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I EVALUACIÓN DE FUENTES ALTERNATIVAS DE NITRÓGENO EN FERMENTACIÓN LÁCTICA EVALUATION OF ALTERNATIVE SOURCES OF NITROGEN IN LACTIC FERMENTATION Jhon Jairo Aragón Arias Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Química y Ambiental 2015
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I
EVALUACIÓN DE FUENTES ALTERNATIVAS DE NITRÓGENO EN FERMENTACIÓN LÁCTICA
EVALUATION OF ALTERNATIVE SOURCES OF NITROGEN IN LACTIC
FERMENTATION
Jhon Jairo Aragón Arias
Universidad Nacional de Colombia
Sede Bogotá Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental 2015
II
EVALUACIÓN DE FUENTES ALTERNATIVAS DE NITRÓGENO EN FERMENTACIÓN LÁCTICA
EVALUATION OF ALTERNATIVE SOURCES OF NITROGEN IN LACTIC FERMENTATION
Tesis de Maestría para optar por el título de magister en ingeniería química:
Jhon Jairo Aragón Arias
Maestría en Ingeniería Química/Modalidad Investigación
Director:
Juan Carlos Serrato Bermúdez
Ingeniero Químico. M. Sc., D. Sc.
Universidad Nacional de Colombia
Sede Bogotá Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental 2015
III
Resumen.
Con el fin de reemplazar en la fermentación láctica totalmente al extracto de
levadura, una fuente de nitrógeno de alto costo económico, fueron evaluadas
cuatro alternativas diferentes: humus líquido, semilla de guayaba, harina de soya y
gallinaza. Estas se caracterizaron y se evaluó el efecto de su adición en la
fermentación, el mejor resultado se obtuvo con gallinaza compostada (a una
concentración de 0,14% de nitrógeno total) logrando una concentración máxima
de ácido láctico de 2,12 %p/v, superando la máxima concentración de ácido láctico
producido con extracto de levadura y una eficiencia de conversión de 50,3 %. La
harina de soya a la misma concentración de nitrógeno equivalente obtuvo una
concentración final de ácido láctico y una eficiencia de 0,73 %p/v y 43,6 %,
respectivamente. El humus y las semillas de guayaba no mostraron ningún efecto
sobre la fermentación. Una evaluación económica preliminar del proceso a escala
de laboratorio encontró que el uso de la gallinaza compostada disminuye los
costos operativos en un 92,7 % con respecto al empleo de extracto de levadura.
Palabras claves.
Fuentes alternativas de nitrógeno; fermentación láctica; ácido láctico;
Lactobacillus.
IV
Abstract.
In order to totally replace in lactic fermentation the yeast extract, a high cost
substrate, four different sources of nitrogen: liquid humus, guava seed, soy flour
and poultry droppings were employed. They were characterized and evaluated on
lactic acid fermentation. The best result was obtained with composted poultry (with
0,14 %p/v of total nitrogen) producing a maximum lactic acid concentration of 2,12
%p/v beating the maximum concentration of lactic acid produced with yeast extract
and a conversion efficiency of 50,3 %. Soy flour at an equivalent nitrogen
concentration obtained maximum lactic acid concentration and efficiency of 0,73
%p/v and 43,6 % respectively. The liquid humus and guava seed sources did not
show any effect on lactic fermentation. Achieved through the use of composted
poultry decreased operating costs of 92.7% with respect to the source of yeast
extract, simulating the laboratory scale process.
Keywords.
Nitrogen sources; lactic fermentation; lactic acid; lactobacillus.
V
TABLA DE CONTENIDO.
1. INTRODUCCIÓN. ............................................................................................. 1
2. ÁCIDO LÁCTICO. ............................................................................................. 7
2.1. Propiedades. .............................................................................................. 8
2.2. Aplicaciones del ácido láctico. .................................................................... 8
2.3. Síntesis del ácido láctico. ......................................................................... 11
2.3.1. Síntesis química de ácido láctico. ...................................................... 12
2.3.2. Producción de ácido láctico por procesos de fermentación. .............. 13
2.4. Los productores de ácido láctico microbianos. ......................................... 15
2.4.1. Bacterias. ........................................................................................... 16
2.4.1.1. Las bacterias ácido lácticas ............................................................ 16
2.4.1.1.1. Género Lactobacillus. ................................................................. 20
2.4.1.2. Otras bacterias productoras de ácido láctico. ................................. 21
2.4.2. Otros organismos productores de ácido láctico. ................................ 22
2.5. Rutas metabólicas. ................................................................................... 23
2.6. Factores que afectan la fermentación láctica. .......................................... 27
2.6.1. Sustratos. .......................................................................................... 27
2.6.1.1. Fuente de carbono. ........................................................................ 28
2.6.1.2. Efecto de carbohidratos mixtos como fuente de carbono. .............. 30
2.6.1.3. Fuentes minerales .......................................................................... 31
2.6.2. Efecto del pH en fermentación láctica. .............................................. 32
2.6.3. Efecto de la actividad de agua en fermentación láctica. .................... 33
2.6.4. Efecto de la temperatura en fermentación láctica. ............................. 34
2.6.5. Efecto del tamaño de inóculo en fermentación láctica. ...................... 35
2.6.6. Efecto de la aireación en la fermentación láctica. .............................. 36
2.7. Fuente de nitrógeno. ................................................................................ 37
2.7.1. Gallinaza. ........................................................................................... 40
2.7.2. Semilla de guayaba. .......................................................................... 41
2.7.3. Harina de soya. .................................................................................. 42
2.7.4. Humus líquido (lombricompuesto). .................................................... 42
VI
3. MATERIALES Y MÉTODOS. .......................................................................... 44
3.1. Metodología. ............................................................................................ 44
3.2. Fuentes de nitrógeno. .............................................................................. 45
3.2.1. Gallinaza. ........................................................................................... 45
3.2.2. Semilla de guayaba. .......................................................................... 45
3.2.3. Harina de soya. .................................................................................. 45
3.2.4. Humus líquido (lombricompuesto). .................................................... 45
3.3. Microorganismos. ..................................................................................... 46
3.3.1. Lactobacillus casei. ............................................................................ 46
3.3.2. Lactobacillus plantarum. .................................................................... 46
3.3.3. Lactobacillus acidophilus. .................................................................. 47
3.4. Selección y caracterización de las fuentes de nitrógeno. ......................... 47
3.5. Medio de mantenimiento. ......................................................................... 48
3.6. Medio de fermentación y condiciones. ..................................................... 49
3.7. Selección del microorganismo. ................................................................ 50
3.8. Efecto de la fuente de nitrógeno. ............................................................. 51
3.8.1. Efecto de la gallinaza en tres distintos estados. ................................ 51
3.9. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno............................... 52
3.10. Métodos analíticos ................................................................................ 53
3.10.1. Caracterización de las fuentes de nitrógeno. ................................. 53
3.10.1.1. Humedad. ....................................................................................... 53
3.10.1.2. Cenizas. ......................................................................................... 54
3.10.1.3. Nitrógeno total. ............................................................................... 54
3.10.1.4. Conteo microbiológico de mesofilos totales y coliformes totales. ... 55
3.10.2. Variables de respuesta. .................................................................. 56
3.10.2.1. Cuantificación de ácido láctico y sacarosa. .................................... 56
3.10.2.2. Biomasa. ........................................................................................ 57
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ...................................................................... 59
4.1. Caracterización de fuentes alternativas de nitrógeno. ............................. 59
4.2. Selección del lactobacilo. ......................................................................... 61
4.3. Efecto de la fuente de nitrógeno en fermentación láctica. ........................ 63
VII
4.3.1. Gallinaza. ........................................................................................... 63
4.3.2. Harina de soya. .................................................................................. 67
4.3.3. Semilla de guayaba. .......................................................................... 69
4.3.4. Humus líquido. ................................................................................... 71
4.3.5. Comparación entre las cuatro diferentes fuentes escogidas. ............ 72
4.4. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno en fermentación
láctica. ................................................................................................................ 76
4.4.1. Efecto de la concentración de la gallinaza. ........................................ 76
4.4.2. Efecto de la concentración de la harina de soya. .............................. 77
4.4.3. Comparación entre el efecto de gallinaza y harina de soya como
fuentes de nitrógeno a tres concentraciones distintas. ................................... 78
4.5. Análisis de costos..................................................................................... 82
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ................................................. 86
6. BIBLIOGRAFÍA. .............................................................................................. 88
7. ANEXOS. ...................................................................................................... 103
VIII
LISTA DE FIGURAS.
Figura 1. Isómeros ópticos del ácido láctico. ........................................................... 8
Figura 2. Aplicaciones del ácido láctico en las diferentes industrias. ...................... 9
Figura 3. Características de los polímeros de ácido láctico y sus mezclas
estereoscópicas.. ............................................................................................ 10
Figura 4. Rutas metabólicas para la producción de ácido láctico .......................... 26
Figura 5. Clases de microorganismos en relación con la temperatura .................. 35
Figura 6. Esquema de proteólisis y ciclo del nitrógeno en bacterias lácticas ........ 38
Figura 7. Sistema de reacción, variables de entrada y respuesta. ........................ 44
Figura 8. Lactobacillus plantarum .......................................................................... 46
Figura 9. Lactobacillus acidophilus ........................................................................ 47
Figura 10. Lactobacillus incubado en medio liquido MRS. .................................... 48
Figura 11. Medios de fermentación. ...................................................................... 50
Figura 12 .extractos acuosos de gallinaza. ........................................................... 52
Figura 13. Montaje para determinación de nitrógeno por método kjeldahl. ........... 55
Figura 14. Agares utilizados en el conteo agar cristal violeta y abs ...................... 56
Figura 15. Equipo hplc y detector utilizados en la cuantificación........................... 56
Figura 16. Fermentación con extracto de levadura para tres distintos lactobacilos
........................................................................................................................ 62
Figura 17. Efecto de la gallinaza seca, compostada y en extracto acuoso ........... 64
Figura 18. Pareto para la comparación del efecto de la gallinaza en distintos
estados en comparación con extracto de levadura ......................................... 65
Figura 19. Cromatograma del medio de fermentación usando semilla de guayaba
como fuente alternativa de nitrógeno. ............................................................. 70
Figura 20. Efecto de la fuente de nitrógeno en la producción de ácido láctico ...... 73
Figura 21. Pareto de las cuatro distintas fuentes de nitrógeno evaluadas en
fermentación láctica. ....................................................................................... 75
Figura 22. Pareto para el efecto de la concentración de gallinaza compostada ... 76
Figura 23. Pareto para el efecto de la concentración de harina de soya ............... 77
Figura 24. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno en la producción
de ácido láctico ............................................................................................... 80
Figura 25. Cromatogramas para la concentración de nitrógeno de 0,21 %p/v de las
fuentes gallinaza y soya. ................................................................................. 80
Figura 26. Pareto del efecto de la concentración de gallinaza compostada y harina
de soya en fermentación láctica ..................................................................... 81
IX
LISTA DE TABLAS.
Tabla 1. Principales importadores y exportadores de ácido láctico ............................ 2
Tabla 2. Ventajas y desventajas de los procesos de fermentación........................... 15
Tabla 3. Caracterización de las lactobacterias (lab) homoferementativas y
heterofermentativas. .................................................................................................. 19
Tabla 4. Estudios anteriores en la búsqueda de fuentes de nitrógeno alternativas
en fermentación láctica. ............................................................................................. 39
Tabla 5. Caracterización de distintas condiciones de la gallinaza de ponedoras de
jaula. ............................................................................................................................. 41
Tabla 6. Composición del humus líquido. ...................................................................... 43
Tabla 7. Composición del medio nutricional implementado ....................................... 49
Tabla 8. Fuente de nitrógeno en el medio nutritivo para la producción de ácido
láctico. .......................................................................................................................... 51
Tabla 9. Contenido de nitrógeno y fuente de nitrógeno en el medio nutritivo para la
producción de ácido láctico. ..................................................................................... 53
Tabla 10. Criterios de clasificación para la selección de las fuentes de nitrógeno. 59
Tabla 11. Selección de las fuentes de nitrógeno para la etapa experimental. ........ 60
Tabla 12. Caracterización de las fuentes de nitrógeno. .............................................. 60
Tabla 13. Porcentaje de ácido láctico y análisis diferencial. ....................................... 64
Tabla 14. Consolidado de resultados obtenidos en la evaluación del efecto de la
fuente de nitrógeno y análisis diferencial. .............................................................. 73
Tabla 15. Consolidado de resultados obtenidos para la evaluación del efecto de la
concentración y análisis diferencial. ........................................................................ 79
Tabla 16. Análisis de costo para la fermentación de 100m3 de medio con la fuente
de nitrógeno extracto de levadura. .......................................................................... 83
Tabla 17. Análisis de costo para la fermentación de 100m3 de medio con la fuente
de nitrógeno gallinaza compostada. ........................................................................ 84
Tabla 18. Comparación de los costos operativos para la fermentación con las
fuentes evaluadas para la producción de una tonelada de ácido láctico. ......... 85
X
LISTA DE ECUACIONES.
Ecuación 1. Síntesis química del ácido láctico ...................................................... 13
Ecuación 2. Eficiencia en la bioconversión de sacarosa a ácido láctico. .............. 44
Ecuación 3. Factor de selección de las fuentes de nitrógeno. .............................. 48
Ecuación 4. Factor de conversión de densidad óptica a biomasa seca ................ 58
XI
LISTA DE ANEXOS.
Anexo A. Determinación de sacarosa y ácido láctico por HPLC………..
Anexo B. Determinación de biomasa………………………………………
Anexo C. Determinación de nitrógeno método Kjeldahl……………........
Anexo D. Resultados obtenidos por HPLC………………………………..
Anexo E. Análisis estadístico………………………………………………..
1
1. INTRODUCCIÓN.
En los últimos años, el desarrollo de procesos biotecnológicos ha aumentado con
la generación de sistemas de mayores eficiencias, costos sostenibles y
competitividad de sus productos, interés generado por la creación de tecnologías
más amables con el medio ambiente, estimulando una nueva tendencia de
producción verde, dentro de estos procesos el ácido láctico producido por
fermentación microbiana atrae gran atención (Wang, Tashiro & Sonomoto 2015;
Castillo et al. 2013); por las distintas aplicaciones de este y sus derivados en
industrias farmacéuticas, alimenticias, cosméticas, textiles y químicas.
El desarrollo científico entorno a la generación de ácido láctico ha centrado su
atención en el estudio de bacterias y otros microorganismos con la capacidad de
sintetizarlo (Wang et al. 2015), debido a que pueden producirlo con una alta
selectividad y excelente conversión de sustratos. Las bacterias ácido lácticas
generalmente tienen requerimientos nutricionales complejos debido a su reducida
capacidad de generar metabolitos necesarios para su propio crecimiento, además
de la fuente de carbono para la generación de la energía suficiente para su
proliferación, estos requerimientos nutricionales incluyen a las fuentes de
nitrógeno, vitaminas y minerales, para el adecuado desempeño metabólico y
crecimiento (Nancib et al. 2005, Wang et al. 2015; Abdel-Rahman, Tashiro &
Sonomoto 2013).
Las bacterias ácido lácticas se definen como organismos anaerobios facultativos o
microaerofilos caracterizados por los siguientes aspectos:
1. Pueden crecer a temperaturas tan bajas como 5 °C o tan altas como 45 °C
2. Pueden crecer a pH 4,0-4,5, algunos también proliferan a pH 3,2 o 9,6
3. Generalmente requieren fuentes complejas de nitrógeno, vitaminas y
minerales para el crecimiento y producción de ácido láctico (Nancib et al.
2005; Wang et al. 2015).
2
Con el desarrollo de la biotecnología y la bioconversión industrial, los sistemas de
fermentación han ayudado a reducir las preocupaciones ambientales, ofreciendo
procesos con bajas temperaturas, bajos requerimientos energéticos, alta pureza y
el desplazamiento casi total del proceso químico, resultando en un crecimiento
anual del 5-7% en la demanda de ácido láctico (Altaf et al. 2007; Djukić-Vuković et
al. 2012; Bilanovic et al. 2011). Se estima un consumo anual de 259 mil toneladas
métricas para el año 2012, y se prevé llegar a 367.300 toneladas en el año 2017
(Abdel-Rahman, Tashiro & Sonomoto 2013) a un costo entre 500 $USD/ton y 1200
$USD/t para la categoría alimentaria (Tianjin Yuanlong Chemical Industry Co., Ltd.
2014; Hebei Huachang Import and Export Trade Co., Ltd. 2014).
El mercado de ácido láctico ha presentado un constante incremento en ventas los
últimos años, un ejemplo importante lo presenta Tailandia con una rápida incursión
en el mercado mundial posicionándose entre los mayores productores de lactatos
luego de no ser un mercado de amplia importancia en este país, por otra parte a
nivel latinoamericano Brasil se ha mantenido como el principal productor con un
0,6% de las exportaciones mundiales y un crecimiento cercano al 42% para el
2008 (Tabla 1)(smartexport 2008).
Principales
importadores
Importe
de las
importaciones
Evolución
de las
importaciones
Principales
exportadores
Peso en
las exportaciones
Evolución
de las
exportaciones
Países Bajos 100 M USD 206,7 % Tailandia 15,5 % +∞
Estados Unidos 55 M USD 47,1 % India 0,7 % 197,2 %
Alemania 35 M USD -15,5 % Brasil 0,6 % 41,2 %
Japón 26 M USD 8,7 % Países Bajos -7,7 % -0,2 %
Francia 25 M USD 5,8 % Estados Unidos -1,3 % 4,3 %
Tabla 1. Principales importadores y exportadores de ácido láctico (smartexport 2008).
En Colombia se importaron aproximadamente 367 toneladas para el 2010 (94 %
del consumo anual), dado que la producción nacional de lactatos no cumple con la
demanda que la industria colombiana exige, por lo tanto el disminuir los costos de
3
producción es un gran incentivo para el avance de la industria ácido láctica, un
mercado escasamente explorado en el país (Suárez 2011).
Otra gran industria basada en el ácido láctico es la manufactura de biopolímeros
como polilactatos, los cuales por sus características biodegradables son
excelentes para la producción de bioplásticos (Altaf et al. 2007; Lu et al. 2009). El
consumo de ácido láctico como una materia prima para su obtención ha crecido
drásticamente en los últimos años. Sin embargo, la cantidad producida de estos
(450 millones de kilogramos por año) es muy inferior a la producción anual de
plásticos (200 mil millones de kilogramos por año) (Abdel-Rahman, Tashiro &
Sonomoto 2013), con precios de venta entre los US$ 1400-1600 por tonelada
métrica (Icis 2013).
Los polilactatos podrían entrar a competir fuertemente en el mercado
reemplazando plásticos derivados de la petroquímica, pero presentan algunas
limitaciones en su fabricación, superables sí se generan procedimientos más
eficientes y menores costos en la producción de éste (Wee Kim & Ryu 2006).
Entre las limitaciones de los procesos de fermentación para la obtención de ácido
láctico encontramos la baja concentración lograda de este en el medio de
fermentación, causada por la inhibición de producto en el metabolismo celular, y
por tanto menores rendimientos económicos. Para superar estas limitantes, se han
estudiado diferentes maneras de elevar la eficiencia de producción reduciendo los
costes de la misma, por ejemplo: por medio del mejoramiento de la cepa, del
medio nutricional o de las condiciones de la fermentación (Lu et al. 2009).
Hoy en día, materiales renovables como la lignocelulosa y almidón a partir de
residuos agrícolas, los recursos agroindustriales son atractivos como fuente de
carbono para la producción del ácido láctico debido a su abundancia y bajo costo
(Castillo et al. 2013). Sin embargo, un limitante para este uso es el costo del
tratamiento previo necesario, ya que los materiales renovables de este tipo poseen
4
una baja digestibilidad por parte de microorganismos lácticos, demandando un
pretratamiento para romper la asociación de la lignina con la holocelulosa debido a
la falta de enzimas hidrolíticas en las cepas utilizadas tradicionalmente (Wang et
al. 2015).
Un gran inconveniente en la industria ácido láctica son los requerimientos
especiales en cuanto a la fuente de nitrógeno requerida por los microorganismos
empleados, la cual debe ser fácilmente disponible, debido a la falta de complejos
enzimáticos hidrolíticos, y a la vez fácilmente asimilable. Por ello el extracto de
levadura se ha utilizado mayoritariamente, pero sus altos costos restringen su uso
en grandes cantidades en los procesos industriales para la producción de ácido
láctico (Nancib et al. 2005).
El extracto de levadura es una excelente fuente de nitrógeno debido a las purinas,
pirimidinas y vitaminas del complejo B, entre otros que lo componen, sin embargo,
su elevado costo perjudica la rentabilidad de la fermentación láctica (Nancib et al.
2005; Yu et al. 2008), limitando su uso en altas cantidades, razón que justifica la
búsqueda de otras fuentes de nitrógeno asimilable que reemplacen de manera
total o parcial el uso del extracto de levadura y posean una alta disponibilidad y
menor valor en el mercado sin afectar de manera negativa la bioconversión de los
carbohidratos (Vázquez & Murado 2008b).
Según Tejayadi y Cheryan (1995) y Djukić-Vuković et al. (2012), uno de los
mayores contribuyentes al costo de la producción de ácido láctico es la utilización
de extracto de levadura como fuente de nitrógeno ya que representa el 38% del
costo total, motivo por el cual se han impulsado estudios en productos que puedan
reemplazar éste para el desarrollo de un proceso industrialmente viable, con altas
productividades, bajas concentraciones de carbohidratos residuales, bajos niveles
de suplementación en el medio y un bajo costo de producción.
5
Algunas fuentes de nitrógeno alternativas se han investigado como peptona y
extracto de carne, las cuales tienen un efecto positivo en la producción de ácido
láctico, pero inferior al proporcionado por el extracto de levadura, además de
necesitar suplementos vitamínicos del grupo B (Arasaratnam et al. 1996).
Adicionalmente, la sustitución del extracto por estas fuentes no ha representado
un gran impacto en la reducción de costos, porque estas alternativas poseen altos
costos también (Wang et al. 2015).
