EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA BIOAUMENTACIÓN CON …
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA BIOAUMENTACIÓN CON HONGOS DURANTE LA DEGRADACIÓN DE BORRAS ACEITOSAS DE LA INDUSTRIA PETROLERA MARÍA CAMILA PERDOMO RENGIFO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar por el título de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA BIOAUMENTACIÓN CON HONGOS DURANTE
LA DEGRADACIÓN DE BORRAS ACEITOSAS DE LA INDUSTRIA PETROLERA
MARÍA CAMILA PERDOMO RENGIFO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
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EVALUACIÓN DE LA BIOAUMENTACIÓN CON HONGOS DURANTE LA
DEGRADACIÓN DE BORRAS ACEITOSAS DE LA INDUSTRIA PETROLERA
MARÍA CAMILA PERDOMO RENGIFO
APROBADO
_________________________ __________________________
Concepción Puerta Bula, PhD Marcela Franco Correa, PhD
Decana Facultad de Ciencias Directora carrera de Microbiología Industrial
Facultad de Ciencias
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EVALUACIÓN DE LA BIOAUMENTACIÓN CON HONGOS DURANTE LA
DEGRADACIÓN DE BORRAS ACEITOSAS DE LA INDUSTRIA PETROLERA
MARÍA CAMILA PERDOMO RENGIFO
APROBADO
__________________________ __________________________
Fabio Roldan, Ph.D Cinthya Rondon
Director Codirectora
__________________________
Aura Marina Pedroza, Ph.D
Evaluador
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NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos
de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las
tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vean en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia”
Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946.
5
AGRADECIMIENTOS
A Dios, a mis padres y mi familia por apoyarme y motivarme a terminar esta etapa de mi vida y ser
mejor cada día.
A Fabio Roldán por su paciencia, asesoría y su interés en formarme como persona y profesional con
el fin de concluir de manera exitosa este proyecto.
A Cinthya Rondon, Hernán Avellaneda, Gustavo Pinilla y al equipo de USBA por su apoyo y
colaboración para la realización de este trabajo.
A Juan David Álvarez por saber escucharme y motivarme en cada momento a pesar de las
dificultades.
A mis amigos por motivarme y alentarme a seguir adelante en esta etapa de mi vida.
A la Pontificia Universidad Javeriana, Colciencias y ATP Ingeniería por la financiación de este
proyecto.
Gracias.
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RESUMEN.
Actualmente, la demanda del petróleo a nivel mundial ha estado en aumento y las industrias petroleras
se han visto forzadas en satisfacer dicho comportamiento con la expansión de sus sistemas de
extracción, producción y procesamiento del petróleo. Esta situación ha generado un incremento en
los problemas de contaminación en el ambiente por la producción de residuos (p.e., lodos aceitosos,
cortes de perforación, salmueras, borras), lo que ha ocasionado un desequilibrio en diferentes
ecosistemas. Los lodos aceitosos son una emulsión compleja de HCs, agua, metales pesados, sólidos,
y puede variar su composición de acuerdo con el tipo de crudo, lugar de extracción, fuente, etc.
Generalmente, los lodos aceitosos son sedimentos que se generan en el fondo de los tanques de
almacenamiento del crudo, estos son retirados y al someterlos a diferentes procesos físico/químicos
(centrifugación) se separa la fase líquida de la fase sólida, la fase sólida denominada “borras” es
considerado un residuo altamente recalcitrante, voluminoso y persistente en el ambiente y del cual no
se ha estudiado en detalle suficientemente, por lo que no se tiene un amplio conocimiento acerca de
los tratamientos que podrían ser efectivos para disminuir la toxicidad de dicho compuesto.
Las técnicas físico químicas para la remediación de sitios contaminados por este tipo de residuos han
mostrado diferentes desventajas (p.e. generación de subproductos perjudiciales para el ambiente,
degradación incompleta de hidrocarburos) por lo que es necesario implementar técnicas que generen
mayor beneficio al ambiente. La biorremediación es un método alternativo que consiste en el uso de
organismos vivos con el fin de degradar contaminantes en un ambiente en específico. Se considera
una técnica completa, rentable y amigable con el medio ambiente, por lo que ha sido altamente
utilizada para el tratamiento de suelos contaminados.
Por lo tanto, el presente trabajo tiene por objetivo evaluar el efecto de la bioaumentación empleando
hongos durante la degradación de borras aceitosas provenientes de la industria petrolera. Los hongos
poseen diferentes ventajas como es la tolerancia a condiciones extremas, mecanismo de crecimiento
fúngico que permite una mayor colonización de los contaminantes y presencia de enzimas
extracelulares de baja especificidad que pueden inducir a procesos de co-metabolismo. Para lograr
esto se buscó seleccionar los hongos con mayor capacidad degradadora de hidrocarburos presentes
en borras aceitosas, definir el consorcio con mayor capacidad degradadora para su posterior uso en
campo y establecer el efecto de la bioestimulación sobre el proceso de biodegradación de las borras.
Para el desarrollo del proyecto, inicialmente se reactivaron 18 hongos que se encontraban conservados
en papel filtro y en viales. Luego, se realizó un cultivo de los hongos en caldo Extracto de Malta (EM)
para posteriormente inocularlos en microcosmos con el fin de evaluar la degradación de los
hidrocarburos totales de petróleo (TPHs) presentes en las borras durante 1 mes. Esta evaluación se
realizó para cada hongo individualmente y para consorcios fúngicos usando cromatografía de tipo
GC-FID. Adicionalmente, se realizó un seguimiento de densidad en agar Rosa de Bengala (RB) con
tres eventos de muestreo (0, 15 y 30 días).
Como resultados principales, se obtuvo que el hongo que presentó mayor degradación de HCs
presentes en las borras fue ATPH 36 con un porcentaje de degradación de 54,01±10,52%, seguido de
Ganoderma sp., y ATPH 54 con un porcentaje de degradación de 28,96±13.54% y 38±18,6%,
respectivamente. ATPH 36 presentó una mayor degradación de HCs que el control sin inóculo
(29±13,5%), lo que indica que la bioaumentación fue efectiva para dicho tratamiento. En cuanto a los
consorcios evaluados se obtuvo que el Consorcio 2 alcanzó un porcentaje de degradación con
20,30±17,93%, este valor no fue mayor que la degradación obtenida por el control sin inóculo.
Por otro lado, los tratamientos que presentaron mayor crecimiento en 30 días fueron los hongos
denominados ATPH 39, 41, 7, 28, 33, 9 y 40, lo que indica que la cantidad de biomasa fúngica
inoculada no tuvo efecto en el crecimiento de los hongos en el tiempo evaluado y la degradación
obtenida no corresponde a los hongos que presentaron mayor crecimiento lo que indica actividad
enzimática y procesos de co-metabolismo.
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TABLA DE CONTENIDO.
Resumen.
1. Introducción…………………………………………………………………………….....1
2. Planteamiento del problema y justificación…………………………………………..…2
3. Marco teórico y referentes conceptuales………………………………………………...4
3.1. Industria petrolera en el mundo y en Colombia………………………………..….4
3.2. Petróleo…………………………………………………………………………….....5
3.3. Residuos de la industria petrolera………………………………………………......5
3.3.1. Sedimentos en el fondo de tanques de almacenamiento………………...…6
3.3.2. Lodos aceitosos…………………………………………………………….....6
3.3.3. Cortes de perforación……………………………………………………......6
3.3.4. Salmueras…………………………………………………………………….7
3.3.5. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH)…………………………......7
3.3.6. Borras aceitosas……………………………………………………………...7
3.4. Tratamientos que se utilizan para la degradación de borras aceitosas………......8
3.4.1. Tratamientos fisicoquímicos para la degradación de borras aceitosas….....8
3.4.2. Biorremediación…………………………………………………………….....9
3.4.3. Atenuación natural…………………………………………………………....9
3.4.4. Bioestimulación……………………………………………………………..…9
3.4.5. Bioaumentación………………………………………………………………10
3.4.6. Uso de Microorganismos nativos……………………………………………10
3.4.7. Uso de Microorganismos externos…………………………………………..10
3.4.8. Uso de Microorganismos genéticamente modificados……………………..10
3.5. Técnicas de biorremediación………………………………………………………11
3.5.1. Biolabranza…………………………………………………………………...11
3.5.2. Bioventeo……………………………………………………………………...11
3.5.3. Biopilas………………………………………………………………………..12
3.6. Hongos degradadores de PAHs…………………………………………………...12
3.6.1. Hongos ligninolíticos o de pudrición blanca……………………………...13
3.6..2. Pleurotus sp…………………………………………………………………14
3.6..3. Ganoderma sp………………………………………………………………14
3.6.4. Hongos no ligninolíticos………………………………………………………..14
3.7. Antecedentes………………………………………………………………………….…14
4. Objetivos…………………………………………………………………………………15
5. Metodología……………………………………………………………………………...15
5.1. Reactivación de las cepas fúngicas………………………………………………....16
5.2. Crecimiento del hongo en cultivo líquido y obtención de biomasa fúngica….....17
5.3. Evaluación de la degradación de hidrocarburos en microcosmos por cada
hongo………………………………………………………………………………..17
8
5.4. Evaluación de la degradación de hidrocarburos en microcosmos por consorcios
fúngicos……………………………………………………………………………..17
5.5. Determinación de crecimiento de hongos filamentosos presente en los microcosmos
a lo largo del tiempo……………………………………………………………….18
5.6. Cuantificación de hidrocarburos por cromatografía de gases…………………18
5.7. Análisis estadístico………………………………………………………………...18
6. Resultados y discusión…………………………………………………………………19
7. Conclusiones…………………………………………………………………………....35
8. Recomendaciones………………………………………………………………………35
9. Bibliografía……………………………………………………………………………..36
ÍNDICE DE FIGURAS.
Figura 1. Crecimiento fúngico de cada uno de los microcosmos realizados en el tiempo 0…………21
Figura 2. Crecimiento fúngico de cada uno de los microcosmos realizados en el tiempo 30….…...22
Figura 3. Crecimiento fúngico de cada uno de los microcosmos realizados en el tiempo 30, agrupados
de la siguiente manera (A) tratamientos que presentaron mayor crecimiento, (B) tratamientos que
presentaron un crecimiento medio y (C) tratamientos que presentaron el menor crecimiento en el
tiempo final………………………………………………………………………………………….24
Figura 4. Crecimiento fúngico en los microcosmos evaluados en el tiempo donde los hongos
inoculados fueron (A) ATPH 26, 33, 53, 54. (B) ATPH 15, 36, 9, Pleurotus sp., (C) ATPH 39, 55,
Hongo Borras, Ganoderma sp., (D) ATPH 28, 52, 7 y (E) ATPH 40, 41, 19. Cada uno comparado
con el control Sin inóculo…………………………………………………………………………...26
Figura 5. Concentración de TPHs transformados en Log base 10 en el tiempo 0 agrupados en (A)
primer montaje, (B) segundo montaje y (C) tercer montaje…………………………………………29
Figura 6. Concentración de TPHs transformados en Log base 10 en el tiempo 30 agrupados en (A)
primer montaje y (B) segundo montaje de los tratamientos evaluados………………………………31
Figura 7. Vías de degradación de PAHs por hongos de podredumbre blanca y hongos con sistema
P450 monooxigenasa………………………………………………………………………………..33
Figura 8. Porcentaje de degradación de TPH de los tratamientos de hongos evaluados
individualmente.
9
ÍNDICE DE TABLAS.
Tabla 1. Producción de petróleo en Producción Fiscalizada de Petróleo (KBPD) en diferentes plantas
operadoras……………………………………………………………………………………………5
Tabla 2. Residuos generados y procesos de tratamiento realizados en la empresa ATP……………8
Tabla 3. Hongos que se reactivaron en agar EM……………………………………………………16
Tabla 4. Log Recuento (UFC/g) y cantidad de biomasa que se inoculó de cada hongo en el primer
montaje……………………………………………………………………………………………...19
Tabla 5. Log Recuento (UFC/g) y cantidad de biomasa que se inoculó de cada hongo en el segundo
montaje……………………………………………………………………………………………...20
Tabla 6. Log Recuento (UFC/g) y cantidad de biomasa que se inoculó de cada hongo en el tercer
montaje…………………………………………………………………………………………...…20
1
1. INTRODUCCIÓN.
El petróleo se considera un recurso energético y una materia prima indispensable para diversas
industrias a nivel mundial. Además, es considerado como un motor de crecimiento económico en
varios países del mundo (Varjani 2017). Evidentemente continuará contribuyendo con una fracción
importante en la generación de energía en todo el mundo durante las próximas décadas. La
Administración de Información Energética de los Estados Unidos (EIA) estableció que para el 2025
la demanda mundial del petróleo puede ser hasta 123 millones de barriles por día mientras que la
Organización de Países Exportadores de Petróleo (OPEP) ha estimado que la producción será
aproximadamente de 61 millones de barriles por día (Sahu et al. 2015). Esta diferencia entre la
demanda y la producción traerá como consecuencia una expansión continua de las operaciones de
producción y procesamiento de petróleo para satisfacer el crecimiento acelerado de la demanda
energética mundial (Ismail et al. 2017)
El aumento de la demanda de combustibles fósiles en el mundo ha generado que la industria petrolera
aumente la producción de residuos tóxicos ya que en China se generan más de 1 millón ton de lodos
aceitosos (Lin et al. 2018), en Estados Unidos se produce aproximadamente 1130 ton, en México se
produce aprox. 6,27,000 ton, en Canadá se produce aprox. 3800 ton, en Nigeria 95,500 ton, dichos
residuos provienen mayoritariamente de los tanques de almacenamiento de petróleo crudo (4,6)
En Colombia, según el Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM)
(IDEAM 2016), la actividad industrial que genera mayor cantidad de residuos peligrosos son los
trabajos relacionados con la extracción del petróleo crudo y gas natural con 118 mil ton (38%), donde
el departamento del Meta es quien reportó la mayor generación de dichos residuos ya que la
producción de residuos aceitosos en Castilla-Chichimene según Ecopetrol S.A. en 2011 desde el 2011
hasta el 2015 es de 575 ton.
