Evaluación preliminar para aislamiento e identificación ...
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Evaluación preliminar para aislamiento e identificación bioquímica
de Streptomyces sp., a partir de un nicho ecológico del Campus
Belmonte de la Universidad Libre, Seccional Pereira
Duque Juan Esteban *López Rodolfo **
*Estudiante de microbiología. Universidad Libre **Docente investigador. Universidad Libre. Grupo de investigación MICROBIOTEC. Semillero de investigación de microorganismos eficientes del suelo SIMICRES.
Resumen: Streptomyces sp. se considera de gran importancia en el campo de la
descomposición de residuos vegetales, por su capacidad para degradar celulosa.
El objetivo del presente trabajo de investigación consistió en evaluar las
posibilidades de aislar y caracterizar bioquímicamente la actinobacteria del género
Streptomyces, de muestras de suelo provenientes de un nicho ecológico del
campus Belmonte de la Universidad Libre Seccional Pereira, con el propósito de
obtener y purificar cultivos con fines de su aplicación en biocompostaje. Las
muestras de suelo se llevaron a laboratorio en bolsas ziploc®; seguidamente se
homogenizaron las muestras de manera manual, para posteriormente realizar las
diluciones propuestas; luego se realizaron siembras de las tres últimas diluciones
en medio de cultivo Agar avena, que permanecieron en condiciones de
temperatura ambiente; de los resultados se escogieron las colonias de morfología
semejante al género Streptomyces; a los 14 días de cultivo se procedió al repique
en medios Ashby, YGM y Murashige & Skoog (con pH ajustados a 7.0) para
conocer su productividad y sus características macroscópicas. El medio de cultivo
Ashby obtuvo los mejores aislamientos y la menor incidencia de contaminación a
diferencia de los otros. Posteriormente se procedió a la caracterización
microscópica, utilizando el Manual de Bergey; seguidamente se realizaron las
pruebas bioquímicas recomendadas para el género Streptomyces.
Palabras Clave: Actinobacterias, Streptomyces, suelo, medios de cultivo.
Abstract: Streptomyces sp. is considered of great importance in the field of the
decomposition of vegetable residues, for his aptitude to degrade cellulose. The aim
of the present work of investigation consisted of evaluating the possibilities of
isolating and characterizing biochemically the actinobacteria of the kind
Streptomyces, of samples of soil from an ecological niche of the campus Belmonte
of the University Free Sectional Pereira, with the intention of obtaining and
purifying cultures with ends of his application in biocompost. The samples of soil
removed to laboratory in bags ziploc®; immediately afterwards there were
homogenized the samples of a manual way, later to realize the proposed dilutions;
then there were realized sowings of the last three dilutions in the middle of culture
Agar oats, which they remained in conditions of temperature set; between the
results there were chosen the colonies of morphology similar to the kind
Streptomyces; to 14 days of culture one proceeded to the chime in means Ashby,
YGM and Murashige and Skoog (with pH fitted to 7.0) to know his productivity and
his macrocospic characteristics. Culture Ashby obtained the best isolations and the
minor incident of pollution unlike others. Later one proceeded to the microscopic
characterization, using Bergey's Manual; immediately afterwards there were
realized the biochemical tests recommended for the kind Streptomyces.
Keywords: Actinobacteria, Streptomyces, soil, culture media.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Generalidades
El bienestar y la prosperidad del hombre dependen en gran medida de su dominio
sobre las poblaciones microbianas. Se ha visto que el crecimiento óptimo de los
microorganismos depende de varios factores corno son: pH, temperatura,
nutrientes, agua, entre otras (Muñoz, 2015).
La ecología microbiana se enfoca al estudio de la diversidad y funcionalidad de las
comunidades microbianas en los ambientes naturales y ambientes creados por el
hombre. Desde hace algunos años se propone que la mayoría de especies
microbianas no crece en el laboratorio, por lo que los estudios sobre la
biodiversidad y biogeografía de los microorganismos de distintos ambientes
ofrecen gran potencial para el campo investigativo e industrial (Medina, H &
Evangelista, 2011).