Otros estudios reportan la implementación de fuentes alternativas de bajo costo de
origen inorgánico y subproductos de distintas industrias, en especial la agrícola,
como harina de lenteja roja, levadura de panadería, licor de maceración de maíz,
extracto de malta, bovinaza (Yu et al. 2008), hidrolizados de pescado, salvado de
trigo, larvas de gusanos de seda, entre otros, con el objetivo de reemplazar total o
parcialmente el extracto de levadura o la peptona (Wang et al.2015). Sin embargo,
muy pocas de estas generan rendimientos en la producción de ácido láctico
comparables a los obtenidos con el uso exclusivo de extracto de levadura.
Con la finalidad de aportar alternativas para la generación de procesos eficientes y
rentables en la producción de ácido láctico en el presente trabajo se pretende
evaluar cuatro fuentes alternativas de nitrógeno que puedan reemplazar
totalmente al extracto de levadura en la fermentación láctica con un Lactobacillus,
para lo cual se escogieron estas en términos de concentración de nitrógeno,
disponibilidad en el mercado nacional y valor comercial.
Con el objetivo de evaluar el efecto de fuentes alternativas en la fermentación
láctica, se procedió a establecer el resultado de la implementación de las cuatro
fuentes seleccionadas a un mismo nivel de nitrógeno total, para posteriormente
determinar las concentraciones de las fuentes con mayor acción benéfica en el
sistema, usando para este propósito las dos mejores fuentes con los resultados
más representativos, finalmente se desarrolló un análisis de costos operativos a
6
nivel de laboratorio con la finalidad de determinar la relación de gastos con la
implementación de fuentes alternativas en contraste con el extracto de levadura.
7
2. ÁCIDO LÁCTICO.
El ácido láctico (ácido 2-hidroxipropanoico) es un ácido α-hidroxicarboxílico de
origen natural, este compuesto fue descubierto y refinado en 1780 por el químico
sueco Carl Wilhelm Scheele, por medio de su aislamiento de leche agria como una
sustancia marrón y nombrándola Mjölksyr, desencadenando su estudio y
desarrollando grandes avances de importancia en la fisionomía animal (Ghaffar et
al. 2011; Wang et al. 2015). Posterior a su descubrimiento, Lavoisier en 1789
denomina a este componente de la leche acide lactique, el cual se convierte en
origen etimológico del actualmente ácido láctico, pero no es hasta 1839 que el
científico francés Edmond Frémy identifica el origen de este, en el proceso de
fermentación de carbohidratos de bajo peso molecular como sacarosa, lactosa,
manitol, almidón y dextrina (Ghaffar et al. 2011).
Estos avances en el uso microbiológico para la obtención de compuestos de
interés dan lugar a su primera producción a escala industrial a cargo de Charles E.
Avery en Littleton, Massachusetts (1881). A partir de ese momento tiene amplias
aplicaciones en alimentos, productos farmacéuticos, cosmética y síntesis química,
entre otros, logrando posicionarse como el primer producto biotecnológico con
éxito comercial, alcanzando a desplazar su síntesis química en aproximadamente
un 96%(Wee, Kim & Ryu 2006), además de tener un aumento considerable en su
demanda causada por nuevas aplicaciones para los lactatos y procesos más
eficientes.
Aunque su producción industrial comenzó a partir de la síntesis química, esta fue
desplazada por el uso de microorganismos productores (Serrato 2004), debido a la
capacidad de los sistemas fermentativos de producir L-ácido láctico puro (isómero
biológicamente activo) más no una mezcla racémica de sus isómeros D y L como
se sucede en su síntesis química (Sikder et al. 2012), esto es un inconveniente ya
que el D-ácido láctico es conocido por sus efectos perjudiciales sobre el
8
metabolismo humano, provocando ácidosis y descalcificación (Young-Jung &
Hwa-Won 2009; Karp et al. 2011).
2.1. Propiedades.
El ácido láctico o ácido 2-hidroxipropanoico es un compuesto incoloro de fórmula
CH3CHOHCOOH (Karp et al. 2011), además de ser una de las moléculas más
pequeñas ópticamente activas, presentando la forma dextrógira D(-) y levógira
L(+),este es un ácido débil con un pKa de 3,5, punto de ebullición cercano al del
agua (98 °C) por lo que forma una mezcla azeotrópica bastante fuerte. El ácido
láctico es producido de manera natural por animales, plantas y microorganismos
(Ramirez & Leal 2008; Lu et al. 2010), aunque también puede ser sintetizado a
partir de acetaldehído o etanol o a partir de derivados del petróleo como etileno y
acetileno.
Figura 1. Isómeros ópticos del ácido láctico.
2.2. Aplicaciones del ácido láctico.
El ácido láctico es un compuesto orgánico catalogado por la Food and Drug
Administration de los Estados Unidos como GRAS (generalmente considerado
como seguro), por lo que sus aplicaciones en los alimentos y otras industrias
químicas son diversas usándose desde hace 120 años aproximadamente
(Bamforth 2005).
9
Figura 2. Aplicaciones del ácido láctico en las diferentes industrias.
La fermentación para formar ácido láctico es utilizada alrededor del mundo para
producir diversos alimentos lácteos como yogurt, queso, kéfir, kishk, encurtidos
como pepino y aceitunas, entre otros (Pescuma et al. 2008), dándoles un sabor
amargo y mejorando su estabilidad microbiológica y regulando la acidez de los
mismos (Alonso et al. 2010). Las industrias cosméticas también se benefician del
ácido láctico en la fabricación de productos de higiene y estéticos como suavizante
en reemplazo de la glicerina, para suavizar contornos, para mejorar la textura y el
tono de la piel (Garcia et al. 2010).
En la industria química es fundamental para la producción de varios productos,
incluyendo lactato de etilo, propilenglicol, 2,3 - pentanodiona, ácido propanoico,
ácido acrílico y acetaldehído en procesos de síntesis orgánica (Young-Jung &
Hwa-Won 2009), así como para la obtención de biopolímeros (Altaf et al. 2007; Liu
et al. 2010; Gao et al. 2008), como el ácido poliláctico, un polímero biodegradable
y versátil, cada vez más importante debido a su uso en los sistemas de
administración de fármacos y en fabricación de envases por sus cualidades
termoplásticas (Wee Kim & Ryu 2006).
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Los ácidos polilácticos son plásticos biodegradables, estos pueden ser utilizados
como una alternativa ecológica a los derivados petro-químicos plásticos en la
industria textil, las industrias farmacéutica, médica y de envases.
El ácido poliáctico puede ser dividido en poli L-ácido láctico (PLLA), poli D-ácido
láctico (PDLA), y poli (DL-ácido láctico) (PDLLA), los polímeros más utilizados
requieren temperaturas de fusión superiores a 185-190°C, sin embargo los
homopolímeros, PLLA como PDLA, son cristalinos y tienen la misma temperatura
de fusión de aproximadamente 180 °C (Mimitsuka et al. 2015). Recientes estudios
han revelado configuraciones estables estéreo-complejas de tipo Stereocomplex
PLA (sc-PLA) la cual es caracterizada por temperaturas superiores de fusión en
aproximadamente 50 °C a las presentadas por los homopolímeros D y L además
tener unas mejores características de cristalinidad (Mimitsuka et al. 2015).
Figura 3. Características de los polímeros de ácido láctico y sus mezclas estereoscópicas. Tomado y adoptado de (Haan 2009).
En cuanto al mercado actual, el ácido láctico de calidad alimentaria a una
concentración del 88% p/v tiene un precio de $ 1400-1600 por tonelada métrica
(Icis 2013), con una demanda anual de 130.000-150.000 toneladas métricas, que
se estima llegar á 367.300 toneladas métricas en 2017 (Prweb 2012), y más de un
millón de toneladas en 2020, este crecimiento dado en gran parte por la demanda
11
de poliláctatos como un polímero medioambientalmente favorable (Upadhyaya,
DeVeaux & Christopher 2014).
2.3. Síntesis del ácido láctico.
La producción industrial de ácido láctico como se mencionó anteriormente, se ha
desarrollado por dos rutas, a través de su síntesis química o por fermentación
microbiana. Sin embargo, los métodos biotecnológicos han desplazado su
producción química dada su capacidad de generar ácido láctico puro en su
naturaleza óptica a diferencia de las mezclas racémicas obtenidas en la industria
química.
El crecimiento en la producción de ácido láctico ópticamente puro en especial el
L(+) impuso su uso en la generación de los bioplásticos con el desarrollo de
poliláctatos con cualidades superiores en su punto de fusión y cristalinidad, y en
menor medida en industrias alimentarias. La producción de este compuesto puro
D- o L-ácido láctico se da a partir de la correcta fermentación de carbohidratos por
parte de microbios denominados como cepas homolácticas como lo son bacterias
especializadas u optimizadas del genero Lactobacillus, organismos ampliamente
utilizados por su alta tasa de conversión de azúcares en ácido láctico.
Otra dificultad en la producción de ácido láctico es su recuperación y purificación,
en el proceso convencional se recupera el lactato por la precipitación en general
con sales de calcio o su hidróxido, posteriormente reconstituyendo el ácido láctico
por medio de la acidificación del medio con ácidos minerales fuertes como HCl o
H2SO4. Estos pasos son considerados un gran obstáculo por su gran demanda de
reactivos químicos de alto costo y la generación final de derivados de yeso como
subproducto los cuales no aportan mayores ganancias con su producción.
12
En cuanto a los procesos de recuperación y purificación son diversos pero en
general procuran la recuperación del ácido láctico desde el caldo de fermentación,
evitando el uso de reactivos causando menor huella ambiental, aunque muchos de
ellos están aún en etapa de desarrollo para su implementación industrial.
Numerosos estudios sobre la purificación del ácido láctico se han realizado
mediante el uso de técnicas diferentes para la separación tales como intercambio
iónico, extracción reactiva, la tecnología de membrana, destilación, electro-diálisis
(González et al. 2008), diálisis por difusión, extracción con solventes, adsorción,
cromatografía, electrodiálisis de membrana bipolar (Abdel-Rahman et al. 2013),
nanofiltración y moléculas tensoactivas (Ghaffar et al. 2011).
2.3.1. Síntesis química de ácido láctico.
El procedimiento comercial para la síntesis química del ácido láctico está
fundamentado en la formación de su producto intermedio lactonitrilo. En su
producción el cianuro de hidrógeno es adicionado al acetaldehído en un medio
básico y a alta presión en fase líquida para la formación de lactonitrilo, este se
recupera por procesos de destilación para su posterior hidrólisis (Ecuación 1).
Su hidrólisis es llevada a cabo en un medio fuertemente ácido usando HCl o
H2SO4 concentrados obteniendo así el ácido láctico y sulfato de amonio como
subproducto del proceso. Para su purificación es necesario esterificar con un
alcohol de bajo peso molecular, generalmente metanol, logrando procesos de
destilación más eficiente, aunque conllevando a una etapa adicional para la
hidrólisis del éster y regenerar el ácido láctico.
13
(a) Síntesis del lactonitrilo.
𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂 + 𝐻𝐶𝑁 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑁
(b) Hidrólisis con H2SO4.
𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑁 + 𝐻2𝑂 + 1
2H2SO4 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐻 +
1
2(NH4)2SO4
(c) Esterificación.
𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶𝐻3𝑂𝐻 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐶𝐻3 + H2O
(d) Hidrólisis con agua.
𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐶𝐻3 + H2O → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶𝐻3𝑂𝐻
Ecuación 1.Síntesis química del ácido láctico (Ghaffar et al. 2011).
2.3.2. Producción de ácido láctico por procesos de fermentación.
La fermentación es un proceso biológico, en el cual por medio del metabolismo del
organismo seleccionado se producen una o más moléculas de interés, este
proceso es ligeramente exotérmico en la mayoría de los casos por lo cual hay
bajos gastos energéticos en forma de calor. Este proceso se ha usado
ancestralmente como un medio de conservación de alimentos, mejorando sus
propiedades microbiológicas, evitando su rápida descomposición o contaminación
con agentes patógenos (Bamforth 2005; Leveau & Bouix 2000).
La fermentación láctica es llevada a cabo por un amplio número de especies
dentro de los géneros lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Carnobacterium
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus, Erysipelothrix, Gemella y Weissella (Serrato 2004; Leveau & Bouix
2000). Los cuales metabolizan carbohidratos tales como glucosa, sacarosa,
lactosa, almidón y maltosa, derivados de materias primas alimenticias como el
azúcar de remolacha, melazas, suero de leche, y malta de cebada, sustratos con
alta humedad y concentración de carbono de fácil digestión, características que
hacen de estas llamativas (Ghaffar et al. 2011). La implementación de estas
principalmente esta atribuida a su disponibilidad y precio, por esto fuentes como la
lignocelulosa aun con sus bajos costos y alta disponibilidad como fuente de
14
carbono ampliamente renovable, no son utilizadas aun por su baja cantidad de
sustrato disponible sin un proceso de pretratamiento e hidrólisis que aumente su
digestibilidad.
Actualmente, el método de fermentación láctica más ampliamente utilizado es la
producción por lotes, las condiciones difieren dependiendo de la naturaleza de los
sustratos y el organismo fermentador, pero en general se manejan intervalos de
35 a 60 °C y un pH de 5,0 a 7,0, siendo este controlado en la mayoría de los casos
con hidróxido de calcio o carbonato de calcio, obteniendo eficiencias en la
conversión de carbohidratos de hasta un 90% basándose en el azúcar consumida
y el ácido láctico producto de su metabolismo (Ghaffar et al. 2011).
Otras alternativas en las fermentaciones para la producción de ácido láctico son,
lote alimentado y sistemas continuos. En cuanto a sus diferencias en producción,
los sistemas discontinuos (lote y lote alimentado) alcanzan mayores
concentraciones de este producto, mientras que los sistemas continuos conllevan
a mayores productividades y periodos de tiempo activo más largos (Ghaffar et al.
2011; Abdel-Rahman et al. 2013) (Tabla 2).
15
Modo de
fermentación
Ventajas Desventajas
Fermentación por
lotes
Operación simple
La alta concentración de producto
Reducción del riesgo de
contaminación
Baja productividad
Inhibición de sustrato y / o producto
final
Fermentación por
lote alimentado.
Superar problema inhibición de
sustrato
La alta concentración de producto
La inhibición del producto final
Difícil de llevar a cabo el diseño
óptimo
Fermentación
repetida
Procesos para ahorrar tiempo y mano
de obra
La omisión de los lapsos de tiempo de
preparación
Las altas tasas de crecimiento
Cultivo principal Short
Requisito de dispositivos especiales
(por ejemplo, fibra de módulo hueco) o
líneas de conexión especiales
utilizados para la concentración
celular
Fermentación
continua
Alta productividad
Las tasas de crecimiento de control
Menos frecuencia cerró proceso
La utilización incompleta de la fuente
de carbono
Tabla 2. Ventajas y desventajas de los procesos de fermentación (Abdel-Rahman et al. 2013).
2.4. Los productores de ácido láctico microbianos.
El ácido láctico es producido en todos los reinos en la naturaleza, en los sistemas
de fermentación se han utilizado microrganismos como en bacterias, hongos,
levaduras, cianobacterias y algas. Cada uno de estos con sus propios beneficios
como baja selectividad de sus sustratos, mejores rendimientos y productividad,
mayor resistencia a la acidez, menores requerimientos nutricionales o mejores
propiedades de pureza óptica. Además de poder ser usados en consorcios
microbianos mezclándose dos o más cepas para mejorar sus producciones o la
digestibilidad de fuentes alimenticias complejas (Abdel-Rahman et al. 2013).
16
2.4.1. Bacterias.
Este reino como productor de ácido láctico podría dividirse en dos, cepas nativas o
salvajes y productores industriales, estas últimas siendo domesticadas, definidas y
acondicionadas para una óptima bioconversión de sus sustratos. Entre los
principales modelos biológicos encontrados como productores potenciales están
las bacterias ácido lácticas, Bacillus, Escherichia coli y Corynebacterium
glutamicum.
En cuanto a las limitaciones de la fermentación bacteriana de ácido láctico
encontramos bajos rendimientos debido a la formación de subproductos además
de bajas concentraciones de este debido a su resistencia a la acidez, necesidad
de la implementación de medios de cultivos de alto poder nutricional y alto riesgo
de contaminación por bacteriófagos causando la muerte celular y por ente el cese
de la conversión a ácido láctico, razones que han impulsado un amplio número de
estudios en la optimización e identificación de organismos productores. Por un
lado la identificación y caracterización de cepas nativas y por otro, trabajos en
ingeniería metabólica para lograr cepas con mayor resistencia y producción
(Abdel-Rahman et al. 2013).
2.4.1.1. Las bacterias ácido lácticas
Son un grupo diverso de microorganismos Gram-positivos, no esporulados, y
carentes de catalasa, existen dentro de las plantas, la carne y los productos
lácteos, pueden producir ácido láctico como un producto de la glucólisis
anaeróbica con alto rendimiento y alta productividad (Leveau & Bouix 2000; Abdel-
Rahman et al. 2013). También durante la fermentación, estas bacterias no
producen sólo el ácido láctico, también son conocidos por producir y excretar
compuestos con actividad antimicrobiana conocidas como bacteriocinas, las
cuales son péptidos anfipáticos catiónicos con la capacidad de deformar la
17
membrana celular de células contaminantes (Hwanhlem, Chobert. & H-Kittikun
2014; Bamforth 2005).
Estas bacterias de caracterizan además por:
1. Capacidad de biosíntesis débil, lo cual genera su poliauxotropía para
diversos aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas y ácidos grasos; su
metabolismo carece de la capacidad de sinterizar el núcleo hemo de las
porfirinas, y no poseen citocromos, por lo cual no les es posible realizar
respiraciones aeróbicas y anaeróbicas (Leveau & Bouix2000).
2. Son bacterias anaerobias facultativas microaerófilas.
3. Obtienen su energía por fosforilación a nivel de sustrato a la vez que oxidan
carbohidratos y no poseen un ciclo de Krebs funcional (Cuenca 2005;
Leveau & Bouix 2000).
4. Poseen una alta tolerancia a los ácidos, así que pueden subsistir a pH
menor a 5, implicando una ventaja competitiva sobre otros organismos no
resistentes los cuales proliferan en medios neutros o básicos, esto debido a
que las bacterias lácticas pueden permitir una acidificación de su
citoplasma, gastando de esta forma menos energía en la regulación del pH
interno.
Las bacterias ácido lácticas posen una gran variedad de formas y singularidades,
algunas en forma de bacilos y otras como cocos, ambos anaerobios y en algunos
casos aerotolerantes. Aunque mayoría de las especies requieren nutrientes
complejos para su crecimiento debido a que carecen de muchas capacidades
biosintéticas, lo que dificulta la recuperación de ácido láctico y aumenta los costes
de producción.
Sus condiciones óptimas de crecimiento varían dependiendo de los productores,
ya que estas bacterias pueden crecer en el intervalo de pH de 3,5-10,0 y la
temperatura de 5-45 °C en algunos casos superiores a esta en organismos
18
termófilos (Bamforth 2005, Cuenca 2005). Sin embargo la baja temperatura de
fermentación para la producción de ácido láctico requerida por la mayoría de las
cepas también representa altos riesgos de contaminación (Abdel-Rahman et al.
2013).
Taxonómicamente, existen doce géneros de bacterias ácido lácticas, los cuales
comprenden Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc,
Enterococcus, Pediococcus, Vagococcus, Aerococcus, Alloicoccus,
Tetragenococcus, Carnobacterium y Weissella (Ramirez & Leal 2008; Garcia et al.
2010; Leveau & Bouix 2000), estas a su vez se pueden clasificar de acuerdo con
su morfología (bacilos o cocos), el mecanismo de fermentación de los
carbohidratos (homofermentativas o heterofermentativas), la temperatura de
crecimiento (mesófilas o termófilas) y la tolerancia a cultivos con altas
concentraciones de sal (halotolerantes o no halotolerantes) (Ramirez & Leal 2008).
Según las rutas metabólicas de las hexosas y pentosas para la generación de
energía se pueden dividir en dos, bacterias homofermentativas y
heterofermentativas basándose en el producto final de la fermentación (Tabla 3),
las bacterias homofermentativas tienen como producto final y casi único al ácido
láctico (Leveau & Bouix 2000; Abdel-Rahman et al. 2013), logrando una conversión
teórica del 100% de la glucosa u otras hexosas a ácido láctico, es por esta razón
que en la producción comercial de este compuesto se prefiere trabajar con estas
bacterias.
Por otro lado, organismos heterofermentativos suelen producir subproductos
además de ácido láctico, estas son también ampliamente utilizadas en industrias
alimentarias para la generación de sabores y olores específicos en alimentos
fermentados como el yogurt, las cuales aportan las características organolépticas
agradables al consumidor de tales productos.
19
Característica Bacterias homofermentativas Bacterias heterofermentativas
Productos Ácido láctico
Ácido láctico, etanol, diacetilo,
formiato, acetona o ácido acético, y
dióxido de carbono
Las vías metabólicas Hexosa: Embden-Meyerhof
Pentosa: vía pentosa fosfato
Hexosa: fosfogluconato y vía
fosfocetolasa
Pentosa: vía fosfocetolasa
El rendimiento teórico
de ácido láctico en
azúcares
Hexosa: 1,0 g / g (2,0 mol / mol)
Pentosa: 1,0 g / g (1,67 mol / mol)
Hexosa: 0,5 g / g (1,0 mol / mol)
Pentosa: 0,6 g / g (1,0 mol / mol)
Generos Lactococcus , Streptococcus , Pediococcus,
Enterococcus , algunos Lactobacillus
Leuconostoc , Oenococcus ,
algunos de Lactobacillus especies
Disponibilidad para la
producción comercial
de ácido láctico
Disponible debido a la alta selectividad No disponible debido a la alta
formación de subproductos
Tabla 3. Caracterización de las lactobacterias (LAB) homoferementativas y heterofermentativas. (Abdel-Rahman et al. 2013).
Las bacterias ácido lácticas producen naturalmente ácido láctico, pero aun en
cepas homofermentativas la pureza óptica pueden variar, ya sean por efectos
ambientales o por pérdida de la actividad biológica a medida que crece el número
de generaciones (Amorocho 2011). Con el fin de minimizar los costos de
producción, es evidente la necesidad de avances biotecnológicos para desarrollar
microorganismos productores de alto rendimiento que mejoren la eficiencia de la
fermentación y faciliten su recuperación.