En Colombia al igual que en otros países existen entidades gubernamentales, como el Ministerio del
Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible y la Autoridad Nacional de Licencias Ambientales (ANLA)
encargadas de promover la conservación y restauración del impacto ambiental que se obtiene a causa
de la actividad humana. Esta situación conlleva a las compañías petroleras en contactar empresas que
se especialicen en el tratamiento de este tipo de residuos, ya sea por métodos físico/químicos o
biológicos.
ATP ingeniería es una empresa colombiana que proporciona asesorías técnicas en diferentes ámbitos
(químico, petrolero, ambiental e industrial) y ha prestado sus servicios con el fin de reducir el impacto
ambiental proporcionando estrategias para el manejo y disposición correcta de dichos residuos.
Inicialmente, la empresa recibe los lodos aceitosos (son residuos caracterizados por ser una emulsión
estable de agua, sólidos, PAHs y metales) (E.A and Meshcheryakov 1999) para someterlos en un
tratamiento físico/químico (centrifugación) con el fin de separar la fase acuosa de la fase sólida, esta
fase sólida es denominada “borras”. Las borras aceitosas se caracterizan por ser mezclas densas con
alta concentración de hidrocarburos de cadena larga, sulfuros, arena, entre otros compuestos
(Espinoza 2003), además de ser residuos altamente recalcitrantes y persistentes en el ambiente. Por
esta razón, es necesario emplear métodos que logren reducir la toxicidad de los contaminantes
generando la menor cantidad de subproductos (p.e., CO2 y lixiviados en aguas/suelos subterráneos y
superficiales)
La biorremediación es una estrategia que es utilizada con el fin de lograr mitigar el impacto ambiental
que genera la industria petrolera. Se caracteriza por ser menos costosa que los métodos
físico/químicos, puede ser in situ y ex situ, no es invasiva (la interferencia en el sitio es mínima), tiene
mayor aceptación pública, etc. (Boopathy 2000).
2
Se han desarrollado diferentes tratamientos para la remedación de sitios contaminados como es: (a)
la biolabranza (es un método en el cual el suelo contaminado se extiende de tal forma que se estimule
la actividad de las bacterias mediante la adición de fertilizantes y aireación) (Thapa and Ghimire
2012), (b) bioventeo (es un método in situ que usa microorganismos nativos con el fin de degradar
compuestos en zonas insaturadas del contaminante) (EPA 1994a), (c) biopilas (es un método que
implica la construcción de pilas con suelo contaminado para estimular la actividad microbiana
aerobia) (Da Silva, Chaves Alves, and Pessoa de Franca 2012), entre otros, y se han desarrollado
diferentes estrategias entre las cuales se encuentra la (d) bioestimulación (proceso en el que se
adiciona nutrientes, aceptores de electrones, oxígeno, etc., para estimular la población microbiana)
(Thapa and Ghimire 2012) y (e) la bioaumentación (es la adición de un grupo de microorganismos
(p.e., bacterias, hongos, algas, etc.) nativos o genéticamente modificados en un sitio contaminado)
(Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017).
Los hongos han demostrado diferentes ventajas frente a otros microorganismos debido a la presencia
de enzimas extracelulares capaces de inducir procesos de co-metabolismo a causa de su
inespecificidad (Winquist et al. 2014) o presencia de sistemas enzimáticos como citocromo P450
monooxigenasa (Durán and Esposito 2000) que facilitan la degradación de contaminantes.
Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo disminuir los hidrocarburos presentes en las borras
aceitosas provenientes de la industria petrolera con el uso de hongos provenientes de tanques de
borras y hongos ligninolíticos aislados de madera para posteriormente ser aplicados en biopilas.
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN.
El crecimiento exponencial en la producción industrial en el mundo ha conllevado un alto consumo
de recursos naturales, especialmente por la industria de hidrocarburos (HCs) lo que ha generado
problemas ambientales y agricultura por la explotación y la producción excesiva de residuos. Los
residuos del petróleo generados en la etapas de producción, explotación, almacenamiento y
refinamiento pueden generar cambios en las propiedades físicas y químicas de los suelos provocando
deficiencia de nutrientes, afectar la capacidad de retención y disponibilidad del agua y crecimiento
de plantas provocando problemas en suelos agrícolas a largo plazo debido a la migración de
contaminantes a aguas subterráneas, así mismo ocasionando una reducción de la biodiversidad (Hu,
Li, and Zeng 2013; Tang et al. 2012).
En los residuos más comunes producidos por la industria petrolera se encuentran los lodos aceitosos,
estos según Hu en 2013 (Hu, Li, and Zeng 2013; Mater et al. 2006) se consideran recalcitrantes,
persistentes en el ambiente y son tóxicos en la salud humana debido a la concentración de HCs,
mayoritariamente PAHs, ftalatos, compuestos fenólicos, cianuro, metales pesados como el níquel y
cromo (Castaldi 2003). Debido a esta problemática es necesario implementar métodos
físico/químicos y/o biológicos para el tratamiento de dichos contaminantes.
En nuestro país se ha dificultado implementar el método apropiado y efectivo para la degradación de
este tipo de contaminantes por la baja disponibilidad de los hidrocarburos presentes en dichos
compuestos y la deficiencia de nutrientes a excepción del carbono para la degradación por parte de
los microorganismos.
Además, los métodos físico/químicos comúnmente utilizados (p.e., incineración, desorción térmica,
sedimentación) son costosas y la mayoría de los casos solo logran una degradación incompleta de los
contaminantes (Hu, Li, and Zeng 2013). Algunos procesos de biorremediación (p.e. landfarming,
biolabranza) pueden ocasionar la movilización de los contaminantes a otros ambientes generando
consecuencias como es la lixiviación en suelo, aguas subterráneas y superficiales ((EPA) 1987).
La situación anteriormente descrita tiene diversas consecuencias ya que dichos contaminantes
generados por la compañías productoras de petróleo pueden afectar la salud pública, ya que según la
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Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2010 (World Health Organization 2010) los HCs se
encuentran en la lista de contaminantes prioritarios debido a que son mutagénicos, teratogénicos y
carcinogénicos. Además, compuestos como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) son los
que representan mayor preocupación, ya que son insolubles en agua (hidrofóbicos), lo que contribuye
a su persistencia en el ambiente (Castaldi 2003).
Adicionalmente, el tratamiento de residuos generados en el proceso de producción de petróleo
representa uno de los mayores problemas de las industrias petroleras ya que son compuestos que
poseen alta densidad y volumen, por consiguiente, dificulta el manejo y disposición correcta de estos
por parte de dichas compañías. Por otro lado, deben cumplir ciertos parámetros establecidos en el
marco de la gestión integral, específicamente el Decreto 4741 de Diciembre 30 de 2005 que tiene por
objetivo proteger la salud humana y el ambiente mediante la regulación de la generación de residuos,
así como el manejo adecuado de estos.
Por este motivo, las compañías petroleras se ven obligadas en contactar empresas que se especialicen
en el tratamiento de este tipo de residuos. Sin embargo, en dichas empresas se ha presentado dificultad
en establecer el tratamiento efectivo y que se ajuste a las normas establecidas en el marco de la gestión
integral en el país para el manejo adecuado de algunos residuos, como las borras. Esto se debe a que
actualmente no se tiene un conocimiento amplio sobre estos residuos.
De acuerdo con esto, se hace necesario implementar alternativas para el manejo de este tipo de
residuos que eviten el inadecuado almacenamiento de borras, con el objetivo de tratar mayores
volúmenes de residuos bajo condiciones controladas, que ocupen menores áreas y lograr degradación
de los HCs. La biorremediación, es considerada una alternativa con varias ventajas ya que puede ser
utilizada in situ o ex situ, es rentable a comparación de los métodos fisicoquímicos, es posible tratar
diferentes tipos de contaminantes en varias matrices (suelo, agua subterránea, sedimentos), utiliza
métodos de baja tecnología por lo que no son invasivos, y generalmente poseen una gran aceptación
pública (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017).
Una técnica de biorremediación son las biopilas las cuales poseen diferentes ventajas como ser
relativamente simples y fáciles de implementar, el tratamiento requiere un corto tiempo, es una
técnica económica, puede ser efectivo para degradar compuestos orgánicos con bajas tasas de
biodegradación, puede ser diseñado como un sistema cerrado y requiere menos espacio que otras
técnicas de biorremediación (p.e. landfarming) (EPA 1994b)
En algunos lugares de Colombia (p.e., Orinoquía) donde se realiza la explotación de petróleo, ocurre
un alta precipitación de lluvias por lo que excede del límite permitido por la EPA (762 mm/año)
((EPA) 1994), este hecho limita el tratamiento de lodos aceitosos en campo abierto (p.e., biolabranza).
Por esta razón es necesario optimizar tratamientos que puedan realizarse bajo techo y que la dilución
permita los procesos biológicos reduciendo la toxicidad del contaminante mediante la mezcla de la
materia orgánica biodegradable.
El uso de hongos en este tipo de biotecnologías posee diferentes ventajas como la tolerancia de estos
organismos a condiciones extremas (p.e. altas concentraciones de HCs, pH y humedad baja), el
mecanismo de crecimiento fúngico permite una mayor distribución en la matriz sólida contaminada
(p.e. asfaltenos presentes en borras) y la presencia de enzimas extracelulares de baja especificidad
pueden inducir procesos de co-metabolismo, además los hongos no lignocelulósicos poseen la
presencia de un sistema enzimático como citocromo P450 monooxigenasa o epóxido hidrolasa que
facilitan la degradación por oxidación de xenobióticos (Durán and Esposito 2000; Subramanian and
Yadav 2009).
Por último, se ha visto la necesidad de usar este tipo de organismos para la degradación de borras
debido a que en proyectos realizados en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental
4
(USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana junto con ATP Ingeniería y Colciencias, se ha
implementado bioestimulación pero este no ha sido eficiente para la degradación de dichos
compuestos, esto es debido a la alta concentración de hidrocarburos de cadenas largas, aromáticos,
compuestos nitrogenados, sulfurosos y oxigenados, fracciones de asfaltenos, etc. de este tipo de
contaminantes (Machín-Ramírez et al. 2008), este hecho dificulta la degradación de todos los
componentes por parte de microorganismos nativos, aunque se tiene reportado la capacidad de estos
de degradar algunos componentes de dichos residuos (Das and Chandran 2011; Maachi, Abousseoud,
and Chaabane 2001)
Por lo tanto, se requiere utilizar otro tipo de estrategias de biorremediación como es la bioaumentación
con el fin de determinar la eficiencia de este procedimiento para la degradación de hidrocarburos
presentes en borras, y posteriormente evaluar la posibilidad de aplicar dicho procedimiento en
biopilas.
3. MARCO TEÓRICO Y REFERENTES CONCEPTUALES.
3.1. Industria petrolera en el mundo y en Colombia.
El petróleo se considera uno de los recursos energéticos más importantes, por lo que se ha convertido
en un recurso indispensable para diferentes industrias en el mundo y ha sido considerado como un
motor de crecimiento económico de diferentes países (Varjani 2017). Actualmente se ha observado
un incremento en la demanda del petróleo a lo largo de los años donde la industria petrolera ha tenido
que satisfacer dicho comportamiento mediante el desarrollo y ampliación de los sistemas de
extracción, producción y procesamiento del petróleo. Dicho comportamiento se encuentra reflejado
por diferentes estudios, de los cuales se encuentra un estudio realizado por Hu en 2013 (Hu, Li, and
Zeng 2013) donde se determinó que la producción logra ser más de 60 millones de toneladas de lodos
aceitosos en el mundo en el 2013, mientras que según La Administración de Información Energética
de los Estados Unidos (EIA) proyectó en el 2018 que en Estados Unidos se lograría producir más de
9.6 millones de barriles por día, y en el 2025 la demanda mundial de petróleo puede ser de 123
millones de barriles por día (U.S. Energy Information Administration 2018).
