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V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica

VI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular

Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F. Tel. y Fax: 5623 3088 email: [email protected], [email protected]

Clave: 372900

EVALUACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE FENOLES CONTENIDOS EN CÁSCARA DE UNA VARIEDAD MEXICANA DE MANZANA (Malus domestica) Y SU ENCAPSULAMIENTO

Aurora Cosette, Reyes Guzmán; Haydeé, Hernández Unzón. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Laboratorio de Investigación de la Academia de Alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Prol. de Carpio y Plan de Ayala Col. Casco de Sto. Tomás, Del. Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel. 5729-6300 Ext. 62464. CORREO ELECTRÓNICO [email protected]




INTRODUCCIÓN Un alimento funcional es similar en apariencia a un alimento convencional, es consumido como parte de una dieta normal, y se ha demostrado que tiene beneficios fisiológicos y/o reduce el riesgo de enfermedades crónicas basada en su función nutricional (Jones, 2002). La manzana es una de las frutas más cultivadas del mundo. La mayoría de manzanas proceden de la especie de manzanos Malus domestica o híbridos de ella (Van Buren, 1970). A nivel mundial se producen aproximadamente 60 millones de toneladas de manzana al año en una superficie de 5.6 millones de hectáreas, siendo China el principal productor con mas de 21 millones de toneladas, seguido de Estados Unidos de América con 5 millones y Alemania con 3 millones. Estos países aportan el 45% de la producción mundial, mientras que México aporta 0.46 millones de toneladas al año (SAGARPA, 2005). En el estado de Puebla, México se celebra cada mes de agosto la feria de la manzana en el municipio de Zacatlán, durante la cual se ofrecen a la venta productos elaborados a partir de la pulpa de manzana roja pequeña que es la que representa la mayor producción en dicho estado y tiene un menor precio comparado con variedades grandes tales como la Red Delicious, Golden Delicious y Starking. Los vegetales, como producto de su metabolismo secundario normal, son capaces de biosintetizar un elevado número de compuestos fenólicos, algunos de los cuales son indispensables para sus funciones fisiológicas y otros son de utilidad para defenderse ante situaciones de estrés. (Van Buren, 1970). Se consideran antioxidantes por su capacidad para eliminar los radicales libres, previniendo la aparición de numerosas enfermedades degenerativas, entre ellas el cáncer. (Harbone, 1975). La mayoría de los compuestos fenólicos contenidos en los frutos son solubles en soluciones alcohólicas al 80%. Generalmente a temperaturas mayores de 40°C se presenta la degradación. Una gran cantidad de compuestos fenólicos poseen la característica de ser pigmentos y presentan coloración en la región visible del espectro (Mullick, 1969). Otros de ellos pueden presentar absorbancia en la región ultravioleta debido a la presencia de compuestos fenólicos lo cual ayuda a su identificación (Goodwin, 1976). La oxidación es un proceso mediante el cual átomos o moléculas transfieren electrones a otros átomos o moléculas, proceso que va asociado con la liberación de energía. La respiración es un proceso oxidativo en el cual la glucosa y los ácidos grasos consumen oxígeno y producen ATP y energía. En este se producen también otras moléculas, entre ellas los llamados radicales libres, Algunas consecuencias del exceso de radicales libres sobre el organismo son el envejecimiento, aparición de artereosclerosis, problemas en el sistema nervioso (Pokorny, 1991), (Imeh y Khokhar, 2002). Los antioxidantes son vitaminas, minerales, pigmentos naturales y otros compuestos vegetales y enzimas, que en conjunto tienen la capacidad de eliminar los radicales libres, previniendo la aparición de numerosas enfermedades degenerativas, entre ellas el cáncer