Este grupo de bacterias se ha considerado de gran importancia en la alimentación
humana, 12 de los 16 géneros de bacterias lácticas son atractivos para las
industrias alimentarias (Bamforth 2005), un ejemplo de estos son los lactobacilos,
de los cuales la mayoría se consideran seguros para la producción de ácido
láctico, debido a su larga historia de uso tanto artesanal como industrial en la cual
no se han presentado efectos adversos en la salud pública (Bamforth 2005),
aunque algunas especies son responsables de la placa dental y el inicio de la
caries (Amorocho 2011).
20
Estudios recientes han reportado al género Enterococcus como candidato
prometedor para ingeniería metabólica dado que no tiene los requerimientos
nutricionales complejos de otras bacterias ácido lácticas como Lactobacillus
sp. y Lactococcus sp. especies predominantemente utilizadas para la producción
de ácido láctico (Upadhyaya et al. 2014).
2.4.1.1.1. Género Lactobacillus.
El género Lactobacillus han sido tradicionalmente usado por su buena eficiencia
en la bioconversión de azúcares y su tolerancia a mayores concentraciones de
ácido láctico, se caracterizan por sus células en forma de bastones las cuales se
pueden ver agrupadas en cadenas, generalmente carentes de movilidad, existen
96 especies actualmente (Amorocho 2011), estas se han agrupado en tres
subgéneros dependiendo de sus características fermentativas:
1. Los lactobacilos estrictamente homofermentativos o Thermobacterium: este
grupo de organismos se distinguen por ser incapaces de fermentar
pentosas y gluconato, sus células son alargadas y rectas, entre este
subgénero encontramos Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus gasseri y Lactobacillus helveticus (Leveau & Bouix 2000), las
cuales suelen estar presentes en productos lácteos fermentados a
temperaturas superiores a los 40 °C (Amorocho 2011; Cuenca 2005).
2. Especies homofermentativas facultativas: en la metabolización de hexosas
se produce una homofermentación, pueden fermentar pentosas y gluconato
de manera heterofermentativa, cuenta con especies tales como los
Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus sake (Cuenca
2005; Leveau & Bouix 2000).
3. Especies heterofermentativas estrictas como: Lactobacillus fermentum,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus kefir, Lactobacillus
sanfrancisco, identificadas por una buena producción de dióxido de carbono
a partir de glucosa (Amorocho 2011; Cuenca 2005).
21
2.4.1.2. Otras bacterias productoras de ácido láctico.
Entre las bacterias también son reportados otros organismos con una producción
significativa de ácido láctico entre las cuales tenemos los Bacillus y Escherichia
coli. En cuanto el género Bacillus son bacterias gram-positivas capaces de
producir endosporas, las cuales poseen un gran potencial para su implementación
en procesos industriales de fermentación gracias a que:
a. Pueden crecer y proliferar con fuentes de nitrógeno menos complejas y
económicas en los medios de cultivo.
b. Existen cepas álcali resistentes como Bacillus sp. WL-S20 la cual sobrevive
en pH mayor a 8,0 lo que provee un medio más seguro contra posibles
contaminaciones microbiológicas (Meng et al. 2012).
c. Algunas cepas termófilas poseen temperaturas de fermentación superiores
a los 50 °C, lo cual posibilita el desarrollo de sistemas hidrlisis enzimática
(amilolitica o celulolítica) y fermentación llevados a cabo de forma
simultánea.
Algunas de las cepas productoras de ácido láctico incluyen Bacillus coagulans,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis y Bacillus sp.
Ya que la identificación de productores nativos que se adapten a procesos
específicos es una labor compleja, muchos estudios en biología sintética e
ingeniería metabólica han usado E. coli como soporte a la maquinaria enzimática
que no poseen naturalmente por medio de su modificación genética, produciendo
ácido láctico a partir de glucosa (Zhou et al. 2005; Zhu et al. 2007), aunque según
los datos reportados su productividad y eficiencia no han superado las de cepas
comerciales y su estabilidad genética presenta dificultades para procesos
continuos.
22
2.4.2. Otros organismos productores de ácido láctico.
Una gran cantidad de organismos son capaces de generar ácido láctico, aunque la
atención se ha centrado en las bacterias lácticas, aunque otros microorganismos
también han generado gran interés entre los que tenemos a hongos filamentosos,
levaduras y algas.
En cuanto al reino de los hongos, específicamente los micromicetos, la atención
se ha centrado en el género Rhizopus, especialmente R. oryzae, por su
producción selectiva de L-ácido láctico, estos son hongos filamentosos saprofitos
los cuales ofrecen ventajas en la fermentación láctica como: capacidad amilolítica,
necesidades nutricionales simples, fácil recuperación de la biomasa fúngica la cual
es un valioso subproducto, además la morfología en la que crecen los hongos
pueden facilitar la reología del caldo de cultivo y el consumo de oxígeno. Aunque
este modelo biológico también posee serias limitaciones como los requisitos
específicos de aireación (Liu et al. 2006), generación de subproductos (Litchfield
2009) y problemas en la transferencia de masa.
Las levaduras también han despertado interés en la producción de ácido láctico,
gracias a que estas crecen en medios de cultivo minerales los cuales pueden
facilitar la recuperación de ácido, además de la ácido resistencia de algunas cepas
las cuales toleran un pH hasta de 1,5, lo que elimina la alta necesidad de agentes
neutralizantes y con ellos la disminución de lactatos precipitados como sales de
calcio, disminuyendo los costos operativos y los procesos de recuperación.
Aunque en general las levaduras no son excelentes productores de este ácido
puesto que este no es su principal producto de fermentación produciéndose en
cantidades muy limitadas, por lo que se ha recurrido a la biología sintética e
ingeniería metabólica para introducir y optimizar las rutas. Levaduras tales
como Candida sp. se están desarrollando para la producción de ácido láctico por
medio de la supresión de la actividad de la piruvato descarboxilasa y la piruvato
23
deshidrogenasa sustituyendo su producción total o parcial de etanol (Abdel-
Rahman et al. 2013).
Finalmente existe un interés creciente en procesos captadores de CO2 que
contribuyan a las problemáticas ambientales del cambio climático mundial, a
través de la inclusión de organismos fotosintéticos en procesos de fermentación
disminuyendo el gasto en fuentes de carbono. Algunas microalgas poseen la
capacidad de degradar el almidón producto de su exposición a la luz en condición
aerobia y generar una mezcla de compuestos de bajo peso molecular como el
ácido láctico, etanol, ácido acético, y ácido fórmico en condiciones oscuras y
anaerobias, como en los casos reportados para Scenedesmus oblicuo cepa D3
y Nannochlorum sp. 26A4 (Abdel-Rahman et al. 2013; Hirayama & Ueda 2004).
2.5. Rutas metabólicas.
En la fermentación láctica las bacterias lácticas presentan dos principales rutas
metabólicas, llevando a cabo homofermentaciones o heterofermentaciones
basado en el producto final del metabolismo de hexosas y pentosas, las bacterias
homofermentativas poseen enzimas de tipo aldolasa lo que conduce a una
producción exclusiva de ácido láctico (Abdel-Rahman et al. 2013; Wang et al.
2015: Amorocho 2011), por el contrario en la heterofermentación se genera una
mezcla equimolar de ácido láctico, etanol, ácido acético y dióxido de carbono
(Amorocho 2011; Bamforth 2005; Serrato 2005).
Las bacterias homolácticas empiezan su cadena metabólica por medio de la
glucolisis, en la cual una molécula de glucosa es dividida en dos moléculas
llevándolas hasta piruvato; este proceso es una de las secuencias más comunes
en la naturaleza y es llevada a cabo tanto por microorganismos como por
organismos superiores, es también denominada como la ruta de Embden-
Meyerhof-Parnas (EMP) (Bamforth 2005), el cual es catalizado por once enzimas
que se encuentran en el citoplasma de la célula pero no en las mitocondrias
24
(Serrato 2005), con una bioconversión teórica en ácido láctico a partir de glucosa
de 1 g/g o 2 mol/mol (Wang et al. 2015; Bamforth 2005).
Este ciclo comienza con la unión de dos puntos de alta energía agregando dos
grupos fosfatos provenientes del ATP a una molécula de glucosa, para
posteriormente ser desdoblada por la aldolasa en dos carbohidratos de tres
carbonos cada uno (enzima no existente en bacterias heterofermentativas), los
carbohidratos resultantes son gliceraldehido-3-fosfato y la dihidroxiacetona fosfato,
este último es luego transformado en otra molécula de gliceraldehido-3-fosfato
(Wang et al. 2015; Leveau & Bouix 2000).
Luego de la etapa de inversión de energía se produce la oxidación del
gliceraldehido-3-fosfato en la cual se produce una molécula de NADH además de
ligar otro grupo fosfato al gliceraldehido-3-fosfato generando el gliceraldehido-1,3-
difosfato un compuesto altamente energético que en las reacciones siguientes
produce dos ATP, este es oxidado hasta ácido pirúvico y posteriormente reducido
a ácido láctico con la inversión de un NADH (Bamforth 2005; Leveau & Bouix
2000).
Las pentosas usan la ruta pentosa fosfato donde son transformadas a xilosa-5-
fosfato y consecutivamente en fructosa-6-fosfato, a partir de este momento siguen
la ruta EMP como las hexosas, pero logran un rendimiento teórico inferior en la
conversión de ácido láctico 1,67 mol/mol (Wang et al. 2015). El piruvato es
finalmente reducido a lactato usando el NADH producto de la glucolisis.
Las bacterias homofermentativas al encontrase en limitaciones de sustrato,
crecimiento con azúcares distintos a la glucosa, en un alto pH o bajas
temperaturas producen una mezcla de ácidos orgánicos de bajo peso molecular
como ácido fórmico y acético además de etanol y CO2, reduciendo el rendimiento
en la producción de ácido láctico (Gaspar et al., 2013; Leveau & Bouix 2000).
25
Por otra parte las bacterias heterofermentativas tan solo logran una conversión
teórica máxima de 0,5 g/g o 1,0 mol/mol por la generación de subproductos
(Abdel-Rahman et al., 2013), este proceso utiliza la ruta fosfogluconato también
llamada pentosa monofosfato en donde tanto pentosas como hexosas son
convertidas a xilosa-5-fosfato como intermediario común (Abdel-Rahman et al.
2013; Bamforth 2005; Leveau & Bouix 2000), luego a través de la vía fosfocetolasa
es dividida en gliceraldehído 3-fosfato y acetil fosfato, de las cuales tan solo el
gliceraldehído 3-fosfato es transformada en lactato, por el otro lado el acetil fosfato
genera ácido acético y o etanol como producto final de la fermentación
dependiendo de las condiciones ambientales así como por la naturaleza del
microorganismo (Wang et al. 2015).
26
Figura 4. Rutas metabólicas para la producción de ácido láctico a partir de azúcares de materiales renovables (glucosa, xilosa, celobiosa, arabinosa, manosa, y galactosa) por bacterias ácido lácticas. Enzimas: 1, galactoquinasa; 2, arabinosa isomerasa; 3, xilosa isomerasa; 4, manosa fosfotransferasa; 5, hexoquinasa; 6, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; 7, 6-fosfogluconato deshidrogenasa; 8, ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa; 9, transcetolasa; 10, transaldolasa; 11, 6-fosfofructoquinasa; 12, fructosa bifosfato aldolasa; 13, triosafosfato isomerasa; 14, lactato deshidrogenasa; 15, fosfomanosa isomerasa; 16, fosfoglucosa isomerasa; 17, fosfoglucomutasa; 18, galactosa-1-fosfato uridil transferasa; 19, glucosiltransferasa; 20, ribuloquinase; 21, xiluloquinasa; 22, fosfocetolasa; 23, acetato quinasa; 24, fosfotransacetolasa; 25, aldehído deshidrogenasa; 26, alcohol deshidrogenasa. GAP, gliceraldehído 3-fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato; Pyr, piruvato. (Wang et al. 2015).
27
2.6. Factores que afectan la fermentación láctica.
2.6.1. Sustratos.
En un proceso típico de fermentación de ácido láctico, el costo de materia prima
constituye entre el 40% y el 70% del costo total de producción (Upadhyaya et al.,
2014). Las materias primas para la producción industrial de ácido láctico deben
cumplir varias características como un bajo costo, baja concentración de
contaminantes, una tasa de fermentación rápida, altos rendimientos de ácido
láctico, poca o ninguna formación de subproductos, y poseer una alta tasa de
disponibilidad en todo el año (Ghaffar et al. 2011; Upadhyaya et al., 2014).
Tradicionalmente se ha implementado el uso de azúcares con alto grado de
pureza y cultivos comestibles como sustrato portador de carbono y extracto de
levadura y peptona como fuentes de nitrógeno en el medio, las cuales han sido
benéficas en la producción de ácido láctico pero a su vez han limitado su uso por
sus altos costos.
La investigación de nuevos sustratos renovables como fuentes de carbono se ha
intensificado en los últimos años, buscando sustratos económicos y sustentables
(materiales almilaceos y lignocelulósicos provenientes de residuos
agroindustriales) (Abdel-Rahman et al. 2013) y en la búsqueda y mejoramiento
genético para el desarrollo de cepas con capacidad hidrolítica (Mazzoli et al.
2014), evitando etapas de pretratamiento para aumentar la disponibilidad de
nutrientes, en este último punto se ha examinado la implementación de hongos
con altas producciones de ácido láctico dadas las capacidades hidrolíticas
naturales de éstos (Castillo et al. 2013).
En cuanto a los medios de cultivo, las investigaciones se han dividido
principalmente en el reemplazo de las fuentes habituales de carbono y la
búsqueda de fuentes alternas de nitrógeno para reemplazar de manera absoluta o
28
parcial las fuentes de nitrógeno tradicionales como el extracto de levadura y
peptona (Alonso et al. 2010, Vázquez & Murado 2008a).
Además de las fuentes de carbono y fuentes de nitrógeno, las vitaminas y los
minerales, otros compuestos tienen efectos significativos sobre la fermentación del
ácido láctico por Lactobacillus, por ejemplo, la piridoxina la cual estimula el
crecimiento, entre otros como sulfato de sodio, acetato de sodio, K2HPO4,
MnSO4·4H2O y FeSO4·7H2O los cuales generan un mayor efecto en la
fermentación que el MgSO4·7H2O, KH2PO4, citrato de sodio, NaCl, y succinato de
sodio (Abdel-Rahman et al. 2013).
2.6.1.1. Fuente de carbono.
La fuente de carbono es el sustrato el cual va en mayor proporción dado que con
este se generara la energía necesaria para la proliferación celular y es la materia
prima para el producto de la fermentación; esta debe ser fácilmente asimilable
dado que las bacterias lácticas no poseen enzimas líticas extracelulares como
amilasas o celulasas, conllevando a procesos adicionales de hidrólisis en
sustratos ricos en polisacáridos (Wang et al. 2015).
En la actualidad se han desarrollado diferentes procesos para la implementación
de recursos disponibles como fuentes de carbono incluyendo almidón y biomasa
lignocelulósica, pero estos demandan procesos de pretratamiento e hidrólisis o
sacarificación ya sea fisicoquímico o enzimático, en ambos casos perjudicando la
producción rentable de ácido láctico (Litchfield 2009 ; Papong et al., 2014; Altaf et
al. 2007). El uso de almidones ya está implementado en la industria y su
fermentación directa se ha demostrado con cepas amilolíticas como el
Lactobacillus amylophilus GV6 logrando conversiones del 92% en ácido láctico
(Altaf et al. 2007), sin embargo es aun necesaria investigación en estos procesos
para su desarrollo industrial.
29
La biomasa lignocelulósica sigue siendo una atractiva fuente de carbono dado que
esta no compite con la industria alimentaria como sucede en los casos anteriores,
es un recurso renovable y altamente disponible, aun con estas grandes ventajas
este polímero natural es altamente recalcitrante y su hidrólisis implica esfuerzos
mayores por su alta organización estructural y heterogeneidad en sus tres
componentes primarios: lignina, hemicelulosa y celulosa, de las cuales solo las
últimas dos están constituidas por azúcares fermentables (Wang et al. 2015;
Ghaffar et al. 2011). Los procesos de pretratamiento e hidrólisis de este sustrato
implican un gran costo ya sea por la necesidad energética, alto consumo de
insumos químicos o por la generación e implementación de nuevas tecnologías.
Sin duda la biomasa implica grandes retos para su implementación, pero también
lograría una producción sustentable en términos sociales y ambientales (Abdel-
Rahman et al. 2013).
Otros sustratos han sido estudiados por su alta producción y buena concentración
de carbono disponible, entre ellos los derivados lácteos y el glicerol, provenientes
de las industrias alimentarias y del biodiesel respectivamente, un gran volumen de
suero lácteo es producido día a día en el procesamiento de distintos derivados, lo
cual genera una problemática ambiental por su alta concentración en material
orgánico y azúcares fermentables, además de poseer concentraciones
significativas de vitaminas, minerales y otros compuestos esenciales para el
crecimiento microbiano, ofreciendo una llamativa oportunidad para su
implementación como caldo de cultivo en la fermentación láctica. Por otra parte
gran cantidad de productos lácteos son rechazados por su calidad o caducidad los
cuales también podrán ser buenos sustitutos a fuentes costosas de minerales,
vitaminas y carbono.
Algunas de las diferentes cepas utilizadas para la producción de ácido láctico a
partir de suero lácteo, incluyen Lactobacillus helveticus , Lb. plantarum,
Lb. delbrueckii sub sp. bulgaricus, Lb acidophilus, Lb casei, Lactoccocus lactis, y
Kluyveromyces marxianus, logrando concentraciones desde 8,8 a 24,6 g/l de ácido
30
láctico (Abdel-Rahman et al. 2013), y de 25,9 con el uso de lácteos de rechazo y
Lb. casei ATCC 393 (Alonso et al, 2010; Abdel-Rahman et al. 2013)
En el caso del glicerol se ha considerado como una materia prima económica por
su alta tasa de producción además de lograr ser fermentada hasta ácido láctico
por diversos organismos, entre ellos Klebsiella, Clostridium y Lactobacillus (Abdel-
Rahman et al. 2013).
Finalmente las microalgas se están considerando como fuente de carbono
atractiva dada su alta velocidad de reproducción, con un ciclo de cosecha que va
de 1 a 10 días, además de ser una biomasa carente de lignina lo que facilita su
hidrólisis a azúcares fermentables (Upadhyaya et al., 2014). Algunos de las
investigaciones incluyen a la microalga verde Hydrodictyon reticulum con un
contenido de 47,5% de azúcares reductores, incluyendo 35% de glucosa (Nguyen
et al., 2012; Abdel-Rahman et al. 2013), usando Lactobacillus paracasei se logró
una concentración de ácido láctico de 37,1 g/L con un rendimiento de 0,46 g/g de
algas (Nguyen et al. 2012).
2.6.1.2. Efecto de carbohidratos mixtos como fuente de carbono.
Con la búsqueda de nuevas fuentes de carbono que remplacen carbohidratos
refinados, se han implementado fuentes con una naturaleza heterogénea en sus
azúcares contenidos como la hemicelulosa (heteropolímero de glucanos, xilanos y
mananos) sustratos que poseen distintos carbohidratos, ya sean en mezclas de
distintas hexosas o de hexosas y pentosas, lo cual ha conllevado a la
investigación del comportamiento de cofermentaciones lácticas para aumentar la
eficiencia del consumo en el sustrato, lograr mayores producciones de ácido
láctico y reducir costos (Wang et al. 2015).
En la actualidad encontramos una mayor cantidad de estudios de conversión de
glucosa como única fuente de carbono a ácido láctico en contraste con estudios
31
realizados para otros azúcares, la razón es dada por su facilidad para ser
metabolizada y la preferencia natural hacia la glucosa favoreciendo la producción
de muchas cepas lácticas (Wang et al. 2015), no obstante los medios de cultivo
con la implementación de fuentes alternativas plantean ventajas económicas
significativas, sin embargo el uso de caldos de cultivos con carbohidratos mixtos
ha presentado serias limitaciones (Forero & Sánchez 2008).
Diversos estudios han demostrado como las bacterias lácticas que crecen en
medios con una mezcla de carbohidratos prefieren metabolizar aquellos que son
más fácilmente degradables y ofrecen unas mejores tasas de crecimiento, este
efecto es denominado represión catabólica por carbono, aunque su mecanismo no
se ha dilucidado completamente este gobierna y coordina el metabolismo
sistemático de los carbohidratos fermentados (Saier & Reizer, 1992; Forero &
Sánchez 2008; Wang et al. 2015), este complejo regulatorio aporta tres facultades
a las bacterias.
1. Utilización preferencial a cierta fuente de carbono de una mezcla presente
en el medio de cultivo.
2. Las fuentes de carbono no favorecidas solo son incorporadas de forma
limitada y con bajas tasas de eficiencia hasta que la fuente preferencial sea
agotada (Forero & Sánchez 2008).
3. Se beneficia la generación subproductos en la fermentación tales como
etanol, ácido acético, ácido fórmico y CO2 (Gaspar et al., 2013).
2.6.1.3. Fuentes minerales
Magnesio:
Estimula el crecimiento y la producción de ácido láctico de las bacterias lácticas en
general, siendo indispensable como cofactor para numerosas enzimas del
crecimiento celular.
32
Manganeso:
La presencia del ion Mn2+ es necesaria para el correcto funcionamiento de
enzimas entre las cuales tenemos el ARN polimerasa, la lactato deshidrogenasa,
la NADH oxidasa, superóxido dismutasa y catalasa, además aporta resistencia a
lactobacilos como Lactobacillus plantarum contra peróxidos y superóxidos en
medios con una baja aireación (Leveau & Bouix 2000).
Hierro:
El hierro en general no es necesario y no afecta significativamente el crecimiento y
la producción de ácido, por ejemplo Lactobacillus plantarum no lo acumula para
prevenir la formación de radicales libres en medios con presencia de oxígeno
(Leveau & Bouix 2000).
Potasio:
Su transporte es esencial para la regulación del pH intracelular y su presión
osmótica.
Calcio:
Este elemento no es esencial aunque es ampliamente utilizado para la
recuperación de ácido láctico como lactato de calcio el cual es insoluble, este
puede llegar a estimular el crecimiento de Lactobacillus casei por su rol en la
fijación y estabilización de proteasas en la pared celular (Leveau & Bouix 2000).
Otros minerales como cadmio, cesio, cobre, molibdeno y cobalto se consideran
como inhibidores del crecimiento (Leveau & Bouix 2000).