El suelo constituye el ambiente que alberga la mayoría de tipos representativos de
seres microscópicos y a una gran cantidad de microecosistemas en los cuales,
muchos de estos seres interactúan entre sí (Tresierra, Bendayán, & García, 1994).
Una de estas interacciones resulta ser la degradación de estructuras complejas a
simples para la mayor asimilación de nutrientes cuya mayor importancia resalta en
la producción de enzimas celulíticas.
La descomposición aeróbica ha sido usada para tratar residuos sólidos;
recientemente, el compostaje ha empezado a ser muy común para la degradación
de biocomponentes con microorganismos, pues los materiales obtenidos del
resultado del compostaje, redundan en la calidad de la estructura del suelo (Wei et
al., 2016).
Los carbohidratos en compostaje no solo incluyen sacáridos solubles sino que
también celulosa insoluble, siendo difícil de degradar para muchos de los
microorganismos. Además, los cambios en el ambiente del compostaje no son
conducentes con la calidad de la degradación de celulosa (Zhao et al., 2016).
1.2 Actinobacterias
Las actinobacterias son un grupo importante de bacterias saprófitas y de
crecimiento filamentoso, capaces de producir una amplia variedad de enzimas
extracelulares (León et al., 2011) y metabolitos secundarios de interés comercial e
industrial. Se ha evaluado que producen compuestos de uso biotecnológico como
antibióticos y enzimas industriales, entre otros (Bérdy, 2005).
Las actinobacterias son microorganismos atractivos por producir enzimas
hidroliticas de lignocelulosa (Taha et al., 2016). Las actinobacterias pueden formar
esporas en condiciones de altas temperaturas, además de resistir duros
ambientes, por lo que la inoculación de actinobacterias puede ser excelente
herramienta para aplicarse en bioprocesos, donde la celulosa se convierte en
productos complejos a simples, sin requerir la adición de enzimas (Zhao et al.,
2016) (Olson, McBride, Joe Shaw, & Lynd, 2012). Grupo en el cual hace parte
Streptomyces sp. (Zhao et al., 2016).
Además, las actinobacterias no solo son importantes en la degradación de
material vegetal, sino que hacen parte de un grupo de bacterias capaces de fijar
nitrógeno; el nitrógeno como factor limitante más importante en el desarrollo de las
plantas, después del agua, es primordial en la formación de estructuras
moleculares como ácidos nucléicos, aminoazúcares y aminoácidos, entre otros
(Olivares, 2008). Dentro de la gran variedad de microorganismos que han sido
descritos como Fijadores Biológicos de Nitrógeno (FBN) forman grupo importante
las bacterias del tipo Actinomicetos, que además desempeñan un papel
importante en la producción de metabolitos secundarios y la degradación de
material orgánico (Salazar & Ordoñez, 2013) .
1.3 Género Streptomyces
Representantes de Streptomyces son gram positivas, aerobias estrictas y catalasa
positivas; que no se colorean con la técnica de Ziehl-Neelsen ni de Kinyoun
(decoloración por ácido sulfúrico al 2%); capaces de producir filamentos (o
micelios) largos (de 0.5 a 1.0 µm de diámetro y una longitud indefinida), muy
ramificados y que no se fragmentan; presentan filamentos aéreos que pueden ser
rudimentarios y pueden estar adornados por espirales, enroscamientos o
ramificaciones múltiples, con producción de esporas (conidias), con frecuencia en
cadenas, que pueden ser rectas o flexuosas, enruladas o espiraladas. La
superficie de la espora puede ser lisa, rugosa o espinosa, formando pigmentos
asociados con las esporas (azules, verdes, grises, rojos, violetas, blandos o
amarrillos). Suelos con condiciones alcalinas y neutras son las más favorables
para el desarrollo de Streptomyces que suelos ácidos (Singleton, 2003).