Los polifenoles son antioxidantes no enzimáticos que rompen la cadena en la fase lipídica bloqueando los radicales libres en las membranas y las lipoproteínas evitando o previniendo la peroxidación lipídica. Son elementos exógenos responsables de la capacidad antioxidante de los fluidos biológicos. Limpian el plasma de radicales capturándolos y evitando las reacciones en cadena (Singleton ,1965). Una de las fuentes potenciales de antioxidantes naturales de extractos de plantas es la cáscara de manzana (Rajalakshmi, 1998), Hamauzu y col. 2006., Oszmiansky y Wojdylo, 2008). Las Técnicas de conservación de los alimentos corresponden a un conjunto de técnicas encargadas de aumentar la vida y disponibilidad de los alimentos para el consumo humano y animal. Existen diversos métodos para tal fin (Woodroof, 1975) tales como el encapsulamiento con alginato. El alginato es un polisacárido que se obtiene de algunas algas marrones que son de gran tamaño, entre las que se encuentran fundamentalmente algas del género Laminaria, Macrocystis pyrifera y algunas especies de los géneros Lessonia, Ecklonia, Durvillaea y Ascophyllum. Todas estas algas contienen entre el 20% y el 30% de alginato sobre su peso seco. Es utilizado en la industria alimentaria desde el siglo XX (Calvo, 2007). El alginato está formado por dos tipos de monosacáridos, los dos con un grupo ácido, el ácido gulurónico y el ácido manurónico (Calvo, 2007). En presencia de calcio, el alginato puede formar una estructura conocida como caja de huevos. En esta estructura, los iones de calcio se sitúan como puentes entre los grupos con carga negativa del ácido gulurónico (Smidsrød y Skjåk-Bræk, 1990). La formación de esferillas de gel se lleva a cabo haciendo caer gotas de disolución de alginato en una disolución diluida de cloruro de calcio exterior (Draget, 1998). Así puede obtenerse la cápsula de la sustancia líquida en el que se disuelva el ácido algínico, con el interior líquido si se sacan con rapidez o sólido si se dejan en contacto con el cloruro de calcio (Smidsrød y Skjåk-Bræk, 1990). Los geles de alginato con calcio son irreversibles térmicamente, por lo que se utilizan mucho en materiales reestructurados que van a ser calentados posteriormente, para su conservación o procesado posterior (Calvo, 2007). MATERIALES Y MÉTODOS Material Materia prima. Manzana (Malus domestica) proveniente de Zacatlán, Puebla. Reactivos y material. Reactivos de grado analítico (utilizados en la preparación de soluciones requeridas en cada determinación). Material propio de laboratorio. Equipo. Cromatografía capa fina (Cromatoplacas de sílica gel 60 20x20 cm, espesor de capa, 0.25 mm). Espectrofotómetro acoplado a un computador (Perkin Elmer UV/VIS), Balanza Analítica, Balanza Granataria




Determinaciones para manzana completa Tamaño y Forma. Determinación de diversos parámetros una vez llevada a cabo la separación cualitativa por estado de madurez (madurez temprana, madurez intermedia, madurez avanzada). Diámetro polar, diámetro ecuatorial mayor, forma (Woodroof, 1975). Se determinaron el peso, volumen, densidad, porcentaje de pulpa, cáscara, semilla y corazón del fruto, Extracción de fenoles con alcohol ácido al 1%. Adicionar 9 gramos de muestra fresca en un frasco ambar con 50 mL de solución extractante (alcohol etílico al 80% con ácido clorhídrico al 1%). Dejar extraer por una semana. Posteriormente se filtra. Llevar a cabo la evaporación a temperatura ambiente (Cortés, 2004) (Díaz, 2006). Identificación de fenoles por Cromatografía en Capa Fin. Se colocan 0.045 mg de fenoles sobre las placas usando el marco de referencia y desarrollar las placas en el disolvente (BAW 4:1:5; v/v). Colocar la placa en la cámara. Dejar correr el frente hasta 1 cm del borde de la placa, hacer una marca y dejar secar al aire. Observar con luz visible y UV (Bate-Smith, 1948), (Ortega y Hernández, 1986).Calcular los valores de Rf con la siguiente ecuación (Lederer, 1957). Identificación de fenoles mediante la elaboración de los Espectros de Absorción. Las manchas del cromatograma se raspan y se resuspenden en 5 mL de alcohol ácido al 1%. Se filtra y las muestras se leen en el espectrofotómetro abarcando la región 600 a 260 nm del espectro (Tsao,2003). Cuantificación de fenoles se llevó a cabo por el método de Folin-Ciocalteu. Los compuestos fenólicos se oxidan por el reactivo Folin-Ciocalteu el cual está formado por una mezcla de ácido fosfotungstínico y ácido fosfomolíbdico que se reduce, por acción de fenoles, en una mezcla de óxidos azules de tungsteno y de molibdeno. La coloración azul produce una absorbancia máxima de 760 nm (Ranganna,1986). Determinación de Capacidad Antioxidante Se utiliza el método de Velioglu y Mazza (1998). La actividad antioxidante se calculó a partir de cuatro distintos métodos. Velocidad de degradación del β –caroteno: Se relacionó el tiempo en función de la absorbancia y la velocidad de degradación del β-caroteno se calculó mediante la siguiente ecuación útil para una cinética de primer orden como la que mostró dicha relación (Al-Saikhan, 1995).