2.6.2. Efecto del pH en fermentación láctica.
Para cualquier microrganismo el pH es un factor fundamental que define el
crecimiento del mismo y su comportamiento, cada especie posee un intervalo para
su crecimiento y un valor óptimo de pH, las bacterias lácticas por general son
33
ácidofilas teniendo un pH optimo entre valores de 4.0 a 6.0 (Bamforth 2005; Willey,
Sherwood & woolverton 2009). Usualmente estas pueden crecer en un amplio
rango de pH aun si se encuentran en un valor lejano a su punto óptimo, aunque sí
se sobrepasan sus límites de tolerancia o hay variaciones dramáticas puede
ocasionar daños en el microorganismo como alteraciones en su membrana
plasmática, inhibición en la actividad enzimática o alterar la ionización de sustratos
lo que reduciría su disponibilidad para el organismo (Willey et al. 2009).
El pH optimo refleja un adecuado funcionamiento celular ayudando a mantener el
pH intracelular deseado para mantener el estado de las cargas de las
macromoléculas, especialmente enzimas y por ende su actividad enzimática,
además de facilitar los fenómenos de adhesión y floculación en la superficie
celular (Bamforth 2005), situación que puede ser solucionada al controlar el pH
con agentes neutralizantes, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio,
hidróxido de calcio, carbonato de calcio, o la solución de amonio (Abdel-Rahman
et al. 2013), para superar parcialmente esta inhibición y mejorar la eficacia de
fermentación pero afectando la presión osmótica por el aumento de solutos en el
medio de fermentación (Wang et al. 2015).
2.6.3. Efecto de la actividad de agua en fermentación láctica.
Los microrganismos están constituidos por un gran porcentaje de agua que puede
variar entre valores del 70 % al 80 % generalmente, estos niveles de hidratación
son altamente desafiantes al estar en un medio con poca agua disponible
(ambiente deshidratante o hipertónico) o en exceso de agua (hipotónico)
(Bamforth 2005), generando en la célula un efecto de hipertónico o de lisis celular,
en ambos casos generando la muerte del organismo.
A causa de la importancia de la concentración osmótica a la cual se mantienen
dichos organismos, el agua disponible para estos es denominada actividad de
agua (aw), siendo inversa a la presión osmótica (Bamforth 2005), por lo tanto se
34
obtienen menores presiones osmóticas al tener medios con aw cercanas a 1 (la aw
de una solución isotónica es cercana al 0,98) generando un ambiente propicio
para el crecimiento celular (Willey et al. 2009).
2.6.4. Efecto de la temperatura en fermentación láctica.
La temperatura es un factor de gran importancia en especial para los
microorganismos, los cuales suelen ser muy susceptibles a cambios en su
temperatura ambiente (Bamforth 2005; Owen 1989), uno de sus mayores efectos
es en las propiedades catalíticas de las enzimas las cuales poseen un punto
óptimo en la cual alcanzan su actividad enzimática máxima, por debajo de este
punto estas pierden progresivamente su velocidad de catálisis, temperaturas
superiores logran desnaturalizar la enzimas así como transportadores y demás
proteínas (Willey et al. 2009; Bamforth 2005), la temperatura además puede
causar serios efectos en la membrana celular, solidificándose a bajas
temperaturas por su alta concentración en lípidos o desestabilizándose y
desintegrándose a temperaturas muy elevadas (Willey et al. 2009).
Los microrganismos pueden clasificarse dependiendo de los rangos de
temperatura en los cuales crecen y poseen su tasa de crecimiento máxima (Figura
5), entre estos encontramos a los mesofilos y termófilos en la cual se ubican las
bacterias lácticas.
35
Figura 5. Clases de microorganismos en relación con la temperatura. Tomado y adaptado de (Diversidad microbiana y taxonomía 2015).
Las bacterias lácticas mesófilas son organismos con un punto óptimo de
temperatura entre 20-40 °C, en esta categoría encontramos la totalidad de
organismos probióticos como algunos Lactobacillus, ya que la temperatura
corporal humana es de 37 °C, valor propicio para la proliferación de estos (Wang
et al. 2015; Willey et al. 2009; Owen 1989). Algunos lactobacilos son termófilos
con valores favorables de temperatura entre 50-60 °C (Wang et al. 2015), estos
suelen poseer un sistema de síntesis proteica más estable con un conjunto de
enzimas encargadas de evitar la denaturización, además de enzimas menos
flexibles por un conjunto superior de enlaces covalentes y puentes de hidrógeno
que evitan su pérdida de la actividad enzimática (Willey et al. 2009).
2.6.5. Efecto del tamaño de inóculo en fermentación láctica.
En la fermentación láctica, el tamaño del inóculo es un factor importante para
reducir el tiempo de la etapa Lag o de latencia (Willey et al. 2009), en la que el
organismo se acostumbra a cambios medio ambientales. Se ha determinado que
el uso de valores superiores al 5 %v/v es benéfico para la generación de biomasa
y ácido láctico, aunque valores superiores al 10 %v/v generan altos costos de
operación (Wang et al. 2015). En la investigación del efecto del inóculo en la
36
fermentación láctica con Lactobacillus casei GIM 1.159 se reportó que un tamaño
de inóculo de 6 % fue la proporción optima, cantidades inferiores resultaron en un
crecimiento insuficiente, con una relación de inóculo mayor se generó
antagonismo de los nutrientes (Wang et al. 2015).
2.6.6. Efecto de la aireación en la fermentación láctica.
La relación entre el oxígeno y los organismos lácticos es compleja, los distintos
organismos pueden diferir en gran manera en su necesidad de oxígeno (Abdel-
Rahman et al. 2013).
Los aerobios obligados necesitan del oxígeno como receptor final de
electrones en su cadena metabólica.
Los aerobios facultativos pueden utilizar el oxígeno como su receptor final
de electrones, pero también pueden proliferar en su ausencia.
Los microaerobios necesitan cantidades pequeñas de oxígeno para
determinadas tareas celulares (un poco superiores al 2 %v/v), entre estos
encontramos una gran cantidad de Lactobacillus.
Anaerobios aerotolerantes no utilizan oxígeno pero lo pueden tolerar.
Los anaerobios obligados mueren en presencia de oxígeno (Bamforth
2005).
Las bacterias lácticas por lo general tienen necesidades pequeñas o nulas de
oxígeno, dado que no pueden sintetizar catalasas hemicas (Cuenca 2005), asi que
el oxígeno presente puede reducirse de manera parcial en la generación de
peróxidos, componente altamente toxico para estas por lo tanto es necesario la
presencia de peroxidasas y enzimas que eliminen radicales libres como la
superóxido dismutasa y pseudocatalasas, evitando riesgos de daño celular e
inhibición por la toxicidad de este elemento (Bamforth 2005; Cuenca 2005).
37
2.7. Fuente de nitrógeno.
Las bacterias lácticas poseen complejos requerimientos nutricionales debido a su
limitada capacidad de síntesis, el medio de cultivo debe estar suplementado con
bases pirimidinas, purinas o aminoácidos, vitaminas (en especial vitaminas del
grupo B) (Gao et al. 2008; Abdel-Rahman et al. 2013; Leveau & Bouix 2000).
La relación entre las fuentes de carbono y nitrógeno es un factor importante que
afecta en gran medida la producción de ácido láctico, está relación (C/N) debe ser
adecuada, concentraciones muy altas pueden resultar tóxicas o inhibitorias para el
organismo, por el contrario la deficiencia de estos elementos resulta en bajo
crecimiento por una baja actividad enzimática (Wang et al. 2015). Por lo general
los sustratos implementados como fuente de carbohidratos poseen muy bajas o
nulas concentraciones de nitrógeno digestible para los microrganismos, por lo cual
estas deben ser complementadas con sustratos de alta concentración en dicho
elemento, tradicionalmente agregando extracto de levadura, peptona o extracto de
carne.
Las fuentes de nitrógeno en fermentación láctica deben tener un gran contenido
de bases pirimidinas y purinas o péptidos de peso molecular medio (Serrato 2004;
Ramirez & Leal 2008; Pescuma et al. 2008), ya que estas fuentes de fácil
asilamiento favorecen a la producción de proteasas ancladas a pared celular,
generando un uso más eficiente de las fuentes de nitrógeno mejorando la
permeabilización de los péptidos de gran tamaño por su hidrólisis extracelular, lo
que conlleva a un rápido crecimiento celular (Figura 6), por lo tanto la adición de
aminoácidos libres en el inicio de la fermentación ayuda en la metabolización de
fuentes complejas (Leveau & Bouix 2000).
38
Figura 6. Esquema de proteólisis y ciclo del nitrógeno en bacterias lácticas (Cuenca 2005; Leveau & Bouix 2000).
La fuente de nitrógeno más usada para la obtención de ácido láctico en la
fermentación con Lactobacillus es el extracto de levadura, ya que éste posee un
alto valor nutricional (contiene además vitaminas y minerales) (Liu et al. 2010), y
por ende una influencia benéfica en la productividad alcanzada por la
fermentación, está fuente es utilizada en concentraciones próximas a 10 g/L donde
la conversión de carbohidratos a ácido láctico es óptima, pero deben ser inferiores
a 20 g/L debido a la toxicidad de esta a altas concentraciones para estas bacterias
(Serrato 2004).
El costo del extracto de levadura es muy elevado, alrededor de US$ 50 por
kilogramo (Qingdao 2015; Lisi 2015; Xian 2015), por lo tanto la sustitución parcial
o total de este es una alternativa para lograr procesos más rentables y sostenibles
reduciendo los costos de los nutrientes. En la actualidad una buena cantidad de
fuentes de nitrógeno de bajo costo han sido estudiadas como: estiércol bovino
(Sun et al. 2012), lenteja roja, levadura de panadería (Altaf et al. 2007), hidrolizado
de plumas de pollo (Taskin, Esim & Ortucu 2012), humus, sedimento del mosto
(Ramirez & Leal 2008), entre otros (Tabla 4).
39
Microorganismo Fuente de nitrógeno Producción ácido láctico (g/l) o (% conversión)
Referencia
Lactobacillus delbrueckii
Peptona
Peptona (vit B)
(NH4)2SO4
(NH4)2SO4 (vit B)
Extracto levadura
22.5
23.5
22.0
24.4
25.0
Arasaratnam et al. 1996
Lactobacillus delbrueckii
Humus
Sedimento del mosto
36,52
13,71
Ramirez & Leal 2008
Lactobacillus amylophilus GV6
Salvado de trigo 77.6 % Altaf et al. 2006
Lactobacillus amylophilus GV6
Lenteja roja
Levadura de panadería
92.0 %
92.0 %
Altaf et al. 2007
Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1466
Licor de maceración de maíz
96.0 % Yu et al. 2008
Lactobacillus rhamnosus
Vinaza de destilería de etanol
42,19 Djukić-Vuković et al. 2013
Lactobacillus rhamnosus
Hidrolizado de soya 92 % know et al. 2000
Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus
(NH4)2SO4 2.6 Nancib et al. 2005
Lactobacillus plantarum
Peptona marina de viseras de pez
15,2 Vázquez et al. 2008
Lactococcus lactis hidrolizado de alcachofa de Jerusalén suplementado con extracto de levadura
--- Shi et al. 2012
Rhizopus oryzae Hidrolizado proteínico de plumas de pollo
38,5 Taskin, Esim & Ortucu 2012
Rhizopus oryzae Estiércol bovino 1,2 y 79.2 % Sun et al. 2012; Yao et al. 2010
Tabla 4. Estudios anteriores en la búsqueda de fuentes de nitrógeno alternativas en fermentación láctica.
Sustratos complejos como el suero de leche han sido estudiados como medio de
fermentación por su contenido en lactosa del 5% y proteínas cercanas al 1%,
conformadas por β-globulina y α-lactalbumina principalmente, con el fin de dar
valor agregado a este subproducto el cual ha presentado graves problemas
ambientales en su disposición (Pescuma et al. 2008; Abdel-Rahman et al. 2013),
40
logrando una alta productividad de ácido láctico de 2,38 g/L⋅h con L. rhamnosus
luego de la suplementación con biomasa de Debaryomyces hansenii y licor de
maíz fermentado como fuentes de nitrógeno (Yu et al. 2008; Abdel-Rahman et al.
2013).
En 2010 Liu et al. usando brote de malta y licor de maíz como sustratos
nitrogenados con Lb. Plantarum As.1.3, logró un rendimiento de 98 % g/g y una
productividad de 13,0 g/L⋅h, valores significativamente superiores a los obtenidos
en iguales condiciones con extracto de levadura.
El estudio de fuentes alternativas ha sido un proceso continuo en la búsqueda de
opciones aprovechables, aunque por el momento no han sido muchas las fuentes
que cumplan todas las características mencionadas para ser implementadas
industrialmente como sustituto parcial o total del extracto de levadura, para
generar procesos a menor costo y sin limitantes económicas por este sustrato.
2.7.1. Gallinaza.
La gallinaza o excrementos producidos de la producción avícola intensiva, es un
sustrato con un importante contenido de material orgánico, su composición de
pende de distintos factores como dieta, edad, alimento y cantidad de plumas de
las aves, así como de la temperatura y ventilación de las jaulas contenedoras, es
usual encontrarla en mezclas con materiales absorbentes como cascarilla de
arroz, aserrín o virutas de madera.
La gallinaza se caracteriza por sus altos contenidos de humedad y de nitrógeno,
usado tradicionalmente como abono sus componentes que se descomponen
fácilmente generando rápidamente olores fuertes y perdiendo cualidades como
fertilizante, para la solución de estos inconvenientes se ha implementado procesos
de secado y compostaje que mejoren su estabilidad química y microbiológica que
41
faciliten su implementación y almacenaje en costos periodos de tiempo (Tabla 5)
(Estrada 2005).
Tipo Humedad % Nitrógeno % Ácido fosfórico % Potasio %
Fresca 70 – 80 1,1 – 1,6 0,9 – 1,4 0.4 - 0.6
Acumulada unos
meses
50 – 60 1,4 – 2,1 1,1 – 1,7 0,7 – 1
Almacenada en foso
profundo
12 – 25 2,5 – 3,5 2,0 - 3,0 1,4 – 2
Desecada
industrialmente
7 – 15 3,6 – 5,5 3,1 – 4,5 1,5 – 2,4
Tabla 5. Caracterización de distintas condiciones de la gallinaza de ponedoras de jaula (Estrada 2005).
El compostaje de gallinaza ha demostrado la generación de mayores cantidades
de nitrógeno orgánico, mejorando la estabilidad de esta como fuente de nitrógeno
en procesos de fertilización de suelos y disminuyendo los olores amoniacales por
la descomposición de la misma por los procesos de fermentación aerobia llevada
a cabo (Estrada 2005; North & Bell 1998).
2.7.2. Semilla de guayaba.
La guayaba pertenece al orden Rosales, familia Mirtáceaes y género Psidium, la
guayaba es una fruta con un amplio número de variedades, en cada uno de los
países en los que se cultiva, siendo uno de los frutos mayormente cultivados en
Colombia (Castro 2008).
La semilla de guayaba es un subproducto pobremente aprovechado en la industria
colombiana generado de la manufactura de derivados de pulpa de guayaba. Se
estima que a partir de una tonelada de guayaba procesada se extraen alrededor
de 120 kg de esta semilla, la cual posee un buen aporte nutricional. Constituida
por valores aproximados de 80% fibra, 11% aceite, 9% proteína y 1.5% cenizas.
42
Esta fibra constituida principalmente por hemicelulosa (65 %) y lignina (25 %)
(Vasco, Toro & Padilla 2005).
Estudios recientes evaluaron este subproducto como fuente de nitrógeno para
fermentación láctica mostrando su aplicabilidad para el cultivo de bacterias ácido
lácticas con fines probióticos, aunque no se fue evaluado su efecto en la
producción de ácido láctico (Campo 2013).
2.7.3. Harina de soya.
La soya es una leguminosa oleaginosa base de fabricación de alimentos con buen
contenido proteínico y de concentrados para alimentación animal, por su gran
valor proteico (36-42%). Con una producción nacional de 90.000 toneladas año
(Fenalce 2015), las importaciones de este producto son importantes ya que su
producción no abástese su demanda creciente.
Las proteínas de la soya como globulinas y β-conglicinina se caracterizan por los
niveles satisfactorios de aminoácidos esenciales (De Luna 2007), a pesar de que
el contenido de metionina es bajo; el elevado contenido de lisina. En medio
acuoso, un 85% de la proteína de soya es soluble a un pH entre 7 y 2. A un pH 11
puede solubilizarse hasta un 95% (Cuenca 2005).
2.7.4. Humus líquido (lombricompuesto).
El humus es un producto obtenido de la cría de lombriz, en la descomposición de
residuos orgánicos ya sean de origen vegetal o animal para la generación de
sustratos ricos en ácidos húmicos, se caracteriza por su color oscuro debido a la
alta concentración de carbono (Tabla 6), su implementación en el manejo de
residuos sólidos domiciliarios ha sido bien aceptada dada su excelente producción
de material orgánico y mineral apto como fertilizante (Canfora et al. 2015).
43
Composición
Materia orgánica 70.57 %
Nitrógeno total 2.26 %
Fosfato 32.25 ppm
Potasio 33.0 ppm
Micronutrientes Trazas de hierro, zinc, manganeso, boro
pH 7.12
Tabla 6. Composición del humus líquido (Ramírez & Leal 2008).
Por su cualidades de producción (alta humedad) se da la generación de una fase
liquida del humus con un pH ligeramente alcalino. El humus líquido es una fuente
de nitrógeno soluble, el cual aporta nitrógeno tanto orgánico ureico y amoniacal
además de tener significativos contenidos de fosfatos y potasio (Arancon et al.
2005, Canfora et al. 2015).
44
3. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. Metodología.
En este proyecto se evaluó el efecto de la fuente de nitrógeno, su concentración y
su estado en la producción de ácido láctico. Como fuentes de nitrógeno fueron
seleccionadas gallinaza, semilla de guayaba, harina de soya y humus líquido, las
concentraciones de nitrógeno total evaluadas para las dos fuentes de carbono con
mejores resultados fueron 0,07, 0,14 y 0,21 % p/v.
Para el desarrollo de los objetivos propuestos se realizaron distintas
fermentaciones por triplicado y guiadas por los resultados obtenidos en las etapas
anteriores, manteniendo como parámetros de fermentación: la temperatura, pH,
tiempo de fermentación, concentración de inóculo, medio mineral y concentración
y naturaleza de la fuente de carbono.
Las variables de entrada para el cumplimiento de los objetivos son: fuentes de
nitrógeno, concentración de nitrógeno total y estado de la fuente de nitrógeno. Las
variables de respuesta fueron la concentración final de ácido láctico, eficiencia de
la bioconversión (según Ecuación 2.) y biomasa seca (Figura 7).
Figura 7. Sistema de reacción, variables de entrada y respuesta.
𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 =á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑙á𝑐𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜
𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑚𝑎𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒× 100
Ecuación 2. Eficiencia en la bioconversión de sacarosa a ácido láctico.
45
3.2. Fuentes de nitrógeno.
3.2.1. Gallinaza.
La fuente de nitrógeno gallinaza fue evaluada en tres estados distintos: seca,
compostada y dos extractos acuosos de gallinaza compostada, estos sustratos
(compostada y seca) fueron recolectados en fincas ubicadas en el departamento
de Boyacá en el municipio de Guateque de galpones para la cría de gallinas
alimentadas con concentrados de crecimiento y engorde. La gallinaza seca fue
triturada para disminuir su tamaño de partícula a un diámetro inferior de 1 mm,
mientras que la gallinaza compostada se recolecto ya con un tamaño de partícula
apto para su aplicación inmediata.
3.2.2. Semilla de guayaba.
La fuente alternativa semilla de guayaba fue recolectada de una empresa
bocadillera en Bogotá, esta se obtuvo posterior al despulpado de guayaba común
y se le realizo un lavado para eliminar el exceso de pulpa remanente en esta, para
su posterior secado y trituración a un tamaño inferior de 1 mm.
3.2.3. Harina de soya.
El sustrato harina de soya fue adquirido ya molido de la moledora Fuen-Naturales
Bogotá Colombia, este se manejó dentro de su fecha de caducidad sin realizarse
le ningún tipo de pretratamiento.
3.2.4. Humus líquido (lombricompuesto).
El humus líquido fue adquirido de la empresa Anasac Colombia LTDA, ubicada en
Siberia Cundinamarca, este se manejó dentro de su fecha de caducidad sin
realizarse le ningún tipo de pretratamiento.
46
3.3. Microorganismos.
3.3.1. Lactobacillus casei.
Bacilos con un tamaño de 0,7-1,1 por 2,0-4,0, generalmente agrupados en
cadenas, considerado como un probiótico importante para la industria alimentaria
para la producción de fermentos lácteos (Amorocho 2011). Sus condiciones de
fermentación optimas reportadas corresponden a una temperatura de 37 °C y un
pH 5,5 (Fitzpatrick, Ahrens & Smith 2001).
La cepa utilizada fue obtenida del laboratorio de microbiología Facultad de
Farmacia (Universidad Nacional de Colombia), en el cual se encontraban en
medio MRS y glicerol bajo congelación.
3.3.2. Lactobacillus plantarum.
Son organismos con forma bacilar redondeada en los extremos y un tamaño de
0,9-1,2 por 3,0-8, 0 µm (Figura 8), se distingue de demás lactobacilos por su
movilidad, actividad pseudoctalasa y reducción de nitratos (Amorocho 2011). Sus
condiciones de fermentación optimas reportadas corresponden a una temperatura
de 37 °C y un pH 5,5 (Zhang & Vadlani 2015; Hetényi, Németh & Sevella 2011).
Figura 8. Lactobacillus plantarum (Jarrow 2015).
47
La cepa utilizada fue obtenida del laboratorio de microbiología Facultad de
Farmacia (Universidad Nacional de Colombia), en el cual se encontraban en
medio MRS y glicerol bajo congelación.
3.3.3. Lactobacillus acidophilus.
Lactobacilo considerado como probiótico, naturalmente encontrado en boca, flora
intestinal y vagina (Leveau & Bouik 2000), posee un tamaño de 0,6-0,9 y 1,5-6,0
µm, además es usual su agrupamiento en parejas y cadenas (Figura 9), es un
productor de Dl-ácido láctico característico por no metabolizar lactosa (Amorocho
2011). Sus condiciones de fermentación optimas reportadas corresponden a una
temperatura de 42 °C y un pH 5,0 (Wang, Corrieu & Béal 2005).
