingresos y valor de mercado del Petróleo de las principales

compañías del mundo en el año 2017. Recuperado de: (Colmen, 2017). 13

Tabla 2. Lista de los oligonucleótidos reportados por literatura para detectar

bacterias sulfato reductoras. __________________________________ 28

Tabla 3. Lista de los oligonucleótidos capaces de detectar BSR al amplificar

el gen dsrA utilizando PCR. ___________________________________ 39

Tabla 4. Microorganismos que presentaron alineamientos significativos con

los oligonucleótidos potenciales para amplificar el gen dsrA. _________ 39

Tabla 5. Propiedades termodinámicas de los oligonucleótidos. _______ 41

Tabla 6. Sondas de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento

del gen dsrA. _______________________________________________ 42

Tabla 7. Concentración de ADN extraído para los microorganismos de

referencia (tres mediciones). __________________________________ 42

IX

LISTA DE ANEXOS

Anexo A. Alineamientos significativos de microorganismos obtenidos en

el análisis de BLAST con los oligonucleótidos. ____________________ 63

Anexo B. Propiedades termodinámicas de los posibles oligonucleótidos.

_________________________________________________________ 64

Anexo C. Alineamiento múltiple local de oligonucleótidos control. _____ 64

Anexo D. Fragmento de la secuencia de Desulfovibrio vulgaris (ATCC

29579) con los alineamientos locales de los oligonucleótidos control. __ 65

Anexo E. Combinaciones de los oligonucleótidos para determinar el

tamaño de amplificación y la formación de homodímeros y heterodímeros.

_________________________________________________________ 66

Anexo F. Especificidad de reconocimiento de los oligonucleótidos pre-

seleccionados con respecto las BSR. ___________________________ 71

Anexo G. Especificidad de reconocimiento primer 2. _______________ 71

X

LISTA DE ABREVIATURAS

BSR Bacterias sulfato reductoras

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

dsrA Gen que codifica la subunidad alfa de la enzima

desasimilativa sulfito reductasa

DSV Desulfovibrio vulgaris

XI

RESUMEN

Título: Evaluación de nuevas sondas de oligonucleótidos para la detección

de bacterias sulfato reductoras.

Autores: Sanmiguel Tarazona María Angelica.

Palabras clave: Bacterias sulfato reductoras, Oligonucleótidos, gen dsrA,

PCR.

Descripción: Las bacterias sulfato reductoras son las principales

causantes de la corrosión inducida por microorganismos en la industria

petrolera debido a que generan ácido sulfhídrico y de este modo se ven

afectados estructuras, equipos y maquinarias de metal, así como el crudo

mismo, ocasionando daños y pérdidas económicas. La enzima responsable

de la reducción desasimilatoria del sulfato es codificada por diferentes

genes, entre ellos el más estudiado el gen dsrA, utilizado para la detección

y cuantificación de estas bacterias. En este trabajo se estandarizó la técnica

de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del gen

dsrA, utilizando nuevos oligonucleótidos diseñados previamente por el

joven investigador Karen Angarita. Para esto, se hizo un análisis “in silico”

de los oligonucleótidos control y los oligonucleótidos con potencial para

amplificar el gen de interés, se evaluaron tres polimerasas diferentes y se

determinaron los respectivos límites de detección. Los productos

amplificados se analizaron mediante geles de agarosa al 1,5 %. Como

control positivo se usó el ADN genómico de Desulfovibrio vulgaris (ATCC

29579). Los resultados muestran que los oligonucleótidos diseñados tienen

el potencial de ser utilizados para detectar bacterias sulfato reductoras,

dado que no mostraron amplificación del ADN de otras posibles bacterias

presentes en muestras de interés en la industria del petróleo y con un límite

de detección de 1×10−5 ng de ADN de Desulfovibrio vulgaris.

XII

ABSTRACT

Title: Evaluation of new oligonucleotides probes for the detection of sulfate

reducing bacteria.

Authors: Sanmiguel Tarazona María Angelica.

Key words: Sulfate reducing bacteria, oligonucleotides, gene dsrA, PCR.

Description: Sulfate reducing bacteria are the main cause of corrosion

induced by microorganisms in the oil industry because they generate sulfide

acid and thus are affected structures, equipment and machinery of metal,

as well as crude causing damage and economic losses. The enzyme

responsible for the reduction of sulfate disassimilation is encoded by

different genes, including the most studied gene dsrA, used for the detection

and quantification of these bacteria. In this work, was standardized the

polymerase chain reaction (PCR) technique for the detection of the DsrA

gene, using new oligonucleotides previously designed by the young

investigator Karen Angarita. For this, an analysis was made "in silico" of the

control oligonucleotides and the oligonucleotides with potential to amplify

the gene of interest, three different polymerases were evaluated, and the

respective detection limits were determined. The amplified products were

analyzed using agarose gels at 1.5%. The genomic DNA of Desulfovibrio

vulgaris (ATCC 29579) was used as a positive control. The results show

that the oligonucleotides designed have the potential to be used to detect

sulfate reducing bacteria, since they showed no DNA amplification of other

possible bacteria present in samples of interest in the industry Oil and with

a detection limit of 1×10−5 ng of Desulfovibrio vulgaris DNA.

1

1. INTRODUCCIÓN

Las bacterias sulfato reductoras son microorganismos anaerobios estrictos

presentes en una amplia variedad de ambientes, tales como suelos, lodos

de estuarios, aguas dulces, aguas de alcantarillado, aguas marinas, aguas

termales, áreas geotermales, depósitos de sulfuro, pozos petroleros y de

gas, y también como comensales del intestino de mamíferos e insectos

(Mardhiah, Yahaya, Bakar, & Noor, 2014).

Este grupo de bacterias es reconocido por la capacidad de oxidar

compuestos orgánicos como el lactato (C3H6O3) o hidrógeno (H2) y

acoplarlo a la reducción del sulfato (SO42-) a ácido sulfhídrico (H2S) con el

fin de obtener la energía suficiente para sintetizar ATP, esta reacción se

conoce como la reducción desasimilatoria del sulfato (Rabus, Hansen, &

Widdel, 2006).

El ácido sulfhídrico, es producto del metabolismo energético, es una de las

principales razones que justifica el estudio de estos microorganismos

debido a que esta molécula ha sido asociada al proceso de corrosión

microbiológica en sistemas de transporte en la industria petrolera.

La reducción desasimilatoria es catalizada por la enzima sulfito

reductasa (Código EC: 1.8.99.5), la cual está constituida por una estructura

terciaria, compuesta por dos subunidades α (alfa) y β (beta), codificada por

los genes dsrA y dsrB. De estos genes el dsrA ha sido

ampliamente estudiado dado que presenta segmentos conservados en su

secuencia de ADN (Dhillon, Teske, Dillon, Stahl, & Sogin, 2003). Estas

características lo han convertido en un marcador útil para la detección y

cuantificación de estas poblaciones en diferentes tipos de muestras como

aguas de producción, sedimentos y drenaje de minas (Cook, Whitehead,

Spence, & Cotta, 2008).

2

En la industria petrolera, las BSR inducen una doble afectación: I) son

responsables de la corrosión y el taponamiento de los sistemas de

transporte y otras estructuras metálicas (Kleyböckera, et al., 2017) e II)

inducen cambios en las propiedades del crudo transportado, adicionando

compuestos parafínicos que disminuyen la calidad (Stott, 2018).

Según Itävaara (2008) la corrosión de las superficies metálicas es causada

por la actividad metabólica de microorganismos que usa metales como

aceptores de electrones, lo cual incluye el proceso de reducción

desasimilatoria de sulfato como un posible agente causal de la corrosión

en la industria petrolera.

La presencia de estos microorganismos esta principalmente asociada a los

sistemas de tratamiento de agua, especialmente en las tuberías de

producción de petróleo y en las tuberías de inyección de agua, estas

tuberías son eliminadas por problemas de corrosión interna a causa de la

corrosión microbiológica, esto ocasiona pérdidas económicas anuales

aproximadamente de 26 mil millones de pesos (ASEDUIS, 2013), lo cual

impulsa la necesidad de estudiar métodos de detección oportunos para su

control y prevención.

Un buen número de especies pertenecientes a los órdenes

de Desulfovibrionales y Desulfobacterales han sido identificadas en

ambientes petroleros (Guan, 2013), y esta pluralidad es la que dificulta la

detección por métodos rápidos, los cuales ofrecen una baja sensibilidad y

especificidad cuando se utilizan en diferentes campos petroleros (Eckert &

Skovhus, 2018). Actualmente los métodos más utilizados para la detección

de BSR en campos petroleros de Colombia son microbiológicos, que

dependen de la capacidad de adaptación de los microorganismos a los

medios de cultivo utilizados, y además el tiempo de entrega de resultados

que puede estar desde semanas o meses (Ben-dov, Brenner, & Kushmaro,

2007).

Por esto, se hace importante identificar las principales especies reportadas

en campos petroleros colombianos y con base en esta información diseñar

3

estrategias específicas y sensibles como las basadas en la PCR para

permitir una detección rápida y sensible de estos microorganismos basados

en el gen que codifica la subunidad alfa (dsrA).

4

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las BSR son causantes de problemas en la industria petrolera colombiana,

puesto que pueden afectar de forma directa e indirecta la integridad de

materiales metálicos empleados en los campos de explotación como

tuberías, máquinas de bombeo, estructuras y tanques de almacenamiento

provocando corrosión microbiológica (Ruiz, Duque, & Aperador, 2016).

Debido al ambiente anoxigénico las BSR pueden llevar acabo sus procesos

metabólicos, los cuales implican la reducción de sulfato a ácido sulfhídrico,

que de forma directa afectan el metal por medio de la producción del H2S,

porque provoca la corrosión microbiológica o biocorrosión. Y de forma

indirecta por medio de su metabolismo tienen la capacidad de generar

metabolitos secundarios los cuales son capaces de formar depósitos

incrustantes y esto genera dificultades en el intercambio de fluidos en las

tuberías, lo cual afecta la eficiencia (Santegoeds CM, 1998). También

generan contaminación de los productos del petróleo y aumenta los niveles

de azufre (Chavez, 2008).

Los estudios relacionados para la identificación y caracterización de las

BSR tienen un alto grado de dificultad, porque la manipulación de dichas

bacterias por técnicas convencionales microbiológica tienen una tasa de

crecimiento bacteriano tardío (Ben-dov, Brenner, & Kushmaro, 2007) y

algunas bacterias no crecen de forma in vitro, debido a que los medios de

cultivo no brindan las condiciones óptimas para su crecimiento (Chavez,

2008).

Debido a las complicaciones en sus cultivos, las BSR son más accesibles

a ser identificadas por métodos moleculares, mediante el análisis de los

ácidos nucleicos, empleando marcadores, como el gen 16S o usando

sondas de oligonucleótidos para amplificar el gen dsrA que codifica la

subunidad α de la enzima 2 desasimilativa sulfito reductasa, encargada de

catalizar la reducción del (bi) sulfito a sulfuro (Spence C, 2008).