Porcentaje de inhibición relativa “Actividad antioxidante”: Para el control se empleó la siguiente ecuación (Al-Saikhan, 1995).

La Proporción de velocidad de oxidación (OOR), se calculó de acuerdo al método de (Marinova, 1994) usando la siguiente ecuación:

Y el coeficiente de actividad antioxidante (AAC): Se calculó a partir de la siguiente ecuación (Marinova, 1994):

Donde: Ao: Absorbancia de la muestra o control en el tiempo cero, At :Absorbancia de la muestra o control en el tiempo t y t = 0 ó 20 ó 30 ó 120 min de incubación a 50°C, Rcontrol: Velocidad de degradación del control (sin el antioxidante), Rmuestra: Velocidad de degradación de la muestra (manzana ó BHT) , AS(120): Absorbancia de la muestra a los 120 minutos; Ac(120): Absorbancia del control a los 120 minutos; Ac(0): Absorbancia del control a los 0 minutos Encapsulamiento del extracto de cáscara de manzana en Alginato de Calcio Tomar extracto concentrado de cáscara de manzana y se mezcla con solución de ácido algínico al 1% en proporción 2:1. Se dejan caer gotas de 0.2 mL de la mezcla en un vaso de precipitados de 500 mL conteniendo una solución de CaCl2 al 1%. Las cápsulas esféricas formadas se dejan reposar 15 minutos en la solución. Se filtran y se dejan secar a temperatura ambiente (24°C) por un periodo de 24 horas en ausencia de luz (Smidsrød y Skjåk-Bræk, 1990).




DESARROLLO

SELECCIÓN DE LAS MANZANAS 11..00

Figura 1: Diagrama general de trabajo. Se sintetiza el desarrollo experimental que se enuncia a continuación:

Determinaciones a manzana completa

Tamaño y forma 22..11

Peso y volumen 22..22

DETERMINACIONES A PULPA DE MANZANA

DETERMINACIONES A CÁSCARA DE MANZANA

DETERMINACIONES A SEMILLA Y CORAZÓN DE

MANZANA

Densidad

Extracción de fenoles

Determinación de % en base húmeda

Evaluación de actividad antioxidante

Identificación

22..00

22..33

Alcohol ácido 0.1%

Cromatografía en Capa Fina

Cuantificación Folin‐Ciocalteu

Determinación de % en base húmeda

55..00 33..00

Alginato de Calcio

Determinación de % en base húmeda 55..11

33..11 44..11

55..22

55..33

Espectros de absorción

55..44

Blanqueamiento del β‐caroteno

55..55

Encapsulamiento

55..66




RESULTADOS El contenido de compuestos fenólicos es distinto entre cada variedad de manzana además de que ciertos factores como el clima en que son cultivadas y la época del año en que se producen (McGhie, 2005) determinan la concentración de fenoles para cada variedad de manzana. Sin embargo la variedad de manzana estudiada provee al consumidor de los mismos beneficios que se obtienen al ingerir cualquiera de las tres variedades extranjeras tales como la Golden Delicious, Red Delicious y Starking.