Streptomycetes son habitantes naturales del suelo, responsables del geosmin que
emite la fragancia terrosa después de las lluvias; contienen una amplia variedad
de metabolitos secundarios que poseen antibacterianos, antifúngicos y antivirales,
entre otros y son importantes en la mineralización en los procesos del suelo,
además de descomponedores de restos vegetales (Sheetal & Modi, 2012).
Streptomyces sp. es un género que agrupa más de 500 especies de bacterias
gram positivas y filamentosas; hacen parte del Phylum Actinobacteria, Orden
Streptomycetales. Streptomyces es un género ubicuo en hábitats del suelo y
sedimentos acuáticos (Gontang et al., 2007).
En condiciones ambientales, los componentes bioactivos son cruciales en la vida
de Streptomyces en el suelo, y asociaciones asimbioticas donde se cree que los
antibióticos son armas antagonistas o como moléculas de señalización que
proporcionan una ventaja en la competitividad por nutrientes. Streptomyces es un
grupo saprofito habitante del suelo, con un rol crucial en el ciclado de nutrientes
(Kennedy, 1999); pero también se han encontrado endófitos, patógenos y como
simbiontes beneficiosos con una amplia variedad en organismos superiores,
incluyendo insectos y plantas (Loria et al., 2007) (Kaltenpoth et al., 2009) (Khan et
al., 2010) (Hulcr et al., 2011).
Además, Streptomyces es reconocido por tener un control en la salud del suelo, frente a diversos patógenos, especialmente cuando es inoculado como un microorganismo nativo (Kinkel, Schlatter, Bakker, & Arenz, 2012).
Actinomicetos viven extensivamente en ambientes ricos en lignocelulosa como el
suelo, compostaje, y otros. En una mezcla de poblaciones microbianas del
compostaje, los actinomicetos son importantes porque son capaces de producir
lacasa y descomponer la lignina, especialmente por altas temperaturas (Lu et al.,
2013).
En trabajos realizados con compostaje de residuos orgánicos, se realizó el
aislamiento de diferentes morfotipos microbianos, para evaluar su actividad
enzimática en medios sólidos con xilano y celulosa. Seleccionaron los mejores
microorganismos para cada actividad, encontrando 5 microorganismos con
potencial para degradar celulosa, de los cuales el actinomiceto Streptomyces sp.
demostró su capacidad para degradar celulosa (Cruz C., Castellanos S., &
Argüello A., 2011).
Jiménez (2012) reporta aceleración de las fases del proceso de compostaje de
residuos vegetales, cuando las pilas se inocularon con los microorganismos
Aspergillus Niger (Hongo) y/o Streptomyces (Actinomycetos), al disminuir el
tiempo de compostaje en 30 días, en comparación con las pilas que no fueron
inoculadas.
En el trabajo realizado por Salazar y Ordoñez (2013), para aislar e identificar
actinomicetos fijadores de nitrógeno, reportan que la caracterización microscópica
de la cepa JBUTP_GEA_G_A014, no indicó un rasgo particular que permitiera la
clasificación dentro de un grupo específico, recomendando las caracterizaciones
macroscópicas y bioquímicas para su identificación.
Además, para la confirmación del género, efectuaron pruebas para características
bioquímicas, según el medio de cultivo selectivo como fijadoras de nitrógeno
(medio Ashby); los resultados obtenidos fueron comparados (grado de similitud)
con referencias reportadas para géneros de Actinomicetos en el Manual de Bergey
(Salazar y Ordóñez, 2013).
1.4 Medios de cultivo
El medio avena agar es muy usado a nivel general para el aislamiento de los
hongos induciendo esporulación ya sea para el aislamiento, donde en algunos de
ellos se pueden cambiar algunas de sus características para favorecer o generar
las condiciones óptimas para el desarrollo del microorganismo en estudio ya sea
modificando el pH o agregando antibióticos (Curvelo & Rojas, 2010).