5

Ben-dov et al, (2007) utilizaron sondas de oligonucleótidos con la

competencia de identificar y cuantificar al menos cuarenta y dos

microorganismos con la presencia del gen dsrA. Pero se generó la

necesidad de evaluar nuevas sondas de oligonucleótidos diseñadas por el

laboratorio de Biotecnología, que tienen la posible capacidad de detectar

BSR que se encuentren presentes en los sistemas de producción y

transporte de petróleo en Colombia.

Por lo anterior, en esta investigación se planteó la siguiente pregunta:

¿Pueden los oligonucleótidos diseñados por el laboratorio permitir la

detección de BSR en bacterias modelo con un mayor límite de detección

que los oligonucleótidos utilizados convencionalmente?

6

3. JUSTIFICACIÓN

Teniendo en cuenta la problemática causada por las BSR en la industria

del petróleo, es indispensable fomentar el uso de herramientas en biología

molecular que presentan una alternativa promisoria más rápida para la

detección, identificación y cuantificación de las BSR, con una mayor

sensibilidad y en menores tiempos de respuesta (Eckert & Cookingham,

2002).

El mejorar los sistemas de detección de las bacterias sulfato reductoras

ayudaría a identificar oportunamente la presencia y multiplicación de estos

microorganismos con lo cual se pueden diseñar mejores y más oportunos

sistemas de prevención, intervención y control que derivarán en la mejora

de la integridad de equipos, en la seguridad industrial y del personal

involucrado en los procesos de producción y transporte, cumplimiento con

regulaciones ambientales, reducción de costos de mantenimiento y

conservación de la calidad del crudo transportado (Eckert & Skovhus,

2018).

7

4. HIPÓTESIS

H1: Los oligonucleótidos diseñados por el laboratorio permiten la detección

del ADN de bacterias sulfato reductoras en concentraciones menores que

los oligonucleótidos usados convencionalmente cuando son utilizados en

microorganismo modelo.

H0: Los oligonucleótidos diseñados por el laboratorio permiten la detección

de ADN de bacterias sulfato reductoras en concentraciones similares o

menores a las obtenidas con oligonucleótidos usados convencionalmente

cuando son utilizados en microorganismos modelo.

8

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

✓ Evaluar nuevas sondas de oligonucleótidos para la detección de

bacterias sulfato reductoras.

5.2 Objetivos específicos

✓ Seleccionar por medio de herramientas de bioinformática los

oligonucleótidos con mejores características para la amplificación

del gen dsrA de bacterias sulfato reductoras.

✓ Identificar las mejores condiciones de detección de ADN de BSR por

medio de la PCR utilizando los oligonucleótidos seleccionados.

✓ Determinar el límite de detección de ADN de bacterias modelo por

medio de la técnica de PCR.

9

6. MARCO TEÓRICO

6.1 Bacterias sulfato reductoras

Las Bacterias Sulfato Reductoras (BSR) son un grupo de microorganismos

metabólicamente versátiles provenientes de varias familias y diferentes

géneros (Sanchez, 2005). Se han detectado más de 150 especies de

bacterias reductoras de sulfato, y están divididas en 40 géneros (Garrity,

Bell, & Lilburn, 2004).

Las BSR cuando se encuentran en condiciones anaeróbicas, utilizan sulfato

como aceptor de electrones terminal en la degradación de la materia

orgánica, lo que resulta en la producción de ácido sulfhídrico que es un

compuesto altamente reactivo, corrosivo y muy tóxico. Las BSR se

encuentran principalmente en ambientes anóxicos, pero también se

pueden encontrar en las interfaces de ambientes anóxicos (Loy, 2003).Se

han dividido en seis grupos taxonómicos diferentes en función de su

diversidad filogenética (figura 1).

Figura 1. Árbol de evolución de bacterias reductoras de sulfato basado en la diversidad

de rRNA 16S. Recuperado de: Wagner, et al (1998).

10

6.2 Metabolismo de las BSR

La mayoría de los BSR son degradadores de la materia orgánica, también

existen especies autótrofas que pueden fijar el CO2 y utilizar el hidrógeno

como fuente de energía en sus procesos metabólicos. Algunas especies

pueden ser capaces de fijar nitrógeno y reducir el fosfito a fosfato (Schink

& Friedrich, 2000). Asimismo, tienen la capacidad para reducir el nitrato

(NO3) a dióxido de nitrógeno (NO2), también se ha demostrado que el

oxígeno es un aceptor de electrones potencial a bajas concentraciones, a

pesar de que las BSR se han considerado especies estrictamente

anaeróbicas (Rabus, Hansen, & Widdel, 2006). Las BSR utilizan una

variedad de compuestos inorgánicos de azufre como aceptores de

electrones tales como azufre elemental (S), sulfito (SO3), y el tiosulfato

(S2O3 2-).

Las BSR obtienen energía para la síntesis celular y el crecimiento,

acoplando la oxidación de compuestos orgánicos a la reducción de sulfato,

como aceptor final de electrones para generar el H2S. Este proceso es

conocido como reducción desasimilativa, el ácido sulfhídrico es producido

en el interior celular y luego es expulsado al ambiente; mientras que, en el

proceso asimilativo, el ácido sulfhídrico es inmediatamente transformado

en compuestos orgánicos de azufre (figura 2), para la formación de

aminoácidos y proteínas (Jong & Parry, 2006).

11

Figura 2. Ruta del metabolismo del sulfuro descrita en las bases de datos de KEEG.

Recuperado de: KEGG PATHWAY (2018).

En la reducción del sulfato de forma desasimilativa ha sido estudiada

especialmente en especies de Desulfovibrio, para realizar este proceso son

necesarias tres enzimas citoplasmáticas para reducir ocho electrones, la

ATP sulfurilasa (2.7.7.4), APS reductasa (1.8.99.2) y la sulfito reductasa

(1.8.99.5) (Barton & Fauque, 2009).

El sulfato es un ion estable que para ser reducido se debe activar. En la

figura 3, la enzima ATP sulfurilasa cataliza la unión del ion sulfato a un

grupo fosfato adenosina trifosfato (ATP), de este modo se forma adenosina

5-fosfosulfato (APS), seguidamente la enzima APS reductasa procede a

realiza la reducción del APS a sulfito (S032-) y se libera el adenosín

monofosfato (AMP) (Madigan, 2009).

12

La reducción del sulfito a ácido sulfhídrico (H2S), se puede realizar por la

vía metabólica que es la reducción directa de seis electrones, la cual es

catalizada por medio de la enzima sulfito reductasa, que es codificada por

el gen dsrA o dsrB, cuya subunidades son y , han sido ampliamente

usadas como marcadores moleculares, para identificar, detectar y

cuantificar bacterias sulfato reductoras (Moreau, Zierenberg, & Banfield,

2010).

Figura 3. Esquema general de la ruta de desasimilativa del sulfato. Recuperado de:

Friedrich (2002).

Como producto del metabolismo desasimilativo se obtiene el ácido

sulfhídrico, el cual es un factor de importancia en la industria del petróleo y

el gas y que afecta las superficies de los metales. El H2S es producido por

el proceso metabólico de las bacterias anaeróbicas. Las bacterias y el

sulfato producirán un proceso electroquímico donde el sulfato se reduce a

ácido sulfhídrico corrosivo. El H2S es un gas fuerte con altas

concentraciones de hidrógeno que se difunde en el metal a través de los

límites del grano, disminuyendo la ductilidad del metal haciéndolo

quebradizo y eventualmente agrietándose (Ossai, Boswell, & Davies,

2015).

13

6.3 BSR y su impacto en la Industria

El petróleo ha jugado un papel importante en la historia social, económica

y política del mundo, debido a que las industrias petroleras son una

importante fuente de ingresos para los países con yacimientos petrolíferos.

Estas industrias exportan a diferentes países del mundo, dado que la

mayoría de las economías dependen de las formas de energía como el

carbono, el petróleo y los productos derivados del petróleo, obteniendo

ingresos para los países y proporcionando empleo a sus ciudadanos. La

formación de petróleo ocurre por varios hidrocarburos que se combinan con

ciertos minerales como el azufre bajo presión extrema (Nielsen & Hejny,

2003).

La producción mundial de petróleo ha venido incrementándose

paulatinamente a través de los años, y es ligeramente superior a la

demanda. Los ingresos anuales en el año 2017 y el valor en el mercado del

petróleo (fabla 1) demuestra que Estados Unidos es el mayor productor de

petróleo y gas del mundo, liderando con la compañía ExxonMobil (Colmen,

2017).

Tabla 1. Ingresos y valor de mercado del Petróleo de las principales compañías del mundo

en el año 2017. Recuperado de: (Colmen, 2017).

Rango Nombre de la compañía Ingresos

2017 (US$

billón)

Valor del

mercado ($

billón)

1 Exxon Mobil (Estados

Unidos)

236.8 363.3

2 Petro China (China) 274.6 203.8

3 Chevron (Estados Unidos) 129.9 192.3

4 Total (France) 143.4 121.9

5 Sinopec (China) 283.6 89.9

6 Royal Dutch Shell

(Netherlands)

264.9 210

7 Gazprom (Rusia) 102.1 57.1

14

8 Rosneft (Rusia) 80.08 51.1

9 Reliance Industries (India) 42.2 50.6

10 LukOil (Rusia) 90.4 36.8

Existe una entidad fundada para coordinar y unificar las políticas petroleras

respectivas, con el fin de acordar las acciones más convenientes, y

determinar los medios más idóneos de resguardar, colectivamente e

individual los intereses de los estados miembros (Zanoni, 2010), es

conocida como Organización de Países Exportadores de Petróleo (OPEP),

los países que actualmente forman parte de esta entidad son los

siguientes: Argelia, Angola, Arabia Saudita, Katar, Ecuador, Emiratos

Árabes Unidos, Gabón, Guinea Ecuatorial, Irán, Irak, Kuwait, Libia, Nigeria,

Venezuela (OPEP, 2018). También existe los países NO OPEP entre los

cuales se encuentran: Azerbaiyán, Baréin, México, Guinea Ecuatorial,

Kazajistán, Malasia, Omán, Rusia, Sudán, Sudán del Sur.

En Colombia históricamente la actividad petrolera fue construyendo

múltiples relaciones con la economía nacional, la renta petrolera de nuestro

país se distribuye entre el Estado colombiano y el sector privado, la

empresa estatal productora de petróleo en Colombia es Ecopetrol. Los

ingresos del sector productor de petróleo y gas se originan en las

exportaciones y ventas internas de crudo y gas (figura 4).

Figura 4. Vínculos del sector petrolero en la economía nacional de Colombia.

Recuperado de: López et al, (2013).

15

El país exporta sus excedentes de producción después de satisfacer la

demanda interna de petróleo, la cual se carga principalmente en las

refinerías principales las cuales son Barrancabermeja y Cartagena con el

fin de obtener los productos refinados necesarios para suplir la demanda

interna. Desde los últimos 10 años, la demanda de las refinerías locales se

ha mantenido relativamente estable, con lo cual las ventas externas de

crudo colombiano han dependido del volumen adicional producido y los

precios internacionales (Lopez, Montes, Garavito, & Collazos, 2013).