En cuanto a Colombia, según un estudio realizado por Agencia Nacional de Hidrocarburos (ANH)
(Agencia Nacional de Hidrocarburos (ANH) 2018), en el año 2016 hubo una producción diaria de
petróleo de 837 KBPD mientras que en el año 2017 la producción diaria de petróleo fue de 864
Producción Fiscalizada de Petróleo (KBPD). Por otra parte, la Unidad de Planeación Minero
Energética (UPME) determinó que en el 2015 (UPME 2016; Unidad de Planeación Minero
Energética (UPME) 2014) la producción de petróleo municipio de Puerto Gaitán fue
aproximadamente 52,321 KBPDC por la operadora CEPSA COLOMBIA S.A., en Nueva Castilla fue
aproximadamente 890,052 KBPDC por ECOPETROL, en Cabuyaro fue aprox. 103,332 KBDPC por
PETROMINERALES COLOMBIA LTD (Tabla 1). Según el estudio realizado, dichas regiones son
los mayores productores de petróleo en el país lo que hace del Meta el departamento con mayor
actividad en el ámbito petrolero en el país en cuanto a producción.
5
Tabla 1. Producción de petróleo en Producción Fiscalizada de Petróleo (KBPD) en diferentes plantas
operadoras.
Operadora. Lugar KBPDC.
CEPSA COLOMBIA S.A. Puerto Gaitán 52,321
ECOPETROL Nueva Castilla 890,052
PETROMINERALES
COLOMBIA LTD
Cabuyaro 103,332
3.2. Petróleo.
El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos (HCs) y compuestos orgánicos como son los
compuestos organometálicos, principalmente el vanadio y el níquel, también pueden poseer
componentes como el oxígeno, nitrógeno, azufre y compuestos inorgánicos, un ejemplo de ellos son
los metales. El petróleo crudo se considera un líquido inflamable y aceitoso, el cual es extraído
principalmente debajo de la superficie de la tierra. (Varjani and Upasani 2017)
El petróleo puede clasificarse de acuerdo con su densidad (sí es baja se denomina ligero o sí es alta
se denomina pesado), cantidad de azufre (sí es baja se denomina dulce o sí es alto se denomina agrío)
y se puede categorizar en cuatro fracciones que pueden ser: (a) saturados, (b) aromáticos, incluyendo
compuestos como el benceno o hidrocarburos aromáticos policíclicos, (c) resinas, como es el azufre,
oxígeno, etc., y (d) asfáltenos (Varjani and Upasani 2017).
El proceso del petróleo consiste en dos fases denominadas upstream y downstream. La operación en
upstream incluye procesos de extracción, transporte y almacenamiento del crudo mientras que la
operación en downstream consiste en los procesos de refinamiento del crudo (Varjani and Upasani
2017).
3.3. Residuos de la industria petrolera.
Los productos derivados del petróleo, son la mayor fuente de energia tanto para la industria como
para la vida cotidiana de las personas. Sin embargo, durante los procesos de exploración, producción,
refineria, transporte y almacenamiento, se pueden presentar fugas y ocasionar derrames accidentales,
los cuales son una de las principales causas de contaminación de suelos y aguas (Hu, Li, and Zeng
2013).
Anualmente, se genera un exceso de residuos alrededor del mundo, ya que según Hu en 2013 (Hu,
Li, and Zeng 2013), en Estados Unidos se producen alrededor de 30 mil ton de lodos aceitosos por
año ((EPA) 1991) y en China se producen 3 millones de ton de lodos aceitosos (Wang et al. 2012);
por lo que se estima que cada año se pueden producir más de 60 millones de ton de lodos aceitosos y
más de 1 billón de ton han sido almacenadas sin tratar alrededor del mundo (Da Silva, Chaves Alves,
and Pessoa de Franca 2012).
En cuanto a Latinoamérica, se ha calculado que anualmente en México se producen 400 mil ton por
año (Castañeda Jiménez et al. 2001) mientras que en Colombia, específicamente en la ciudad de
Barrancabermeja, las marismas lograron contener alrededor de 2 millones de metros cúbicos de lodos
aceitosos y se asoció con más de 5 millones de barriles de aguas contaminadas (Echeverría, Monsalve,
6
and Vidales 2002), debido a esta problemática ha sido necesario implementar diversas estrategias
físico/químicas y biológicas para tratar dichos contaminantes.
Los residuos aceitosos generados por la industria petrolera pueden caracterizarse como aceites
simples o lodos dependiendo de la proporción de agua y sólidos que se encuentren en el residuo. Los
aceites simples poseen menor cantidad de agua y sólidos a comparación de los lodos que poseen
mayor viscosidad por el alto porcentaje de sólidos presentes como es el caso de las borras (Hu, Li,
and Zeng 2013; Elektorowicz and Habibi 2005).
Entre los principales contaminantes provenientes de la industria petrolera se encuentran:
3.3.1. Sedimentos en el fondo de tanques de almacenamiento.
Los sedimentos en el fondo de tanques de almacenamiento se genera en el proceso realizado antes
del refinamiento del petróleo. El crudo es alojado temporalmente en tanques de almacenamiento con
el objetivo de separar los hidrocarburos del petróleo más pesados y ligeros (Hu, Li, and Zeng 2013)
donde los hidrocarburos más pesados sedimentan en el fondo del tanque junto con partículas sólidas
y agua (mezcla oleosa/aceitosa) este es eliminado en las operaciones de limpieza del tanque mediante
tratamientos físicos, químicos y/o biológicos (Hu, Li, and Zeng 2013).
3.3.2. Lodos aceitosos.
Los lodos aceitosos (del inglés: Oily sludge) se consideran una emulsión compleja de varios HCs,
agua, metales pesados y partículas sólidas (Wojtanowicz 2008; Kriipsalu et al. 2007; E.A and
Meshcheryakov 1999). Los compuestos presentes en los lodos aceitosos varían según el tipo de crudo,
el lugar de extracción, su formación y la fuente de la cual proviene este tipo de residuos (Hu, Li, and
Zeng 2013), de este último, los principales residuos generados en la operación down stream como
sólidos de aceite en emulsión en el proceso de decantación, residuos que se generan en el separador
de aceite y agua, lodo que se genera en la unidad de floculación-flotación, lodo activado en exceso
de la planta de tratamiento biológico de aguas residuales, sedimentos que pueden generarse en el
fondo de tanques de almacenamiento, entre otras (Hu, Li, and Zeng 2013) (Tabla 2)
Los lodos aceitosos son residuos que se caracterizan por ser emulsiones estables, dicha estabilidad
depende de la partículas (p.e. asfáltenos, resinas, sólidos finos, ácidos orgánicos solubles en aceite,
entre otros) que restringen la fusión de gotas de agua y su pH se encuentra entre 6.5 y 7.5 (10,11)
Los lodos aceitosos suelen acumularse en el proceso de refinamiento del petróleo por daños de la
bomba, falla del desalador, inconsistencia en la limpieza periódica de los tanques de almacenamiento,
rotura de tuberías, entre otras (Elektorowicz and Habibi 2005).
Generalmente, la cantidad de HCs del petróleo en los lodos aceitosos puede estar entre 5% a 86%
mientras que el contenido de agua puede estar entre 30% a 85%. Entre los HCs más representativos
se encuentran los alifáticos y aromáticos (p.e. alcanos, benceno, fenoles, xilenos, PAHs, entre otros)
que suelen estar en una concentración del 75% de hidrocarburos presentes en los lodos aceitosos, el
contenido de azufre, oxígeno, nitrógeno se encuentra en el rango de 0.3-10%, menor a 4.8%, menor
a 3%, respectivamente. (Hu, Li, and Zeng 2013)
7
3.3.3. Cortes de perforación.
Los cortes de perforación (del inglés: Drill cutting) es un subproducto del proceso de perforación
(Mostavi, Asadi, and Ugochukwu 2015) los cuales son generados en la fase de trituración de rocas
por la broca. En el proceso de perforación se requiere el uso de fluidos o “lodos” con el fin de
suministrar un medio de transporte para los recortes de perforación, también son utilizados para
enfriar, lubricar la broca y estabilizar las presiones subsuperficiales de los pozos para evitar
explosiones (Ball, Stewart, and Schliephake 2012).
A medida que ocurre el proceso de trituración, los recortes quedan atrapados en los fluidos utilizados
en el proceso los cuales son retirados de los fluidos y de otros contaminantes cuando llegan a la
superficie con el fin de que el lodo pueda ser reutilizado en la operación. Los sólidos son almacenados
en tanques o fosas para su posterior tratamiento (Ball, Stewart, and Schliephake 2012)
3.3.4. Salmueras.
Las salmueras (del inglés: Produced water) son aguas formadas en el proceso de producción del
petróleo y gas. La composición de las sustancias químicas presentes en dichos fluidos dependen de
las características geológicas de los reservorios usados para su explotación.
Estos residuos se caracterizan por ser complejos ya que pueden poseer HCs disperados, aromáticos,
alquifenoles, metales pesados, material readioactivo, material orgánico, partículas, sales inorgánicas
y ácidos orgánicos de bajo peso molecular (p.e. ácido acético y ácido propiónico) y ser re-inyectado,
puede aumentar la traza de químicos (p.e. biocidas, coagulantes/floculantes, eliminadores de oxígeno)
y microorganismos como bacterias sulfato reductoras (Bakke, Klungsøyr, and Sanni 2013)
3.3.4. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs).
Los PAHs (del inglés: polycyclic aromatic hydrocarbons) son un grupo extenso de grupos de
químicos que se caracteriza por poseer dos o más anillos aromáticos fusionados en forma lineal,
angular o agrupada. Se encuentran clasificados en PAHs de tamaño corto (quienes poseen menos de
seis anillos aromáticos) y PAHs de tamaño largo (Kadri et al. 2017).
Usualmente, los PAHs son sólidos incoloros de color blanco o amarillo que poseen puntos de fusión
y ebullición elevados, y baja solubilidad en agua si la estructura molecular de este es elevada. Son
producidos a partir de la combustión incompleta de materiales orgánicos que pueden ser carbón,
petróleo, madera, entre otros (Kadri et al. 2017).
Los PAHs pueden integrarse en el medio ambiente mediante diferentes procesos como es la
volatilización, fotooxidación, oxidación química, adsorción en las partículas del suelo y lixiviación
(Kadri et al. 2017).
3.3.4. Borras aceitosas.
Las borras aceitosas se generan en tanques de almacenamiento después de largos periodos de tiempo
por procesos de sedimentación y aglomeración de HCs y diferentes sólidos y elementos (p.e, arena,
sulfuros, asfalto) (Espinoza 2003). Esta mezcla es viscosa y densa lo que dificulta el bombeo de este
ocasionando taponamiento de las tuberías (Carrasco and Ore 2000).
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En Colombia, el proceso de centrifugación que realiza la empresa ATP Ingeniería S.A.S, en la planta
de tratamiento El Recreo, ubicada en el departamento del Meta, Colombia. La centrifugación se
realiza para recuperar hidrocarburos, remover el contenido de agua y separar la fracción sólida,
denominada “borras”.
Los tipos de borras existentes dependen del crudo que se deposita en los tanques de almacenamiento
y la composición de este, por lo que se puede clasificar en: (a) parafínicos, se caracterizan por estar
compuestos de hidrocarburos saturados de bajo peso molecular y poseer alta fluidez, (b) nafténicos,
el cual se encuentra compuesto de naftenos y PAHs, (c) mixtos, los cuales se encuentran formados
por parafinas, naftenos, hidrocarburos saturados, insaturados y aromáticos, (d) dulce, compuesto por
un contenido de azufre menor a 0.5% y (e) agrio, el cual posee un contenido de azufre mayor que 1%
(Gómez and Gómez 2015).
3.4. Tratamientos que se utilizan para la degradación de borras aceitosas.
3.4.1. Tratamientos fisicoquímicos para la degradación de borras aceitosas.
Existen diferentes tecnologías de remediación por métodos físicos, químicos y térmicos para el
tratamiento de las borras. Entre los métodos físicos se encuentra: (a) asentamiento y sedimentación,
en este proceso se generan piscinas cerca al lugar de extracción que poseen un material especial para
evitar la infiltración del contaminante al subsuelo, la borra extraída se deja por un periodo de tiempo
para generar la separación de hidrocarburos y lodos, después estos dos son separados para continuar
con tratamientos secundarios, (b) tamizado, consiste en separación de sólidos gruesos de la borra
antes de decantar, (c) flotación, floculación y filtración, consiste en retirar sólidos suspendidos en el
agua y (d) separación electrostática, en el cual se utiliza un campo eléctrico intenso generando unión
entre las gotas de agua y un aumento en el tamaño de estas, las cuales se sedimentan posteriormente
(Gómez and Gómez 2015).