El medio Ashby es un agar especial por estar libre de nitrógeno, lo que facilita la
identificación de cepas potenciales en la fijación de nitrógeno. Los
microorganismos que crecen en este medio reemplazan la metabolización del
nitrógeno por el nitrógeno atmosférico que se encierra en el microambiente de la
caja de Petri (Salazar & Ordoñez, 2013).
El medio YGM contiene el extracto de levadura y la glucosa que influyen en el
crecimiento de actinobacterias (Glazebrook, Doull, Stuttard, & Vining, 1990)
(Shima, Hesketh, Okamoto, Kawamoto, & Ochi, 1996). Aunque se han utilizado
diferentes fuentes de carbono para el crecimiento de S. kanamycetus, se
encuentra que la glucosa (dextrosa) es la fuente de carbono más adecuada para
la producción de un antibiótico de S. kanamyceticus (Roodney et al., 2005). El
medio GYM streptomyces o ISP que a diferencia del anterior se utiliza extracto de
malta y carbonato de calcio (CaCO3) como fuente de cationes esenciales para el
crecimiento de Streptomyces (Song, Lee, Kang, Baek, & Suh, 2004)(Schumann &
Maier, 2014)(Montero-Calasanz et al., 2013).
En una gran mayoría de trabajos de investigación que se realizan en la
micropropagación vegetal, el medio basal MS es el medio de cultivo más utilizado,
propuesto por (Murashige & Skoog, 1962), para aplicarse en las técnicas de
cultivo de tejidos vegetales; medio en el cual se reporta con frecuencia la aparición
de microorganismos, especialmente bacterias (López, 2009); (Ramírez, Castaño,
& López, 2009)
2. OBJETIVO
Teniendo en cuenta la importancia ambiental de los actinomicetos en el desarrollo
de los suelos, y sabedores del posible potencial natural de sus representantes que
pueden estar presentes en el campus Belmonte de la Universidad Libre Seccional
Pereira, se propuso como objetivo del presente trabajo de investigación la
evaluación preliminar para aislar e identificar bioquímicamente actinobacterias del
genero Streptomyces sp., presentes en un nicho ecológico del campus Belmonte,
con propósitos para aplicarse en procesos de biocompostaje.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Protocolo de aislamiento y cuantificación de Streptomyces sp., a partir de
muestras de suelo de la Universidad Libre Seccional Pereira.
3.1Toma de la muestra de los suelos.
Se tomaron las muestras a partir del suelo rizosférico de uno de los (4) nichos
ecológicos presentes en la Universidad Libre los cuales son: Humedal, Bosque
intervenido, Matorral, guadual. (Ver Figura 1). El tipo de nicho ecológico escogido
fue el bosque intervenido.
Figura 1. Tipos de ecosistemas presentes en la Universidad Libre Seccional
Belmonte (Fuente: Autores).
Se analizó un nicho ecológico (Ver Figura 2), basados en la metodología
propuesta por Korayem et al. (2015) para el aislamiento de Streptomyces sp. en
suelos áridos, así como la metodología propuesta por Salazar & Ordoñez (2013)
para el aislamiento de actinomicetos en diferentes ecosistemas. El sitio de
recolección de la muestra de suelo se indica con su posicionamiento geográfico,
haciendo uso de un equipo GPS que denota: 4°48’19.72”N 75°45’34.91” O
Elevación 1246 m. Dicho suelo indicó al tacto una textura franco limosa, propia de
un suelo de la Unidad Montenegro, presente en la región del Eje Cafetero.
.
Figura 2. Mapa del muestreo geográfico de la Universidad Libre seccional
Belmonte (Fuente: Google Earth).