6.4 Afectación de las BSR en la Industria de Petróleo

Las BSR por medio de su metabolismo además de causar corrosión

microbiológica, también causa acidificación (agriamento) del crudo de

petróleo, es debido a la producción indeseable del ácido sulfhídrico,

problema común durante la recuperación de petróleo cuando se inyecta

agua de inundación para producir algún subproducto (Hubert & Voordouw,

2007).Estas operaciones de inundación de agua, se inyecta en el fondo del

pozo para volver a presurizar el depósito después de la presión natural y

para barrer el aceite hacia los pozos de producción, de este modo se

extiende la vida de producción de un yacimiento petrolífero. Esto lleva al

aumento de las concentraciones de sulfuro en el agua, el aceite, y gas

(Gieg, Jack, & Foght, 2011).

6.4.1 Corrosión en sistemas de transporte.

La corrosión es un problema común que se encuentra en la industria del

petróleo y el gas, afectando las tuberías de petróleo y gas, las refinerías y

las plantas petroquímicas. La corrosión en la industria del petróleo y el gas

generalmente es causada por el agua, el dióxido de carbono (CO2) y el

ácido sulfhídrico (H2S), y también puede agravarse por la actividad

microbiológica (Mohammed Nuri & Kannan, 2014).

16

El impacto de la corrosión en la industria petrolera se ha visto afectada en

términos de gastos de capital, gastos operacionales, de salud, seguridad y

medio ambiente. Según la Asociación Nacional de Ingeniería de la

Corrosión (NACE), la industria está tomando la mayor parte del gasto total

en solucionar los problemas relacionados con la corrosión en los Estados

Unidos, lo cual tiene un costo anual de $1.372 mil millones del monto total,

la industria está gastando $589 millones en tuberías de superficie y costo

de planta, $463 millones anuales en tubería de fondo de pozo y $320

millones en todo lo demás relacionado con la corrosión. Este es un

problema económico que está afectando la estabilidad de la industria y

poniendo en riesgo la vida de los empleados (Makhlouf, Herrera, & Muñoz,

2018). Los tipos de corrosión son:

2.4.1.1 Sweet corrosión (CO2 corrosión).

La corrosión por CO2 ha sido un problema reconocido en las instalaciones

de producción y transporte de petróleo y gas durante muchos años. El CO2

es uno de los principales agentes de corrosión en los sistemas de

producción de petróleo y gas (Nalli, 2010). El gas CO2 seco no es en sí

mismo corrosivo a las temperaturas encontradas en los sistemas de

producción de petróleo y gas, pero sí cuando se disuelve en una fase

acuosa a través de la cual puede promover una reacción electroquímica

entre el acero y la fase acuosa en contacto (Popoola, Grema, Latinwo,

Gutti, & Balogun, 2013). El CO2 se mezclará con el agua, formando ácido

carbónico (H2CO3), haciendo que el fluido sea ácido. La corrosión por CO2

está influenciada por la temperatura, aumento en el valor del pH,

composición de la corriente acuosa, presencia de fases no acuosas,

condición de flujo y características del metal y es la forma de ataque más

frecuente en petróleo y gas producción (Kermani & Smith, 1997).

A temperaturas elevadas, la escala de carburo de hierro se forma en la

tubería de petróleo y gas como una escala protectora, y el metal comienza

17

a corroerse en estas condiciones. La corrosión por CO2 puede aparecer en

dos formas principales: picadura (ataque localizado que resulta en

penetración rápida y remoción de metal en una pequeña área discreta

(figura 5)) y ataque en mesa (una forma de corrosión localizada por CO2

bajo condiciones de flujo medio).

Figura 5. Corrosión por picadura. Recuperado de: Popoola et al. (2013).

2.4.1.2 Corrosión ácida (corrosión H2S).

El deterioro del metal es debido al contacto con el ácido sulfhídrico (H2S) y

la humedad se denomina corrosión ácida, que es la más perjudicial para la

tubería de perforación. Aunque el H2S no es corrosivo por sí solo, se

convierte en un agente severamente corrosivo en presencia de agua, lo que

lleva a la fragilización de la tubería (Nalli, 2010). El ácido sulfhídrico cuando

se disuelve en agua es un ácido débil y, por lo tanto, es una fuente de iones

de hidrógeno y es corrosivo. Los productos de la corrosión son sulfuros de

hierro (FeSx) e hidrógeno. El H2S forma una escala que a baja temperatura

puede actuar como una barrera para desacelerar la corrosión. Las formas

de corrosión agria son uniformes, picaduras y grietas escalonadas (figura

6).

Figura 6. Tubería con corrosión acida. Recuperado

de: Popoola et al. (2013).

18

2.4.1.3 Corrosión por oxigeno (O2).

El oxígeno es un oxidante fuerte y reacciona con el metal muy rápidamente.

El oxígeno disuelto en los fluidos de perforación es una causa importante

de corrosión en las tuberías de perforación (figura 7). La entrada de oxígeno

ocurre en los fluidos del pozo a través de fugas en los sellos de la bomba,

la carcasa y las aberturas de proceso y las compuertas abiertas. Como un

despolarizador y aceptor de electrones en las reacciones catódicas, el

oxígeno acelera la destrucción anódica del metal (Stott, 2018).

Figura 7. Corrosión inducida por oxígeno. Recuperado de: Popoola et al. (2013).

2.4.1.4 Corrosión de grietas.

Es una corrosión localizada que tiene lugar en espacios estrechos o grietas

en el metal y el fluido se estanca en el espacio. Esto es causado por

diferencias de concentración de corrosivos sobre una superficie de metal.

Las diferencias de potencial electroquímico resultan en grietas selectivas o

ataques de corrosión por picaduras (figura 8). El oxígeno disuelto en el

fluido de perforación promueve el ataque de hendiduras y picaduras de

metal en las áreas blindadas de la sarta de perforación y es la causa común

de deslaves y destrucción bajo protectores de tubos de caucho (Roberge,

2000).

19

Figura 8. Corrosión por grietas. Recuperado de: Popoola et al. (2013).

2.4.1.5 Corrosión por erosión.

El mecanismo de corrosión por erosión aumenta la velocidad de reacción

de corrosión al eliminar continuamente la capa pasiva de productos de

corrosión de la pared de la tubería. La corrosión por erosión siempre se

experimenta cuando hay un régimen de flujo de alta turbulencia con una

tasa de corrosión significativamente mayor y depende del caudal del fluido

y de la densidad y morfología de los sólidos presentes en el fluido

(Abulnoun Ajeel & Abdullatef Ahmed, 2008).

2.4.1.6 Corrosión galvánica.

Este tipo de corrosión ocurre cuando dos materiales metálicos con diferente

potencial electroquímico están en contacto y están expuestos a un entorno

electrolítico. El metal con menos potencial o el más negativo se convierte

en el ánodo y comienza a corroer (Popoola et al., 2013).

2.4.1.7 Corrosión bajo tensión.

El agrietamiento por corrosión bajo tensión (SCC) es una forma de

corrosión localizada que produce grietas en los metales por acción

simultánea de una tensión corrosiva y de tensión. Depende de la

combinación de aleación y ambiente involucrado. SCC es el craqueo

20

inducido por la influencia combinada del esfuerzo de tracción y un medio

corrosivo. El impacto de SCC en un material parece caer entre el craqueo

(fraccionamiento o descomposición) en seco y el umbral de fatiga de ese

material (Saracin, Paraschiv, Pandia, & Bozga, 2015).

6.4.2 Corrosión inducida por microorganismos (MIC) o

Biocorrosión.

La corrosión inducida microbiológicamente (MIC) es un tipo de corrosión

que degrada el metal por organismos biológicos. Las BSR son un tipo de

corrosión inducida microbiológicamente. La presencia de estas bacterias

se encuentra comúnmente en diversos atributos de la industria del petróleo

y el gas, tan profundos como los pozos de una planta petrolera costa afuera,

hasta llegar a las refinerías. Las bacteria sulfato reductoras pueden estar

presentes en cualquier entorno acuoso o en el suelo y es un problema

común en las instalaciones de la industria del petróleo y el gas debido a la

naturaleza omnipresente de los microorganismos y los productos

corrosivos en las tuberías (Popoola et al., 2013).

La presencia de las BSR en el petróleo crudo en forma de microbios utiliza

el sulfato como un aceptor de electrones para generar ácido sulfhídrico

corrosivo (H2S) como su producto. Las bacterias utilizan H2S para corroer

el metal y despolariza la superficie del metal (figura 9) debido al producto

de sulfuro de hidrógeno (Whitby & Lund Skovhus, 2011).

Figura 9. Corrosión causada por microorganismos. Recuperado de: Popoola et al.

(2013).

21

En el caso de las estructuras de acero cuando entran en contacto con el

ácido sulfhídrico (H2S) forman varias cadenas de sulfuros de hierro e

hidrógeno. El hidrógeno alimenta a las BSR, y esto les permite continuar

creciendo y reproduciéndose, aumentando las tasas de ácido sulfhídrico

(figura 10). La presencia de BSR también influye en el pH y la concentración

de oxígeno para aumentar los resultados en ataques localizados, como la

grieta y la corrosión por picadura, e iniciar el agrietamiento por corrosión

por estrés (Makhlouf, Herrera, & Muñoz, 2018).

Figura 10. Mecanismo de las bacterias sulfato reductoras en el acero. Recuperado de:

Makhlouf et al. (2018).

6.4.3 Clasificación de las BSR.

6.4.3.1 Desulfovibrionaceae.

El género Desulfovibrio es el más diverso, sus células tienen formas más o

menos curvadas y frecuentemente presentan motilidad (figura 11), la

característica más importante es su capacidad para tolerar oxígeno y en

algunos casos, incluso consumirlo (Loubinoux, Bronowicki, Pereira,

Mougenel, & Faou, 2002). Además, el género Desulfomicrobium también

está dentro de este grupo y es muy similar a Desulfovibrio, en cuanto a sus

características fisiológicas, tiene forma de bastoncillo y carece de

desulfoviridin.

22

6.4.3.2 Desulfobacteriaceae.

Los miembros de esta familia presentan características filogénicas o

filogenéticas y morfológicas muy variables. Algunas especies del género

Desulfobulbus son de forma ovalada y pueden tener o no movilidad, pueden

usar el etanol, lactato o propionato como sustrato para su metabolismo.

Las Desulfobacter generalmente son de forma ovalada y su principal

característica es que tiene la capacidad de usar el acetato completamente.

Por otro lado, las Desulfobacterium tiene una forma de bastoncillos y

presenta una gran capacidad para degradar compuestos orgánicos y

además son capaces de descomponer hidrocarburos, son

microorganismos anaerobios estrictos (King, Kostka, & Fris, 2001).

Desulfococcus y Desulfosarcina pueden presentar forma ovalada o en

bastoncillo, Desulfococcus pueden reducir el sulfato lentamente, pueden

tolerar el oxígeno (figura 11).