Entre los métodos químicos usualmente se utilizan disolventes que diluyen las borras con el fin de
reducir la viscosidad de esta sin separar los componentes, esta técnica se utiliza con el fin de evitar
obstrucción en las tuberías en el proceso de extracción (Gómez and Gómez 2015).
En los métodos térmicos se encuentra: (a) desorción térmica, es una técnica que utiliza elevadas
temperaturas para remover compuestos orgánicos y agua de la mezcla e (b) incineración, es una
técnica que utiliza elevadas temperaturas para transformar los compuestos orgánicos a CO2 y H2O
por combustión, se considera uno de los métodos más costoso.
Tabla 2. Residuos generados y procesos de tratamiento realizados en la empresa ATP.
Residuo Procesos de tratamiento.
Borras/lodos base aceite 1. Desestabilización emulsión
2. Centrifugación
3. Desorción térmica
4. Biorremediación
Fluidos aceitosos 1. Separación de aceite
2. Oxidación, clarificación, filtración
3. Tratamiento físico avanzado:
Electrocoagulación y membranas
Salmueras 1. Separación material decantable
2. Tratamiento físico avanzado:
Electrocoagulación y desalinización
Fluidos acuosos 1. Separación material decantable
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2. Clarificación, Filtración
3. Tratamiento físico avanzado:
Electrocoagulación y membranas
Residuos base agua 1. Deshidratación
2. Acondicionamiento
3. Dilución bureal
Suelos contaminados 1. Clasificación
2. Acondicionamiento
3. Biorremediación
Residuos integrales 1. Pre-tratamiento
2. Aislamiento del residuo
3. Disposición en celda de seguridad
3.4.2. Biorremediación.
Es un método que implica el uso de organismos vivos con el fin de degradar o desintoxicar
contaminantes peligrosos en un ambiente en específico. Se utilizan las capacidades metabólicas de
los microorganismos para eliminar o reducir contaminantes en un sitio por medio de diferentes
estrategias como la atenuación natural, la bioestimulación y bioaumentación (Álvarez and Illman
2005; Kriipsalu et al. 2007).
La biorremediación se ha empleado y ha sido bien desarrollado para tratar suelo contaminado con
petróleo, residuos y derivados de este ya que se considera una técnica completa, rentable y amigable
con el medio ambiente a diferencia de otras técnicas de remediación que son los procesos químicos y
físicos (Quinmei et al. 2018) también se caracteriza porque requiere un diseño de baja energía,
construcción, operación, y uso simple (Al-Hawash et al. 2018).
Diferentes microorganismos (p.e. bacterias, algas, levaduras y hongos) pueden usar los hidrocarburos
como su única fuente de energía y/o como fuente de carbono (Al-Hawash et al. 2018) dependiendo
de diferentes factores como son las condiciones ambientales, el tipo de microorganismo presente, la
naturaleza y estructura química del compuesto a remover (Kadri et al. 2017).
Los parámetros más importantes para tener en cuenta en la biorremediación es la diversidad
microbiana que posee el suelo a tratar, la naturaleza del contaminante y las propiedades del suelo (p.e.
pH, temperatura, potencial óxido-reducción, humedad, nutrientes, aireación, entre otros.) (Morillo
and Villaverde 2017)
3.4.3. Atenuación natural.
La atenuación natural es un proceso mediante el cual la concentración del contaminante se reduce
mediante procesos físico-químicos (p.e. rayos U.V, volatilización, procesos de óxido-reducción) y
biológicos sin la intervención humana (Thapa and Ghimire 2012). La degradación de un contaminante
por atenuación natural ocurre por el resultado de un número de procesos que involucran la dispersión
y por lo tanto la dilución del contaminante en el sitio a tratar, biotransformación, sorción, entre otros
procesos. La biotransformación depende de factores como nutrientes, capacidad degradativa y de
proliferación de poblaciones microbianas, aireación, etc. (Fraser et al. 2008)
10
3.4.4. Bioestimulación
La bioestimulación implica la modificación de las condiciones de un entorno para estimular la
actividad metabólica de los microorganismos nativos (Al-Hawash et al. 2018), esto se encuentra dado
por la determinación de parámetros limitantes como pueden ser los nutrientes, aceptores de
electrones, oxígeno, pH, temperatura, humedad, entre otros (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget
2017) y proporcionarlos al medio con el fin de potenciar el crecimiento microbiano mediante la
formación de biomasa el cual puede eliminar el contaminante de forma directa usando dichos
sustratos como fuente de carbono y energía o de forma indirecta, que puede ser mediante co-
metabolismo, proceso donde los microorganismos producen enzimas capaces de degradar un sustrato
primario pero dichas enzimas también poseen la capacidad de degradar sustratos secundarios, como
es el contaminante presente en el medio (Semrany et al. 2012).
Existen diferentes técnicas para emplear bioestimulación, algunas de ellas son (a) la adición de
biosurfactantes con el fin de que el contaminante tenga mayor biodisponibilidad y los
microorganismos nativos puedan proliferar y consumir dicho compuesto mediante la emulsificación
(Ju Zhang et al. 2011) y (b) la adición de solventes hidrofóbicos biocompatibles con el fin de moderar
la toxicidad de algunos contaminantes que se encuentran altamente concentrados depositándolos en
una fase acuosa donde los microorganismos pueden proliferar y consumir una baja cantidad de
contaminantes. (Zilouei, Guieysse, and Mattiasson 2008)
3.4.5. Bioaumentación
Se considera una tecnología empleada para eliminar contaminantes basada en la adición de
microorganismos, previamente caracterizados como degradadores. Se pueden inocular
microorganismos nativos, externos o genéticamente modificados (Thapa and Ghimire 2012).
3.4.6. Uso de Microorganismos nativos.
Los microorganismos son aislados de ambientes contaminados generalmente usando cultivos de
enriquecimiento para luego ser re-inoculados en el mismo lugar. Este tipo de Bioaumentación se
aplica cuando la degradación del contaminante es baja y se atribuye a una baja concentración de
biomasa y/o una alta concentración de contaminante tóxicos, por lo que se debe inocular una alta
concentración de biomasa con el fin de asegurar la sobrevivencia de un número suficiente de
microorganismos para la degradación de contaminantes (Semrany et al. 2012).
Diferentes estudios han determinado que la Bioaumentación con microorganismos autóctonos puede
ser aplicada in situ en vez aislar los microorganismos e implementar un cultivo de enriquecimiento
para que posteriormente sean re-inyectados (Jingxin Zhang et al. 2012).
3.4.7. Uso de Microorganismos externos.
Los microorganismos externos son extraídos de un lugar diferente y posteriormente son introducidos
al sitio contaminado (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017). En ocasiones, no necesariamente
logran adaptarse a las condiciones abióticas (p.e. pH, temperatura, salinidad) (Mrozik and
Piotrowska-Seget 2010) y a las condiciones bióticas ya que pueden entrar en competencia por
nutrientes con los microorganismos y protozoarios nativos del sitio contaminado (Yu, Peng, and Ren
2011).
11
Una alternativa para que la Bioaumentación logre funcionar en ambientes hostiles es con la
inmovilización de microorganismos externos mediante métodos como adsorción, biofilms (Quan,
Tang, and Ma 2011) o con lodos activados granulares (Puyol et al. 2011).
3.4.8. Uso de Microorganismos genéticamente modificados.
Los microorganismos genéticamente modificados son células vivas que poseen genes que codifican
proteínas responsables de la degradación de compuestos recalcitrantes o se puede introducir de forma
directa vectores al medio ambiente (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017). Algunos
microorganismos al ser inoculados en el sitio contaminado generan una modificación de las
capacidades de degradación de los microorganismos nativos debido a la presencia de elementos
génicos móviles que se encuentran involucrados en el proceso de degradación. Por ejemplo, en el
caso de las bacterias, se pueden transferir plásmido mediante conjugación (Semrany et al. 2012).
La bioaumentación se utiliza en sitios con bajos recuentos de microorganismos degradadores o
cuando los microorganismos nativos no poseen las vías catabólicas necesarias para metabolizar los
contaminantes (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017). Los microorganismos nativos del sitio
contaminado pueden poseer capacidades metabólicas específicas para la biodegradación de crudo ya
que pueden adaptarse al ambiente en que dichos organismos se encuentran (Al-Hawash et al. 2018)
o se pueden introducir microorganismos externos de los cuales se conoce su capacidad degradadora
de petróleo (Al-Hawash et al. 2018).
Los criterios de selección de las cepas apropiada para utilizarlas en la Bioaumentación deben ser: (a)
tener un alto potencial para la degradación del contaminante, (b) rápido crecimiento, (c) fácil de
cultivar, (d) capacidad de soportar altas concentraciones del contaminante y (e) sobrevivir a un amplio
rango de condiciones ambientales.
El proceso para llevar a cabo la Bioaumentación se encuentra conformado por diferentes fases donde
la primer fase se basa en realizar un screening de microorganismos degradadores, este proceso
consiste en: (a) la recolección de la muestra de sitios contaminados (p.e. suelo, lodo, agua, sedimento,
etc.), (b) realizar un cultivo de enriquecimiento selectivo donde el contaminante es la única fuente de
carbono y energía usando un medio mínimo de sales, después de debe realizar (c) un aislamiento y
selección de los organismos usando agar con sales mínimas y el contaminante como única fuente de
carbono y energía, (d) identificación taxonómica de los aislamientos por análisis genéticos, pruebas
bioquímicas, entre otros. (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017)
La segunda fase consiste en determinar las características del potencial de degradación de los
aislamientos en condiciones de laboratorio para (a) determinar los factores que influyen en la tasa de
degradación (p.e. degradación metabólica, degradación por co-metabolismo, tamaño del inóculo,
temperatura, pH, concentración del contaminante, entre otros.) y por último se procede a la tercera
fase que consiste en un estudio de escalamiento en el cual se introducen los organismos previamente
aislados y seleccionados a los sitios contaminados; para dicho proceso se debe determinar (a) la
concentración del contaminante, (b) metabolitos y (c) las consecuencias físico-químicas y biológicas
producidas en la degradación del contaminante. (Cycón, Mrozik, and Piotrowska-Seget 2017)
12
3.5.Técnicas de biorremediación.
3.5.1. Biolabranza.
Biolabranza (del inglés: Landfarming) es una técnica utilizada para reducir la concentración de
petróleo en suelos por medio de la biodegradación o por procesos abióticos en donde ocurre una
propagación del suelo contaminado generando una capa delgada en al superficie del suelo en un sitio
de tratamiento con el fin de estimular los microorganismos aerobios y potenciar la actividad
microbiana para acelerar el proceso de biodegradación.
Las ventajas del uso de Landfarming es que es un técnica simple de implementar, requiere baja
cantidad de materiales destinados a infraestructura o equipos muy costosos, es efectivo para la
reducción de hidrocarburos en condiciones ambientales (Brown et al. 2017)
3.5.2. Bioventeo.
Bioventeo es una técnica de remediación in situ que se utiliza para biodegradar contaminantes
orgánicos adsorbidos en suelos no saturados mediante microorgansimos (EPA 1994a).
Los microorganismos nativos tienen la función de reducir el flujo de aire (u oxígeno) en la zona no
saturada del suelo, la cual es aplicada por inyección o pozos de extracción. El objetivo de los sistemas
bioventilados aplicados en esta técnica es promover la biodegradación de los contaminantes
minimizando la volatilización usando tasas de flujo de aire más bajas (EPA 1994a).
3.5.3. Biopilas.
Las biopilas son una modificación de la biolabranza donde se reduce el área requerida y el tiempo de
tratamiento, se utilizan con el fin de reducir las concentraciones de PAHs y otros constituyentes del
petróleo mediante la biodegradación. Este proceso consiste en acumular suelo contaminado en pilas
estimulando la actividad microbiana a través de la aireación (p.e. inyección de aire extracción de aire,
volteo) y/o adición de nutrientes, minerales, humedad, etc, dando como resultado la degradación del
petróleo (EPA 1994b).
Esta técnica resulta similar a landfarming ya que ambos procesos son técnicas que se trata suelo por
medio del oxígeno para estimular el crecimiento de microorganismos aerobios, la diferencia radica
en que las biopilas se ventilan con mayor frecuencia ya que son aplicadas por inyección o mediante
tuberías que se disponen en toda la biopila (EPA 1994b).
Las biopilas es considerada una alternativa efectiva para la reducción de constituyentes o compuestos
derivados del petróleo que generalmente se encuentran en tanques de almacenamiento, donde los
compuestos volátiles pueden ser eliminados mediante evaporación durante procesos de aireación para
posteriormente ser capturados antes de que se emitan a la atmósfera, y los compuestos con alto peso
molecular se reducen generalmente por biodegradación (EPA 1994b).