Figura 9. Lactobacillus acidophilus (Hopeland 2015).
La cepa utilizada fue obtenida del laboratorio de microbiología Facultad de
Farmacia (Universidad Nacional de Colombia), en el cual se encontraban en
medio MRS y glicerol bajo congelación.
3.4. Selección y caracterización de las fuentes de nitrógeno.
Se postularon diferentes fuentes alternativas, de las cuales se seleccionaron
cuatro para la etapa experimental, seleccionadas con base en su volumen de
producción, su costo y concentración de nitrógeno, a partir de la fórmula de pesos
ponderados siguiente (Ecuación 3).
48
𝑋 = 𝐷 × 0.3 + 𝐶 × 0.3 + 𝑁 × 0.4
Dónde:
D: disponibilidad
C: costo
N: concentración de nitrógeno
Ecuación 3. Factor de selección de las fuentes de nitrógeno.
Posterior a la selección de las fuentes de nitrógeno se realizó su caracterización
por un análisis próximo y microbiológico (métodos según ASTM E-871, ASTM E-
1755, ASTM E258-07 & Neill 2004).
3.5. Medio de mantenimiento.
El mantenimiento de las cepas de Lactobacillus se llevó a cabo en medio liquido
de MAN, ROGOSA y SHARPE (MRS) para microbiología 50 g/l (MERCK;
1106610500) (pH 5.5 - 5.9 tras autoclave) y se mantuvo en nevera a una
temperatura constante de 4 ºC, el almacenamiento de las cepas se realizó a -17
°C en el mismo medio con glicerol en una relación 1:1.
Figura 10. Lactobacillus incubado en medio liquido MRS.
49
3.6. Medio de fermentación y condiciones.
El medio de fermentación utilizado se basó y se adaptó del medio utilizado por
Cortes (1992) y Serrato (2005) para el cultivo de lactobacilos y producción de
ácido láctico, compuesto por (KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4, MnSO4), sacarosa y
fuente de nitrógeno.
Sustrato Concentración Fuente
Sacarosa 4,5 %p/v Merck
KH2PO4 0,1 %p/v BDH Chemicals
(NH4)2SO4 0,1 %p/v Merck
MgSO4 0,05 %p/v Merck
MnSO4 5,0 ppm J T Baker
Tabla 7. Composición del medio nutricional implementado
La sacarosa utilizada en el proceso de fermentación fue calidad microbiológica
producida por laboratorios Merck, usada a una concentración de 4,5 % para evitar
inhibición por sustrato con concentraciones superiores al 8,0 % (Medina 2001).
Se realizaron las respectivas fermentaciones a nivel de laboratorio en erlenmeyers
de 250 ml con 100 ml de medio de fermentación, y llevando está a condiciones de
temperatura óptima de producción para el lactobacilo a utilizar, un pH 6
controlado manualmente con NaOH 0,1M para evitar la inhibición por acidez,
además de lograr producciones de lactato superiores a fermentaciones con un pH
libre (Bilanovic et al. 2011). Cada fermentación se realizó por 7 días.
50
Figura 11. Medios de fermentación.
3.7. Selección del microorganismo.
Para la selección del Lactobacillus utilizado se realizaron fermentaciones con L.
casei, L. plantarum y L. acidophilus, cepas obtenidas del laboratorio de
microbiología de la Facultad de Farmacia (Universidad Nacional de Colombia),
seleccionadas por ser cepas ampliamente utilizadas en la industria ácido láctica y
por esto investigaciones para el desarrollo de la fermentación láctica, cada
fermentación se realizó por triplicado siguiendo el consumo de sacarosa y la
producción de ácido láctico cada día desde el tercer al séptimo día.
Las condiciones de fermentación fueron las mismas en los tres casos exceptuando
la temperatura de fermentación (37 °C, 37 °C y 42°C respectivamente para cada
cepa), se utilizó extracto de levadura al 1 %p/v como fuente de nitrógeno. A partir
de los resultados obtenidos se determinó el microorganismo con mejor producción
de ácido láctico y tiempo de fermentación.
51
3.8. Efecto de la fuente de nitrógeno.
Posterior a la selección de las fuentes (la cual se desglosa en el siguiente capítulo
sección 4.1. Caracterización de las fuentes alternativas de nitrógeno) se realizó la
evaluación de las mismas en la fermentación.
Para la evaluación del efecto de la fuente de nitrógeno en la fermentación láctica
se realizó una fermentación por triplicado con las mismas condiciones de
fermentación cambiando la fuente de nitrógeno, dichas fuentes de nitrógeno
fueron añadidas al medio de manera tal que en los sistemas de fermentación
exista la misma cantidad de nitrógeno total, esta concentración estándar fue
proporcional al nitrógeno presente en el experimento patrón con extracto de
levadura al 1,5 %p/v, sustrato que posee una concentración de nitrógeno de 9,1
%p/p, las fuentes y las concentraciones utilizadas fueron: gallinaza 9,1 %, semilla
de guayaba 7,9 %, harina de soya 2,1 % (porcentajes en peso sobre volumen) y
humus líquido 4,5 % v/v según la Tabla 8.
Fuente de nitrógeno
Contenido de
nitrógeno en el
sustrato %p/p
Contenido de
nitrógeno en el medio
de fermentación %p/v
Contenido de la fuente
en el medio de
fermentación %p/v
Extracto de levadura 0,91 0,14 1,0
Gallinaza 1,50 0,14 9,1
semilla de guayaba 1,73 0,14 7,9
harina de soya 6,49 0,14 2,1
Humus líquido 3,06 (p/v) 0,14 4,5 (v/v)
Tabla 8. Fuente de nitrógeno en el medio nutritivo para la producción de ácido láctico.
3.8.1. Efecto de la gallinaza en tres distintos estados.
Para determinar el efecto de la gallinaza en la fermentación láctica fueron
evaluados tres distintos estados de este sustrato, gallinaza fresca, gallinaza
compostada y extracto acuoso de la gallinaza compostada, este último para evitar
52
la gran cantidad de sólidos precipitados presentes en los dos primeros estados
evaluados y bajo la hipótesis de encontrar una mayoritaria fracción de compuestos
nitrogenados solubles.
Los extractos acuosos fueron realizados con una relación de 1:3 fuente de
nitrógeno, agua destilada y llevada a agitación de 100 RPM a dos temperaturas, el
primero a una temperatura cercana de fermentación a 40 °C, temperatura elegida
para evitar la descomposición térmica de compuestos termolábiles, la segunda a
una temperatura de 80 °C para favorecer la extracción, ambas se llevaron a una
concentración de 0,14 %p/v en el medio de fermentación y fueron evaluadas junto
a la gallinaza compostada y seca.
Figura 12 .Extractos acuosos de gallinaza.
3.9. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno
En cumplimiento con el tercer objetivo propuesto se utilizaron las dos fuentes de
nitrógeno con las mayores concentraciones de ácido láctico producido y
eficiencias en la conversión de sacarosa, las cuales resultaron ser gallinaza y
harina de soya, en esta etapa estas dos fuentes se utilizaron en fermentaciones
con distintos contenidos de nitrógeno variando entre 0,07 % a 0,21 % en tres
distintos niveles como se ve en la Tabla 9.
53
Fuente de nitrógeno Contenido de nitrógeno en el
medio de fermentación %p/v
Contenido de la fuente en el
medio de fermentación %p/v
Gallinaza
0,07 4,6
0,14 9,1
0,21 13,7
Harina de soya
0,07 1,1
0,14 2,2
0,21 3,3
Tabla 9. Contenido de nitrógeno y fuente de nitrógeno en el medio nutritivo para la producción de ácido láctico.
3.10. Métodos analíticos
3.10.1. Caracterización de las fuentes de nitrógeno.
La caracterización de las fuentes seleccionadas se realizó por medio de la
determinación de nitrógeno por método kjeldalh, con el fin de cuantificar la
cantidad de nitrógeno en el medio de fermentación y así cotejar las distintas
fuentes a un mismo nivel de nitrógeno adicionado, además de realizarse un
análisis próximo con la determinación de humedad y cenizas y aun análisis
microbiológico para evaluar su contaminación microbiana.
3.10.1.1. Humedad.
Se utilizó una muestra de 1 g en cápsulas previamente limpiadas, libres de
materiales extraños o restos de humedad, fueron colocadas en un horno
previamente calibrado a 106 °C durante tres horas para eliminar restos de
humedad. Posteriormente se colocaron en un recipiente cerrado con sílica gel
(desecador) durante una hora para llevar a temperatura ambiente y determinar su
peso seco en una balanza de precisión según la norma ASTM E-871 (2013).
54
3.10.1.2. Cenizas.
Se utilizó una muestra de 1 g en cápsulas de porcelana previamente limpiadas,
libres de materiales extraños o restos de humedad, fueron colocadas en una mufla
a temperatura ambiente programada según la norma ASTM E-1755 (2015), la cual
conlleva a una primera rampa de calentamiento de 40 min a 110 °C, luego se
mantuvo la temperatura una hora para iniciar la segunda rampa de calentamiento
de 1 hora a 550 °C, finalmente se mantuvo a esta temperatura por dos horas hasta
su calcinación completa.
Posteriormente se colocaron en un recipiente cerrado con sílica gel (desecador)
durante una hora para llevar a temperatura ambiente y determinar su peso seco
en una balanza de precisión.
3.10.1.3. Nitrógeno total.
El nitrógeno de cada fuente fue determinada por el método Kjeldahl según norma
ASTM E258-07 (2015), usando negro de selenio como catalizador, el tamaño de
cada muestra fue de 1 g para las muestras sólidas y de 1 ml para las liquidas y
llevadas a digestión a 380 °C. La destilación se realizó sobre 100 ml de ácido bórico
al 4 %p/v y fue valorado con HCl 1,16 N hasta lograr el viraje del indicador mixto de
tashiro al color gris. Se utilizó extracto de levadura y un balón sin muestra como
blancos positivo y negativo respectivamente (Panreac 2009; Alaiz et al. 1992)
(Anexo C).
55
Figura 13. Montaje para determinación de nitrógeno por método Kjeldahl.
3.10.1.4. Conteo microbiológico de mesofilos totales y coliformes totales.
Se realizaron diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras tomadas en agua
estéril; posteriormente, se adicionó a cada caja de petri 1 ml de dicha dilución y se
adicionó el agar fundido; se homogenizó la caja. Posteriormente, se incubaron a
37ºC durante 24 horas, al cabo de las cuales se efectuó el conteo de colonias
formadas.
Los medios utilizados para el conteo de microorganismos: coliformes totales y
mesofilos totales fueron agar cristal violeta y ABS medio nutritivo respectivamente
(Figura 14) (Neill 2004; Mhone, Matope & Saidi 2011).
56
Figura 14. Agares utilizados en el conteo agar cristal violeta y ABS (izquierda a derecha)
3.10.2. Variables de respuesta.
3.10.2.1. Cuantificación de ácido láctico y sacarosa.
El análisis químico cuantitativo de sacarosa remanente en el medio y de ácido
láctico producido se realizó por HPLC (TERMO SCIENTIFIC Dionex UtiMate 3000)
con una columna SHODEX con un tiempo total de corrida de 20 min y tiempos de
retención de 6,6 y 9,5 min para sacarosa y ácido láctico respectivamente.
Figura 15. Equipo HPLC y detector utilizados en la cuantificación de ácido láctico y sacarosa.
57
Condiciones de determinación (Ramirez & Leal 2008; Serrato 2005):
Fase móvil H3PO4 0,05% v/v en agua desgasificada y desionizada.
Velocidad de circulación de la fase móvil 0,9 ml/min
Temperatura de la columna 30 °C
Detector índice de refracción SHODEX RI-101
Temperatura del detector 30 °C
Rangos de detección: sacarosa (0-100 g/l) y ácido láctico (0-100g/l)
La calibración para la determinación de la concentración de sacarosa y acido
láctico se calculó integrando la curva cromatografica, la curva de calibración
pertinente en el ANEXO A.
3.10.2.2. Biomasa.
En esta investigación, los valores de concentración de biomasa se reportaron en
peso seco de células por unidad de volumen (mg/ml). La determinación de la
concentración de la biomasa de cada muestra se efectuó centrifugando a 5500
rpm por 20 min una muestra de 10ml, recuperando la biomasa y descartando el
sobrenadante, proceso que se repitió por cinco veces agregando cada vez 10ml
de solución isotónica, posterior se diluyó en 10 ml de solución isotónica, y de
nuevo se diluyó con un factor de 1:5 para la posterior medición de su absorbancia
en un espectrofotómetro (P SELECTA V-1100D) a 600 nm.
Los datos de absorbancia fueron convertidos en biomasa seca (microgramos de
biomasa libre de humedad producida por mililitro de medio de cultivo) por medio
de la curva de calibración (ANEXO B) realizada con un patrón del microorganismo
cultivado en medio MRS, según la Ecuación 4.
58
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 =(𝐴𝑑𝑠 − 0,0121)
7,9439𝐹𝑑
Dónde:
Ads: absorbancia
Fd: factor de dilución
Ecuación 4. Factor de conversión de densidad óptica a biomasa seca por cada mililitro.
59
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.1. Caracterización de fuentes alternativas de nitrógeno.
Para la selección de las fuentes utilizadas en la experimentación se escogieron
seis distintas fuentes pensando en tres factores: una buena producción nacional,
un bajo costo y un buen aporte de nitrógeno, estos factores fueron clasificados en
5 distintos niveles cada uno para su mejor comparación, por medio del uso de la
Ecuación 3., los valores de clasificación para cada nivel se muestran en la Tabla
10.
Valor Nivel PRODUCCIÓN
(toneladas)
PROTEÍNA
(% equivalente)
Nivel
de costo
COSTO
(pesos/tonelada)
5 MUY ALTA 100.000-superior 50-superior MUY BAJO 100.000-inferior
4 ALTA 10.000-100.000 50-25 BAJO 100.000-500.000
3 MEDIA 10.000-5.000 25-10 MEDIO 500.000-2´000.000
2 BAJA 5.000-1.000 10-1 ALTO 2´000.000-5´000.000
1 MUY BAJA 1.000-inferior 1-inferior MUY ALTO 5´000.000-superior
Tabla 10. Criterios de clasificación para la selección de las fuentes de nitrógeno.
Fueron escogidas harina de soya, humus líquido, semilla de guayaba, gallinaza,
quinua y cascara de banano como fuentes alternativas por ser sustratos con una
buena cantidad de nitrógeno y poseer una buena producción nacional como
producto principal o subproductos, de las cuales las cuatro primeras se
caracterizaron y evaluaron en fermentación láctica contra la fuente de nitrógeno
tradicional extracto de levadura con la iniciativa de encontrar sustratos que lo
puedan sustituir de manera total, los resultados obtenidos de esta clasificación con
su correspondiente factor de selección se muestran en la Tabla 11.
60
FUENTE PRODUCCIÓN PROTEÍNA COSTO FACTOR DE
SELECCIÓN
EXTRACTO DE LEVADURA BAJA MUY ALTA MUY ALTO 2,6
HARINA DE SOYA ALTA ALTA MEDIO 3,7
HUMUS LÍQUIDO MEDIA MEDIA MEDIO 3
SEMILLA DE GUAYABA ALTA MEDIA BAJO 4,2
GALLINAZA ALTA ALTA BAJO 3,7
QUINUA BAJA ALTA ALTO 2,8
CASCARA DE BANANO MUY BAJA BAJA MUY BAJO 2,2
Tabla 11. Selección de las fuentes de nitrógeno para la etapa experimental.
Para la caracterización de las fuentes de nitrógeno fueron realizados análisis de
cenizas, humedad, microbiológicos y la determinación de nitrógeno para las cuatro
fuentes seleccionadas harina de soya, humus líquido, semilla de guayaba y
gallinaza (Tabla 12).
Fuente N (% ad
p/p)
humedad (% ad
p/p)
cenizas (% ad
p/p)
mesófilos
totales (ufc/g)
coliformes
(ufc/g)
Gallinaza 1,50 11,33±0,24 39,83±1,22 0,440x106 10
Soya 6,49 7,26±0,23 6,62±0,06 560 0
Guayaba 1,73 0,27±0,03 1,08±0,11 2700 0
Humus
(ml) 3,06
Sólidos disueltos
23±0,14 20,09±0,11 0,118x106 0
Tabla 12. Caracterización de las fuentes de nitrógeno.
En cuanto la concentración de nitrógeno total dos fuentes se destacaron, harina de
soya y humus aunque su naturaleza química difiere en gran medida, la primera
con un gran aporte de nitrógeno orgánico de carácter proteínico y la segunda con
una mezcla de nitrógeno úreico e inorgánico como sales amoniacales
(Cuenca2005; Canfora et al. 2015).
Respecto a los análisis de humedad y cenizas se determinó que tanto el humus
líquido como la gallinaza poseen una gran cantidad de material inorgánico no
61
volátil lo que podría generar estrés osmótico en las células de lactobacilos,
teniendo en cuenta la baja concentración de nitrógeno en la gallinaza se presentó
un aumento de material inorgánico soluble e insoluble en el medio con respecto a
otras fuentes.
Los análisis microbiológicos mostraron una mayor actividad microbiana en las
fuentes humus líquido y gallinaza por lo que estas fuentes deberán recibir
procesos de esterilización para su implementación a una mayor escala, la
gallinaza reportó una leve presencia de coliformes, las demás fuentes presentaron
resultados negativos en su conteo. La gallinaza puede ser utilizada de manera
compostada o recuperando su fracción nitrogenada por extracción acuosa
(procesos económicos viables para no incrementar ampliamente los gastos
operativos del proceso) para disminuir su contaminación bacteriana y por lo tanto
reducir problemas en la ejecución de la fermentación.
4.2. Selección del Lactobacillus.
El organismo utilizado para la producción de ácido láctico en los sistemas de
fermentación para la evaluación de la fuente de nitrógeno fue seleccionado entre
tres organismos, todos ellos pertenecientes al género Lactobacillus, las cepas
comerciales usadas fueron L. acidophilus, L. plantarum y L. casei, cepas
ampliamente utilizadas en la industria para la producción de biomasa y ácido
láctico.
Además se realizó un seguimiento a la fermentación en los siguientes siete días,
cuantificando su producción de ácido láctico y de sacarosa remanente en el
medio, estas concentraciones fueron calculadas con las curvas de calibración
respectivas (Anexo A), y reportando su valor en porcentaje peso-volumen (g/100
ml).
62
Figura 16. Fermentación con extracto de levadura para tres distintos lactobacilos.
Se obtuvo en todos los casos una producción continua de ácido láctico
aumentando la concentración de ácido láctico hasta el séptimo día, en el cual se
detuvo la fermentación, las concentraciones de sacarosa disminuyeron en el
transcurso del tiempo como resultado de su metabolización y bioconversión en
ácido láctico.
El Lactobacillus plantarum produjo las mejores concentraciones de ácido láctico en
su séptimo día de fermentación destacándose entre los demás microorganismos,
logrando duplicar y triplicar los valores de concentración obtenidos por L.
acidophilus y L. casei respectivamente.
Según los resultados anteriores se escogió el Lactobacillus plantarum como
modelo biológico para la evaluación del efecto de la fuente de nitrógeno en los
sistemas de fermentación láctica, además se escogió siete días como tiempo de
fermentación, por mostrar un mayor aumento en la concentración de ácido láctico
con respecto a los otros días evaluados.
0
1
2
3
4
5
6
3 4 5 6 7
% p
/v
días de fermentación
Selección de Lactobacillus
L. acidophilus (sacarosa)
L. casei (sacarosa)
L. plantarum (sacarosa)
L. acidophilus (ácidoláctico)
L. casei (ácido láctico)
L. plantarum (ácidoláctico)
63
4.3. Efecto de la fuente de nitrógeno en fermentación láctica.
4.3.1. Gallinaza.
La gallinaza fue evaluada a una misma concentración de nitrógeno en 4 distintas
condiciones: seca, pretratada biológicamente por compostaje y dos extractos
acuosos con diferentes temperaturas de extracción, la valoración de estas fuentes
fue realizada en términos de concentración final de ácido láctico producido.
El tratamiento de extracción fue definido para evitar la gran cantidad de sólidos
precipitados en el medio y favorecer la disponibilidad del nitrógeno presente en la
gallinaza compostada, trabajando a partir de la hipótesis de lograr altos contenidos
de nitrógeno en la fracción soluble. Los resultados de ceniza obtenidos para la
fuente compostada demostraron un gran contenido de compuestos minerales no
volátiles los cuales al ser disueltos podrían aumentan la presión osmótica del
microorganismo, resultando en la disminución de su producción láctica.
Por medio de la determinación de nitrógeno Kjeldalh se reportaron bajas
concentraciones de nitrógeno total, obteniendo una eficiencia en la extracción del
nitrógeno del 13,2 % y 14,3 % y una concentración de 0,20 y 0,22 %p/v
respectivamente para las temperaturas de extracción de 40 °C y 70 °C
respectivamente, además los tratamientos de extracción no reportaron resultados
favorables para el aumento de producción de ácido láctico (Figura 17).
64
Figura 17. Efecto de la gallinaza seca, compostada y en extracto acuoso a temperaturas de extracción de 40 °C y 70 °C en la producción de ácido láctico.
En las distintas fermentaciones se destacó la fuente compostada, obteniendo
resultados muy superiores a las otras dos condiciones evaluadas del sustrato,
logrando una concentración final de 2,12 %p/v, las otras fuentes reportaron
valores de 1,07, 0,44 y 0,47 %p/v usando la gallinaza seca, extracto acuoso a 40
°C y extracto acuoso a 70 °C respectivamente (Tabla 13), estos extractos lograron
las más bajas concentraciones de ácido láctico sin un efecto significativo de la
temperatura de extracción (Figura 18).
Fuente de nitrógeno % p/v
Gallinaza compostada 2,12 ± 0,02 a
Gallinaza seca 1,07 ± 0,14 b
Extracto de levadura 1,19 ± 0,09 b
Extracto de gallinaza 40 °C 0,44 ± 0,1 c
Extracto de gallinaza 70 °C 0,47 ± 0,07 c
Tabla 13. Porcentaje de ácido láctico y análisis diferencial.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
seca compostada extracto a 40 °C extracto a 70 °C
Co
nce
ntr
ació
n f
inal
(
% p
/v)
Efecto de la condición de la gallinaza en fermentación láctica
65
Figura 18. Pareto para la comparación del efecto de la gallinaza en distintos estados en comparación con extracto de levadura en términos de concentración final de ácido láctico.