6.4.3.3 Gram negativas mesófilas.

Las mesofílicas son representantes de la subdivisión delta de

proteobacterias, dentro de la que se han identificado dos familias. La

primera familia es Desulfovibrionaceae que incluye a los géneros

Desulfovibrio (figura 11) y Desulfomicrobium, y han sido incluidos otros dos

géneros Desulfohalobium y Desulfonatronum. La segunda familia es

Desulfobacteriaceae, compuesta por Desulfobacter, Desulfobacterium,

Desulfonema, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfobulbus (Daly, Sharp

RJ, & McCarthy, 2000).

6.4.3.4 Gram positivas formadoras de esporas.

Este grupo está conformado por el género Desulfotomaculum, el cual es

posiblemente homogéneo morfológica y metabólicamente. Presenta la

capacidad para formar esporas (figura 11), lo cual le permite sobrevivir

23

mejor que otras BSR a la desecación y oxidación del medio ambiente y

pueden subsistir en una gran variedad de medios (Smit, 2001).

Figura 11. Diferentes formas celulares de las bacterias sulfato reductoras. Recuperado

de: Sánchez (2005).

24

6.5 Métodos para la detección de bacterias sulfato reductoras

6.5.1 Microbiológicos.

6.5.1.1 Técnica de número más probable (NMP).

El método de cultivo para detectar y cuantificar bacterias sulfato reductoras

más utilizado es el número más probable (NMP), en el cual se asume que

en las diluciones seriadas los microorganismos se encuentran distribuidos

al azar, y que al menos uno crecerá, produciendo una respuesta positiva

como turbidez o producción de metabolitos específicos. Para el caso de las

BSR, existen medios de cultivo recomendados como Postgate,

principalmente formado de sales de sulfato y de hierro, al entrar en contacto

con el sulfuro producido por las BSR, genera un precipitado negro (FeS).

El resultado se determina contando el número de tubos positivos según el

método de ceros de Poisson (Whitby & Lund Skovhus, 2011).

Es una técnica muy utilizada para determinar recuentos de BSR, pero

existen varias limitantes, primero se debe realizar un gran número de

réplicas por cada dilución para reducir los intervalos de confianza, esta

metodología tiende a subestimar el número de microorganismos, puesto

que la mayoría de los organismos no son cultivables y el NMP es una

metodología muy laboriosa y requiere largos períodos de incubación

(Whitby & Lund Skovhus, 2011).

6.5.1.2 Medio de cultivo BSR 10.

Es un medio muy utilizado para el recuento de BRS planctónicas, son

utilizados mediante la técnica de dilución por extinción (figura 13) y sus

rangos de pH y Eh lo hacen analíticamente confiable. Su aspecto es claro,

incoloro o ligeramente ambarino. Un medio positivo muestra un precipitado

negro (figura 12), o un mucílago negro sobre el clavo, el limitante principal

es que debe tener un tiempo de incubación de más de 21 días a

temperaturas que oscilen entre 30 y 32°C.

25

Figura 12. Controles positivos y negativo del medio de cultivo BSR. Recuperado de:

Aqualab (2015).

Figura 13. Dilución por extinción. Recuperado de: Aqualab (2015).

6.5.1.3 Prueba BART.

La prueba BART es de Presencia o Ausencia (figura 14) debe tener un

tiempo de incubación de 5 días a una temperatura entre 30 y 32°C, la cual

consiste en un biodetector que es una herramienta de diagnóstico que

ayudan identificar la presencia y actividad de varios tipos de BSR, es un

método simple pero efectivo para controlar el tamaño y la actividad de la

población de un grupo específico de bacterias, también cuenta con una

facilidad de uso, y no requiere equipos caros ni complicados ni capacitación

especializada y es una prueba efectiva y económica que es fácil de

interpretar y que pueden llevarse a cabo a temperatura ambiente en casi

cualquier entorno (HACH, s.f.).

26

Figura 14. Prueba BART. Recuperado de: (HACH, s.f.).

6.5.2 Enzimáticos.

6.5.2.1 Kit QuickChekTM BSR.

Es un método rápido de inmunoensayo enzimático que detectan bacterias

reductoras de sulfato (figura 15), por medio de la detección de la enzima

adenosina-5'-fosfosulfonato (APS) reductasa que es común a todas las

cepas de las bacterias sulfato reductoras, es un kit que permite la prueba

de muestras sólidas y semisólidas, los resultados de las pruebas no se ven

comprometidos por interferencias químicas o de salinidad que a menudo

se encuentran en muestras de campo. No es necesario pretratar o diluir

muestras y no existen limitaciones especiales para la eliminación de

desechos peligrosos. Los resultados disponibles en 8-10 minutos, tiene un

límite de detección de 103 células / ml (ANSAC, s.f.).

Figura 15. Kit QuickChekTM BSR. Recuperado de: (ANSAC, s.f.).

27

6.5.2.2 RapidChek® II SRB Test Kit.

Es un método que emplea anticuerpos policlonales purificados para

detectar la enzima adenosin-5'-fosfosulfato (APS) reductasa, común a

todas las bacterias sulfato reductoras. Se considera que la cantidad de

enzima presente es directamente proporcional a la cantidad de bacterias

viables capaces de producir biocorrosión. Los resultados se expresan en

bacterias/ml (Expotech USA, s.f.).

6.5.3 Basados en el ADN.

En la industria del petróleo y el gas se ha aumentado el uso de aplicaciones

de métodos moleculares para el identificar, cuantificar, diagnosticar y

conocer el tipo de corrosión microbiológica (MIC) en la última década,

debido a que se quiere averiguar y establecer cuales condiciones ayudan

a la proliferación de las BSR y conocer más sobre los mecanismos de

corrosión.

El uso de estas herramientas fomenta a detectar con una mayor

sensibilidad y en menores tiempos de respuesta la detección de estas

bacterias. Esto presenta una ventaja frente a los métodos convencionales.

El método de FISH (Hibridación fluorescente in situ) emplea una sonda de

un fragmento de ARNr (Ácido ribonucleico ribosómico) de tamaño 16S

marcado con fluorescencia, esta técnica identifica los microorganismos de

interés (Lorenzana, Fernandez, & Garcia, 2002).

Se han diseñado sondas de oligonucleótidos y cebadores de DNA o

RNA tomando como blanco los genes 16s rDNA, dsrA, dsrB, aps entre

otros como puede apreciarse en la tabla 2. Cuando se utiliza el

gen dsrA como marcador, se ha podido realizar filogenia, identificación y

cuantificación debido a que este gen es asociado a las BSR y es el

encargado de codificar la subunidad α de la enzima 2 desasimilativa sulfato

reductasa, es la enzima clave que se encarga de catalizar la reducción del

28

sulfito a sulfuro (Cook, Whitehead, Spence, & Cotta, 2008), pueden utilizar

como un marcador filogenético para la identificación de los BSR (Rabus,

Hansen, & Widdel, 2006).

6.5.3.1 Lista de oligonucleótidos diseñados.

Tabla 2. Lista de los oligonucleótidos reportados por literatura para detectar BSR.

Especie Oligonucleótidos (5' a 3') Gen

Desulfovibrio sp

27f (GAGTTTG(AC)TCCTGGCTCAG) 1541r (AAGGAGGTGWTCCARCC)

ARNr 16S

341f-GC (CCTACGGGAGGCAGCAG) 907r (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT)

DSV230 (GRG YCY GCG TYY CAT TAG C) DSV838 (SYC CGR CAY CTA GYR TYC ATC )

27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 1522R (AAGGAGGTGATCCAGCCGCA).

DSR1F (AC [C/G] CACTGGAAGCACG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)

dsrA dsrB

dsrAvibF (ACCCACTGGAAGCACGGCG) dsrAvibR (TTATCTCTGATGGYGTTTRCGGTAATCC) /

dsrBvibF (ATGGCWTTYRTTTCTTCCGGGTACAATCCC)

dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG)

Desulfobulbus sp

(DBB) (CGCGTAGATAACCTGTCYTCATG, GTAGKACGTGTGTAGCCCTGGTC).

ADNr 16S

DBB121 (CGC GTA GAT AAC CTG TCY TCA TG) DBB1237 (GTA GKA CGT GTG TAG CCC TGG TC)

dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC) dsrBbacR

(TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)

dsrB

dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG)

dsrA

Desulfobacter sp

(DSB) (GATAATCTGCCTTCAAGCCTGG, CYYYYYGCRRAGTCGSTGCCCT).

ADNr 16S

Cebadores 27F y 530R ARNr 16S

DSB127 (GAT AAT CTG CCT TCA AGC CTG G) DSB1273 (CYY YYY GCR RAG TCG STG CCC T)

ARNr 16S


dsrA

29

Desulfovibrio desulfuricans


dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG) /

dsrAvibF (ACCCACTGGAAGCACGGCG) dsrAvibR (TTATCTCTGATGGYGTTTRCGGTAATCC)

dsrAB

Desulfovibrio vulgaris

DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG)

dsrA

385f (CGGCGTCGCTGCGTCAGG) 907r (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT)

ARNr 16S


dsrAB

dsrAvibF (ACCCACTGGAAGCACGGCG) dsrAvibR (TTATCTCTGATGGYGTTTRCGGTAATCC)

dsrA

Desulfomicrobium

sp

(DSV-DMB) (GRGYCYGCGTYYCATTAGC, SYCCGRCAYCTAGYRTYCATC)

ADNr 16S


dsrAB

Desulfobacterium sp

(DBM) (CTAATRCCGGATRAAGTCAG, ATTCTCARGATGTCAAGTCTG).

ADNr 16S

DBM169 (CTA ATR CCG GAT RAA GTC AG) DBM1006 (ATT CTC ARG ATG TCA AGT CTG)

ARNr 16S

Desulfobulbus rhabdoformis

dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)

dsrBbacR (TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)

dsrB

Desulfobulbus propionicus

Desulfococcus

olevorans

dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG) / dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)


dsrAB

Desulfobacter curvatus

dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG

dsrA


Desulfovibrio

acrylicus


dsrA

Desulfovibrio simplex



dsrB

Desulfovibrio piger

Desulfovibrio halophilus


dsrA

Desulfovibrio termiditis

30

Desulfovibrio dechloracetivorans

27F (AGRGTTTGATCTGGCTGGCTCAG) 530R (CCGCNGCNGCTGGCAC)

344F (CGGGGYGCAGCAGGCGCGA) 915R (GTGCTCCCCCGCCAATTCCT)

ARNr 16S

Desulfovibrio indonesiensis

Desulfovibrio oxamicus



dsrAB

Desulfomicrobium norvegicum

Desulfomicrobium apsheronum



dsrAB

Desulfomicrobium baculatum

dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC) dsrBbacR

(TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)

dsrB

Desulfomicrobium escambiense

Desulfomicrobium macestii



dsrA

Desulfomicrobium thermophilum

DSRp2060F (CAACATCGTYCAYACCCAGGG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)

dsrB

Desulfohalobium utahense


dsrA

Desulfohalobium retbaense

DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG) /


dsrAB

Desulfonatronum sp


dsrB

Desulfobacterium vacuolatum


dsrA

Desulfobacterium autotrophicum

Desulfocurlus sp Cebadores 27F y 530R ARNr 16S

Desulfococcus sp (DCC-DNM-DSS) (GATCAGCCACACTGGRACTGACA, GGGGCAGTATCTTYAGAGTYC).