A partir de la información presentada en la Tabla I se corrobora que las dimensiones de la variedad mexicana de manzana es menor comparada con las tres variedades de origen extranjero comúnmente comercializadas en territorio nacional con las que se realizó la comparación. En la Tabla II se muestra la predominancia de la pulpa mientras que la cantidad de cáscara es menor, sin embargo es posible obtener una importante cantidad de compuestos fenólicos a partir de ella.

Tabla I: Densidad de las muestras de tres variedades extranjeras de manzana comunes en el mercado mexicano.

MASA (g)

σ

VOLUMEN(mL)

σ

DENSIDAD (g/mL)

σ

Manzana mexicana 125.31 7.14 76.23 4.57 1.64 0.06

Golden Delicious 138.43 1.15 81.92 3.01 1.68 0. 06Red Delicious 147.30 6.23 86.66 5.75 1.69 0.04

Starking 139.87 3.80 82.70 2.91 1.69 0.01

Tabla II: Porcentajes en peso de pulpa, semilla, corazón y cáscara con respecto a la manzana completa.

PULPA (%)

CORAZÓN(%)

SEMILLA (%)

CÁSCARA(%)

Promedio de las muestras 80.53±0.25 6.16±0.55 0.17±0.03 1.22±0.02 La extracción se realizó con un rendimiento del 30% el cual representa una fuente potencial de compuestos fenólicos debido al color característico de algunos de dichos pigmentos (Bate-Smith, 1948). En la Tabla III se muestran las concentraciones de compuestos fenólicos de algunas variedades no especificadas de manzana determinadas por distintos autores. A partir de las referencias presentadas se observó que la concentración de compuestos fenólicos de la manzana estudiada representa un 30% de la mayor concentración de fenoles registrada en la bibliografía (Van Buren, 1970).




Tabla III: Contenido de fenoles en variedades de manzana. Datos reportados de contenido de compuestos fenólicos contenidos en manzana.

CONCENTRACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS (g** / 100 g*) AUTOR

1.10 Burroughs (1961) 0.50 Maier y Metzler (1965) 0.45 Van Buren y cols.(1966) 0.30 Reyes y Hernández (2007) 0.25 Caldwell (1934)

0.11-0.34 Walker (1962) 0.10-1.0 Williams (1959)

0.05 Harel y cols.(1966) (Van Buren, 1970).

Resultado experimental de los autores.**Gramos de compuestos fenólicos expresado como Ácido Tánico. *En 100 gramos de muestra húmeda. Las manchas reveladas en la placa cromatográfica correspondientes a diversos compuestos fenólicos se rasparon para ser eluídas en alcohol ácido al 0.1% y posteriormente se realiza el espectro de absorción para así observar sus máximos de absorción, comparar con los datos bibliográficos e indicar con precisión el compuesto presente. Los valores de Rf determinados y los colores observados en luz visible y ultravioleta se muestran en la Tabla IV, así como los compuestos identificados después de cotejar los resultados obtenidos de la Cromatografía en Capa Fina con la información reportada en la bibliografía. Se muestran también los compuestos fenólicos identificados en el extracto de cáscara de manzana mexicana a partir de la identificación parcial y la identificación precisa de los mismos a partir de la comparación de los máximos de absorción observados en el espectro con los característicos para cada compuesto reportados en la bibliografía (Kindt, 2007) (Ortega, 1986) (Tsao, 2003), (Lederer, 1957) (Ranganna, 1986), (Arditti, 1969). En la Figura 2 se observan los máximos de absorción representativos de algunos compuestos fenólicos que contiene el extracto de cáscara de manzana criolla; en 534nm un máximo de absorción muestra la presencia de cianidinas, compuesto característico de la cáscara de manzana y en 280 nm específico para el conjunto de compuestos fenólicos totales. Así mismo se obtuvieron los espectros de absorción de cada uno de los diez compuestos fenólicos identificados mediante la Cromatografía en Capa Fina, estos datos coinciden con los reportados por Oszmianski y Wojdylo, 2008. En la Figura 3 se muestra una importante actividad antioxidante en el extracto de manzana con concentración de 13.5 mg de fenoles con respecto al antioxidante más utilizado comercialmente en alimentos, BHT con concentración de 0.2 mg/mL; mientras que el control de metanol al 80% no muestra protección ante la decoloración oxidativa del β-caroteno.