La gallinaza compostada fue usada a una concentración de 9,12 %p/v con un
contenido de nitrógeno de 0,14 %p/v en el medio de fermentación, esta fuente
alcanzó una concentración final de ácido láctico de 2,12 %p/v el cual fue superior
al obtenido en iguales condiciones con extracto de levadura (1,19 %p/v), en
cuanto la eficiencia de bioconversión de carbohidratos a lactato, esta alcanzó un
valor de 50,3 % eficiencia menor a la obtenida por la fuente tradicional, la cual
logró valores de 82,5 %. Valores que indican una buena digestibilidad y
aprovechamiento del nitrógeno encontrado en el sustrato, el cual es de naturaleza
mayoritariamente orgánico (Estrada 2005; North & Bell 1998), aunque generando
mayores consumos de sacarosa en los procesos de fermentación.
La biomasa generada por esta fuente fue de 0,81 mg/ml, un crecimiento por
debajo del obtenido por el medio tradicional de cultivo con extracto de levadura,
pero con una producción excelente de ácido láctico, observando un metabolismo
más rápido de la sacarosa pero no tan eficiente como las fermentaciones con
extracto de levadura, conllevando a un consumo superior de sacarosa con
respecto al ácido láctico producido.
A partir de los resultados obtenidos se resalta el compostaje de la gallinaza como
un tratamiento biológico apropiado para aumentar la producción de ácido láctico
Gallinaza compostada
Extracto 40°C Extracto 70°C
Extracto de levadura
Gallinaza seca
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
Ácido láctico
66
(Figura 18), evitando la descomposición de la fracción nitrogenada que se revela
por la generación de olores amoniacales en el inadecuado almacenamiento de la
gallinaza fresca, generando mayores cantidades de nitrógeno orgánico disponible
y mejorando la estabilidad de la misma (Estrada 2005; North & Bell 1998),
nitrógeno asimilable para la producción de biomasa por su buena digestibilidad en
congruencia con compuestos nitrogenados de mediano peso molecular,
mayoritariamente insoluble a temperaturas inferiores de 70°C, generando la
fijación de los microorganismos a el sustrato solido insoluble. Además las altas
concentraciones de contenidos minerales no volátiles limitan el uso de la fuente en
altas concentraciones causando estrés osmótico, y bajas concentraciones de
carbohidratos de bajo peso molecular, aportando una pequeña porción de
azucares fermentables lo que favorece el uso de estos en el medio de
fermentación.
Han sido pocos los estudios realizados a partir de estiércoles como subproductos
de la producción animal incluyendo las industrias avícolas y ganaderas para la
producción de ácido láctico, Ramirez & Leal (2008) con el uso de Lactobacillus
delbrueckii y la fracción soluble de gallinaza producida en fermentación sumergida
aeróbica lograron una concentración final de ácido láctico de 0,90 %p/v, producida
en el transcurso de la fermentación por 250 horas, logrando concentraciones
inferiores a las obtenidas en el presente trabajo con el uso de la gallinaza
pretratada biológicamente en compostaje.
En cuanto a otros estiércoles evaluados como fuentes de nitrógeno Sun et al.
(2012) evalúan el efecto de bovinaza hidrolizada con un tratamiento ácido en
fermentación con Rhizopus oryzae y 2,81% de proteína en el medio, alcanzando
una concentración de 1,21 %p/v con una eficiencia del 40 %, valores muy
inferiores a los obtenidos con el uso de extracto levadura y a los logrados en esta
investigación con gallinaza compostada.
67
Otros subproductos de la producción avícola han sido utilizados como las plumas
de pollo, Taskin et al. (2012) valoró el efecto del hidrolizado de plumas al 0,5 %p/v
alcanzando una concentración final de 3,85 %p/v fermentado por Rhizopus oryzae
por 48 horas.
Los subproductos de la industria avícola han representado una buena opción
como sustrato aportante de nitrógeno para medios de crecimiento, el estudio de la
recuperación y adecuada implementación de gallinaza como sustrato ha definido
algunos retos en el tratamiento correcto para aumentar la digestibilidad de su
nitrógeno, tratando de aumentar su disponibilidad y solubilidad, la gallinaza
compostada presentó valores significativos en comparación con la fuente
tradicional proporcionando altos valores de eficiencia y producción de ácido láctico
con un pretratamiento tradicional y ampliamente difundido.
4.3.2. Harina de soya.
La harina de soya logró una concentración final de 0,73 %p/v de ácido láctico, la
eficiencia obtenida fue de 43,7 %. Ambos valores fueron inferiores a los generados
por el extracto de levadura con valores de 1,19 %p/v de ácido láctico generado y
eficiencia de 50,3 %, mostrando una buena influencia de esta en la fermentación
láctica pero indicando la necesidad de la aplicación de pretratamientos que
permitan aumentar la disponibilidad del nitrógeno, el cual es mayoritariamente
proteico.
En cuanto a la generación de biomasa se obtuvieron valores estadísticamente
similares a los reportados para la gallinaza compostada aunque inferiores a los
reportados para el extracto de levadura, esta disminución posiblemente puede ser
atribuida a la formación de biopelículas en las partículas sólidas precipitadas en el
medio, se observó la fijación del material microbiológico al sustrato soya y
gallinaza, lo que conllevo a una menor eficiencia de procesos recuperación de la
68
biomasa debido a la fuerte unión que se presenta entre una biopelícula y una
superficie porosa (Kubota et al. 2009).
La soya es un alimento rico en nitrógeno orgánico de forma proteica entre ellas
globulinas y β-conglicina, estas proteínas presentan un tamaño considerable entre
los 10 kDa a 220 kDa (De Luna 2007) y como fue mencionado anteriormente las
bacterias lácticas presentan en general una capacidad hidrolítica limitada causada
por la baja actividad de proteasas extracelulares, por lo que necesitan de péptidos
de mediano o bajo peso molecular para un adecuado crecimiento y generación de
enzimas, al tener un crecimiento con una fuente de alto peso molecular como la
proteína en la harina de soya los lactobacilos presentan limitaciones en la
generación de proteasas, resultando en una baja actividad enzimática en su
metabolismo (Cuenca 2005).
Otros estudios han identificado a la soya como una fuente promisoria para la
implementación en la fermentación láctica, en el trabajo reportado por
Arasaratnam et al. (1996) se usó harina de soya no pretratada alcanzando una
concentración final de ácido láctico de 1,12 %p/v con Lactobacillus delbrueckii tras
72 horas de fermentación. Hsieh, Yang & Lannotti (1999) lograron una producción
de 1,7 %p/v a una concentración de péptidos del 3% tras la fermentación con
Lactobacillus amylovorus, la cual es una cepa amilolítica capaz de degradar el
almidón de esta fuente para su metabolización como fuente de carbono y
aumentar la digestibilidad de la fuente de nitrógeno, con la implementación de
tratamientos de hidrólisis anexos se logró a un aumento en la producción de ácido
láctico hasta un valor de 5,1 %p/v, una concentración superior a la obtenida en
este trabajo por la implementación de una cepa con capacidad hidrolítica y
pretratamientos enzimáticos.
Se han evaluado otros sustratos derivados de la soya como vinazas y melazas de
soya (Karp et al. 2011), obteniendo valores de 2,16 y 1,38 %p/v respectivamente
69
con el mismo modelo biológico usado en esta investigación Lactobacillus
plantarum.
Otros cereales han sido evaluados como la lenteja roja, un sustrato pobremente
utilizado en la industria alimentaria, alcanzando valores de ácido láctico de 1,21
%p/v (Altaf et al. 2007) y 1,51 %p/v (Altaf et al. 2006) tras una fermentación de 4
días a 37 °C con Lactobacillus amylophilus GV6 y logrando una eficiencia del 92%,
usando como fuente de nitrógeno una mezcla de lenteja roja, levadura de
panadería y extracto de levadura a concentraciones de 1,8 %, 0,75 % y 0,7 %
respectivamente.
Las distintas concentraciones de ácido láctico alcanzadas en este trabajo fueron
inferiores a las reportadas en la literatura aunque se debe tener en cuenta el uso
de cepas amilolíticas o de medios mixtos suplementados con extracto de levadura
en búsqueda de un remplazo parcial de esta fuente, además se evidenció la
necesidad de un pretratamiento para aumentar la disponibilidad del nitrógeno y
sea de bajo impacto en el costo de producción del ácido láctico.
4.3.3. Semilla de guayaba.
La semilla de guayaba molida presentó valores muy bajos en la producción de
ácido láctico en términos de concentración final del mismo y eficiencia de la
conversión de sacarosa, logrando una concentración de 0,25 %p/v y una eficiencia
de 7,4 %, valores muy inferiores a los obtenidos con el extracto de levadura,
mostrando una baja eficacia como fuente aportante de nitrógeno en sistemas de
fermentación de este tipo.
Esta fuente presentó un crecimiento aceptable de la biomasa reportando valores
de 0,53 mg/ml, resultado que destaca su buen comportamiento en el crecimiento
del microorganismo aunque con un pobre efecto en la fermentación láctica, esto
soportado por el alto consumo de sacarosa, su baja concentración de ácido
70
producido y baja eficiencia, a partir de los cromatogramas obtenidos en la
determinación de ácido láctico por HPLC se hace evidente el fomento a rutas de
ácidos mixtos del microorganismo generando una mayor gama de subproductos
entre los cuales se destacó el ácido acético (Figura 19), presentando una
fermentación atípica no asociada la producción de ácido acético.
Figura 19. Cromatograma del medio de fermentación usando semilla de guayaba como fuente alternativa de nitrógeno.
Estos resultados indican que la semilla de guayaba es un sustrato aceptable para
el cultivo de Lactobacillus mas no para una generación industrial de ácido láctico,
procurando la biomasa como producto de interés, además de ser un producto
estable microbiológicamente y poseer una rica matriz nitrogenada, aportando 15
aminoácidos esenciales que conforman proteínas como glutelinas, globulinas y
albuminas, proteínas que por su naturaleza química son tan solo solubles en
medios altamente ácidos (Bernardino et al. 2006; Habib 1986), creando la
necesidad de pretratamientos que aumenten la digestibilidad de nitrógeno
contenido en la misma, además de no presentar péptidos de bajo peso molecular,
71
los cuales son necesarios para la generación de proteasas que facilitan la
metabolización de las proteínas más complejas.
Además la semilla de guayaba es un producto con una matriz lignocelulósica
fuertemente ligada a la fracción proteica, imposibilitando la acción de peptidasas
sobre esta fuente de nitrógeno, además de generar procesos de adsorción sobre
estas por parte de la hemicelulosa y lignina presente (65% hemicelulosa y 25%
lignina) (Vasco et al. 2005).
Son nulos los artículos que reporten el uso de este sustrato en fermentación, pero
otros productos obtenidos de la guayaba han sido estudiados en la producción de
ácido láctico, Bhat et al. (2015) con el mismo modelo biológico evaluado en este
trabajo (Lactobacillus plantarum) utilizó extracto de guayaba blanca por su alto
contenido de antioxidantes y fenoles resultando en un efecto benéfico en la
proliferación del microorganismo logrando una biomasa de 0,95 mg/ml a partir de
las 12 horas de fermentación, efecto atribuido a la alta concentración de
antioxidantes y ácidos grasos de mediana y corta cadena.
4.3.4. Humus líquido.
El efecto de humus liquido o lombricompuesto a una concentración de 0,14 %p/v
de nitrógeno no fue benéfico en la fermentación láctica, logrando valores inferiores
de eficiencia, biomasa seca final y concentración final de ácido láctico con
respecto a las demás fuentes de nitrógeno evaluadas incluyendo la fuente
tradicional extracto de levadura.
El humus líquido reportó concentraciones finales de ácido láctico cercanas al 0,20
%p/v y una eficiencia del 10,4 %, además de un bajo contenido de biomasa seca
de 0,14 mg/ml, mostrando un deficiente efecto en el crecimiento del organismo y
por consiguiente en la producción de ácido láctico como producto final de su
metabolismo.
72
En contraste con los resultados obtenidos por Ramirez & Leal (2008) obtuvieron
una concentración máxima de ácido láctico tras 227 horas de 3,65 %p/v con la
implementación de humus líquido y Lactobacillus delbrueckii, en el cual lograron
excelentes resultados para esta fuente de nitrógeno aunque sus ensayos
realizados con extracto de levadura en iguales condiciones reportan valores
atípicamente bajos (0,83 %p/v), reportando los resultados más bajos con esta
fuente tradicional.
El humus líquido no presenta un gran estudio en su efecto en fermentación láctica
pero si sus componentes mayoritarios, este es una fuente mixta de nitrógeno:
orgánico (urea) y compuestos nitrogenados inorgánicos como sales amoniacales.
Nancib et al. (2005) usando Lactobacillus casei subsp. rhamnosus logró
concentraciones finales de 1,41 y 1,90 %p/v con urea y sulfato de amonio como
fuentes de nitrógeno, bajo las mismas condiciones se evaluó extracto de levadura
obteniendo concentraciones superiores (2,48 %p/v), Islam et al. (2001) reporta un
efecto adverso en la fermentación adverso por altas concentraciones de urea. En
comparación con los resultados obtenidos y reportados, las bacterias ácido
lácticas requieren nitrógeno preferentemente orgánico de mediano peso molecular
como péptidos, purinas y pirmidinas, siendo la urea un compuesto que no cumple
con las características metabólicas para un crecimiento adecuado del organismo.
4.3.5. Comparación entre las cuatro diferentes fuentes escogidas.
En la cuantificación del efecto de la fuente de nitrógeno en la fermentación láctica
a una misma concentración de nitrógeno total de 1,4 % p/v, se obtuvieron
resultados mayormente favorables con la implementación de gallinaza seguida por
harina de soya en términos de concentración final de ácido láctico y eficiencia
(Figura 20), aunque tan solo la gallinaza logró una concentración final a la
generada por la fuente tradicional extracto de levadura.
73
Figura 20. Efecto de la fuente de nitrógeno en la producción de ácido láctico. Concentración final de ácido láctico: azul; eficiencia de la bioconversión: rojo.
En cuanto la generación de biomasa ninguna fuente superó a la biomasa formada
con extracto de levadura, aunque la gallinaza y la harina de soya presentan
buenos valores de biomasa estadísticamente similares aunque con una
heterogeneidad superior a la reportada por las demás fuentes (Figura 21), lo que
podría implicar dificultades en la estabilidad de los medios de fermentación (Tabla
14).
Fuente de nitrógeno
Concentración de la fuente en
el medio (%p/v)
Concentración final de ácido láctico (%p/v)
Eficiencia en la bioconversión
(%)
Biomasa seca (mg/ml)
Sacarosa consumida
(%p/v)
Extracto de levadura
1,0 1,19±0,09 b 82,5±11,4
a 1,32±0,09
a 1,47
Gallinaza compostada
9,1 2,12±0,14 a 50,3±5,4
b 0,81±0,10
b 4,23
Harina de soya
2,1 0,733±0,04 c 43,6±3,4
b 0,83±0,12
b 1,68
Semilla de guayaba
7,9 0,25±0,05 d 7,4±2,1
c 0,53±0,02
c 3,42
Humus líquido
4,5 (v/v) 0,20±0,004 d 10,4±0,3
c 0,14±0,02
d 1,89
Tabla 14. Consolidado de resultados obtenidos en la evaluación del efecto de la fuente de nitrógeno y análisis diferencial.
0102030405060708090100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Gallinazacompostada
Harina desoya
Semilla deguayaba
Humuslíquido
Extracto delevaduraC
on
cen
trac
ión
fin
al
(%
p/w
)
Efic
ien
cia
(%)
Efecto de la fuente de nitrógeno en fermentación láctica
74
En contraste con las demás fuentes la gallinaza fue la única fuente con un efecto
benéfico en la producción de ácido láctico logrando resultados significativamente
superiores a los logrados con la fuente tradicional extracto de levadura (Figura 21),
además de tener el menor impacto en la eficiencia de la fermentación, resultados
seguidos en segundo lugar por la fuente harina de soya la cual si bien no logró
una concentración superior a la lograda con extracto de levadura, si mantiene una
eficiencia de conversión similar a la obtenida con gallinaza compostada a iguales
condiciones de fermentación.
Según la variación de los datos se ratifica la importancia de la composición de la
fuente de nitrógeno, cada una de estas poseía características distintas dadas por
el origen de la fuente y el tamaño de las moléculas ricas en nitrógeno. Fuentes de
origen mixto (inorgánico y ureico) son ineficaces para la producción de ácido
láctico y biomasa, aunque este sea soluble, la fermentación láctica muestra una
marcada necesidad de nitrógeno orgánico.
En cuanto a fuentes de origen orgánico se corrobora la necesidad de fuentes de
nitrógeno de alta disponibilidad a nivel microbiano por la carencia de sistemas
enzimáticos líticos que aumenten el acceso a los compuestos nitrogenados
(Cuenca 2005), casos como semilla de guayaba y soya se presentan
impedimentos causados por la fibra alimentaria y no alimentaria que componen
dichos sustratos, impedimentos que incluso pueden generar la adsorción de las
enzimas extracelulares (Santos et al. 2005), casos que además de recubrimientos
protectores también presentan una fracción proteica importante la que posee altos
pesos moleculares, globulinas y albuminas que no son de fácil digestibilidad,
creando la necesidad de complejos de proteasas carentes en Lactobacillus.
Los buenos resultados obtenidos por la gallinaza compostada se debe a su
fracción nitrogenada compuesta por moléculas orgánicas de pequeño y mediano
peso molecular la cual es fácilmente digerible para modelos bilógicos sin
75
importantes actividades proteolíticas, además de menores cantidades de
materiales absorbentes como lignocelulósicos.
Figura 21. Pareto de las cuatro distintas fuentes de nitrógeno evaluadas en fermentación láctica en términos de concentración final de ácido láctico, eficiencia y biomasa.
GalIinaza compostada
Semilla de guayaba
Humus líquido
Extracto de levadura
Harina de soya
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
Ácido láctico / Coeficientes estandarizados (Interv. de conf. 95%)
GalIinaza compostada
Semilla de guayaba
Humus líquido
Extracto levadura
Harina de soya
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
eficiencia / Coeficientes estandarizados (Interv. de conf. 95%)
Gallinaza compostada
Semilla de guayaba
Humus líquido
extracto de levadura
Harina de soya
-1
-0,5
0
0,5
1
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
biomasa / Coeficientes estandarizados (Interv. de conf. 95%)
76
4.4. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno en
fermentación láctica.
4.4.1. Efecto de la concentración de la gallinaza.
Los resultados generados para tres distintas concentraciones de gallinaza
compostada presentaron un comportamiento similar en la biomasa y producción
final de ácido láctico (Figura 22), obteniendo conjuntamente los resultados más
altos para las concentraciones de nitrógeno de 0,14 y 0,21 %p/v sin presentar
cambios estadísticamente significativos entre los datos obtenidos, la concentración
máxima de ácido láctico obtenido con gallinaza fue de 2,12 %p/v a 0,14 %p/v de
nitrógeno. La biomasa no reportó cambios significativos entre las tres
concentraciones de nitrógeno evaluadas.
Figura 22. Pareto para el efecto de la concentración de gallinaza compostada en términos de concentración final de ácido láctico, eficiencia y biomasa.
La eficiencia de la fermentación fue afectada adversamente por el aumento de la
concentración, logrando una máxima eficiencia en la bioconversión de 79,8 % a la
menor concentración de nitrógeno evaluado, a concentraciones superiores (0,14 y
0,21 %p/v) la eficiencia disminuyó aunque no se presentaron cambios
significativos entre las dos concentraciones.
77
El efecto observado muestra una limitación para el uso de concentraciones
superiores a 0,14 %p/v en nitrógeno, el cual podría ser causado por estrés
osmótico causado por el incremento de sólidos solubles en el medio por la adición
de gallinaza (sustrato con un alto contenido de cenizas). El efecto de la
concentración para este tipo de sustratos no ha sido reportado, razón por la cual
no ha sido contrastado con datos obtenidos en otras investigaciones para cotejar
el efecto observado en este trabajo usando fuentes generadas como subproductos
en industrias de producción animal.
4.4.2. Efecto de la concentración de la harina de soya.
El comportamiento de los datos generados en la fermentación láctica con harina
de soya en tres distintas concentraciones de nitrógeno fue benéfica para la
concentración de 0,14 %p/v logrando valores de concentración final de 0,73 %p/v,
a concentraciones superiores e inferiores de nitrógeno la producción tuvo una
acción significativamente adversa (Figura 23).
Figura 23. Pareto para el efecto de la concentración de harina de soya en términos de concentración final de ácido láctico, eficiencia y biomasa.
78
La eficiencia de la fermentación fue afectada negativamente por el aumento de la
concentración, logrando una máxima eficiencia en la bioconversión de 57,0 % a la
menor concentración de nitrógeno evaluado. En cuanto la biomasa no se presentó
un cambio significativo entre las concentraciones de 0,07 y 0,14 %p/v,
presentando una concentración de biomasa de 0,84 mg/ml, concentraciones
superiores a estas no beneficiaron el crecimiento celular.
En contraste con la literatura encontrada para la evaluación de cereales a distintas
concentraciones en fermentación láctica, Hsieh et al. (1999) determina un efecto
favorable en el aumento de la concentración para valores inferiores de 3 %p/v de
péptidos de mediano peso molecular resultado de la hidrólisis de soya, reportando
un aumento constante para concentraciones inferiores a un nitrógeno total en el
medio de 0,55 %p/v máxima concentración evaluada tras tratar la muestra con una
hidrólisis acida.
El sistema de fermentación es dependiente de la concentración de harina de soya
observando un comportamiento típico de inhibición a concentraciones superiores
de 0,14 %p/v y el déficits de nitrógeno por debajo de la misma concentración,
mostrando así a la concentración intermedia como la mejor alternativa para la
fermentación láctica.
4.4.3. Comparación entre el efecto de gallinaza y harina de soya como
fuentes de nitrógeno a tres concentraciones distintas.
La evaluación del efecto de la concentración de la fermentación láctica se realizó
con las fuentes de nitrógeno harina de soya y gallinaza compostada por los altos
valores de ácido láctico producido en la etapa anterior, estas fueron evaluadas a
las concentraciones de nitrógeno total de 0,07, 0,14 y 0,21 %p/v en el medio de
fermentación (Tabla 15).