ADNr 16S

Desulfobacter postgatei



dsrAB

Desulfobacter psychrotolerans


31

Desulfosarcina sp (DCC-DNM-DSS) (GATCAGCCACACTGGRACTGACA, GGGGCAGTATCTTYAGAGTYC).

ADNr 16S

Desulfosarcina sp



dsrAB

DCC305 (GAT CAG CCA CAC TGG RAC TGA CA) DCC1165 (GGG GCA GTA TCT TYA GAG TYC)

ARNr 16S

Desulfosarcina varabilis


dsrA

Desulfosarcina cetonicum

Desulfotomaculum sp

(DFM) (TAGMCYGGGATAACRSYKG, ATACCCSCWWCWCCTAGCAC).

ADNr 16S

Desulfotomaculum halopilum

27F (AGRGTTTGATCTGGCTGGCTCAG) 530R (CCGCNGCNGCTGGCAC)

ARNr 16S Thermotoga

subterranea

Thermogota martitima

Geotoga subterranea

Cebadores 27F y 530R/ 344F y 915R ARNr 16S

32

7. METODOLOGÍA

7.1 Ubicación

Universidad de Santander (UDES), Campus Universitario Lagos del

Cacique, edificio de biotecnología, laboratorio de biología molecular y

genética, Calle 70 No 55-210 Bucaramanga.

7.2 Diseño del estudio

El tipo de diseño de este trabajo de grado es de tipo experimental.

7.3 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos.

El grupo de investigación Ciencias Básicas y Aplicadas para la

Sostenibilidad (CIBAS) realizo un proyecto previamente en el cual se

diseñaron sondas de oligonucleótidos para la identificación de las BSR por

medio de la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucles (PCR-

LAMP), teniendo en cuenta los microorganismos reportados en Colombia

en sistemas de producción y transporte de petróleo. Por tal motivo fue

necesario analizar el potencial uso de las sondas de oligonucleótidos en la

técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional.

7.3.1 Análisis en BLAST.

Inicialmente se evaluaron los posibles oligonucleótidos en el programa

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de acceso libre, para

seleccionar las secuencias que se identificaron con BSR. Del estudio

anterior se seleccionaron que no incluyeran bases degeneradas. Se

tomaron las secuencias sentido (5’ a 3’) y para las secuencias anti-sentido

(3’ a 5’) se halló la secuencia complementaria y se realizó la inversión de la

33

secuencia. Posterior a esta revisión se identificaron los mejores

oligonucleótidos se realizó usando la herramienta online Multiple Primer

Analyzer de Thermo Fisher Scientific (Scientific, s.f.), adicionalmente se

hicieron combinación de posibles parejas de oligonucleótidos para

determinar la posible formación de homodímeros, heterodímeros y conocer

las propiedades termodinámicas (porcentaje de guanina – citocina,

temperaturas de hibridación de los oligonucleótidos, número de pares de

bases) y el tamaño de amplificación.

Luego de seleccionar la mejor pareja de oligonucleótidos se realizaron

alineamientos locales múltiples de un fragmento de secuencia del gen dsrA

de la BSR obtenida de la base de datos National Center for Biotechnology

Information (NCBI), con los oligonucleótidos seleccionados usando el

programa BioEdit Sequence Alignment Editor y el algoritmo ClustalW, con

esto se determinó la similitud de pares de bases de los oligonucleótidos con

la secuencia de ADN y el tamaño de amplificación.


utilizando PCR.

7.4.1 Microorganismos de referencia.

Se usó una BSR de referencia Desulfovibrio vulgaris (ATCC: 29579), y

como testigos negativos suministrados por el cepario de la Universidad de

Santander se usaron: Klebsiella pneumoniae (ATCC:10031), Klebsiella

oxytoca (ATCC:43165), Pseudomonas aeruginosa (ATCC:27853),

Enterobacter cloacae (ATCC: 13047), Pseudomonas putida

(ATCC:49128), Burkholderia cepacia (ATCC:25416), Alcaligenes faecalis

(ATCC:35655), Pseudomonas putida.

34

7.4.2 Extracción de ADN.

La extracción del ADN genómico se realizó mediante el kit comercial Wizard

Genomic DNA purification kit (Promega, Ref. A1120), y se usó de acuerdo

con el protocolo del fabricante. Para esto, los cultivos bacterianos, se

resuspendieron en 480 μl de EDTA 50mM. Se les agrego 60 μl de lisozima

(20 mg/mL) y se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Posteriormente se

centrifugaron a 1400 rpm por 2 minutos y luego se descartó el

sobrenadante, después se les agrego al pellet 600 μl de solución de lisis l,

se incubaron durante 5 minutos a 80°C, se les adiciono 3 μl de solución de

RNAsas y se incubaron durante 15 minutos a 37°C.

Seguidamente se les agrego 200 μl de solución de precipitación de

proteínas, se incubaron en hielo durante 5 minutos, luego se centrifugaron

los cultivos y se prosiguió a transferir los sobrenadantes a otros tubos de

micro centrifuga. Seguidamente se añadió 600 μl de isopropanol y se

mezcló hasta evidenciar la formación de la malla de ADN, se retiró

completamente el isopropanol por centrifugación y se adicionó 600 μl de

etanol 70%. Finalmente se centrifugaron, se retiró el etanol, se dejó secar

hasta evaporar completamente y el ADN de los microorganismos se

resuspendieron en 100μl de solución de rehidratación de ADN.

Posteriormente se conservó a -20°C.

7.4.3 Detección molecular (gen 16s).

Como control positivo se realizó la amplificación del gen 16s mediante la

técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), esperando un

tamaño de amplificación de aproximadamente 890 pb. Para ello se

emplearon los oligonucleótidos 17A (5’-TGCCAGCAGCCGCGATA-3’) y

18A (5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’). La amplificación se llevó a cabo

en un termociclador Bio-Rad T100TM y las condiciones de la amplificación

fueron las siguientes: Buffer de reacción 1X, MgCl2 1,8 mM, dNTPs 200μM,

35

oligonucleótidos 17ª – 18A 0.5μM y 1U/μl de Taq polimerasa (Thermo

Fisher Scientific) para un volumen final de 20μl.

El programa de amplificación utilizado consistió en una desnaturalización a

95°C durante 4 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C (40 seg), 73°C (30

seg) y 72°C (2 min.), por último, un ciclo de extensión final a 72°C (5 min).

Posteriormente se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, teñido

con el colorante SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen s33102), con buffer

TAE 1X y se corrió a 60 V.

7.4.3.1 Agua de producción.

Se obtuvo una muestra de agua de cabeza de pozo, la cual fue donada por

Ecopetrol. La empresa pidió reserva sobre las condiciones de toma, uso y

sitio de toma. Esta muestra fue fraccionada de la siguiente forma: la primera

fracción correspondió a la muestra homogenizada por agitación y la

segunda fracción corresponde a la misma agua, pero decantada a 4°C

durante aproximadamente 6 meses. El tiempo y temperatura de

decantación obedecen a las condiciones de almacenamiento descritas por

el oferente. El agua de producción fue usada para diluir el ADN de

Desulfovibrio vulgaris, para determinar si presentaba inhibición en la

amplificación por medio de la técnica de PCR.

7.4.4 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control.

Se realizó con las condiciones estándar del programa de amplificación y del

mix de reactivos descritas por Ben-dov (2007). Para cada reacción se

empleó ADN de Desulfovibrio vulgaris ATCC 29579 como control positivo y

como control negativo, agua libre de nucleasas (Promega Corporation,

Madison USA). Las amplificaciones se realizaron en el termociclador

modelo BIO RAD T100 THERMAL CYCLER, y los productos se analizaron

por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %, teñido con el

36

colorante SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen s33102), con buffer TAE

1X.

Las sondas oligonucleótidos control empleadas fueron las reportados por

Ben-dov (2007), dsrA1F (5’-ACSCACTGGAAGCACG-3’) y RH3-dsr-R (5’-

GGTGGAGCCGTGCATGTT-3’), específicos para amplificar un fragmento

del gen dsrA de un tamaño de 222 pb. El programa de amplificación

utilizado consistió en una desnaturalización a 95°C durante 10 minutos,

seguido de 40 ciclos de 95°C (20 seg), Melting°C (20 seg) y 68°C (30 seg),

finalmente un ciclo de extensión final a 68°C (5 min.). Y los componentes

del master mix fueron: Agua de PCR, Buffer de reacción 1X, MgCl2 1,8 mM,

dNTPs 200μM, oligonucleótidos forward y reverse 0.5μM y 1U/μl de Taq

DNA polimerasa Thermo Scientific (recombinant Lote 00355220) para un

volumen final de 20μl.

7.4.4.1 Prueba de amplificación con diferentes polimerasas.

Para los oligonucleótidos control se usaron tres enzimas polimerasas

provenientes de diferentes casas comerciales las cuales fueron: Thermo

Fisher Scientific (recombinant Lote 00355220), Biorad (Sso advancedTM

Universal – SBRY- Green super mix (Lote:1893A)) y Biolabs One Taq

Quick-Load 2X MM w/ Std Buffer (Lote:0251712).

7.4.5 Condiciones base para la amplificación del gen dsrA.

Se usó inicialmente una mezcla de reacción con los siguientes reactivos:

Agua de PCR, Buffer de reacción 1X, MgCl2 1,8 mM, dNTPs 200μM,

oligonucleótidos sentido y anti-sentido 0.5μM y 1U/μl de Taq DNA

polimerasa Thermo Scientific (recombinant Lote 00355220) para un

volumen final de 20μl.

El programa de amplificación utilizado consistió en una desnaturalización a

95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C (20 seg), Melting°C

37

(30 seg) y 68°C (30 seg), finalmente un ciclo de extensión final a 68°C (5

min.). Posteriormente se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1.5%,

teñido con el colorante SYBR Safe DNA Gel Stain (invitrogen s33102), con

buffer TAE 1X y se corrió a 60 V.

Para la estandarización de la técnica de reacción en cadena de la

polimerasa se evaluó:

7.4.5.1 Temperaturas de hibridación y concentración de

oligonucleótidos.

Se evaluaron diferentes temperaturas de anillamiento de los

oligonucleótidos control dsr1F y RH3-dsr-R, las temperaturas usadas

fueron: 60°C - 62°C – 63,8°C - 66°C y 67,4°C. Y para las oligonucleótidos

en evaluación A1F Y K1R, las temperaturas usadas fueron: 60°C - 61,6°C

- 64,9°C - 66,4°C y 68 °C.

La curva melting se basó en desarrollar un análisis de hibridación de los

oligonucleótidos con el ADN bacteriano de Desulfovibrio vulgaris, para

verificar la especificidad del producto amplificado, y además se evaluó la

concentración de los oligonucleótidos que fue 0,4 μM y 0,2 μM.