Existen diferentes parámetros a evaluar si se desea determinar la efectividad de un tratamiento en
biopilas como son las características del suelo (p.e. densidad de población microbiana, pH de suelo,
temperatura, concentración de nutrientes, textura), características de los contaminantes (p.e.
volatilidad, estructura química, concentración y toxicidad) y condiciones climáticas (p.e. temperatura
ambiente, viento, lluvia) (EPA 1994b)
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Las ventajas que poseen las biopilas es que dicha técnica es relativamente simple de diseñar e
implementar, su duración es corta (puede ser de 6 meses a 2 años bajo óptimas condiciones), es de
bajo costo, requiere menor espacio que otras técnicas como landfarming, puede ser diseñado como
un sistema cerrado con el fin de controlar los vapores que se puedan emitir, entre otras (EPA 1994b).
Las desventajas de usar biopilas es que pueden no ser efectivas en la reducción de altas
concentraciones del contaminante como son los hidrocarburos, en cuanto a las altas concentraciones
de metales pesados pueden llegar a inhibir el crecimiento microbiano, los compuestos volátiles
tienden a evaporarse en más cantidad que la biodegradación durante el tratamiento, la generación de
vapor durante la aireación requiere tratamientos, entre otras (EPA 1994b).
3.6. Hongos degradadores de PAHs.
En el medio ambiente los hongos pueden desempeñar un papel importante en el ciclo del carbono
orgánico, nitrógeno y fósforo, así como la degradación de compuestos xenobióticos, incluidos los
derivados del petróleo (Kriipsalu et al. 2007). Los principales hongos implicados en dicha función
son Aspergillus sp., Cephalosporium sp., Penicillium sp., Candida sp., Torulopsis sp.,
Saccharomyces sp., Paecilomyces sp., Gliocladium sp., Yarrowia sp., Pichia sp., Pleurotus sp.,
Geotrichum sp., Talaromyces sp., Cladosporium sp., Fusarium sp., Alternaria sp., Mucor sp.,
Polyporus sp., Rhizopus sp. y Rhodotolura sp (Simister et al. 2015).
3.6.1. Hongos ligninolíticos o de pudrición blanca.
Los hongos de pudrición blanca (del inglés: White-rot fungi) constituyen un grupo de hongos
pertenecientes a la división Basidiomycetes, quienes son capaces de despolimerizar y mineralizar,
como la lignina o sustratos como algunos xenobióticos. Estos hongos se consideran una pieza clave
para el ciclo del carbono. (Wesenberg, Kyriakides, and Agathos 2003)
El uso de hongos, principalmente los hongos de pudrición blanca, están emergiendo como una
alternativa que puede resultar efectiva para diferentes tipos de contaminantes orgánicos, ya que al
degradar compuestos de origen vegetal (p.e., lignina), permite estimular procesos de co-metabolismo.
Es importante mencionar que los hongos poseen un sistema de enzimas extracelulares que son
esenciales para la degradación de la lignina, y que se combinan con otros procesos para llevar a cabo
la mineralización de esta. Las tres enzimas principales son lignina peroxidasa (LiP, E.C. 1.11.1.14),
manganeso peroxidasa (MnP, E.C. 1.11.1.13) y lacasas (Lac, E.C. 1.10.3.2) (Vyas et al. 1994; Tortella
et al. 2013).
Los hongos ligninolíticos han sido estudiados extensivamente debido a la capacidad de producir
enzimas extracelulares con baja especificidad a un sustrato por lo que puede resultar en la degradación
y mineralización de diferentes contaminantes, aparte de degradar la lignina (Winquist et al. 2014).
Esta capacidad se atribuye a la presencia de la enzima lignina peroxidasa (LiP) (Vyas et al. 1994), la
cual es capaz de oxidar las estructuras no fenólicas de la lignina con la extracción de un electrón
generando radicales catiónicos los cuales son descompuestos de forma química (Hatakka 1994) y la
presencia de la enzima manganeso peroxidasa (MnP), la cual es capaz de oxidar Mn2+ a Mn3+ y oxidar
los anillos fenólicos a radicales fenoxi. (Hatakka 1994)
El proceso de degradación del contaminante comienza con la lignina peroxidasa la cual oxida los
PAHs de forma directa mientras que la enzima manganeso peroxidasa co-oxida dichos compuestos
de forma indirecta (Vyas et al. 1994), por lo que la ligninolisis es oxidativa y es inducida por el alto
oxígeno y baja condiciones de escasos nutrientes (p.e. nitrógeno) presente en el medio y hace parte
14
del metabolismo secundario del organismo. Ambas enzimas poseen glicoproteínas que requieren
peróxido de hidrógeno como agente oxidante (Kadri et al. 2017) y significantes fracciones de varios
contaminantes que son oxidados (p.e. PAHs) son incorporados en sustancias húmicas durante el
proceso de mineralización en la biorremediación (Winquist et al. 2014)
También se encuentran las enzimas que producen H2O2 (p.e. glioxal oxidasas y superóxido
dismutasa), enzimas que unen las diferentes vías para la degradación de lignocelulosa (p.e. glucosa
oxidasa y aril alcohol oxidasa) (Novotný et al. 2004), enzimas como citocromo P450 monooxigenasa,
epóxido hidrolasas, lipasas proteasas, dioxigenasas, entre otras enzimas, que han sido estudiadas
debido a su capacidad de degradar PAHs (Kadri et al. 2017).
Aunque los hongos se muestren como una alternativa altamente eficiente para la degradación de
diferentes compuestos tóxicos, existen pocos estudios que reporten escalamiento de tratamientos que
involucren hongos (Winquist et al. 2014) debido a que por ejemplo, los hongos de podredumbre
blanca requieren de condiciones especiales para su desarrollo y crecimiento, además que poseen baja
capacidad competitiva cuando se encuentran involucrados en un ambiente complejo y amplio
(Tortella et al. 2013)
3.6.2. Pleurotus sp.
P. ostreatus es un hongo de podredumbre blanca considerado como una potencial alternativa para la
degradación de PAHs (Tortella et al. 2013; Kadri et al. 2017) ya que este logra producir enzimas
extracelulares como lacasas, manganeso peroxidasas o peroxidasas independientes de manganeso. Se
ha reportado la degradación de hidrocarburos por parte de dicho hongo, específicamente con
fenantreno, el cual puede ser metabolizado a fenantreno trans-9R, 10R-dihidrodiol por una molécula
de oxigeno lo cual indica que P. ostreatus es capaz de oxidar el fenantreno por citocromo P-450
monooxigenasa y un epóxido hidrolasa para formar el dihidrodiol (L. E. A. Bezalel et al. 1996)
también se ha reportado que la remoción de antraceno ocurre en diferente rendimiento que el fluoreno
por dos diferentes vías
3.6.3.. Ganoderma sp.
Ganoderma sp. es un hongo de podredumbre blanca que ha sido investigado extensivamente en sus
aplicaciones en el ámbito farmacéutico. En cuanto a degradación, ha sido estudiado para tratar
farmacéuticos como ibuprofeno y carbamazepina, también ha sido reportado para la degradación de
tricloroetileno, triclosán, fenantreno, pentaclorofenol y tintes sintéticos (Coelho-moreira et al. 2017).
Los procesos de degradación generados se dan por la capacidad de dicho organismo en producir tres
tipos de enzimas ligninolíticas (p.e. lacasas y Mn peroxidasas) aunque la actividad enzimática varía
de acuerdo al tipo de cepa y las condiciones de cultivo (Ting et al. 2011).
3.6.4. Hongos no ligninolíticos.
Los hongos no ligninolíticos tienen la capacidad de crecer en diferentes sustratos distintos de la
madera y no producir peroxidasas y lacasas. Aún así han sido reportados para oxidar PAHs a
productos que sean solubles en agua, esta facultad se debe a la presencia de un sistema citocromo
P450 monooxigenasa (Cerniglia and Sutherland 2001). Este sistema produce epóxidos que pueden
ser reorganizar en derivados hidroxi o se pueden hidrolizar a dihidrodioles vicínicos (Haritash and
Kaushik 2009).
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3.7. Antecedentes.
Se ha observado en diferentes estudios el efecto que genera la bioaumentación en la degradación de
residuos generados por la industria petrolera. En el estudio realizado por Marchand en 2016 se
observó disminución de los HCs evaluados (antraceno, pireno, fenantreno y fluoreno) debido a
condiciones físicas como la volatilización, y la degradación realizada por las bacterias y hongos
evaluados en el estudio. Se determinó que hubo una mayor degradación (~80%) del fluoreno por
Trichoderma tomentosum, Fusarium oxysporum y Sphingomonas sp (Kriipsalu et al. 2007).
En otro estudio realizado por Mancera en el 2007 (Rodríguez-casasola et al. 2007) se aislaron cepas
bacterianas y fúngicas de suelos contaminados con HCs. Se observó que 3 cepas fúngicas del género
Rhizopus sp., Aspergillus funiculosum y Penicillium funiculosum presentaron degradación de los HCs
(60-72%).
Además otros estudios han demostrado el efecto positivo de la bioaumentación con el uso de cepas
fúngicas; en el año 2011 una investigación realizada por la universidad de Maharashtra de la India se
evaluó el efecto de la bioaumentación por Aspergillus niger (Bhalerao 2012) donde se inoculó a
suelos contaminado, como resultado se evidenció que el proceso de bioaumentación con la utilización
de cepas fúngicas en condiciones optimizadas puede proporcionar un modelo de biorremediación de
suelos contaminados con este tipo de residuos .
El grupo de investigación de Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la
Pontificia Universidad Javeriana ha realizado diversos estudios en biorremediación de sitios
contaminados. Entre ellos se encuentra la tesis de Sáenz y Rosas en 2010, en donde se buscó hongos
degradadores de TNT, PETN a partir de diferentes ambientes, los hongos que presentaron mayor
degradación de los contaminantes están bajo el término S2, H10, S3 y S4.
Actualmente se está realizando el proyecto de investigación denominado “Tratamiento de lodos
aceitosos de la industria petrolera empleando biopilas”, en donde se enmarca el presente trabajo de
grado. Dicho proyecto se está trabajando en conjunto con ATP Ingeniería SAS, la cual es una empresa
que presta asistencia técnica y profesional en la industria petrolera para el tratamiento de diversos
residuos como son las salmueras, fluidos acuosos, fluidos aceitosos, suelos y sedimentos, borras, entre
otros.
El objetivo del proyecto proyecto de investigación es optimizar un sistema de biopilas para el
tratamiento de lodos aceitosos generados por la industria petrolera a través de procesos de
bioestimulación y bioaumentación bajo condiciones de laboratorio y campo.
En trabajos previos realizados en USBA, se aislaron 18 hongos degradadores de PAHs (fenantreno,
antraceno y pireno). Se encontró que los hongos ATPH 7, 52, 53, 54 y 55 presentaron tolerancia a
los 3 PAHs y los hongos ATPH 28, 33 y 36 presentaron inhibición.
Actualmente, no se tiene conocimiento del efecto que poseen los hongos que fueron aislados en el
trabajo de grado mencionado anteriormente en la degradación de borras aceitosas. Por esta razón, es
importante evaluar la capacidad degradadora de los hongos por un método directo como la
cromatografía de gases y un método indirecto, que es la determinación de la densidad fúngica en el
tiempo (30 d)
16
4. OBJETIVOS.
4.1. Objetivo general.
Determinar el efecto de la bioaumentación con hongos durante la degradación de borras aceitosas
de la industria petrolera.
4.2. Objetivos específicos.
• Seleccionar los hongos con mayor capacidad degradadora de hidrocarburos presentes en
borras aceitosas.
• Definir el consorcio con mayor capacidad degradadora para su posterior uso en campo.
• Establecer el efecto de la bioestimulación sobre el proceso de biodegradación
5. METODOLOGÍA.
Se evaluó el efecto de la bioaumentación con hongos en la degradación de borras aceitosas
provenientes de la industria petrolera. Esta evaluación se llevó a cabo en microcosmos donde se
tuvieron en cuenta dos parámetros: (1) cuantificación de TPHs por cromatografía de gases, en dos
eventos de muestreo (0 y 30d) y (2) determinación de crecimiento fúngico durante el estudio
realizados en placa en agar RB. Se realizó tres eventos de muestreo (0, 15 y 30 días). Inicialmente, el
protocolo se llevó de cabo de la siguiente manera:
5.1. Reactivación de las cepas fúngicas.
Se reactivaron 15 hongos que previamente fueron aislados y evaluados por Barreto y Forero (2017).
De estos hongos, 7 cepas fueron aisladas de borras proveniente provenientes de una industria petrolera
en Meta (Colombia), 5 cepas fueron aisladas de borras provenientes de piscina 3 y 4 cepas fueron
aisladas de muestras de madera provenientes de Tunja, Boyacá. Los hongos fueron conservados por
el método de desecación en filtro y fueron guardados en sobres de papel pergamino estéril y en bolsas
Ziploc a -20ºC (Tabla 1.)