79
Fuente de
nitrógeno
Concentración
de nitrógeno
total aportado
(%p/v)
Concentración
de la fuente
en el medio
(%p/v)
Concentración
final de ácido
láctico (%p/v)
Eficiencia en la
bioconversión
(%)
Biomasa
seca
(mg/ml)
Extracto de
levadura 0,14 1,0 1,19±0,09
b 82,5±11,4
a 1,32±0,09
a
Gallinaza
compostada
0,07 4,6 1,20±0,11 b 79,8 ±11,4
a,b 0,73±0,09
b,c
0,14 9,1 2,12±0,14 a 50,3±5,4
c,d 0,81±0,10
b
0,21 13,7 2,11±0,19 a 45,0±2,2
c,d 0,86±0,08
b
Harina de
soya
0,07 1,1 0,12±0,007 d 57,0±14,3
b,c 0,81±0,06
b
0,14 2,2 0,73±0,04 c 43,6±3,4
c,d 0,84,±0,12
b
0,21 3,3 0,63±0,01 c 30,5±7,1
d 0,53±0,02
c
Tabla 15. Consolidado de resultados obtenidos para la evaluación del efecto de la concentración y análisis diferencial.
Los resultados reportados para estas fuentes de nitrógeno alcanzaron sus
mayores concentraciones de ácido láctico para la concentración de 0,14 %p/v en
nitrógeno (Figura 24), manteniendo el nivel de nitrógeno reportado como óptimo
para la fuente tradicional extracto de levadura (Medina 2001). En los resultados de
eficiencia se presentó un efecto inversamente proporcional en la bioconversión de
sacarosa, obteniendo su máximo a la menor concentración, la fuente gallinaza a
0,07 %p/v logro una eficiencia y concentración de ácido láctico comparable a la
obtenida con extracto de levadura,
Se lograron concentraciones de ácido láctico significativamente superiores con el
incremento en la concentración de la fuente, generando una metabolización más
rápida de la fuente de carbono pero perdiendo la selectividad de sus productos,
mostrando un favorecimiento a rutas heterofermentativas por la formación de
compuestos atípicos desconocidos con un tiempo de retención de 5,5 min
presente en gran medida en los ensayos de 0,21 %p/v de nitrógeno para ambas
fuentes, este pico no correspondió con subproductos de otras
heterofermentaciones como ácido fórmico, etanol o ácido acético (Figura 25).
80
Figura 24. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno en la
producción de ácido láctico. Gallinaza compostada: concentración final (♦);
eficiencia (■) y harina de soya: concentración final (x); eficiencia (▲).
Figura 25. Cromatogramas para la concentración de nitrógeno de 0,21 %p/v de las fuentes gallinaza (derecha) y soya (izquierda).
La biomasa generada con las distintas fuentes no supero la lograda con extracto
de levadura, con el uso de la gallinaza compostada no se presentaron cambios
significativos en el crecimiento celular, mientras que con el uso de harina de soya
se presenta una acción negativa para concentraciones superiores al 0,14 % p/v
(Figura 25).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0,07 0,14 0,21
Efic
ien
cia
(%)
Co
nce
ntr
ació
n f
inal
(
% p
/v)
% Nitrógeno (p/v)
Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno en fermentación láctica
81
Figura 26. Pareto del efecto de la concentración de gallinaza compostada y harina de soya en fermentación láctica en términos de concentración final de ácido láctico, eficiencia y biomasa.
La gallinaza a una concentración de 0,14 %p/v presentó un efecto predominante
en sus resultados en comparación con la otra fuente evaluada. Las inferiores
concentraciones de ácido láctico producido y biomasa para las menores
concentraciones se pueden deber a la limitaciones por déficits de nitrógeno,
causando un mayor tiempo de crecimiento y de producción, para la harina de soya
también se observó un efecto inhibitorio por concentraciones superiores al 0,14
Gallinaza C. 0,07
Gallinaza C. 0,14
Gallinaza C. 0,21
extracto de levadura H. soya
0,07
H. soya 0,14
H. soya 0,21
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
ácido láctico / Coeficientes estandarizados (Interv. de conf. 95%)
gallinaza C. 0,07
Gallinaza C. 0,14
Gallinaza C 0,21
Extracto de levadura
H. soya 0,07
H. soya 0,14
H. soya 0,21
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
eficiencia / Coeficientes estandarizados (Interv. de conf. 95%)
Gallinaza C. 0,07
Gallinaza C. 0,14
Gallinaza C. 0,21
Extracto de levadura
H. soya 0,07
H. soya 0,14
H. soya 0,21
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
Co
efi
cie
nte
s e
stan
dar
izad
os
Variable
biomasa / Coeficientes estandarizados (Interv. de conf. 95%)
82
%p/v del sustrato (Amrane & Prigent 1997), comportamiento que señalaron a la
gallinaza como una fuente de nitrógeno con mayor digestibilidad por su mediano
peso molecular (pequeños péptidos y bases aminadas cíclicas como purinas),
mientras que la soya aunque con un mayor contenido de nitrógeno, fue
parcialmente asimilado por las limitaciones hidrolíticas de los lactobacilos y el gran
tamaño de las proteínas en la soya, lo que dificulta la formación de proteasas en la
membrana celular (cuenca 2005).
4.5. Análisis de costos.
El siguiente análisis es propuesto como parte de la aplicación del modelo de
costos operativos para la producción de ácido láctico con la fuente alternativa
gallinaza, este análisis se llevó a cabo simulando las condiciones de laboratorio
igualándolas a las del centro de microbiología, Departamento De Química
Farmacéutica de la Universidad Nacional, asumiendo los menores cambios
posibles en la infraestructura de la fermentación, procesos, procedimientos e
instrumentación utilizada, considerando como únicos costos cambiantes el valor
de la fuente de nitrógeno (gallinaza), la cantidad consumida de esta.
Para analizar el efecto de la implementación de fuentes alternativas en los gastos
de materias primas se utilizaron precios por tonelada de cada uno de los insumos
utilizados discriminados en fuente de nitrógeno, fuente de carbono, fuentes
minerales, neutralizantes, servicios, recuperación y purificación, los procesos de
recuperación y purificación se realizaron simulando un proceso de destilación
reactiva según Suarez (2007).
Los costos obtenidos para el extracto de levadura fueron de US$ 85251,69 para la
producción de ácido láctico de 1,19 Ton/100m3 (71640,07 US$/Ton de ácido
láctico) (Tabla 16), reportando un 91,2 % del costo operativo. En cuanto la
eficiencia obtenida del 82,5 % en la bioconversión se revela una pérdida de fuente
de carbono por un costo de US$ 242,60, asumida en la generación de biomasa y
subproductos de la fermentación.
83
VALOR (US $/Ton) FUENTE
CANTIDAD (Ton)
COSTO (US $)
Fuente de nitrógeno
Extracto de levadura 50000 Qingdao 2015; lisi 2015; xian 2015 1,5 75000
Fuente de carbono
Azúcar crudo de caña 285,7 Asocaña 2015 4,5 1285,65
Fuentes minerales
KH2PO4 3177,5 Microbal 2013 0,1 317,75
(NH4)2SO4 1610,8 Microbal 2013 0,1 161,08
MgSO4 3312,8 Microbal 2013 0,05 165,64
MnSO4 3113,7 Microbal 2013 0,0005 1,56
Neutralizantes
HCL 822,6 Microbal 2013 0,02 16,452
NaOH 674,8 Microbal 2013 0,15 101,22
Indicadores 10,1 Microbal 2013 30 303
Servicios
Agua m3 0,92 Acueducto 2015 120 110,4
Electricidad kwh 1,19 Codensa 2015 1026 1220,94
Incubadoras kwh 810 Autoclaves kwh 216 Recuperación y purificación
Destilación reactiva 65,68 Suárez 2007 100 6568
Costo (US $) 85251,69
Producción 1,19
Costo por Ton 71640,07
Tabla 16. Análisis de costo para la fermentación de 100m3 de medio con la fuente de nitrógeno extracto de levadura.
Los costos obtenidos para gallinaza compostada fueron de US$ 11061,6 para la
producción de ácido láctico de 2,12 Ton/100m3 (5217,7 US$/Ton de ácido láctico)
(Tabla 17), reportando el 7,3 % del costo operativo. En cuanto a la eficiencia
obtenida del 50,3 % en la bioconversión se revela una pérdida de fuente de
carbono por un costo de US$ 386,74.
Los valores obtenidos con gallinaza compostada son significativamente menores a
los presentados por la fuente tradicional bajo las condiciones específicas de
laboratorio ya expresadas, logrando una disminución de los costos de materias
primas en un 94,3 % por tonelada de ácido láctico producido, con lo que podemos
84
afirmar que la fuente gallinaza podría ser una fuente prometedora en la
fermentación de ácido láctico a nivel industrial, lo que conllevaría al estudio de su
escalado para lograr los valores óptimos a un nivel competitivo en el mercado
mundial.
VALOR (US $/Ton) FUENTE
CANTIDAD (Ton)
COSTO (US $)
Fuente de nitrógeno
Gallinaza compostada 89
Sispa 2010; Evisos 2015; Jiménez 2010 9,1 809,9
Fuente de carbono
Azúcar crudo de caña 285,7 Asocaña 2015 4,5 1285,65
Fuentes minerales
KH2PO4 3177,5 Microbal 2013 0,1 317,75
(NH4)2SO4 1610,8 Microbal 2013 0,1 161,08
MgSO4 3312,8 Microbal 2013 0,05 165,64
MnSO4 3113,7 Microbal 2013 0,0005 1,56
Neutralizantes
HCL 822,6 Microbal 2013 0,02 16,452
NaOH 674,8 Microbal 2013 0,15 101,22
Indicadores 10,1 Microbal 2013 30 303
Servicios
Agua m3 0,92 Acueducto 2015 120 110,4
Electricidad kwh 1,19 Codensa 2015 1026 1220,94
Incubadoras kwh 810 Autoclaves kwh 216 Recuperación y purificación
Destilación reactiva 65,68 Suárez 2007 100 6568
Costo (US $) 11061,59
Producción 2,12
Costo por Ton 5217,73
Tabla 17. Análisis de costo para la fermentación de 100m3 de medio con la
fuente de nitrógeno gallinaza compostada.
Aunque el costo obtenido es muy superior al comercial (US$ 1400-1600 por
tonelada métrica) (Icis 2013), pero logra verse el contraste entre el uso de fuentes
tradicionales contra la implementación de fuentes alternativas de bajo costo con
un buen efecto en la bioconversión a ácido láctico, que representa una gran
85
disminución en costos operativos del proceso, con la implementación de las
demás fuentes se observaría el efecto presentado en la Tabla 18.
Fuente de nitrógeno Producción
(Ton/100m3)
Costo (US$/ton) Disminución del costo
(%)
Extracto de levadura 1,19 71.640,07 --------------------------
Gallinaza compostada 2,12 5.217,73 92,7
Harina de soya 0,73 15.694,37 78.1
Semilla de guayaba 0,25 142.586,76 Aumento 199.0 %
Humus líquido 0,20 185.352,14 Aumento 258,7 %
Tabla 18. Comparación de los costos operativos para la fermentación con las fuentes evaluadas para la producción de una tonelada de ácido láctico.
86
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.
La fuente de nitrógeno gallinaza logró aumentar significativamente la producción
de ácido láctico, alcanzando las mayores concentraciones finales de ácido láctico,
las cuales fueron superiores a las obtenidas con la fuente tradicional extracto de
levadura, además de obtener las mejores eficiencias en la bioconversión de
sacarosa entre las demás fuentes evaluadas.
El tratamiento biológico compostaje es benéfico en fermentación láctica,
aumentando la disponibilidad de nitrógeno de la gallinaza y la estabilización de la
fuente, además de ser un tratamiento ampliamente aplicado y de bajo costo.
La concentración de nitrógeno de 0,14 %p/v proveniente de gallinaza compostada
es la más apta para la fermentación láctica generando valores superiores de ácido
láctico, concentraciones superiores no representan cambios significativos en la
concentración final de ácido, pero si genera disminución en la eficiencia de la
fermentación.
La implementación de gallinaza compostada representó una importante
disminución de los gastos operacionales del 94,3% según la simulación a escala
de laboratorio en comparación a la fuente de nitrógeno extracto de levadura, el
valor de la fuente de nitrógeno constituyó el 7,3 % de los gastos operativos,
conformándose como una excelente opción para la sustitución total o parcial del
extracto de levadura, superando las limitantes económicas que acarrea dicha
fuente tradicional.
La harina de soya reportó sus mejores resultados a la concentración de 0,14 %p/v
de nitrógeno, los cuales fueron inferiores a los obtenidos por extracto de levadura,
concentraciones superiores generaron la inhibición del microorganismo.
87
Las fuentes alternativas humus líquido y semilla de guayaba no presentaron mayor
efecto en la fermentación láctica, generando bajas concentraciones de ácido
láctico con bajas eficiencias.
Se recomienda realizar el escalamiento a planta piloto del proceso de
fermentación láctica con la fuente de nitrógeno gallinaza compostada para evaluar
un efecto más directo de la implementación de esta fuente de bajo costo sobre los
gastos operativos, implicaciones en la recuperación y purificación y
concentraciones máximas obtenidas.
Dados los resultados en la generación de ácido láctico con la fuente gallinaza se
sugiere realizar estudios en la búsqueda de pretratamientos de bajo costo para el
aumento de la disponibilidad de nitrógeno en el proceso de fermentación.
Además se propone para trabajos futuros la evaluación de pretratamientos de bajo
costo para el sustrato harina de soya, los cuales puedan aumentar la digestibilidad
de su nitrógeno además del posible aprovechamiento de los carbohidratos
contenidos en este.
88
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103
7. ANEXOS.
7.1. Anexo A.
Determinación de sacarosa y ácido láctico por HPLC.
El análisis químico para la cuantificación de sacarosa y ácido láctico fue efectuado
por HPLC modelo TERMO SCIENTIFIC Dionex UtiMate 3000.
Condiciones de determinación.
Fase móvil H3PO4 0,05% v/v en agua desgasificada y desionizada.
Velocidad de circulación de la fase móvil 0,9 ml/min
Temperatura de la columna 30 °C
Detector índice de refracción SHODEX RI-101
Temperatura del detector 30 °C
Rangos de detección
Sacarosa (0-100 g/l)
Ácido láctico (0-100g/l)
Calibración.
Las concentraciones de ácido láctico y sacarosa son proporcionales al área del
pico correspondiente en el cromatograma, calculado por la integración de la curva
cromatografica. Donde en el eje x encontramos el tiempo de retención de los
componentes cuantificados y el eje y es la respuesta cromatigrafica del detector,
en este caso índice de refracción. La calibración se realizó con 6 patrones con una
concentración de 10 a 0,3125 %p/v (100-3,2 g/l) determinando para cada una de
ellas el área correspondiente a el pico de sacarosa y ácido láctico (Tabla 19).
% p/v Sacarosa promedio (µRIU*min)
A. Láctico promedio (µRIU*min)
10 305,9851 179,3118
5 157,6469 94,7759
2,5 76,918 46,6624
1,25 38,4726 23,9996
0,625 20,4032 12,938
0,3125 10,6228 5,9659
Tabla 19. Curva de calibración para sacarosa y ácido láctico por HPLC.
104
Figura 26. Curva de calibración para sacarosa y ácido láctico por HPLC,
sacarosa: azul ♦; ácido láctico: rojo ■.
Regresión lineal sacarosa:
Pendiente: 30,608
Intercepción: 1,124
R2: 0, 9998
Regresión lineal ácido láctico
Pendiente: 17,909
Intercepción: 1,845
R2: 0, 9993
y = 30,608x + 1,2415 R² = 0,9998
y = 17,909x + 1,8452 R² = 0,9993
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10 12
are
a d
el p
ico
(µ
RIU
*min
)
concentración (%p/v)
105
7.2. Anexo B.
Determinación de biomasa.
Se tomaron dos alícuotas de 50 ml de un cultivo del microorganismo en medio
MRS con 72 horas de incubación, estas fueron centrifugadas a una velocidad de
5500 RPM por media hora, posteriormente se desechó el sobrenadante y se
adicionaron 10 ml de solución isotónica, este proceso de centrifugación y adición
de solución salina fue llevado acabo 4 veces más.
En la centrifugación final fueron añadidos 10 ml de solución salina a una de las
muestras, la cual posteriormente homogenizado con bortex a velocidad media,
esta solución resúltate fue utilizada pada realizar diluciones en serie, a las que se
les determinó la densidad óptica con la medición de su absorbancia en un
espectrofotómetro a 600 nm.
La muestra restante fue secada en estufa a 100 °C por 24 horas y luego pesada.
Los datos obtenidos fueron utilizados para la elaboración de la siguiente tabla y su
respectiva regresión lineal.
Muestra Concentración (mg/ml)
Absorbancia
1 0,1315 1,093
2 0,107 0,839
3 0,075 0,574
4 0,052 0,428
5 0,021 0,181
6 0,004 0,054
7 0,0008 0,024
Tabla 20. Curva de calibración para la determinación de biomasa seca.
106
Figura 27. Curva de calibración para la determinación de biomasa seca.
Regresión lineal biomasa seca:
Pendiente: 7,944
Intercepción: 0,012
R2: 0, 9968
y = 7,9439x + 0,0121 R² = 0,9968
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
abso
rban
cia
concentracion
107
7.3. Anexo C.
Determinación de nitrógeno método Kjeldahl.
a) Digestión: Pesar una catridad de muestra de muestra de 1 g y colocar en un tubo Kjeldahl. Agregar una pequeña cantidad de catalizador negro se selenio, 15 ml de H2SO4 98%. Conectar El tubo a la trampa de agua y luego calentar a 380 °C hasta completar la digestión de la materia orgánica (no se observan partículas carbonosas sin oxidar y el líquido queda translúcido y de color azul-verdoso). La digestión demanda entre 2 y 3 hs. Enfriar y agregar lentamente 30 ml de agua destilada.
b) Destilación: Destilar la muestra digerida con solución de NaOH 40% para neutralizar el ácido sulfúrico y recuperar el amoniaco en un erlenmeyer con 100 ml de H3BO3 4% y gotas de indicador de tashiro (color azul). Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el erlenmeyer colector. Una vez alcanzado dicho volumen se retira el erlenmeyer.
c) Valoración: El destilado se valora con solución de H2SO4 0.1 N, hasta lograr el viraje del indicador de tashiro al color gris.
d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas
indicaciones pero sin colocar muestra en el tubo.
Cálculos:
Nitrógeno total % = (V Muestra – V Blanco) ⋅ NAcido ⋅ 0.014 ⋅ 100/gMuestra
Siendo:
VMuestra ml de ácido gastados en la valoración de la muestra
VBlanco ml de ácido gastados en la valoración del blanco
NAciodo normalidad del ácido sulfúrico
0.014 peso del meq de nitrógeno, en g
gMuestra peso en g de la muestra
108
7.4. Anexo D.
Resultados obtenidos de la determinación por HPLC.
Fermentación preliminar para la selección del microorganismo y tiempo de
fermentación.
Summary Sequence Details
Name: Muestras jj 16 diciembre preeliminar microo
Created On:
16/dic/13 16:13:47
Directory: Acido Lactico
Created By:
Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On:
25/may/15 19:28:15
No. of Injections: 32 Updated By:
Ultimate 3000
By Component sacarosa
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height
Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 blanco ext levadura 6,625 149,446 383,616 90,63 90,86 n.a.
3 acidophilus d3 1 6,742 157,751 408,831 88,00 86,64 n.a.
4 acidophilus d4 1 6,733 157,335 400,327 90,32 88,97 n.a.
5 acidophilus d5 1 6,727 154,917 391,860 91,51 91,03 n.a.
6 acidophilus d6 1 6,708 150,851 384,431 90,03 89,63 n.a.
7 acidophilus d7 1 6,717 144,986 373,085 88,78 88,22 n.a.
8 acidophilus d3 2 6,720 156,974 418,167 92,11 91,02 n.a.
9 acidophilus d4 2 6,742 156,065 414,292 88,56 87,00 n.a.
10 acidophilus d5 2 6,735 153,080 396,971 89,96 89,13 n.a.
11 acidophilus d6 2 6,692 147,967 385,132 87,99 87,20 n.a.
12 acidophilus d7 2 6,712 136,232 358,417 86,79 87,28 n.a.
13 cassei d3 1 6,708 162,341 414,446 93,64 93,87 n.a.
14 cassei d4 1 6,703 157,326 403,888 93,31 92,94 n.a.
15 cassei d5 1 6,730 151,804 391,480 91,29 91,04 n.a.
16 cassei d6 1 6,725 145,531 377,859 91,98 90,76 n.a.
17 cassei d7 1 6,677 139,329 363,958 90,76 89,42 n.a.
18 cassei d3 2 6,748 162,972 415,275 93,12 93,49 n.a.
19 cassei d4 2 6,740 156,189 398,836 92,43 92,27 n.a.
20 cassei d5 2 6,738 150,576 384,586 90,88 90,93 n.a.
21 cassei d6 2 6,733 143,902 368,946 91,54 90,33 n.a.
22 cassei d7 2 6,725 137,796 353,504 89,87 88,58 n.a.
23 plantarum d3 1 6,752 155,655 395,604 90,10 89,43 n.a.
24 plantarum d4 1 6,737 138,468 352,297 86,20 85,68 n.a.
25 plantarum d5 1 6,728 130,568 331,140 83,20 82,85 n.a.
109
26 plantarum d6 1 6,722 121,850 309,277 80,36 80,30 n.a.
27 plantarum d7 1 6,710 107,275 271,260 75,00 75,62 n.a.
28 plantarum d3 2 6,763 151,624 370,672 91,08 90,77 n.a.
29 plantarum d4 2 6,757 140,939 344,070 87,39 87,24 n.a.
30 plantarum d5 2 6,748 132,239 323,282 84,10 84,14 n.a.
31 plantarum d6 2 6,705 123,246 300,261 80,98 81,20 n.a.
32 plantarum d7 2 6,725 106,561 260,966 74,18 74,63 n.a.