Tabla IV: Compuestos fenólicos identificados con Cromatografía en Capa Fina MANCHA COLOR

VIS COLOR UV

RF (Exp)

RF (Ref)

MÁXIMOS DE ABSORCIÓN (nm)* (Exp)

MÁXIMOS DE ABSORCIÓN (nm)* (Ref)

COMPUESTO IDENTIFICADO

1 Incoloro Azul brillante 0.12 0.13 271, 318 320b Ácido

clorogénico

2 Rosa Rosa 0.18 0.16a 276 277, 535 c Cianidina-3,5-diglucósido

3 Azul Azul brillante 0.29 0.29a 275, 531 277, 535 c Cianidina-3-

gentobiósido

4 Azul púrpura Púrpura 0.37 0.37a 275, 532 277, 535c Cianidina-3-

ramnoglucósido

5 Azul Púrpura 0.43 0.44c 273, 531 277, 535 c Cianidina-5-glucósido

6 Amarillo Púrpura marrón 0.53 0.52b 269, 362 225 - 280b Epicatequina

7 Amarillo Púrpura marrón 0.59 0.58b 268, 355 260 - 360b Quercetina-3-

glucósido 8 Amarillo Rosa 0.63 0.64b 277 225 - 280b Catequina

9 Amarillo Rosa amarillo 0.72 0.72a 273, 369 260 - 360b Isoquercetina

10 Incoloro Rosa 0.80 0.82b 271, 318 270b Dihidroquercetinaa.(Lederer, 1957), b.(Ranganna, 1986), c.(Arditti, 1969).

*En alcohol ácido 0.1%.




Figura 2. Espectro de absorción del extracto de cáscara manzana. Máximos de

absorción representativos de algunos compuestos fenólicos que contiene el extracto de cáscara de manzana criolla.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0 20 40 60 80 100 120 140

A 470

tiempo (min) Figura 3. Actividad antioxidante del extracto de manzana. Actividad antioxidante en la ( ) Manzana 13.5 mg fenoles/g cáscara húmeda, ( ) BHT 0.2 mg/mL y ( ) Control.




Tabla V: Actividad antioxidante en el BHT, Manzana y Control obtenidos experimentalmente.

aAOX: Valor antioxidante. bAA: Actividad antioxidante. cOOR: Proporción de velocidad antioxidante. dAAC: Coeficiente de actividad antioxidante.

MUESTRA AOXa (A/h) AAb (%) ORRc ACCd

BHT (0.2 mg/mL) 0.029 99.54 0.05 978.46

Manzana (13.5 mg) 0.18 45.83 0.43 350.01

CONTROL 0.26 0 1 0

Los compuestos fenólicos contenidos en la cáscara de la variedad mexicana de manzana brindan una importante protección al β-caroteno durante la decoloración que sufre como consecuencia de la acción oxidativa del peróxido y por el calentamiento, condiciones a las que fue sometido durante la determinación. Con la finalidad de que el extracto permanezca más tiempo disponible para ser consumido y que de este modo sea posible aprovechar los beneficios de la actividad antioxidante que los compuestos fenólicos le confieren a la cáscara de manzana, se conserva en esferas sólidas de alginato de calcio. Las dimensiones de la esfera son de 5 milímetros de diámetro. En la Figura 4 se muestra una de las esferas que contienen 13.5 miligramos de fenoles.