Se reactivaron 2 hongos de podredumbre blanca, específicamente Pleurotus sp y Ganoderma sp, los
cuales han sido reportados como degradadores de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs). (L.
E. A. Bezalel et al. 1996; Di Gregorio et al. 2016; Mohammadi-Sichani et al. 2018), Pleurotus sp. fue
aislado en un estudio realizado en USBA y Ganoderma sp. proviene del laboratorio de Microbiología
Ambiental de la Pontificia Universidad Javeriana. Ambos hongos se encuentran conservados en viales
por medio de discos de agar a 4±6°C (Tabla 1).
Se aisló 1 hongo presente en borras tratadas en el laboratorio de USBA en agar Extracto de Malta
suplementado con 100 mg/L de cloranfenicol, el cual posteriormente se repicó.
17
La reactivación de los hongos se realizó colocando un disco de papel filtro y un disco de agar en agar
Extracto de Malta suplementado con cloranfenicol (100 mg/mL) y se incubó a 20°C entre 2 a 3
semanas. Se realizó por triplicado.
Tabla 3. Hongos que se reactivaron en agar EM.
Origen. Número de hongos Conservación en USBA-PUJ.
Lodos aceitosos (Tanque de
borras)
12 hongos Método de desecación por
filtro a -20°C.
Madera, Tunja. Boyacá. 4 hongos Método de desecación por
filtro a -20°C.
Laboratorio de Microbiología
Ambiental – PUJ.
1 hongo (Ganoderma sp.) Viales por medio de discos de
agar 3±5°C.
Laboratorio Unidad de
Saneamiento y Biotecnología
Ambiental (USBA) – PUJ.
1 hongo (Pleurotus sp.) Viales por medio de discos de
agar 3±5°C.
(Borras III) Laboratorio
Unidad de Saneamiento y
Biotecnología Ambiental
(USBA) – PUJ.
1 hongo En el momento no se ha
planteado un método de
conservación.
5.2. Crecimiento del hongo en cultivo líquido y obtención de biomasa fúngica.
Se tomaron 10 discos (5 mm diámetro) del hongo creciendo en agar EM con cloranfenicol (100
mg/mL) y se colocaron en 100 mL de caldo EM con cloranfenicol (100 mg/mL) en Erlenmeyer de
250 mL. Estos cultivos se incubaron a 25°C a 120 rpm por 15d (Makadia et al. 2011; Marchand et al.
2017; Birolli et al. 2018).
La preparación de biomasa se realizó mediante dos formas (1) centrifugación a 10.000 rpm por 15
min, se descartó el sobrenadante y posteriormente se realizó un lavado con 10 mL de agua destilada
estéril (Wu et al. 2008) y (2) descarte directo del medio para recuperación de biomasa y lavado con
10 mL de agua destilada. Finalmente, se descartó el agua destilada en ambos métodos. Este proceso
se realizó dependiendo del crecimiento del hongo en cultivo líquido y la viscosidad del medio en el
momento de obtener la biomasa.
Posteriormente, se procedió a la inoculación del hongo colocando la biomasa obtenida en recipientes
de aluminio y se pesó en una balanza. De acuerdo con el peso obtenido, se distribuyó equitativamente
la biomasa en los microcosmos realizados.
18
5.3. Evaluación de la degradación de hidrocarburos en microcosmos por cada hongo.
La degradación de las borras fue evaluada en microcosmos (recipientes de vidrio 640 mL). Para cada
hongo, se emplearon tres microcosmos (n=3) usando 46,1 g de suelo orgánico con 23,2 g de bagazo
de caña de azúcar (Angel et al. 2017; Pérez-Armendáriz et al. 2010; Reyes-César et al. 2014; Antonio
Ordaz et al. 2011) y 23,2 g de cascarilla de arroz (Morais et al. 2014; Andriani and Tachibana 2016),
como materiales de aporte. Se empleó una relación de C:N:P (100:10:1) (Montero et al. 2015; Roldán,
García, and Garzón 2011) ajustada con sales inorgánicas (4,2 g NH4NO3 y 1.00 g K2HPO4) (Pérez-
Armendáriz et al. 2010). Los microcosmos fueron contaminados con 27,6 g de borras aceitosas para
alcanzar una concentración de 35,000 mg TPH/kg de suelo. Se buscó colocar 12 gramos con biomasa
de cada hongo con un tiempo de crecimiento de 15 días en el cultivo líquido (D’Annibale et al. 2005).
Los microcosmos se incubaron a 25°C durante 30 d (Mao 2016) y se realizaron 2 eventos (tiempo
inicial y tiempo final).
Cada 8 d se humedecieron los microcosmos con 3 – 5 mL de agua destilada estéril y se aireo mediante
la técnica de volteo cada 3 días (Cristina Vásquez et al. 2010). En total se realizaron 3 montajes, cada
uno con sus respectivos controles (Sin inóculo, Ganoderma sp., y Pleurotus sp.) y se repitieron los
hongos que no presentaron un peso de biomasa entre 6 a 12g.
5.4 Evaluación de la degradación de hidrocarburos en microcosmos por consorcios fúngicos.
Se definieron los consorcios según los resultados del screening enzimático y tolerancia a diferentes
hidrocarburos realizado en el trabajo de grado de Barreto y Forero en 2017. Se realizaron tres
consorcios, cada uno con 5 hongos: (1) consorcio 1, corresponden a los hongos que presentaron mayor
halo de decoloración del Azure B y mayor halo de formación de color verde por reducción del ABTS
con el fin de determinar LiP y lacasas, respectivamente. Se utilizaron los hongos denominados ATPH
41,9, 54, 26 y 28 (2) consorcio 2, corresponden a los hongos que presentaron la mayor tolerancia a
diferentes hidrocarburos a los 15d de crecimiento (antraceno, pireno y fenantreno). Se utilizaron los
hongos ATPH 55, 53, 7, 15 y 52 y (3) consorcio 3, corresponde a una mezcla de hongos que
presentaron mayor tolerancia a diferentes hidrocarburos y hongos que presentaron mayor halo de
decoloración del Azure B y ABTS. Se utilizaron los hongos ATPH 53, 55, 52, 7 y 41.
Los consorcios poseen los mismos controles que fueron realizados en el numeral 4.3.
5.5. Determinación de crecimiento de hongos filamentosos presente en los microcosmos a lo largo
del tiempo.
Se realizó diluciones seriadas con aproximadamente 1 g de suelo de cada unidad experimental en
agua destilada estéril, se refrigeraron las muestras suspendidas a 3ºC y se realizó siembra en agar
Rosa de Bengala suplementado con cloranfenicol (100 mg/L) de la siguiente manera: en el tiempo 0
de cada uno de los tratamientos se realizó la siembra de las diluciones 10-1 y 10-3, en el tiempo 15 se
realizó la siembra de las diluciones 10-2 y 10-4, y en el tiempo 30 se realizó las siembras de las
diluciones 10-3 y 10-5 . Cada una de las siembras se incubó por 8 días a 25°C. Este paso del
procedimiento se realizó solamente para evaluar el crecimiento fúngico de los microcosmos
inoculados con los hongos individualmente.
Los recuentos se informan como UFC de hongos filamentosos/g de suelo contaminado.
19
5.6. Cuantificación de hidrocarburos por cromatografía de gases.
Se muestreo 1 g tomando pseudoréplicas, esto se realizó por duplicado de cada unidad experimental,
se guardaron en sobres de papel aluminio y en tubos falcon (15 mL) y se refrigeraron a 3ºC.
Posteriormente, se realizó la extracción de hidrocarburos por microondas (MARS 6, CEM)
empleando el método 3546 de la EPA. Durante la extracción se utiliza una mezcla de acetona y
diclorometano (1:1 v/v) siguiendo el protocolo establecido en USBA.
La cuantificación de HCs se realizó mediante cromatografía de gases (GC-FID) empleando el método
MADEP EPH. Este método permitirá la determinación de alifáticos (cadena corta y larga) y PAHs.
5.7. Análisis estadístico.
Se evaluó la distribución normal de los datos por Shapiro-Wilk y en caso de no presentar normalidad,
fueron transformados con logaritmo base 10. Se utilizó la prueba HSD de Tukey-Kramer para
determinar diferencias significativas de los porcentajes de degradación de TPH obtenidos. Se realizó
una prueba t-student para determinar diferencias significativas de los tratamientos evaluados en el
tiempo. Se consideró una diferencia significativa cuando p≤0,05. Se determinó diferencia
significativa mediante regresión lineal entre los diferentes tratamientos según crecimiento fúngico.
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando JMP-IN® versión 14.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Durante el estudio se reactivaron 18 hongos, 11 de los cuales fueron aislados de lodos aceitosos, 4 de
madera, 1 de borras aceitosas en el laboratorio y finalmente 2 que fueron utilizados en estudios
anteriores (Ganoderma sp. y Pleurotus sp.).
Los datos del crecimiento fúngico no presentaron una distribución normal, ni homogeneidad de
varianzas. Por esta razón fueron transformados utilizando el logaritmo base 10 del recuento. A cada
tratamiento se le determinó el crecimiento fúngico a lo largo del tiempo y se realizó una comparación
del crecimiento obtenido al inicio y al final del experimento (0 y 30 d, respectivamente).
Al inicio del estudio los hongos que presentaron el recuento significativamente mayor fueron: hongo
borras (HB), ATPH 41, 52 y 19. Por otro lado los hongos Pleurotus sp., ATPH 7 y 40 presentaron el
recuento significativamente menor (Tukey-Kramer: p<0.05), mientras que los demás hongos no
presentaron diferencias significativas entre sus recuentos (Anexo 1). Estas diferencias observadas no
pudieron ser relacionadas con las cantidades de biomasa inicialmente adicionadas en los microcosmos
(Tablas 4-6). La masa de inóculo del hongo colocada en cada microcosmo dependía de la cantidad de
biomasa generada de este en cultivo líquido. Por esta razón algunos de los hongos lograron obtener
la biomasa deseada (~12 g), mientras que otros hongos no generaron esta biomasa. En el caso de los
hongos donde solo se alcanzó una biomasa pequeña (< 6 g) se volvió a cultivar para su evaluación en
el siguiente montaje.
Es importante mencionar que en el control sin inoculo se obtuvieron recuentos de hongos
(3,97±0,60log) lo que indica la presencia significativa de hongos en el material de aporte. Materiales
como el bagazo de caña y suelo pueden aportar una cantidad significativa de hongos al tratamiento,
aunque algunos de ellos no sean degradadores.
20
Tabla 4. Recuento (Log UFC/g) y biomasa (g) inoculada en el primer montaje.
Hongo Log Recuento (UFC/g) Cantidad de biomasa inoculada
(g) 0d 30d
Ganoderma sp. 3.87±0.66 4.77±0.07 12.0
Pleurotus sp. 4.50±0.34 5.47±0.75 3.9
ATPH 19 4.78±0.11 4.87±0.19 5.8
ATPH 26 4.31 ±0.66 6.16±0.63 6.0
ATPH 52 4.81±0.12 4.92±0.07 9.3
ATPH 53 4.19±0.89 6.10±0.73 6.0
ATPH 54* 4.23±0.72 5.54±0.66 2.5
ATPH 55 4.42±0.31 5.47±0.73 3.4
Nota: (*) Significa que se repitió en el siguiente montaje.
Tabla 5. Recuento (Log UFC/g) y biomasa (g) inoculada en el segundo montaje
Hongo Log Recuento (UFC/g)
Cantidad de biomasa (g) 0 d 30 d
Ganoderma sp. 3.17±1.0 6.15±0.12 12.0
Pleurotus sp. 3.69±0.89 6.08±0.14 12.0
ATPH 7 3.23±0.62 6.57±0.07 12.0
ATPH 15 3.84±0.94 5.95±0.90 12.0
ATPH 28 3.67±0.77 6.53±0.09 10.3
ATPH 36* 3.84±0.78 6.31±0.57 2.3
ATPH 9 3.62±0.90 6.25±0.54 9.6
ATPH 39 4.36±1.19 6.66±0.17 10.3
ATPH 41 4.88±0.44 6.58±0.16 10.3
ATPH 54 3.61±0.87 6.53±0.13 12.0
Nota: (*) Significa que se repitió en el siguiente montaje.
21
Tabla 4. Recuento (Log UFC/g) y biomasa (g) inoculada en el tercer montaje
Hongo Log Recuento (UFC/g)
Cantidad de biomasa (g) 0 30
Ganoderma sp. 4.49±0.27 6.37±0.12 12.0
Pleurotus sp. 3.31±0.69 6.36±0.13 12.0
ATPH 36 4.22±0.15 6.16±0.45 8.0
Hongo borras (HB) 5.07±0.39 6.23±0.16 12.0
ATPH 33 4.23±0.60 6.53±0.28 11.3
ATPH 40 2.99±0.15 6.24±0.42 8.7
Figura 1. Recuento fúngico en los microcosmos al inicio del estudio (t = 0).