7.5 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA

La especificidad para la detección del gen dsrA asociado a las BSR por los

oligonucleótidos seleccionados, se evaluó utilizando ADN de otros

microorganismos como Klebsiella pneumoniae (ATCC:10031), Klebsiella

oxytoca (ATCC:43165), Pseudomonas aeruginosa (ATCC:27853),

Enterobacter cloacae (ATCC: 13047), Pseudomonas putida

(ATCC:49128), Burkholderia cepacia (ATCC:25416), Alcaligenes faecalis

(ATCC:35655), Pseudomona putida, utilizando las condiciones definidas

anteriormente para los reactivos y programa de amplificación.

38

7.6 Límite de detección

Se cuantificó el ADN de Desulfovibrio vulgaris utilizando el equipo nanodrop

de Thermo Fisher Scientific. A partir de la cuantificación se realizaron

diluciones seriadas desde 1 nanogramo hasta 1 × 10−8 nanogramo (ng)

del ADN de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) y se amplificaron por

medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con el fin de

determinar la mínima concentración de ADN con presencia del gen drsA

que puede ser detectado por la técnica de PCR previamente estandarizada.

39

8. RESULTADOS

8.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos

Tabla 3. Lista de los oligonucleótidos capaces de detectar BSR al amplificar el gen dsrA

utilizando PCR.

Nombre Secuencias Descripción inicial

Primer 1 AAGTACTACCACACCGACTACCT

Sentido

Primer 2 AGTACTACCACACCGACTAC

Primer 3 GTACTACCACACCGACTACC

Primer 4 GAATACGCCTGCTACGACAC

Primer 5 CGAATACGCCTGCTACGACA

Primer 6 CATGGAATACCAGGACGAAC

Primer 7 GGAATACCAGGACGAACTGC

Primer 8 GGAAGGACGACATCAAGATC

K1R TCCTTCCAGGTACCGATGAC Anti-sentido

K2R TTTGCCTTCTTCCATCACC

K3R TCCTTGATTTCGTCGTAGGG

Tabla 4. Microorganismos que presentaron alineamientos significativos con los

oligonucleótidos potenciales para amplificar el gen dsrA.

Sequence ID

Microorganismo

U16723.1

Desulfovibrio vulgaris dissimilatory sulfite reductase alpha (dsvA), dissimilatory sulfite reductase beta (dsvB) and dsvD genes, complete cds

AB061542.1 Desulfovibrio termitidis dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds

AF418185.1 Desulfovibrio termitidis HI1 strain DSM 5308 dissimilatory sulfite reductase alpha subunit (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase beta subunit (dsrB) genes, partial cds

AB061543.1 Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds

EU127914.1 Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F' desulfoviridin alpha subunit, desulfoviridin beta subunit, and desulfoviridin gamma subunit genes, complete cds

KJ801803.1 Desulfovibrio sp. wpp1 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds

41

Figura 16. Alineamientos múltiples locales de los oligonucleótidos potenciales para

amplificar el gen dsrA, con las secuencias de las BSR prevalentes en sistemas de

producción y transporte de petróleo. Programa Bioedit, algoritmo ClustalW.

Tabla 5. Propiedades termodinámicas de los oligonucleótidos.

Nombre Tm°C CG% nt A T C G Coeficiente de

extinción (l/(mol·cm)

Peso molecular

(g/mol)

nmol µg/OD260

dsr1FA 62.3 62.5 16 5.0 1.0 5.5 4.5 156150.0 4880.2 6.4 31.3

RH3-dsr-RA

67.8 61.1 18 2.0 5.0 3.0 8.0 170700.0 5586.7 5.9 32.7

A1FB 60.0 47.8 23 8.0 4.0 9.0 2.0 221300.0 6921.6 4.5 31.3

K1RB 64.3 55.0 20 4.0 5.0 7.0 4.0 185200.0 6053.0 5.4 32.7

A. Oligonucleótidos control, B. Oligonucleótidos evaluados

Figura 17. Formación de heterodímeros de los oligonucleótidos control.

Este análisis se realizó utilizando el software Multiple Primer Analyzer de la casa comercial

Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/co/en/home/brands/thermo-

42

scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-

resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html.

Tabla 6. Sondas de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento del gen dsrA.

Nombre Secuencia (5' a 3') Gen reconocido

Sitio de

uniónC

Producto amplificado

Referencia

dsr1FA ACSCACTGGAAGCACG

dsrA

189 - 204

222 pb

(Eitan Ben-Dov, 2007) RH3-

dsr-RA GGTGGAGCCGTGCATGTT 411 -

428

A1FB AAGTACTACCACACCGACTACCT 520 -542

384 pb

En este estudio K1RB TCCTTCCAGGTACCGATGAC 904-

923 A Oligonucleótidos control, B Oligonucleótidos en evaluación, C Sitio de unión de los

oligonucleótidos en la secuencia de ADN Desulfovibrio vulgaris (ATTC: 29579).


utilizando PCR.


Tabla 7. Concentración de ADN extraído para los microorganismos de referencia (tres

mediciones).

Microorganismos Concentración de ADN

(ng / μl)

Desulfovibrio vulgaris 62,9 ng

Klebsiella pneumoniae 18,4 ng

Klebsiella oxytoca 13,9 ng

Pseudomonas aeruginosa 106,4 ng

Enterobacter cloacae 15.7 ng

Pseudomonas putida 73.8 ng

Burkholderia cepacia 26,2 ng

Alcaligenes faecalis 66,6 ng

Pseudomonas putida 11,5 ng

43

8.2.2 Detección molecular (gen 16s)

Figura 18. Productos de la amplificación por PCR del gen 16S del ADN de Desulfovibrio

vulgaris.

-) Control negativo, +) Control positivo, M) Marcador Generuler 100 pb plus (Thermo),

Carril 1 al 4) ADN diluido desde 1 ng hasta 1 × 10−3 ng. Carril 5 al 8) ADN diluido en agua

de producción homogenizada desde 1 ng hasta 1 × 10−3 ng. Carril 9 al 12) ADN diluido

en agua de producción decantada desde 1 ng hasta 1 × 10−3 ng.

8.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control.


oligonucleótidos.

Figura 19. Optimización de condiciones de PCR para los oligonucleótidos de referencia

para el gen dsrA y los evaluados en este trabajo.

A

B

44

A. Oligonucleótidos control dsr1F y RH3-dsr-R.

B. Oligonucleótidos seleccionados A1F Y K1R. -) Control negativo, +) Control positivo, M)

Marcador Generuler 100 pb plus (Thermo).


Figura 20. Especificidad de oligonucleótidos evaluados.

-) Control negativo, +) Control positivo Desulfovibrio vulgaris, Dn) Desulfotomaculum

nigrificans, Af) Alcaligenes faecalis, Pp) Pseudomonas putida, Pa) Pseudomonas

aeruginosa, Kp) Klebsiella pneumoniae, Ko) Klebsiella oxytoca, Ec) Enterobacter cloacae,

Bc) Burkholderia cepacia, M) Marcador de peso molecular de 100 pb plus (Thermo).


45

Figura 21. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen dsrA con los

oligonucleótidos control.

Se uso ADN de Desulfovibrio vulgaris diluido en agua libre de nucleasas desde 1 ng hasta

1 × 10−8 ng. -) Control negativo, +) Control positivo, M) Marcador Generuler 100 pb plus

(Thermo), A) Taq polimerasa de Biolabs, B). Taq polimerasa de Biorad, C). Taq polimerasa

de Thermo Fisher Scientific.

Figura 22. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen dsrA con los

oligonucleótidos en evaluación.

Se uso ADN de Desulfovibrio vulgaris diluido en agua libre de nucleasas desde 1 ng hasta

1 × 10−8 ng. -) Control negativo, +) Control positivo, M) Marcador Generuler 100 pb plus

(Thermo).

46

9. DISCUSIÓN

9.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos

Se evaluaron inicialmente ocho sondas de oligonucleótidos con posible

potencial para amplificar el gen dsrA por PCR convencional (tabla 3). Debe

aclararse que la selección de oligonucleótido diseñados obedece a que

estos fueron desarrollados para su uso en LAMP-PCR, lo que cambia las

condiciones de alineamiento, porcentaje de guanina y citocina (%G-C) y

longitud (Abd-Elsalam, 2003). Cada uno de los oligonucleótidos descritos

en la tabla 3, fueron analizados en Blast (Basic Local Alignment Search

Tool) para determinar la especificidad de reconocimiento y de este modo

comenzar a seleccionar los posibles oligonucleótidos, que presentaran la

capacidad de detectar solo BSR con un porcentaje de identificación del

100%.

De este primer alineamiento se obtuvieron seis secuencias reconocidas por

los diferentes oligonucleótidos con un porcentaje de identidad no inferior al

90% (U16723.1- AB061542.1- AF418185.1- AB061543.1- EU127914.1-

KJ801803.1), que corresponde a los microorganismos descritos en la tabla

4.

Cada uno de los oligonucleótidos se alineó por separado con las

secuencias de los seis microorganismos descritos anteriormente, para

determinar, la complementariedad entre los pares de bases de las

secuencias y los oligonucleótidos (anexo A). Luego de identificar el

reconocimiento de los oligonucleótidos con las secuencias seleccionadas

se identificaron las posiciones en las cuales pueden hibridarse con el fin de

establecer el tamaño de amplificación esperado, los posibles tamaños

esperados se hallaron al realizar alineamientos múltiples locales teniendo

en cuenta los microorganismos reportados por literatura que se encuentran

prevalentes en los sistemas de producción y transporte del petróleo (anexo

E).

47

Este indicador es de gran importancia para que estudios posteriores

puedan utilizar estos resultados en pruebas de PCR cuantitativa (qPCR).

Se hicieron combinaciones de los oligonucleótidos para determinar

tamaños de amplificación, formación de homodímeros y heterodímeros

entre las parejas (anexo E).

Para los oligonucleótidos control también se realizó el alineamiento Multiple

local con los microorganismos prevalentes en los sistemas de producción

y transporte del petrolero en Colombia (anexo C), y el alineamiento local de

los oligonucleótidos con respecto al microorganismo de referencia

Desulfovibrio vulgaris (ATCC: 29579) (anexo D).

Como resultado del análisis in silico por medio de la herramienta online

Multiple Primer Analyzer (Scientific, s.f.), se fueron descartando los posibles

oligonucleótidos teniendo en cuenta la especificidad de reconocimiento de

los oligonucleótidos con respecto las BSR (anexo F), el primer 2 se

descartó como posible oligonucleótido teniendo en cuenta que podría

reconocer microorganismos diferentes a las BSR con un porcentaje entre

el 85% y 95% (anexo G). y en el anexo B, se muestran todas las

propiedades de los posibles oligonucleótidos. Se logró seleccionar una

pareja de oligonucleótidos que cumplía con todos los criterios y las

características termodinámicas, se presentan en la tabla 4 y 5, para los

oligonucleótidos control dsrA1F y RH3-dsr-R descritos por Ben-dov (2007)

y los oligonucleótidos seleccionados A1F y K1R, los cuales cumplen con

los criterios de aceptación para ser usados.