110
Summary Sequence Details
Name: Muestras jj 16 diciembre preliminar microo
Created On:
16/dic/13 16:13:47
Directory: Acido Lactico
Created By:
Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On:
25/may/15 19:28:15
No. of Injections: 32 Updated By:
Ultimate 3000
By Component Ácido Láctico
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height
Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 blanco ext levadura n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 acidophilus d3 1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
4 acidophilus d4 1 9,565 5,497 15,307 3,16 3,40 n.a.
5 acidophilus d5 1 9,563 10,357 24,897 6,12 5,78 n.a.
6 acidophilus d6 1 9,550 12,657 30,847 7,55 7,19 n.a.
7 acidophilus d7 1 9,567 14,569 36,703 8,92 8,68 n.a.
8 acidophilus d3 2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
9 acidophilus d4 2 9,577 4,865 10,323 2,76 2,17 n.a.
10 acidophilus d5 2 9,570 10,730 25,957 6,31 5,83 n.a.
11 acidophilus d6 2 9,537 13,903 34,315 8,27 7,77 n.a.
12 acidophilus d7 2 9,577 20,741 52,210 13,21 12,71 n.a.
13 cassei d3 1 9,540 6,568 12,460 3,79 2,82 n.a.
14 cassei d4 1 9,528 6,966 16,186 4,13 3,72 n.a.
15 cassei d5 1 9,558 8,165 21,050 4,91 4,90 n.a.
16 cassei d6 1 9,562 8,468 24,390 5,35 5,86 n.a.
17 cassei d7 1 9,523 10,164 29,284 6,62 7,20 n.a.
18 cassei d3 2 9,575 5,819 12,329 3,32 2,78 n.a.
19 cassei d4 2 9,565 7,314 17,267 4,33 3,99 n.a.
20 cassei d5 2 9,565 8,666 21,770 5,23 5,15 n.a.
21 cassei d6 2 9,568 9,193 25,779 5,85 6,31 n.a.
22 cassei d7 2 9,570 11,537 32,120 7,52 8,05 n.a.
23 plantarum d3 1 9,582 11,287 26,764 6,53 6,05 n.a.
24 plantarum d4 1 9,590 16,474 39,625 10,26 9,64 n.a.
25 plantarum d5 1 9,597 21,189 50,590 13,50 12,66 n.a.
26 plantarum d6 1 9,605 24,878 58,920 16,41 15,30 n.a.
27 plantarum d7 1 9,620 29,211 68,415 20,42 19,07 n.a.
28 plantarum d3 2 9,597 10,976 24,930 6,59 6,10 n.a.
29 plantarum d4 2 9,605 16,547 37,971 10,26 9,63 n.a.
30 plantarum d5 2 9,613 21,292 48,862 13,54 12,72 n.a.
31 plantarum d6 2 9,587 25,375 57,790 16,67 15,63 n.a.
32 plantarum d7 2 9,633 29,725 67,154 20,69 19,21 n.a.
111
Fermentación 1. Efecto de la fuente de nitrógeno.
Summary
Sequence Details
Name: 13 agosto Ferm 1 lac (2)
Created On: 13/ago/14 09:16:52
Directory: Acido Lactico
Created By: Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On: 25/may/15 18:12:21
No. of Injections: 21 Updated By: Ultimate 3000
By Component sacarosa
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height
Amount
min
µRIU*min µRIU % %
1 ext levadura 1 6,672 119,341 209,984 76,00 76,57 n.a.
2 ext levadura 2 6,673 124,609 224,072 78,15 79,09 n.a.
3 ext levadura 3 6,655 106,036 195,603 68,72 70,28 n.a.
4 gallinaza C 0,14 1 6,638 94,315 300,428 56,15 56,46 n.a.
5 gallinaza C 0,14 2 6,643 104,622 334,659 56,96 57,53 n.a.
6 gallinaza C 0,14 3 6,627 91,814 298,932 56,90 57,64 n.a.
7 H soya 0,14 1 6,657 142,086 418,624 85,94 85,62 n.a.
8 H soya 0,14 2 6,655 141,981 416,763 84,93 84,92 n.a.
9 H soya 0,14 3 6,617 139,978 419,622 86,32 85,88 n.a.
10 Humus L. 0,14 1 6,637 136,383 465,977 80,52 80,39 n.a.
11 Humus L. 0,14 2 6,637 136,729 467,235 80,50 80,39 n.a.
12 Humus L. 0,14 3 6,637 134,632 465,622 79,77 80,09 n.a.
13 S. guayaba 0,14 1 6,622 100,050 319,869 59,70 59,47 n.a.
14 S. guayaba 0,14 2 6,627 115,667 369,795 68,75 70,60 n.a.
15 S. guayaba 0,14 3 6,618 106,139 341,601 63,13 65,29 n.a.
16 blanco soya 0,14 6,657 192,850 567,984 99,29 99,23 n.a.
17 blanco gallinaza 0,14 6,685 226,429 641,450 98,08 97,78 n.a.
18 blanco guayaba 0,14 6,657 212,104 636,337 99,94 99,96 n.a.
19 blanco humus 0,14 6,663 193,835 586,972 93,86 95,14 n.a.
20 blanco ext levadura 6,652 161,748 245,905 97,49 96,77 n.a.
112
Summary
Sequence Details
Name: 13 agosto Ferm 1 lac (2)
Created On: 13/ago/14 09:16:52
Directory: Acido Lactico
Created By: Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On: 25/may/15 18:12:21
No. of Injections: 21 Updated By: Ultimate 3000
By Component Ácido Láctico
No. Injection Name Ret. Time Area Height Relative Area Relative Height Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 ext levadura 1 9,548 22,233 34,449 14,16 12,56 n.a.
2 ext levadura 2 9,548 22,287 35,055 13,98 12,37 n.a.
3 ext levadura 3 9,545 25,091 40,741 16,26 14,64 n.a.
4 gallinaza C 0,14 1 9,567 41,583 120,199 24,76 22,59 n.a.
5 gallinaza C 0,14 2 9,565 41,435 119,565 22,56 20,55 n.a.
6 gallinaza C 0,14 3 9,553 37,045 107,758 22,96 20,78 n.a.
7 H soya 0,14 1 9,550 15,065 43,069 9,11 8,81 n.a.
8 H soya 0,14 2 9,548 15,713 43,933 9,40 8,95 n.a.
9 H soya 0,14 3 9,508 14,174 40,503 8,74 8,29 n.a.
10 Humus L. 0,14 1 9,518 5,306 15,922 3,13 2,75 n.a.
11 Humus L. 0,14 2 9,518 5,449 16,328 3,21 2,81 n.a.
12 Humus L. 0,14 3 9,518 5,370 16,104 3,18 2,77 n.a.
13 S. guayaba 0,14 1 9,532 5,465 17,542 3,26 3,26 n.a.
14 S. guayaba 0,14 2 9,525 7,291 21,516 4,33 4,11 n.a.
15 S. guayaba 0,14 3 9,522 6,291 18,599 3,74 3,56 n.a.
16 blanco soya 0,14 9,683 0,808 2,744 0,42 0,48 n.a.
17 blanco gallinaza 0,14 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
18 blanco guayaba 0,14 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
19 blanco humus 0,14 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
20 blanco ext levadura n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
113
Fermentación 2. Efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno.
Summary
Sequence Details
Name: muestras jj 15 septiembre 2014 fer 2
Created On: 15/sep/14 08:41:03
Directory: Acido Lactico
Created By: Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On:
25/may/15 18:31:54
No. of Injections: 19 Updated By:
Ultimate 3000
By Component sacarosa
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height
Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 gallinaza C 0.7 1 6,612 158,691 495,000 80,76 79,73 n.a.
2 gallinaza C 0.7 2 6,605 143,546 449,200 81,51 80,28 n.a.
3 gallinaza C 0.7 3 6,602 150,495 467,102 81,44 80,29 n.a.
4 gallinaza C 2.1 1 6,558 107,203 307,949 61,29 58,44 n.a.
5 gallinaza C 2.1 2 6,588 95,295 277,037 56,54 53,97 n.a.
6 gallinaza C 2.1 3 6,590 99,646 284,725 58,07 55,15 n.a.
7 H soya 0,7 1 6,607 141,776 460,420 87,26 86,96 n.a.
8 H soya 0,7 2 6,607 138,561 460,325 86,67 86,15 n.a.
9 H soya 0,7 3 6,595 141,399 478,052 87,59 87,41 n.a.
10 H soya 2,1 1 6,698 153,172 214,935 87,83 84,91 n.a.
11 H soya 2,1 2 6,602 130,643 422,696 79,06 80,18 n.a.
12 H soya 2,1 3 6,695 129,735 214,813 86,33 83,95 n.a.
13 blanco gallinaza 0,7 6,612 152,783 476,800 98,53 98,29 n.a.
14 blanco gallinaza 2,1 6,613 157,704 478,816 95,70 95,61 n.a.
15 blanco soya 0,7 6,615 150,732 473,871 90,27 90,04 n.a.
16 blanco soya 2,1 6,588 147,222 477,399 94,13 93,48 n.a.
114
Summary
Sequence Details
Name: muestras jj 15 septiembre 2014 fer 2
Created On:
15/sep/14 08:41:03
Directory: Acido Lactico
Created By:
Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On:
25/may/15 18:31:54
No. of Injections: 19 Updated By:
Ultimate 3000
By Component Ácido Láctico
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height
Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 gallinaza C 0.7 1 9,498 25,457 79,330 12,96 12,78 n.a.
2 gallinaza C 0.7 2 9,493 21,522 67,017 12,22 11,98 n.a.
3 gallinaza C 0.7 3 9,490 22,942 71,095 12,42 12,22 n.a.
4 gallinaza C 2.1 1 9,475 35,892 110,432 20,52 20,96 n.a.
5 gallinaza C 2.1 2 9,515 42,581 128,729 25,26 25,08 n.a.
6 gallinaza C 2.1 3 9,513 40,259 119,564 23,46 23,16 n.a.
7 H soya 0,7 1 9,497 4,093 10,271 2,52 1,94 n.a.
8 H soya 0,7 2 9,498 3,973 9,934 2,49 1,86 n.a.
9 H soya 0,7 3 9,483 3,837 9,738 2,38 1,78 n.a.
10 H soya 2,1 1 9,550 13,235 17,128 7,59 6,77 n.a.
11 H soya 2,1 2 9,498 13,363 34,877 8,09 6,62 n.a.
12 H soya 2,1 3 9,575 13,007 23,407 8,66 9,15 n.a.
13 blanco gallinaza 0,7 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
14 blanco gallinaza 2,1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
15 blanco soya 0,7 9,665 1,591 4,745 0,95 0,90 n.a.
16 blanco soya 2,1 9,637 0,537 1,683 0,34 0,33 n.a.
115
Fermentación 3. Efecto de la gallinaza como fuente de nitrógeno.
Summary
Sequence Details
Name: muestras jj 15 noviembre 2014 fer 3 extra y soja
Created On:
04/nov/14 11:24:15
Directory: Acido Lactico
Created By:
Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On:
25/may/15 18:45:28
No. of Injections: 16 Updated By:
Ultimate 3000
By Component sacarosa
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 ext gallinaza 40°C 1 6,682 155,081 249,310 83,97 81,03 n.a.
2 ext gallinaza 40°C 2 6,668 150,424 236,077 82,22 79,37 n.a.
3 ext gallinaza 40°C 3 6,665 147,275 239,714 82,11 79,37 n.a.
4 ext gallinaza 70°C 1 6,678 147,866 227,758 82,02 79,42 n.a.
5 ext gallinaza 70°C 2 6,705 150,878 212,666 82,79 80,07 n.a.
6 ext gallinaza 70°C 3 6,702 150,177 199,096 80,76 79,35 n.a.
7 gallinaza C 0,14 1 6,638 94,315 300,428 56,15 56,46 n.a.
8 gallinaza C 0,14 2 6,643 104,622 334,659 56,96 57,53 n.a.
9 gallinaza C 0,14 3 6,627 91,814 298,932 56,90 57,64 n.a.
1 ext levadura 1 6,672 119,341 209,984 76,00 76,57 n.a.
2 ext levadura 2 6,673 124,609 224,072 78,15 79,09 n.a.
3 ext levadura 3 6,655 106,036 195,603 68,72 70,28 n.a.
13 pre gallinaza seca 6,765 126,467 326,023 73,09 75,42 n.a.
14 blanco ext Gall 40°C 6,713 159,635 224,440 90,55 88,64 n.a.
15 blanco ext Gall 70°C 6,658 154,128 208,828 90,82 88,16 n.a.
16 blanco ext levadura 6,652 161,748 245,905 97,49 96,77 n.a.
17 blanco gallinaza 0,14 6,685 226,429 641,450 98,08 97,78 n.a.
116
Summary
Sequence Details
Name: muestras jj 15 noviembre 2014 fer 3 extra y soja
Created On:
04/nov/14 11:24:15
Directory: Acido Lactico
Created By:
Ultimate 3000
Data Vault: ChromeleonLocal
Updated On:
25/may/15 18:45:28
No. of Injections: 16 Updated By:
Ultimate 3000
By Component Ácido Láctico
No. Injection Name Ret. Time Area Height
Relative Area
Relative Height Amount
min µRIU*min µRIU % %
1 ext gallinaza 40°C 1 9,518 7,639 13,710 4,14 4,46 n.a.
2 ext gallinaza 40°C 2 9,515 10,358 18,170 5,66 6,11 n.a.
3 ext gallinaza 40°C 3 9,513 11,171 19,952 6,23 6,61 n.a.
4 ext gallinaza 70°C 1 9,522 10,359 17,532 5,75 6,11 n.a.
5 ext gallinaza 70°C 2 9,527 9,097 14,056 4,99 5,29 n.a.
6 ext gallinaza 70°C 3 9,535 11,521 14,470 6,20 5,77 n.a.
7 gallinaza C 0,14 1 9,567 41,583 120,199 24,76 22,59 n.a.
8 gallinaza C 0,14 2
9,565 41,435 119,56
5 22,56 20,55 n.a.
9 gallinaza C 0,14 3
9,553 37,045 107,75
8 22,96 20,78 n.a.
1 ext levadura 1 9,548 22,233 34,449 14,16 12,56 n.a.
2 ext levadura 2 9,548 22,287 35,055 13,98 12,37 n.a.
3 ext levadura 3 9,545 25,091 40,741 16,26 14,64 n.a.
13 pre gallinaza seca 9,672 21,011 45,839 12,14 10,60 n.a.
14 blanco ext Gall 40°C n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
15 blanco ext Gall 70°C n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 blanco ext levadura n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
17 blanco gallinaza 0,14 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
117
7.5. Anexo E.
Análisis estadístico.
Fermentación 1 (ÁCIDO LÁCTICO).
Análisis de varianza.
Contraste Diferencia Diferencia
estandarizada Valor crítico Pr > Dif Significativo
gallinaza 0,14 vs humus 0,14 1,925 29,796 3,291 < 0,0001 Sí gallinaza 0,14 vs guayaba 0,14 1,871 28,954 3,291 < 0,0001 Sí
gallinaza 0,14 vs soya 0,14 1,388 21,490 3,291 < 0,0001 Sí
gallinaza 0,14 vs levadura 0,929 14,386 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs humus 0,14 0,996 15,410 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs guayaba 0,14 0,941 14,568 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs soya 0,14 0,459 7,104 3,291 0,000 Sí
soya 0,14 vs humus 0,14 0,537 8,306 3,291 < 0,0001 Sí
soya 0,14 vs guayaba 0,14 0,482 7,463 3,291 0,000 Sí
guayaba 0,14 vs humus 0,14 0,054 0,842 3,291 0,911 No
Valor crítico del d de Tukey: 4,654 Prueba de Tukey.
Categoría Medias
LS Grupos
gallinaza 0,14 2,122 A
Levadura 1,193
B soya 0,14 0,734
C
guayaba 0,14 0,251
D
humus 0,14 0,197 D
Regresión y ecuación del modelo
R² 0,992
R² ajustado 0,989 Ácido láctico = 2,12199638915257-1,87051389431757*fuente de nitrogeno-guayaba 0,14-1,92491484728349*fuente de nitrogeno-humus 0,14-0,929400487650531*fuente de nitrogeno-levadura-1,38835036387664*fuente de nitrogeno-soya 0,14
118
Fermentación 1 (EFICIENCIA)
Análisis de varianza
Contraste Diferencia
Diferencia estandarizad
a Valor crítico Pr > Dif
Significativo
levadura vs guayaba 0,14 75,069 15,519 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs humus 0,14 72,098 14,905 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs soya 0,14 38,865 8,035 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs gallinaza 0,14 32,192 6,655 3,291 0,000 Sí gallinaza 0,14 vs guayaba 0,14 42,877 8,864 3,291 < 0,0001 Sí
gallinaza 0,14 vs humus 0,14 39,907 8,250 3,291 < 0,0001 Sí
gallinaza 0,14 vs soya 0,14 6,673 1,380 3,291 0,653 No
soya 0,14 vs guayaba 0,14 36,204 7,484 3,291 0,000 Sí
soya 0,14 vs humus 0,14 33,233 6,870 3,291 0,000 Sí
humus 0,14 vs guayaba 0,14 2,970 0,614 3,291 0,969 No
Valor crítico del d de Tukey: 4,654
Prueba de Tukey.
Categoría Medias LS Grupos
Levadura 82,516 A gallinaza 0,14 50,325
B
soya 0,14 43,651
B humus 0,14 10,418
C
guayaba 0,14 7,448 C
Regresión y ecuación del modelo.
R² 0,971
R² ajustado 0,959 Eficiencia = 50,3246578314742-42,877058217201*fuente de nitrogeno-guayaba 0,14-39,9066249174508*fuente de nitrogeno-humus 0,14+32,1915917318034*fuente de nitrogeno-levadura-6,67324856419364*fuente de nitrogeno-soya 0,14
119
Fermentación 1 (BIOMASA).
Análisis de varianza.
Contraste Diferencia Diferencia
estandarizada Valor crítico Pr > Dif Significativo
levadura vs humus 0,14 1,175 17,427 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs guayaba 0,14 0,791 11,734 3,291 < 0,0001 Sí
levadura vs gallinaza 0,14 0,503 7,460 3,291 0,000 Sí
levadura vs soya 0,14 0,473 7,017 3,291 0,000 Sí
soya 0,14 vs humus 0,14 0,702 10,410 3,291 < 0,0001 Sí
soya 0,14 vs guayaba 0,14 0,318 4,717 3,291 0,006 Sí
soya 0,14 vs gallinaza 0,14 0,030 0,443 3,291 0,991 No
gallinaza 0,14 vs humus 0,14 0,672 9,967 3,291 < 0,0001 Sí gallinaza 0,14 vs guayaba 0,14 0,288 4,274 3,291 0,011 Sí
guayaba 0,14 vs humus 0,14 0,384 5,693 3,291 0,001 Sí
Valor crítico del d de Tukey: 4,654 Prueba de Tukey.
Categoría Medias LS Grupos
Levadura 1,317 A
soya 0,14 0,844
B gallinaza 0,14 0,814
B
guayaba 0,14 0,525
C humus 0,14 0,142 D
Regresión y ecuación del modelo.
R² 0,971
R² ajustado 0,959 Biomasa = 0,813737584813505-0,288271503921248*fuente de nitrogeno-guayaba 0,14-0,672213899973565*fuente de nitrogeno-humus 0,14+0,503153362957741*fuente de nitrogeno-levadura+2,98971537909589E-02*fuente de nitrogeno-soya 0,14
120
Fermentación 2 (ÁCIDO LÁCTICO).
Análisis de varianza.
Prueba de Tukey.
Categoría
Medias LS Grupos
gallinaza 0,14 2,122 A
gallinaza 0,21 2,107 A gallinaza 0,07 1,198
B
Levadura 1,193
B soya 0,14 0,734
C
soya 0,21 0,634
C soya 0,07 0,119 D
Regresión y ecuación del modelo.
R² 0,985
R² ajustado 0,979 Ácido láctico = 1,19839187000949+0,923604519143075*concentración-gallinaza 0,14+0,908487352727679*concentración-gallinaza 0,21-5,79596850745469E-03*concentracion-levadura-1,07987417871834*concentracion-soya 0,07-0,464745844733561*concentración-soya 0,14-0,564267500511847*concentración-soya 0,21
121
Fermentación 2 (EFICIENCIA).
Análisis de varianza.
Prueba de Tukey.
Categoría Medias LS Grupos
Levadura 82,516 A gallinaza 0,07 79,841 A B
soya 0,07 57,004
B C gallinaza
0,14 50,325
C D gallinaza 0,21 45,047
C D
soya 0,14 43,651
C D
soya 0,21 30,544 D
Regresión y ecuación del modelo.
R² 0,857
R² ajustado 0,796
Eficiencia = 79,8411436837443-29,5164858522701*concentracion-gallinaza 0,14-34,7939289339553*concentracion-gallinaza 0,21+2,67510587953333*concentracion-levadura-22,8374059956055*concentracion-soya 0,07-36,1897344164637*concentracion-soya 0,14-49,2972583232626*concentracion-soya 0,21
122
Fermentación 2 (BIOMASA).
Análisis de varianza.
Prueba de Tukey.
Categoría Medias LS Grupos
Levadura 1,317 A
gallinaza 0,21 0,858
B soya 0,14 0,844
B
gallinaza 0,14 0,814
B soya 0,07 0,808
B
gallinaza 0,07 0,733
B C
soya 0,21 0,528 C
Regresión y ecuación del modelo
R² 0,904
R² ajustado 0,863
biomasa = 0,73348732990093+8,02502549125744E-02*concentracion-gallinaza 0,14+0,124938632158008*concentracion-gallinaza 0,21+0,583403617870316*concentracion-levadura+7,42708241543826E-02*concentracion-soya 0,07+0,110147408703534*concentracion-soya 0,14-0,205188887070582*concentracion-soya 0,21
123
Fermentación 3 estados de gallinaza (ÁCIDO LÁCTICO).
Análisis de varianza.
Prueba de Tukey.
Categoría Medias LS Grupos
Compost 2,122 A
Levadura 1,193
B Seca 1,074
B
extracto 70°C 0,474
C
extracto 40°C 0,440 C
Regresión y ecuación del modelo.
R² 0,984
R² ajustado 0,977 Ácido láctico = 2,12199638915257-1,68212816647124*fuente de nitrogeno-extracto 40°C-1,6484467772256*fuente de nitrogeno-extracto 70°C-0,92940048765053*fuente de nitrogeno-levadura-1,04810640831885*fuente de nitrogeno-seca