Figura 4. Extracto de cáscara de manzana encapsulado. Esferas de 5 mm de diámetro

conteniendo 13.5 mg de fenoles. DISCUSIÓN Presentaron siempre valores mayores las tres variedades extranjeras, sin embargo esto no representa una limitante para la extracción de compuestos fenólicos de la cáscara de la variedad mexicana de manzana, por el contrario, debido a que su contenido de fenoles es similar cualtitativa y cualitativamente al del resto de las manzanas es posible realizar una comparación a partir del análisis de la concentración y composición de los compuestos fenólicos contenidos en su cáscara para conocer el grado de similitud que se presenta.




A pesar de que la predominancia de la pulpa mientras que la cantidad de cáscara es menor, es posible obtener una importante cantidad de compuestos fenólicos a partir de ella. Aproximadamente del 30% del máximo contenido reportado en la bibliografía revisada. Los compuestos fenólicos usualmente encontrados en cáscara de manzana son Antocianina, Quercetina, Catequina y Flanonoles principalmente (Bate-Smith, 1948, Wolfe, 2003 Ranganna, 1986, Oszmianski y Wojdylo, 2008), algunos de los cuales fueron hallados en el extracto de cáscara de manzana mediante la identificación parcial de fenoles con Cromatografía en Capa Fina. Corroborados mediante una identificación más precisa de los compuestos fenólicos la cual se realiza obteniendo los espectros de absorción de cada uno de los compuestos separados e identificados con la cromatografía. El extracto de cáscara de manzana ofrece una significativa protección ante el fenómeno de decoloración del β-caroteno causada por la acción del peróxido de hidrógeno como agente oxidante además del calentamiento a 50°C y aunque es únicamente cercana al 50% de la protección brindada por el antioxidante comercial BHT es posible incrementar el efecto protector una vez que se aumenta la cantidad de cáscara y así mismo la concentración de los compuestos fenólicos con tal actividad antioxidante. Con la finalidad de que el extracto permanezca más tiempo disponible para ser consumido y que de este modo sea posible aprovechar los beneficios de la actividad antioxidante que los compuestos fenólicos le confieren a la cáscara de manzana, se conserva en esferas sólidas de alginato de calcio. La esfera tiene 5 milímetros de diámetro y contiene 13.5 miligramos de fenoles; es decir, para cubrir la cantidad de compuestos fenólicos contenidos en una manzana mexicana (27 mg) con una cantidad promedio de cáscara de 7 a 9 gramos será necesario consumir 2 de las esferas. CONCLUSIONES El contenido porcentual de cáscara de manzana mexicana es de cáscara 1.2%, de pulpa 81%, de corazón 6% y semilla 0.17%. Se realizó la extracción de los compuestos fenólicos contenidos en la cáscara de manzana mexicana con alcohol al 0.1%. El extracto obtenido se concentró a condiciones ambientales para evitar la degradación de los compuestos fenólicos contenidos. Los compuestos fenólicos contenidos el extracto de cáscara de manzana identificados son Cianidina, Catequina, Quercetina y Ácido clorogénico. Se determinó la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos de cáscara de manzana mexicana con el método de Velioglu y cols. (1998) (Blanqueamiento del β-caroteno). La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos contenidos en la cáscara de la manzana analizada es buena (46%) aunque menor que la del BHT (99%).




El extracto obtenido a partir de cáscara de manzana se encapsuló con Alginato de Calcio en esferas de 5 mm de diámetro conteniendo 13.5 mg de compuestos fenólicos con actividad antioxidante del 46%. La variedad de manzana mexicana Malus domestica representa una opción importante para la obtención de compuestos fenólicos y así mismo de los beneficios que éstos ofrecen al organismo para contrarrestar los efectos de los radicales libres y la oxidación del mismo sin la necesidad de consumir medicamentos, a un bajo precio y de sencillo y práctico consumo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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REFERENCIAS INFORMÁTICAS I. FAO. 2006. Producción mundial de manzana. www.fao.org/ag/esp/default.htm II. SAGARPA. 2005. Producción nacional de manzana. www.sagarpa.gob.mx/cgcs

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