Según Orozco, et al. (2016) los oligonucleótidos deben tener una longitud

ideal de pares de bases que debe estar entre 15 y 25 pb; con un porcentaje

de guanina y citosina >40%, y además deben tener temperaturas de

hibridación (Tm °C) entre 50°C y 68°C. Además, no debe formar estructuras

secundarias (homodímeros y heterodímeros) y deben amplificar

fragmentos menores de 500 pb, para en un futuro poder usarlos para

qPCR.

48

En la tabla 5, se presenta las secuencias de los oligonucleótidos de (5’ a

3’), el sitio de unión de los oligonucleótidos con respecto al microorganismo

de referencia Desulfovibrio vulgaris (ATCC: 29579), el gen que debe

reconocer (dsrA) y el tamaño de amplificación esperado y obtenido en el

estudio.

Igualmente, por medio de esta herramienta se evidencia la posible

formación de heterodímeros entre los oligonucleótidos control (figura 17),

lo cual puede generar estructuras secundarias no deseables, y como

consecuencia los oligonucleótidos se pueden unir entre sí. Pero por otro

lado los oligonucleótidos en evaluación no generan ninguna formación de

homodímeros y heterodímeros.

Las sondas de oligonucleótidos reportadas por Ben-dov (2007) están

diseñadas para la identificación y cuantificación de 42 microorganismos con

la presencia del gen dsrA; por otro lado las sondas de oligonucleótidos en

evaluación fueron diseñadas para tener la capacidad de detectar BSR,

teniendo en cuenta los microorganismos reportados en Colombia por otros

estudios, de los cuales se identificaron 37 microorganismos prevalentes en

los sistemas colombianos, pertenecientes a las familias

Desulfovibrionaceae y Desulfobacteriaceae. En comparación con Ben-dov

se excluyen algunas especies de Desulfovibrio y se incluyen especies

diferentes de los géneros Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfobacterium,

Desulfobacter, Desulfococcus.


utilizando PCR.


Se extrajo entre 11,5 y 106,4 ng/μL de ADN de los diferentes

microorganismos de referencia como se muestra en la tabla 7. Para el

49

testigo positivo Desulfovibrio vulgaris se obtuvo una cuantificación de 62,9

ng/μl.

9.2.2 Detección molecular (gen 16s)

La identificación molecular de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) por

medio del gen 16s, permitió obtener una banda aproximadamente de 890

pb, al usar los oligonucleótidos 17A y 18A. Estos oligonucleótidos son

universales, y se usaron como control positivo de las reacciones de PCR,

dado que permite identificar la presencia de ADN bacteriano, con esto se

descartan falsos negativos de amplificación para el gen dsrA con cualquiera

de los oligonucleótidos en estudio.

En la figura 18, se muestra los amplificados del gen 16s con la presencia

del ADN de D. vulgaris. Teniendo en cuenta el potencial uso de la técnica

para la detección de BSR en la industria del petróleo, se realizó una primera

aproximación diluyendo el ADN de Desulfovibrio vulgaris y se realizó límite

de detección utilizando concentraciones de ADN desde 1 ng hasta 1 × 10−8

ng. Se observó la amplificación del gen 16s utilizando agua libre de

nucleasas y cuando se utilizó agua de producción como diluyente del ADN

para la PCR en las dos fracciones utilizadas en este estudio, homogenizada

y decantada. La amplificación fue mayor cuando se utilizó agua de cabeza

de pozo como diluyente del ADN de Desulfovibrio vulgaris pudiéndose

obtener amplificación hasta 1 × 10−3 ng de ADN. El agua de cabeza de

pozo es el agua que se obtiene tras el bombeo de un pozo de producción

de petróleo y esta puede contener gran cantidad de material particulado

(Martinez, y otros, 2011). Por esta razón, se probaron dos condiciones de

esta agua, centrifugada y sin centrifugar con el fin de observar un posible

efecto inhibitorio en la PCR. Por el contrario, se observó una mayor

amplificación cuando se utilizó el agua de cabeza de pozo sin centrifugar.

Esta prueba es de gran valor para este trabajo teniendo en cuenta que no

50

se observó amplificación del gen 16s en el agua de cabeza de pozo en

ninguno de los dos tratamientos (Duque, y otros, 2004).

9.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control.


oligonucleótidos.

La mejor temperatura de hibridación de los oligonucleótidos control para el

gen dsrA utilizando el ADN de Desulfovibrio vulgaris fue 66,4°C debido a

que se observó una única banda definida del peso esperado de 222 pb,

además se pudo identificar la mejor concentración de los oligonucleótidos

la cual corresponde a 0,4 μM (figura 19A). Esto concuerda con los

resultados descritos por Ben-dov (2007), quien en una investigación diseño

pares de oligonucleótidos con la capacidad de detectar bacterias sulfato

reductoras por medio del gen dsrA, se buscaron las BSR en aguas

industriales producidas por varias industrias químicas y mediante PCR

obtuvieron una amplificación del mismo tamaño obtenido en este estudio,

empleando como control positivo Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris

(AE017285).

La identificación de las BSR ha sido objeto de estudio en varias

investigaciones, la primera fue realizada por Wagner et al (1996), se

buscaba conocer la filogenia de la sulfito reductasa disimilatoria, la cual

sustentan los orígenes tempranos de la respiración con sulfato, como

control positivo usaron el ADN molde de Desulfovibrio vulgaris y fue el

estudio inicial en el cual diseñaron el oligonucleótido forward dsr1F (5’-

ACSCACTGGAAGCACG-3’). Recientemente Blazejak & Schippers (2011),

reportaron el análisis de diversidad de los genes funcionales para las

enzimas adenosina 5'-fosfosulfato reductasa (aprA) y sulfito reductasa

disimilatoria (dsrA) de procariontes reductores de sulfato presentes en

sedimentos marinos del margen continental del Perú y el Mar Negro,

incluyendo muestras de la biosfera profunda, como resultado obtuvieron

51

que el gen metabólico para la reducción de sulfatos de forma desasimilativa

se podría detectar en todas las capas de sedimentos analizadas y que los

microorganismos encontrados pertenecían a las

familias Desulfobacteriaceae y Desulfovibrio.

Con respecto a los oligonucleótidos en evaluación se seleccionó la

temperatura de 62°C, puesto que se observa una banda definida de 384 pb

(figura 19B). Es de importancia resaltar que la temperatura de hibridación

del producto depende principalmente de la composición de la base y la

longitud del ADN, y, por lo tanto, los productos específicos se pueden

distinguir de los productos no específicos por la diferencia en sus

temperaturas (Orozco, Franco, & Olivo, 2016).

Con respecto la concentración de oligonucleótidos se halló que la mejor

concentración correspondía a 0,4 μM, puesto que al disminuir la

concentración de oligonucleótidos se obtenía una mínima visibilidad de las

bandas, debido a que la intensidad disminuía, a tal punto de no observar

las bandas.


Se utilizaron los ADN de los microorganismos de referencia en una

concentración de 10 ng/μl. En la figura 20, se muestra una única banda sin

interferencias de la amplificación del gen dsrA con el peso esperado de

aproximadamente 384 pb. No se observó amplificación de ningún tipo

cuando se utilizaron los ADN de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca,

Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida,

Burkholderia cepacia, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida.


La identificación del límite de detección permite tener un valor de referencia

de la posible sensibilidad que tendrán los oligonucleótidos al ser utilizados

52

en la detección de BSR en muestras de campo. En este trabajo el límite de

detección fue evaluado utilizando inicialmente los oligonucleótidos de

referencia para amplificar el ADN de Desulfovibrio vulgaris utilizando tres

polimerasas de ADN diferentes para demostrar si el uso de ellas influía en

la capacidad de amplificación del gen dsrA. Es de importancia resaltar que

la prueba de polimerasas solo fue realizada a los oligonucleótidos control,

y al seleccionar la mejor condición, esta se replicó para los oligonucleótidos

seleccionados en el presente trabajo.

En la figura 21-A, se pudo demostrar que al usar la Taq polimerasa

OneTaq® Quick-Load® 2X Master Mix with Standard Buffer de la casa

comercial Biolabs, logró detectar hasta la concentración de 1 × 10−2 ng,

debido a que es una polimerasa que tiene una combinación de Taq y Deep

VentR™, esto favorece a la amplificación debido a que tiene una actividad

de exonucleasa de corrección de 3'→ 5', de manera que aumenta la

fidelidad y la amplificación de la Taq con el ADN, es altamente termoestable

(New England Biolabs, 2018).

Por otro lado, al usar la Taq polimerasa SsoAdvanced™ Universal SYBR®

Green Supermix de la casa comercial Biorad se logró detectar la mínima

concentración de 1 × 10−6 ng (figura 21-B), este resultado se da a causa

que la polimerasa contiene una enzima pequeña de 7 kD obtenida de

Sulfolobus solfataricus y es conocida como Sso7d, la cual es capaz de

unirse covalentemente al ADN sin ninguna preferencia por secuencias

específicas (Biorad, s.f.). Y como beneficios ayuda a aumentar la

sensibilidad y detección del ADN, mejora la tolerancia a inhibidores

presentes en la PCR, minimiza el error mediante la amplificación, y se

mejora le eficiencia en la PCR.

Por último, se observa que al usar la Taq polimerasa convencional de la

casa comercial Thermo Fisher Scientific la mínima concentración que se

detecta es de 1 × 10−2 ng, esta polimerasa no cuenta con actividad de

exonucleasas para realizar correcciones, como limitación o desventaja

tiene una tasa de error de Taq ADN polimerasa en PCR es de 2,2 × 10−5

53

errores por nt por ciclo. En consecuencia, la precisión de la PCR es

4,5 × 104 y no presenta desoxinucleotidil transferasa terminal para

adicionar adeninas al extremo 3’ (Thermo Fisher Scientific, s.f.) (figura 21-

C).

Cabe resaltar que es de suma importancia conocer la mínima

concentración de ADN con presencia del gen dsrA, debido a que se puede

establecer que posiblemente si existe la presencia de BSR, pero la

concentración de ADN no es la suficiente para ser detectada por la técnica

de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Asimismo, es de

importancia resaltar que el límite de detección es ampliamente usado para

qPCR, pero para PCR convencionales no se usa, teniendo en cuenta que

no todos los laboratorios cuentan con los recursos necesarios para hacer

qPCR, es importante el desarrollo de una técnica convencional con bajos

requerimientos de ADN molde.

Teniendo en cuenta el resultado anterior, se seleccionó la Taq polimerasa

de Biorad, con la que se observó que la mínima concentración de ADN

detectada es de 1 × 10−5 ng (figura 22), un orden de magnitud anterior a

los oligonucleótidos control.

Ben-dov (2007) por medio de la técnica qPCR reporto un límite de

detección en número de copias teóricas del ADN genómico de Desulfovibrio

vulgaris por cada ensayo, el número de copias fue calculado en función de

la concentración de ADN medida (ng/ml), una masa molecular promedio de

660 para un par de bases en un ADN bicatenario y el tamaño del genoma

de Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris (3,570,858 pb), como resultado

expreso que el número de copias estaba entre 1,21 × 104 y 5,56 × 103.