En el nicho ecológico se tomaron 3 muestras con la utilización de una pala
previamente lavada, en una capa de suelo no superior a los 20 cm de profundidad
en un hoyo en forma de V (Salazar & Ordoñez, 2013). Cada muestra de suelo se
rotuló como lo señala la NTC 3656 que incluye fecha, hora, nombre de la persona
que realiza el muestreo, profundidad, tipo de análisis, mapa o esquema de la zona
muestreada.
Para optimizar y homogenizar las muestras se adoptó la metodología enunciada
en el Manual de Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y foliares de la UTP
(Salazar & Ordoñez, 2013).
Rojo: Bosque intervenido
Las muestras fueron recolectadas en bolsas con cierre hermético (Ziploc®); del
sitio de muestra, las muestras se transportaron en nevera portátil hasta al
laboratorio de Biología, donde se llevó el análisis.
El trabajo se realizó en el laboratorio de Biología de la Universidad Libre Seccional
Pereira. El cuarteo de las muestras de suelo se realizó sobre superficies
asépticas; retirando raíces, piedras y otros residuos sólidos (Ver figura 3). Paso
seguido, se formó un montón simétrico el cual se dividió en cuatro partes iguales,
dos de las cuales se desechan y las dos restantes se mezclaron nuevamente
hasta homogeneidad (Ver Figura 4). Estos pasos se vuelven a repetir hasta lograr
una cantidad de muestra aceptable aproximada de 100 g (NTC 3656) (Ver Figura
5).
Figura 3. Preparación de las muestras de 100 g.
Figura 4. Mezcla manual y cuarteo de las muestras.
Luego las contramuestras fueron refrigeradas a 4°C durante 2 semanas, luego
fueron descartadas por no requerirse.
3.2 Aislamiento de Streptomyces sp.
Para efectuar el aislamiento de especies de Streptomyces, se tomaron 10 g de la
muestra; luego se suspendieron en 90 ml de agua estéril, y se realizaron
diluciones por duplicado desde 10-1 hasta 10-7 en solución peptona (Oliveira, Silva,
& Sand, 2010).
Para la suspensión de las diluciones, se empleó el medio Agar-Avena, propuesto
por Curvelo y Rojas (2010).
Tabla 1. Componentes de avena agar
Componentes g/L
Agar-Agar 15
Avena 30
Para su preparación, se debe hervir la avena durante 1 hora en un litro de agua;
se procede a colar y se agrega el agar, después se completa el litro de agua y se
lleva a condiciones de autoclave a 121°C y 15 lbs de presión, por 20 min y servir
(Curvelo & Rojas, 2010).
Posteriormente, 0,1 ml de cada suspensión (las tres últimas diluciones) son
esparcidos en superficie en el agar (Agar Avena) por triplicado. Finalmente, se
incubaron a temperatura ambiente (30 ± 3° C), durante 14 días. En los días 7 y 14
de la incubación se revisaron las poblaciones microbianas presentes de cada
suspensión (Salazar & Ordoñez, 2013).
Para el cultivo de las suspensiones se empleó el medio Ashby, propuesto por
(Salazar & Ordoñez, 2013).
Componentes y preparación:
Tabla 2. Componentes del medio Ashby
Componentes g/L
Sacarosa 20
CaCl2 0.2
KH2PO4 1
MgSO4 0.2
FeSO4 0.005
NaCl 0.2
Agar-Agar 15
Se agregan los componentes al agua destilada. Seguido se calienta hasta
ebullición 5 min y se lleva a condiciones de autoclave (15lb y 121°C), por 20 min.
Por último se sirven en cajas de petri estériles.
También se empleó el agar YGM, propuesto por (Glazebrook et al., 1990) (Shima
et al., 1996).
Componentes y preparación:
Tabla 3. Componentes del medio YGM
Componentes g/L
Glucosa 4.0
Extracto de levadura 4.0
Agar 15
Agua destilada 1000
Seguido se calienta hasta ebullición 5 min y se lleva a condiciones de autoclave
(15lb y 121°C), por 20 min. Por último se sirven en cajas de petri estériles.