Después de 30 días de estudio se observó un aumento significativo en los recuentos fúngicos en casi
todos los hongos, incluyendo el control sin inoculo (Tukey-Kramer: p<0.05)(Figura 2). Sin embargo,
los hongos ATP 52 y 19 no mostraron un aumento significativo a pesar de haber presentado los
mayores recuentos al inicio del estudio.
Hongos1
Lo
g R
ecu
en
to (
UF
C/g
)
0
2
4
6
Sin inoculo Ganoderma Pleurotus HB ATPH 40 ATPH 33 ATPH 55 ATPH 53 ATPH 54 ATPH 52 ATPH 19 ATPH 26 ATPH 7 ATPH 9 ATPH 15 ATPH 36 ATPH 39 ATPH 28 ATPH 41
22
Los hongos ATPH 41, 7, 28, 33, 36, 39 presentaron recuentos significativamente mayores que el
grupo de los hongos ATPH 52, 19 y el control sin inóculo. Por otro lado, los hongos ATPH 9, 40, 26,
53, 54, Pleurotus sp. y hongo borras también presentaron un crecimiento mayor que los hongos ATPH
52, 19 pero no que el control sin inóculo, mientras que los demás tratamientos no mostraron
diferencias significativas entre sí (Tukey-Kramer: p<0.05).
Figura 2. Recuento fúngico en los microcosmos al inicio del estudio (t = 30).
En terminos generales los hongos que presentaron los mayores recuentos durante el estudio fue la
cepa ATPH 39 (6.66±0.17 logUFC/g) seguida de las cepas ATPH 41, 7, 28, 33, 9 y 40 (Figura 3A).
Los hongos que presentaron un crecimiento medio fueron las cepas ATPH 36, 26, 53 y 54 y el Hongo
Borras (Figura 3B). Finalmente, los hongos que presentaron el menor crecimiento durante el estudio
fueron las cepas ATPH 19 ( 4.87±0.19 logUFC/g) seguida de las cepas ATPH 52, 55, control sin
inóculo y ATPH 15 (Figura 3C).
El crecimiento fúngico del control sin inoculo fue estimulado por los materiales de aporte y nutrientes
presentes en el microcosmos, de igual forma pudo ser estimulado por la presencia de las borras
aceitosas. Algunos de los hongos (ATPH 19, 52 y 55) presentaron recuentos menores que el control
sin inóculo posiblemente ocasionado por el antagonismo con el hongo inoculado. Según Borrero y
Forero (2017) estos hongos con bajo crecimiento pertenecen a los géneros Absidia sp., hongo de
Micelio estéril y Rhizopus sp., respectivamente.
Los materiales de aporte utilizados pudieron influir en el crecimiento fúngico de los hongos ATPH
39 y 41, pertenecientes al género Penicillium sp. La mezcla de estos materiales esponjosos (bagazo
de caña, cascarillas de arroz) permiten una mayor difusion de los tratamientos (aereacion) y nutrientes
dentro del microcosmo. Este hecho facilita la activación de enzimas y propicia la degradación de
PAH, ya que el oxígeno puede servir como un aceptor de electrones además de funcionar como un
co-sustrato para oxigenasas.
23
Se ha demostrado que la concentración de oxígeno tiene un efecto significativo en el metabolismo de
Penicillium sp., ya que en un estudio se determinó que cuando Penicillium frequentans crece en
bagazo de caña de azúcar y suelo contaminado con fenantreno, y es expuesto a altas tasas de oxígeno
pueden eliminar 52% del contaminante mientras que si es expuesto a bajas tasas de oxígeno
unicament elimina 13% de fenantreno (Meléndez-Estrada et al. 2006). Este hecho indica que la
concentración de oxígeno afecta el metabolismo, y por lo tanto, puede alterar el crecimiento de
diferentes géneros de Penicillium sp.
Se puede determinar que la cantidad de inóculo de los hongos evaluados no tiene un efecto en los
recuentos finales obtenidos (30 d). Esto se ve evidenciado en la figura 4A que inicialmente se inoculó
10.3 y 12 g para ATPH 39 y ATPH 7, respectivamente. A pesar de que la biomasa en ATPH 39 es
menor que la biomasa en ATPH 7; el hongo denominado ATPH 39 presento el mayor crecimiento en
el tiempo final. En la Figura 4C, se puede observar que ATPH 52 tiene uno de los menores
crecimientos fúngicos a los 30 días junto con ATPH 55 y Ganoderma sp., a pesar de que se inoculó
9.3, 8.4 y 12 g, respectivamente. A diferencia de ATPH 26, quien presentó un crecimiento fúngico
intermedio cuando se inoculó 6 g de este hongo inicialmente (Tabla 4-6)
(A)
24
(B)
(C)
Figura 3. Crecimiento fúngico de cada uno de los microcosmos realizados en el tiempo 30, agrupados
de la siguiente manera (A) tratamientos que presentaron mayor crecimiento, (B) tratamientos que
25
presentaron un crecimiento medio y (C) tratamientos que presentaron el menor crecimiento en el
tiempo final.
En las Figura 4A-E, se puede observar la evaluación del crecimiento fúngico de los microcosmos
donde se evaluaron los hongos individuales hasta el tiempo final (30 días) y se agruparon los hongos
de acuerdo a la diferencia significativa en su crecimiento a lo largo del tiempo. Acorde a la regresión
lineal realizada en la prueba estadística, se obtuvo que los hongos denominados ATPH 40, 41, 19, 28,
52 y 7 (Figura 4D-E) presentaron la mayor diferencia significativa en cuanto a su crecimiento a lo
largo del tiempo con respecto a los demás hongos evaluados (ver Anexo 3), mientras que los hongos
que no presentaron diferencia significativa en cuanto a su crecimiento a lo largo del tiempo fueron
los hongos denominados ATPH 55, Hongo Borras, ATPH 39 y Ganoderma sp., (Figura 4C) por
último los demás hongos (ATPH 26, 33, 53, 54, 15, 36, 9 y Pleurotus sp.) junto con el control Sin
inóculo mostraron una baja diferencia significativa en cuanto a su crecimiento a lo largo del tiempo,
lo que equivaldría a que su crecimiento fue constante desde el día 0 hasta el día 30 (Figura 4 A-B)
(A) (B)
(C) (D)
26
(E)
Figura 4. Crecimiento fúngico en los microcosmos evaluados en el tiempo donde los hongos
inoculados fueron (A) ATPH 26, 33, 53, 54. (B) ATPH 15, 36, 9, Pleurotus sp., (C) ATPH 39, 55,
Hongo Borras, Ganoderma sp., (D) ATPH 28, 52, 7 y (E) ATPH 40, 41, 19. Cada uno comparado
con el control Sin inóculo.
En los resultados anteriormente expuestos se puede evidenciar que los hongos presentes en dichos
tratamientos que mostraron crecimiento en el tiempo manifestaron mayor adaptabilidad a las
condiciones adversas (p.e. alta concentración de HCs de cadena larga), este hecho proporciona una
ventaja con respecto a las bacterias debido a que los hongos pueden adaptarse más fácilmente a
condiciones como pH y humedad baja. Según Prenafeta-Boldú en 2001, el desarrollo de los hongos
puede verse favorecido en evaluación de degradación en estado sólido (Prenafeta-Boldú et al. 2001).
En la Figura 3 y 4E, se puede observar que ATPH 9 posee uno de los crecimientos con mayor
significancia en el tiempo 30. Según Borrero y Forero en 2017, dicho hongo pertenece al género de
Penicillium sp. En un estudio realizado por Husaini en el 2018 (Husaini et al. 2008), se encontró que
los hongos pertenecientes al género Penicillium sp., obtuvieron el promedio de crecimiento más alto
(cm/día) que los demás hongos aislados en dicho estudio (Trichoderma sp. y Aspergillus sp.) cuando
estos se expusieron a gasolina, además lograron crecer rápidamente en un medio mínimo con 1% de
dicho compuesto.
Además, se observó que la presencia de los materiales lignocelulósicos utilizados (bagazo de caña de
azúcar, cascarilla de arroz) estimuló el crecimiento de los hongos, además del suelo orgánico y los
nutrientes que se aplicaron.
Es importante aclarar los componentes principales de dichos residuos lignocelulósicos. Sus
principales constituyentes son la celulosa, seguido de la hemicelulosa y la lignina. La celulosa y la
hemicelulosa son macromoléculas constituidas de diferentes azúcares, la celulosa se encuentra
constituida por subunidades de D-celulosa unidos por enlaces β1-4 y la hemicelulosa se encuentra
formada por D-xilosa, D-manosa, D-galactosa, D-glucosa, L-arabinosa, 4-O-metil-glucurónico, D-
galacturónico y ácidos D-galacturónico unos por enlaces β1-4 y β1-3 glucosídicos mientras que la
27
lignina es un polímero aromático constituido de precursores fenilpropanoides: alcohol coniferílico,
alcohol cumarílico y alcohol sinapílico (Sánchez 2009).
El proceso de biodegradación de los residuos lignocelulósicos por parte de los hongos se debe al
crecimiento micelial que permite al hongo transportar nutrientes como el nitrógeno y el hierro y a la
presencia de sistemas enzimáticos extracelulares: sistema hidrolítico y sistema ligninolítico
oxidativo, este último es capaz de abrir los anillos de fenilo para degradar la lignina. Los hongos de
podredumbre blanca tienen la capacidad de degradar la lignina mediante procesos oxidativos por un
sistema enzimático constituido principalmente por lignina peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa
(MnP) y lacasas (Sánchez 2009).
Las peroxidasas pueden oxidar un sustrato mediante dos etapas oxidativas consecutivas de un electrón
mediante la formación de radicales catiónicos intermedios mientras que las lacasas son oxidasas que
catalizan la oxidación de un electrón de compuestos fenólicos. En el proceso de degradación de la
lignina, las enzimas anteriormente mencionadas oxidan el polímero generando radicales aromáticos
mediante la ruptura del éter, la escisión del anillo aromático y la desmetilación. Los radicales
aromáticos producidos son sustrato para la generación de H2O2 mediante la actividad de oxidasas
(aril-alcohol oxidasa y aril-alcohol deshidrogenada) y los radicales fenoxi producidos por la ruptura
del éter pueden repolimerizarse en el polímero de la lignina o pueden ser degradados produciendo p-
quinonas. Dichas moléculas inducen la actividad del oxígeno en reacciones redox generando una
reducción del hierro férrico presente en la madera y a consecuencia de esto, ocurre una reducción de
H2O2 a un radical libre de hidroxilo (OH). Este último es capaz de iniciar el proceso de entrada a la
lignina debido a que la pared externa de dichos residuos tiene poros de tamaños pequeños y no permite
el acceso de enzimas. Por último los productos generados en la degradación de la lignina entran a las
hifas y son añadidos a las rutas metabólicas de los hongos (Sánchez 2009).
En el caso de los hongos de podredumbre blanca, estos carecen de oxidasas capaces de generar H2O2
por lo que dependen de la oxidación de ácidos orgánicos (p.e., oxalato y glioxilato). Dicho proceso
produce H2O2 de forma indirecta.
En cuanto a la degradación de la celulosa, los hongos pueden generar relaciones sinérgicas que
permiten completar la degradación de la celulosa mediante la producción de celulasas. Las celulasas
son capaces de hidrolizar los enlaces β1-4 glicosídicos de la celulosa mediante tres tipos de dichas
enzimas: endoglucanasas, celobiohidrolasa y β-glucosidasa. Las endoglucanasas son quienes inician
el proceso de degradación de la celulosa mediante un ataque aleatorio de estructuras internas de este
componente, posteriormente la celobiohidrolasa remueve monómeros y dímeros que constituyen la
parte final de la cadena de glucano, por último, la β-glucosidasa hidroliza los dímeros de glucosa
(Kuhad, Gupta, and Singh 2011).
Por último, la degradación de la hemicelulosa produce finalmente monómeros de azúcar y ácido
acético mediante la actividad de endo-1,4-β-xilanasas que generan oligosacáridos produciendo xilosa,
también se encuentra enzimas como xilano esterasas (capaz de remover grupos acetilo),
galactosidasas (elimina residuos de galactosa) y furanosidasas que son capaces de hidrolizar xilanos
y mananos presentes en materiales lignocelulósicos (Pérez et al. 2002).