Por otro lado, Kondo (2004) reportó el límite de detección de su estudio el

cual se basó en la detección y enumeración de bacterias reductoras de

sulfato en sedimentos estuarinos mediante PCR competitiva, como

resultado describió que el límite de detección fue de 10 copias por reacción

de PCR si se usaba 40 ciclos de PCR.

54

10. CONCLUSIONES

En este estudio se identificaron los posibles oligonucleótidos competentes

de detectar BSR, se evaluaron dos sondas de oligonucleótidos que

presentaron la capacidad de amplificar el gen dsrA es asociado a las

bacterias sulfato reductoras, por lo cual se cumplió con el objetivo

planteado.

Por lo tanto, este es el primer reporte sobre sondas de oligonucleótidos que

fueron diseñadas y evaluadas con el fin de detectar BSR.

El análisis “in silico” ayudó a conocer las posibles formaciones de

estructuras secundarias entre los oligonucleótidos, y además ayudó a

conocer cuales oligonucleótidos presentaban las condiciones óptimas para

su selección y evaluación.

Por medio de la curva melting se identificó las mejores temperaturas en las

cuales los oligonucleótidos se hibridaban a las secuencias de ADN, para

los oligonucleótidos control fue de 66,4°C y para los oligonucleótidos

evaluador fue de 62°C.

Además, se identificó una única banda del tamaño esperado para las

sondas de oligonucleótidos.

Se obtuvo una alta especificidad de reconocimiento del gen dsrA usando

los oligonucleótidos evaluados, debido a que solo amplifico la bacteria

sulfato reductora usada en este estudio Desulfovibrio vulgaris.

La mejor concentración de oligonucleótidos en los productos de

amplificación fue de 0,4 μM.

La polimerasa de la casa comercial Biorad, presenta el mayor límite de

detección de la mínima concentración de ADN con presencia del gen dsrA,

hasta la dilución de 1 × 10−5 ng para los oligonucleótidos evaluados y

1 × 10−6 ng para los oligonucleótidos control.

55

11. RECOMENDACIONES

Para estudios posteriores se recomienda amplificar el gen dsrA

directamente de muestras de agua de producción, debido a que las aguas

asociadas a los crudos constituyen medios naturales donde se desarrollan

bacterias capaces de facilitar la formación de metabolismo que ocasionan

daños por corrosión a los equipos de producción de la industria petrolera

Además, evaluar más oligonucleótidos que detecten microorganismos

prevalentes en los sistemas de producción y transporte de Petróleo en

Colombia.

Recuperar las bandas amplificadas y secuenciarlas para tener la certeza

de que los oligonucleótidos, amplificaron el gen de interés.

Finalmente, futuros trabajos deberán evaluar el límite de detección con más

de un par de oligonucleótidos control y usar en las pruebas más

microorganismos de referencia pertenecientes a las bacterias sulfato

reductoras.

56

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63

13. ANEXOS

Anexo A. Alineamientos significativos de microorganismos obtenidos en el análisis de

BLAST con los oligonucleótidos.

64

Nombre Tm°C CG% nt A T C G Coeficiente de

extinción (l/(mol·cm)

Peso molecular

(g/mol)

nmol µg/OD260

Primer 1 53.7 50.0 20 7.0 3.0 8.0 2.0 194300.0 6015.0 5.1 31.0

Primer 2 56.6 55.0 20 6.0 3.0 9.0 2.0 188000.0 5990.9 5.3 31.9

Primer 3 62.7 55.0 20 6.0 3.0 7.0 4.0 191200.0 6071.0 5.2 31.8

Primer 4 66.4 55.0 20 6.0 3.0 7.0 4.0 191900.0 6071.0 5.2 31.6

Primer 5 62.3 50.0 20 8.0 2.0 5.0 5.0 204900.0 6144.1 4.9 30.0

Primer 6 63.8 55.0 20 7.0 2.0 5.0 6.0 201700.0 6160.1 5.0 30.5

Primer 7 61.6 50.0 20 8.0 2.0 4.0 6.0 209300.0 6184.1 4.8 29.5

Primer 8 64.3 55.0 20 4.0 5.0 7.0 4.0 185200.0 6053.0 5.4 32.7

K2R 63.1 47.4 19 2.0 8.0 8.0 1.0 158000.0 5640.7 6.3 35.7

K3R 64.3 50.0 20 2.0 4.0 8.0 3.0 184600.0 6130.0 5.4 33.2

Anexo B. Propiedades termodinámicas de los posibles oligonucleótidos.

Anexo C. Alineamiento múltiple local de oligonucleótidos control.

B

A

65

Fragmento de las secuencias de las BSR prevalentes en sistemas de producción y

transporte de petróleo, con los alineamientos locales de los oligonucleótidos control. A).

Alineamiento local del Forward dsrA1F. B). Alineamiento local del Reverse RH3-dsr.

Anexo D. Fragmento de la secuencia de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) con los

alineamientos locales de los oligonucleótidos control.

A). Alineamiento local del forward dsrA1F.

B). Alineamiento local del reverse RH3-dsr-R.

A

B

66

Anexo E. Combinaciones de los oligonucleótidos para determinar el tamaño de

amplificación y la formación de homodímeros y heterodímeros.

El posible tamaño de amplificación se determinó realizando alineamientos múltiples

locales usando los microorganismos reportados en colombia en sistemas de producción y

transporte de petróleo.

Olig

on

ucl

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os

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uen

cias

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1RG

GA

AG

GA

CG

AC

ATC

AA

GA

TC -

TCC

TTC

CA

GG

TAC

CG

ATG

AC

280

pb

12

PC

R 8

- K

2RG

GA

AG

GA

CG

AC

ATC

AA

GA

TC -

TTTG

CC

TTC

TTC

CA

TCA

CC

280

pb

13

PC

R 8

- K

3RG

GA

AG

GA

CG

AC

ATC

AA

GA

TC -

TCC

TTG

ATT

TCG

TCG

TAG

GG

280

pb

21

67

Primer 1 Forward

AAGTACTACCACACCGACTACCT nt: 23 Tm: 60.0

BLAST

Sequence ID Microorganismos

nt % # C

Longitud

KJ801803.1

Desulfovibrio sp. Subgénesis reductasa de sulfito disimilatorio wpp1 A (dsrA) y genes de la subunidad reductasa de sulfito B (dsrB), CD parcial

23 100 1 1857

EU127914.1

Desulfovibrio vulgaris str. Subunidad alfa de desulfoviridina 'Miyazaki F', subunidad beta de desulfoviridina y genes de la subunidad gamma de desulfoviridina, cds completos

23 100 1 3787

CP001197.1

Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F', genoma completo

23 100 1 4040304

AF418185.1

Desulfovibrio termitidis HI1 cepa DSM 5308 sublimación disimilatoria de la sulfita reductasa alfa (dsrA) y genes de la subunidad beta reductasa de sulfito asimiladora (dsrB), CD parcial

23 100 1 1899

AB061543.1

Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes para sulfito reductasa alfa y subunidades beta, CD parcial

23 100 1 1943

Primer 1 Reverse

TCCTTCCAGGTACCGATGAC nt: 20 Tm: 64.3

BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/CP001197?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=6&RID=BJSVK8HS015

68

Sequence ID

Microorganismos nt %

# C

Longitud

KJ801803.1

Desulfovibrio sp. wpp1 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds

20 100 1 1857

CP002297.1

Desulfovibrio vulgaris RCH1, complete genome

20 100 1 3532052

GU060532.1

Fusobacterium sp. SRBBR 3 gen dissimilatory sulfite reductase alpha subunit (dsrA), CD parc

20 100 1 589

EU127914.1

Desulfovibrio vulgaris str. Subunidad alfa de desulfoviridina 'Miyazaki F', subunidad beta de desulfoviridina y genes de la subunidad gamma de desulfoviridina, cds completos

20 100 1 3787

DQ826729.1

Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsvA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsvB) genes, partial cds

20 100 1 1910

Primer 2 Forward

GTCCATCAAGACCACCGAGT nt: 20 Tm: 64.5

BLAST


nt % # C Longitud

KJ801803.1


19 95 1 1857

69

EU127914.1

Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F' desulfoviridin alpha subunit, desulfoviridin beta subunit, and desulfoviridin gamma subunit genes, complete cds

19 95 1 3787

AB061542.1

Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds

19 95 1 1943

FO203522.1

Desulfovibrio hydrothermalis AM13 = DSM 14728 chromosome, complete genome

<15 75 104 3703034

CP003220.1

Desulfovibrio desulfuricans ND132, complete genome

<15 75 314 3858580

Primer 2-3-4 Reverse

TTTGCCTTCTTCCATCACC nt: 19 Tm: 63.1

BLAST

Sequence ID Microorganismos nt % # C Longitud

CP023415.1

Desulfovibrio sp. G11 chromosome, complete genome

16 84 179 3414934

CP001358.1

Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27774, complete genome

16 84 159 2873437

70

KJ801799.1

Desulfovibrio sp. SR22 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds

16 84 1 1859

CP006585.1

Desulfovibrio gigas DSM 1382 = ATCC 19364 genome

16 84 216 369399

CP014229.1

Desulfovibrio fairfieldensis strain CCUG 45958, complete genome

16 84 154 3699310

Primer 3 Forward

GTACTACCACACCGACTACC nt: 20 Tm: 56.6

BLAST


nt % # C

Longitud

KJ801803.1


20 100 1 1857

EU127914.1

Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F' desulfoviridin alpha subunit, desulfoviridin beta subunit, and desulfoviridin gamma subunit genes, complete cds

20 100 1 3787

AF418185.1

Desulfovibrio termitidis HI1 strain DSM 5308 dissimilatory sulfite reductase alpha subunit (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase beta subunit (dsrB) genes, partial cds

20 100 1 1899

71

AB061543.1

Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds

20 100 1 1943

AB061542.1 Desulfovibrio termitidis dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds

20 100 1 1943

Anexo F. Especificidad de reconocimiento de los oligonucleótidos pre- seleccionados con respecto las BSR.

Usando el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de acceso libre. nt)

Numero de pares de bases, #C) Numero de coincidencias, %) Porcentaje de identificación.

Primer 2 Forward

GTCCATCAAGACCACCGAGT nt: 20 Tm: 64.5

BLAST

Anexo G. Especificidad de reconocimiento primer 2.

Usando el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de acceso libre. nt)

Numero de pares de bases, #C) Numero de coincidencias, %) Porcentaje de identificación.

Sequence ID Microorganismos nt % # C Longitud

CP015810.1 Microbacterium chocolatum strain SIT 101, complete genome

19 95 1 3117902

CP022862.1 Parastagonospora nodorum isolate Sn79-1087 chromosome 13, complete sequence

18 90 1 1396077

LN006619.1 Spirometra erinaceieuropaei genome assembly S_erinaceieuropaei, scaffold SPER_scaffold0006551

18 90 1 14303

CP023141.1 Aeromonas dhakensis strain KN-Mc-6U21, complete genome

17 85 1 4868053

LT629687.1 Pseudomonas koreensis strain BS3658 genome assembly, chromosome: I

17 85 1 6123913

EVALUACIÓN DE NUEVAS SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS …

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