Se probó suplementando el medio YGM con extracto de malta y carbonato de
calcio al medio, según (Song et al., 2004)
Tabla 4. Componentes del GYM Streptomyces
Componentes g/L
Glucosa 4.0
Extracto de levadura 4.0
CaCO3 2.0
Extracto de malta 10.0
Agar 15
Agua destilada 1000
Seguido se ajustó el pH a 7.0 antes de agregar el agar. Después se llevó a
condiciones de autoclave (15lb y 121°C), por 20 min.
El último medio de cultivo probado fue el medio basal MS (Murashige y Skoog),
compuesto por las siguientes sustancias, según Tabla 4:
Tabla 5. Composición del medio basal MS
NUTRIENTE MS mg/L 1. NH4NO3 1650.0
2. KNO3 1900.0
3. MgSO4 x 7 H2O 370.0
4. KH2PO4 170.0
5. CaCl2 x 2 H2O 440.0
6. Na2EDTA x 2 H2O 37.4
7. FeSO4 x 7 H2O 27.8
8. H3BO3 6.2
9. MnSO4 x 4 H2O 22.3
10. ZnSO4 x 7 H2O 8.6
11. KI 0.83
12. Na2MoO4 x 2 H2O 0.25
13. CuSO4 x 5 H2O 0.025
14. CoCl2 x 6 H2O 0.025
Luego de mezcladas las sales, se lleva la solución a condiciones de autoclave (15
psi y 121 °C), por 20 minutos.
3.3 Caracterización macroscópica
Cuando el tiempo de incubación ha terminado se recopilan las características a un
nivel macroscópico crecidas en el agar (Agar Ashby, Agar YGM y Murashige &
Skoog) considerando: textura, color, forma, superficie y borde. Los aspectos a
valorarse son: colonias rugosas, cerosas, polvorosas bordes irregulares, colores
blanco, gris y café claro, posibilidad de colonias con anillos segmentados.
3.4 Caracterización microscópica
Se efectúa una primera clasificación de las colonias crecidas Agar (Agar Ashby,
Agar YGM y Murashige & Skoog) usando la tinción de Gram, descartando colonias
que macroscópicamente pueden ser similares a los Actinomicetos pero
microscópicamente presenten morfologías diferentes. Los actinomicetos son
bacterias Gram grampositivas, filamentosas y parcialmente ácido resistentes
(Negrón, Serrano, & Panizo, 2013) (Boone, Castenholz, & Garrity, 2001).
3.5 Caracterización bioquímica
Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la
presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía
metabólica completa en uno o más microorganismos (Bojalil, Trujillo, & Cerbon,
1959).
A partir de las características bioquímicas que se evidencian con la aplicación de
estas pruebas, se logra la identificación en género o especie de microorganismos
mediante comparación de similitudes con características bioquímicas que han sido
reportadas (Krieg & Padgett, 2011)
3.5.1 Prueba de la Catalasa
Se utiliza para comprobar la presencia de la enzima catalasa que se encuentra en
la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias que contienen citocromo. Para
ello se deposita una gota de Peróxido de Hidrógeno al 30% sobre un portaobjetos
y haciendo uso de un asa de argolla se deposita sobre el reactivo la masa
bacteriana. El resultado será positivo si se observa la producción de pequeñas
burbujas como resultado de la degradación de peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno gaseoso (Bailón, Cruz, & Sandoval, 2003). El resultado para
Streptomyces sp. es positivo (Arias, Sánchez, & Hardisson, 1978).
3.5.2 Prueba de la Oxidasa
Al ser la mayoría de los actinomicetos aerobios estrictos, la prueba de la Oxidasa
permite poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en
organismos de este tipo. Para ello se usó el método directo en donde se adiciona
una gota del reactivo de Kovacs sobre las colonias en el medio. El resultado es
positivo si se produce una reacción de color violeta a los pocos segundos (Bailón
et al., 2003). El resultado para Streptomyces sp es negativo (Hernández & Loaiza
Cano, 2014)(Salazar & Ordoñez, 2013).