Degradación de hidrocarburos totales de petróleo (TPH)
En cuanto a los resultados obtenidos en la cuantificación de TPHs por cromatografía de gases. Se
puede determinar que Hongo Borras (HB) es el tratamiento que presenta una mayor concentración de
TPHs a comparación de los hongos individuales evaluados en el tiempo inicial (0 días) (Tukey-
Kramer p<0.05). Además, HB mostró una diferencia significativa con el control sin inóculo, ATPH
28, ATPH 33 y ATPH 40, mientras que los demás tratamientos no presentaron diferencias
28
significativas entre sí (Figura 5A)(Anexo 3) El consorcio 3 mostró una mayor diferencia significativa
con respecto al consorcio 1 y consorcio 2 en el tiempo inicial (Figura 5B) (Anexo 4). Estas diferencias
de concentración de HCs entre los diferentes tratamientos realizados puede deberse a la falta de
homogenización del contaminante en los microcosmos mediante la formación de “bolsillos de
contaminación”.
(A)
Hongo
TP
Hs (
mg/k
gp
s)
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000 Sin inoculo Ganoderma sp. Pleurotus sp. ATPH 19 ATPH 26 ATPH 52 ATPH 53 ATPH 54 ATPH 55 ATPH 7 ATPH 15 ATPH 28 ATPH 36 ATPH 9 ATPH 39 ATPH 41 ATPH 40 HB ATPH 33
29
(B)
Figura 5. Concentración de TPHs (mg/kgps) de los diferentes tratamientos en el tiempo 0 donde (A)
hongos a evaluar individualmente y (B) consorcios a evaluar. Cada una de las gráficas se compara
con el control sin inóculo.
Se puede determinar que la concentración de hidrocarburos del tratamiento ATPH 53 es
significativamente diferente que la concentración de los demás tratamientos realizados para los
hongos individuales en el tiempo final (30 días) (Tukey-Kramer p<0.05), seguido de ATPH 52 y
ATPH 19 quienes mostraron diferencias significativas respecto a los demás tratamientos,
exceptuando Pleurotus sp., y Ganoderma sp. (Anexo 4)
Hongo
TP
Hs (
mg/k
gp
s)
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000Consorcio 3 Consorcio 2 Consorcio 1 Sin inoculo
30
(A)
(B)
31
(C)
Figura 6. Concentración de TPHs en el tiempo 30 agrupados en (A) primer montaje y (B) segundo
montaje de los tratamientos evaluados y (C) tercer montaje realizado.
En la Figura 8 se puede observar el porcentaje de degradación de los hongos evaluados
individualmente (Ganoderma sp., Pleurotus sp., ATPH 54, 39, 41, 36). El hongo ATPH 36 presentó
una diferencia significativa junto con Ganoderma sp., ATPH 54 y ATPH 39 con respecto al control
sin inóculo y ATPH 41 (p<0.05 Tukey-Kramer) (Anexo 5). Para realizar dicha comparación se
eliminó Pleurotus sp., debido a que los datos presentan una varianza alta y no deja determinar las
diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 8).
ATPH 36 es el hongo que presento mayor degradación (54,01±10,52%). Según Borrero y Forero,
este hongo pertenece al género Beauveria sp. Este género de hongos se consideran entomopatógenos
y poseen la capacidad de degradar hidrocarburos (n-alcanos y cadenas ramificadas) presentes en los
lípidos que conforman la cutícula de los insectos tomando la mayoría de alcanos como única fuente
de carbono, mediante la presencia del sistema enzimático citocromo P450 (Pedrini et al. 2013) (Figura
7). Ha sido reportado la inducción de genes del citocromo P450 con el cultivo de Beauveria sp. en
medio mínimo que contienen C16, C24 o C28 a comparación de cuando este es cultivado en medio
con glucosa (Pedrini, Crespo, and Juárez 2007). Sin embargo, el recuento fúngico obtenido por ATPH
36 a los 30d no estuvo en los recuentos más altos obtenidos en el presente trabajo (presentó un
crecimiento medio) por lo que la degradación obtenida pudo ser realizada por procesos enzimáticos
del hongo (Figura 3B)
Ganoderma sp., es el segundo hongo que presentó un porcentaje de degradación más alto frente a los
demás hongos evaluados con 28,96±13.54% de degradación (Figura 8). Ganoderma sp., al pertenecer
a los hongos de podredumbre blanca, posee un sistema enzimático conformado por peroxidasas y
lacasas (Figura 7). La degradación por parte de Ganoderma sp., se ve reflejado en diferentes estudios
32
como el estudio realizado por Mohammadi-Sichani en 2018 (Mohammadi-Sichani et al. 2018), en
donde se evaluó la degradación de suelo contaminado por PAH por parte de tres hongos de
podredumbre blanca, entre los cuales Ganoderma lucidum presentó un porcentaje de degradación de
TPH de 57.7%
Según la Figura 8, se pueden observar que los hongos denominados como ATPH 39 y 41 presentaron
degradación de TPH presentes en las borras teniendo porcentajes de degradación de 27,53±1,75% y
17,42±18.75%, respectivamente, dichos resultados no mostraron diferencia significativa (p>0.05) con
respecto al control sin inóculo. Según Borrero y Forero en 2017, ATPH 39 y 41 pertenecen al género
Penicillium sp. Este género se caracteriza por generar enzimas (xilanasas y celulasas) capaces de
hidrolizar materiales lignocelulósicos (Rodriguez et al. 1994), también poseen un sistema de enzimas
monooxigenasas del citocromo P450, que al oxidar PAH forman monofenoles, difenoles,
dihidrodioles, quinonas, y otros metabolitos. Estas moléculas tienen mayor solubilidad en el agua
(mayor biodisponibilidad) (Launen et al. 1995; Van Den Brink et al. 1998). En un estudio realizado
por Saraswathy en 2005 (Saraswathy and Hallberg 2005), evaluaron dos cepas pertenecientes a la
especie Penicillium ochrochloron. Una de las cepas pudo degradar el 75% de pireno (50 mg/L)
durante 28 días a 22°C en medio líquido. En otro estudio (Garon, Sage, and Seigle-Murandi 2004),
se encontró que P. janczewskii pudo degradar (79%) el fluoreno, el cual fue tomado como única
fuente de carbono en medio líquido a 23°C. Sin embargo, los hongos ATPH 39 y ATPH 41
presentaron la menor degradación de TPH de los hongos evaluados individualmente, incluso por
debajo del control sin inóculo.
Fuente: (Leitão 2009)
Figura 7. Vías de degradación de PAHs por hongos de podredumbre blanca y hongos con sistema
P450 monooxigenasa.
También se puede observar que el control sin inóculo presentó un porcentaje de degradación de
28,96±13.54%. Según un estudio realizado por Mancera -López en 2007 (Mancera-López et al. 2008)
el control de bioestimulación obtuvo un porcentaje de degradación de PAH de 34±1%. Por lo tanto,
se puede determinar que los materiales de aporte (bagazo de caña de azúcar, cascarilla de arroz y
suelo) utilizados en el presente trabajo lograron estimular la actividad enzimática de la población
33
microbiana presente en borras y materiales. Según el proceso de degradación de materiales
lignocelulósicos anteriormente descrito en el crecimiento fúngico, un proceso similar se puede llevar
a cabo en la degradación de contaminantes aromáticos. En un estudio realizado por Acevedo en 2011
(Acevedo et al. 2011), se determinó que la oxidación de PAHs catalizada por MnP dio como resultado
quinonas (antrona, 9,10-antranquina y antraquinona) y ácido 2-(2-hidroxibenzoil)-benzoico, producto
de la ruptura del anillo aromático de PAH, lo que evidencia la degradación de este tipo de compuestos.
En otro estudio realizado se determinó la oxidación de PAHs por LiP genera antraquinona como
principal producto de oxidación del antraceno y pireno, esto deja en evidencia que LiP es la primer
enzima en catalizar la degradación de dichos compuestos (Field et al. 1996)
Según Borrero y Forero en 2017, ATPH 52 es un hongo de micelio estéril. Los hongos de micelio
estéril se encuentran reportados con la capacidad de oxidar hidrocarburos, específicamente n-
hexadecano (Jones and Edington 1968). Sin embargo, se determinó en el presente trabajo que en el
tratamiento realizado para ATPH 52 aumentó la concentración de HCs (-32,07±13,80%), al igual que
para los tratamientos denominados ATPH 19 (-14,40±4,64%), ATPH 53 (-63,71±104,59%),
Ganoderma sp en el montaje 2 . (-0,08±18,99%), ATPH 15 (-17,50±69,99%), ATPH 28 (-
5,07±10,78%), ATPH 54 del montaje 2 (-22,24±6,60%), ATPH 33 (-60,63±29,23%) y Consorcio 1
(-12,93±7,42%)
El aumento de hidrocarburos a lo largo del tiempo (30 d) frente otros estudios realizados (Kriipsalu
et al. 2007; Rodríguez-casasola et al. 2007; Bhalerao 2012) puede deberse a la generación de fases
no disponibles para la biodegradación (p.e., sólidos del suelo, cristales de PAH) (Ghosh and Mukherji
2016) denominado líquidos de fase no acuosa (del inglés: non-aqueous phase liquids) o NAPLs
(García-Junco, De Olmedo, and Ortega-Calvo 2001). Los NAPLs son una clase de químicos presentes
en sedimentos, suelos, lodos, etc. Pueden estar constituidos de uno o varios compuestos de
hidrocarburos saturados e insaturados, PAH, hidrocarburos clorados, bifenilos policlorados, etc.
Dichos compuestos se caracterizan por tener una solubilidad baja en agua (Govindarajan, Deshpande,
and Raghunathan 2018) lo que dificulta la degradación por microorganismos haciendo de esto un
proceso lento (Mohammadi-Sichani et al. 2018). Las borras aceitosas presentan gran cantidad de
hidrocarburos pesados y compuestos complejos que hacen de dicho residuo una mezcla con baja
solubilidad, por lo que es altamente factible la formación de NAPLs en borras aceitosas.
34
Figura 8. Porcentaje de degradación de TPH de los tratamientos de hongos evaluados
individualmente y en consorcio.
Se determinó que el consorcio 2 fue el tratamiento que mayor porcentaje de degradación obtuvo
(20,30±17,93%) en la evaluación de los consorcios fúngicos. En dicho tratamiento se utilizó ATPH
55, ATPH 53, ATPH 7, ATPH 15 y ATPH 52. Según Borrero y Forero, los hongos pertenecen a los
géneros Rhizopus sp., Mucor sp., Absidia sp., Alternaria sp. y un hongo de micelio estéril.
Rhizopus sp., se encuentra reportado con la capacidad de oxidar PAH como el naftaleno (Cerniglia
1992), al igual que diferentes especies de Mucor sp. como Mucor mucedo ha presentado degradación
de diferentes PAHs como pireno y benzo [a]pireno, con una reducción de 87% y 81%,
respectivamente (Jia, Li, and Allinson 2015). Absidia sp. también ha presentado degradación de HCs
como antraceno (Villemain and Guiraud 2006).
Hongo
Degra
dació
n (
%)
0
10
20
30
40
50
60
70Sin inoculo
Ganoderma sp.
Pleurotus sp.
ATPH 54
ATPH 39
ATPH 41
ATPH 36
ATPH 15
Consorcio 2
Consorcio 3
35
7. CONCLUSIONES.
Se determinó que la mayor degradación obtenida en los tratamientos de los hongos individuales
evaluados fue por ATPH 36 (perteneciente al género Beauveria sp.) con un porcentaje de degradación
de 54,01± 10,52% seguido de Ganoderma sp., el cual presentó uno de los recuentos fúngicos
filamentosos más bajos. Este hecho evidencia que la bioaumentación realizada en dichos tratamientos
fue efectiva ya que presentaron mayor degradación que el control sin inóculo debido a la posible
degradación de TPH por sistemas enzimáticos (peroxidasas y lacasas) pertenecientes a hongos de
podredumbre blanca, mientras que Beauveria sp., posee el sistema enzimático citocromo P450. En la
evaluación de los consorcios se determinó que el consorcio 2 fue el que presentó mayor porcentaje
de degradación 20,30 ± 17,93% aunque la bioaumentación no fue efectiva en dicho caso. También se
puede observar que en el control sin inóculo hubo degradación de las borras, esto se ve favorecido
por los sustratos proporcionados por los materiales de aporte, nutrientes, aireación de la mezcla, etc,
por medio de procesos de co-metabolismo y presencia de microorganismos degradadores presentes
en los materiales de aporte.
8. RECOMENDACIONES.
Se recomienda seguir estudiando los hongos ATPH 36, Ganoderma sp. y ATPH 54 con el fin de
rectificar su degradación para ser aplicados en campo.
Evaluar las interacciones antagónicas que podrían existir en los tratamientos que presentaron menor
degradación que el control sin inóculo.
Determinar degradación de HCs por un consorcio fúngico conformado por los hongos que
presentaron mayor degradación en el presente trabajo (ATPH 36, Ganoderma sp., y ATPH 54)
Realizar identificación molecular de los hongos evaluados en el presente trabajo.
36
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