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Toma de muestras
A partir de las muestras se realizó el procedimiento de cuarteo para su posterior
análisis (Ver Figura 5).
Figura 5. Representación de cuarteo de la muestra
4.2 Aislamiento de Streptomyces sp.
Posteriormente de una de las partes resultantes del cuarteo se procedió a efectuar
las diluciones (Ver Figura 6).
Figura 6. Preparación de las diluciones desde 10-1 hasta 10-7
Para el aislamiento de Streptomyces sp se utilizó el medio de cultivo Agar avena,
en el cual se realizó las diluciones de 10 -7. En la última dilución que fue 10-7, se
encontró una supuesta colonia del grupo actinobacteria y supuesto Streptomyces
sp (Ver figura 7).
Figura 7. Dilución 10-7 en el agar avena. Presencia de hongos y bacterias
filamentosos.
En el medio Agar avena se notó que crecen Actinobacterias y también una gran
diversidad de microorganismos tanto hongos como bacterias. Al ser un medio
enriquecido, y especial para microorganismos del suelo (Curvelo & Rojas, 2010).
Al agar avena también se le puede agregar sustancias antimicrobianas o
antifúngicas dependiendo de qué tipo microorganismo.
A partir de la colonia se realizaron repiques en los medios a probar (Agar Ashby,
Agar YGM y Murashige & Skoog). En el medio Ashby, las colonias aparecieron
entre los 5 a 7 días de incubación (Ver Figura 8).
Figura 8. Resultado del repique en medio Ashby.
En el agar YGM, las colonias aparecieron de 4 a 7 días de incubación (Ver Figura
9)
.
Figura 9. Resultado del repique en Agar YGM
En el agar suplementado (GYM streptomyces médium) las colonias aparecieron
de 5 a 8 dias (Ver Figura 10).
Figura 10. Resultado del repique en el agar GYM Streptomyces
En medio basal MS, las colonias empezaron a aparecer de 4 a 7 días de
incubación (Ver Figura 11).
Figura 11. Resultado del repique en medio basal MS
En el medio Asbhy, el aislamiento es más factible quizás por la escasez de
nutrientes, lo que impide que otro tipo de bacterias proliferen.
Se evidencio que el medio de cultivo Ashby usado tuvo buena productividad al
aislar una colonia con características de Streptomyces sp el mayor problema fue la
incidencia de contaminación por hongos (Ver Figura 12).
Figura 12. Evidencia de los repiques contaminados en el medio Asbhy.
Para el agar YGM, la incidencia de contaminación fue tanto de hongos y bacterias,
puede estar relacionado con el alto contenido de nutrientes (Glazebrook et al.,
1990) (Ver Figura 9). En la Figura 10 se nota que hubo poca contaminación.
Para el medio basal MS, la incidencia de contaminación fue especialmente de
hongos, aunque el aislamiento no fue tan productivo (Ver Figura 13).
Figura 13. Evidencia de los repiques contaminados en el medio MS
4.3 Caracterización macroscópica
Del previo aislamiento de la actinobacteria Streptomyces sp. se escogieron las
colonias morfológicas más parecidas a la literatura.
En el caso del agar Asbhy se obtuvo colonias rugosas y polvorosas con bordes
irregulares asimismo un color café grisáceo (Ver figura 12). Estas colonias son
parecidas a las colonias registradas por (Salazar & Ordoñez, 2013).
Figura 13. Evidencia macroscópica en el medio Ashby. Primera y segunda foto a
la izquierda; colonias obtenidas del repique, tercera foto a la derecha; evidencia
fotográfica por (Salazar & Ordoñez, 2013).
En el Agar YGM podemos notar que las colonias bacterianas fueron colonias
cerosas y polvorosas con bordes irregulares y un color blanquecino, estas colonias
pueden ser comparadas con el registro fotográfico del aislamiento, debido que
algunos ingredientes utilizados en el YGM, concuerdan con los ingredientes del
medio usado por (Sheetal & Modi, 2012).
Figura 14. Comparación macroscópica de colonias Streptomyces sp. Primera foto
a la izquierda; colonias obtenidas del repique, la segunda foto del centro; colonias
obtenidas del GYM Streptomyces la tercera foto a la derecha y la cuarta foto;
evidencia fotográfica por (Sheetal & Modi, 2012).
En el medio basal MS, se obtuvo colonias polvorosas y bordes irregulares con un
punto negro en el centro el resto es de color blanquecino.
Figura 15. Evidencia macroscópica de colonias en el medio basal MS
4.4 Caracterización microscópica
Para la tinción de Gram se escogió una de las colonias aisladas en el agar Ashby,
debido a que el aislamiento fue más productivo.
Se hicieron las respectivas pruebas, sin embargo los resultados no concuerdan
con los conceptos expuestos en el literatura (Sheetal & Modi, 2012)(Boone et al.,
2001)(Hernández & Loaiza Cano, 2014).
Streptomyces sp, es un estreptococo Gram positivo (Atta, 2015) (Röttig et al.,
2016). En esta prueba no se pudo evidenciar, semejante a lo reportado por
Salazar y Ordóñez (2013).
Figura 16. Comparación fotográfica de los resultados microscópicos. La primera
foto a la izquierda; tinción de Gram de colonias aisladas (100x), la foto del centro
es una foto de referencia de Streptomyces (Salazar & Ordoñez, 2013) y la tercera
foto a la derecha es la morfología descrita por (Boone et al., 2001).
Caso también registrado en una de las cepas reportados por (Salazar & Ordoñez,
2013) en donde la caracterización microscópica no permitió clasificarla.
4.5 Caracterización bioquímica
4.5.1 Prueba de la Catalasa
Para las pruebas bioquímicas, en la prueba de la catalasa resulto positivo (Ver
Tabla 5).
Tabla 6. Comparación de las pruebas bioquímica catalasa.
Colonia aislada Positivo (Salazar & Ordoñez, 2013)
Negativo(Salazar & Ordoñez, 2013)
Prueba catalasa
La prueba para Streptomyces sp, es positiva (Hernández & Loaiza Cano, 2014)
(Arias et al., 1978) (Varela & Grotiuz, n.d.).
4.5.2 Prueba de la Oxidasa
En el caso de la prueba oxidasa, el resultado fue negativo concordando con la
literatura pero la prueba puede estar determinada con la viabilidad metabólica de
las colonias aisladas (Lara Mantilla et al., 2008) (Varela & Grotiuz, n.d.) .
Tabla 7. Comparación de la prueba oxidasa
Colonia aislada Positivo (Salazar & Ordoñez, 2013)
Negativo (Salazar & Ordoñez, 2013)
Prueba oxidasa
5. CONCLUSIONES
En el suelo del nicho ecológico evaluado, se pudo tener la evidencia de la
presencia de Actinomicetos, dentro de los cuales se pudieron aislar colonias con
características morfológicas del género Streptomyces sp.
Cuando las siembras seleccionadas no se someten a repiques frecuentes en el
tiempo, tienden a perder su capacidad de crecimiento en las siembras nuevas,
además de no presentar actividad metabólica.
6. RECOMENDACIONES
Realizar nuevos análisis a partir del mismo nicho ecológico y mejorar las pruebas
bioquímicas que permitan identificar el género Streptomyces, para ser evaluado en
diferentes medios de cultivo, incluido el medio líquido, además de evaluar su
tiempo de viabilidad y actividad metabólica.
Se recomienda la utilización del medio Nitrato-Agar, debido a que por el contenido
de sus sales, se beneficia el crecimiento de actinomicetos, según lo reportan
Korayem y colaboradores (2015).
7. BIBLIOGRAFÍA
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