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EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL OZONO Y DE LA RADIACIÓNULTRAVIOLETA SOBRE LA ESTRUCTURA Y VIABILIDAD DE HUEVOS DE

HELMINTOS

Ma. Neftalí Rojas Valencia y Teresa Orta de Velásquez

Instituto de Ingeniería, UNAM, Ciudad Universitaria.Apdo. Postal 70-472, Coyoacan 04510, México, D.F.

Tel: 622-33-20 ext. 14, Fax 616-21-64

RESUMEN

Como parte de un estudio sobre diversos métodos de tratamiento y desinfección de las aguasresiduales para reusarse en el riego, se evaluó experimentalmente el efecto del ozono (O3) yde las radiaciones ultravioleta (UV) sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helminto,bajo diferentes tiempos de contacto (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min, con tres repeticiones cadauno) en medio líquido y exposición directa. Se utilizaron muestras sintéticas preparadas conuna suspensión de huevos recientemente extraidos de una hembra grávida de Ascaris suum.

Los huevos después de haber sido ozonados o en su caso expuestos a radiaciones UV fueronobservados y posteriormente incubados, en obscuridad a 26 °C durante 21 días (al igual queel testigo que no fue expuesto ni al ozono ni a las radiaciones UV), para ver si se habiaafectado la viabilidad de los huevos en los diferentes tiempos de contacto.

Los resultados obtenidos bajo condiciones de ozonación y radiaciones UV en medio líquido yexposición directa muestran que dichos desinfectantes no ocasionan ningún efecto sobre laestructura y viabilidad de los huevos fértiles de A. suum ya que se observarón larvas móvilesdentro del huevo y su eclosión, al igual que en el testigo.

INTRODUCCIÓN

En nuestro país la reutilización segura de las aguas residuales en agricultura es una necesidadurgente ya que dichas aguas contienen agentes patógenos como virus, bacterias, protozoariosy huevos de helmintos que producen infecciones gastrointestinales, por lo que su reciclaje parariego agrícola presenta un riesgo potencial para la salud pública. Por ello se ha tenido queestudiar la posibilidad de aplicar sistemas de tratamiento eficientes y desinfectantes efectivos,que produzcan efluentes con calidad bacteriológica y helmintológica requerida para riegosegún la normatividad mexicana.

Dentro de los agentes químicos que han sido empleados como desinfectantes de las aguasresiduales se encuentra el cloro (hipocloritos y cloraminas), y otros compuestos como

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bromina, iodo, fenol, alcoholes, metales pesados, jabones, detergentes sintéticos, compuestosde amonio,y varios ácidos (como el clorhídrico, nitríco, acético y sulfúrico). Si bién el empleode dichos desinfectantes han sido efectivos para eliminar bacterias y virus entre otrosmicroorganismos, no lo son para los huevos de helmintos (parasitos intestinales, que ocupanlos primeros lugares dentro de los problemas de salud pública en México), ya que los huevossobreviven muy bien bajo las sustancias mencionadas y otras inhóspitas similares (Odda,1987; Schmidt y Roberts, 1981; Schmidt y Roberts, 1984; Shephard, 1987 y Orta etal., 1990).

Por lo que respecta al estudio de otros desinfectantes más potentes, como el ozono y lasradiaciones ultravioletas, el primero se ha considerado desde hace muchos años como undesinfectante eficaz, agente bactericida y un oxidante químico poderoso tanto en reaccionesorgánicas como innorgánicas (Tebbut, 1990; Orta et al., 1995). Por otra parte lasradiaciones UV han mostrado tener efectos fotoquímicos sobre el material génetico debacterias y virus, las investigaciones más recientes se han enfocado a estudiar la inactivación ytiempos de reactivación de bacterias, virus y quistes de protozoarios (Harris et al., 1987 yMechsner et al., 1991). Hasta la fecha no se han encontrado datos en la literatura sobreacción que ejercen estos desinfectantes sobre los parásitos intestinales presentes en las aguasresiduales.

De aquí que en este estudio se evaluó experimentalmente el efecto del ozono y las radiacionesUV sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Dado que en México la ascariasis es la parasitosis de mayor incidencia, además de tenerdistribución cosmopolita y que las formas infectivas de Ascaris son sumamente resistentes alas condiciones ambientales adversas, se seleccionó a este helminto como modelo en nuestroestudio. Sin embargo, para disminuir el riesgo de infección durante su manipulación se decidióutilizar la variedad Ascaris suum, debido a que es específicamente infectante para cerdos yno para humanos, aún cuando es morfológicamente indistingible de la variedad lumbricoidesde humanos (Schmidt y Roberts, 1984).

Obtención de la suspensión de huevos de Ascaris suum (A. suum)

Se recolectarón hembras de A. suum del rastro de Zumpango, Estado de México. Lashembras fueron trasladadas al laboratorio en solución salina isotónica, en el laboratorio sesometierón a disección para extracción de los úteros grávidos, de los cuales se extrajerón loshuevos por molienda y lavados con solución salina isotónica.

Con esta suspensión se iniciaron pruebas para determinar el efecto del ozono y de lasradiaciones ultravioleta sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos.

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Preparación de experimentos para evaluar el efecto del ozono sobre la estructura yviabilidad de los huevos de helmintos

Se prepararon muestras testigo (por triplicado) en un recipiente de plástico de 2 litros, de lasiguiente manera: se añadió 1 litro de solución salina isotónica más 0.1 ml de una suspensiónde huevos (aproximadamente 500 huevos) se homogenizó con la ayuda de un agitadormagnético y se dejó en agitación sin ozonar el mismo tiempo de contacto al que se sometieronlas muestras tratadas con ozono (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min).

Paralelamente a las muestras testigo se realizaron pruebas de desinfección en medio líquido(por burbujeo) y exposición directa de ozono (a partir de aire enriquecido con oxígeno),variando tiempos de contacto en un generador de O3 para laboratorio "Trailigaz, LABO 76".

Pruebas de desinfección con ozono de huevos de A. suum en medio líquido

Las muestras en medio líquido sometidas al generador de ozono (fig. 1), a diferentes tiemposde contacto, se prepararon así: en un recipiente de plástico de 2 litros, se le añadió 1 litro desolución salina isotónica más 0.1 ml de una suspensión de huevos (aproximadamente 500huevos), se homogenizó con la ayuda de un agitador magnético e inmediatamente se paso a unsistema continuo de ozonación mediante burbujeo y se les aplicó un flujo constante de gas"O3" durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones por cada tiempo). Para todoslos casos, el flujo de ozono a la salida del generador se mantuvo constante en 0.61 l/min.aplicando una concentración promedio de 31.3 mg O3/l en fase gas.

Figura 1. Sistema continuo de ozonación en laboratorio.

Después de haber sido sometidas las muestras a diferentes tiempos de contacto con azono,así como el testigo sin ozonar, se aplicarón dos métodos para concentrar los huevos y parapoder observarlos en el microscopio y ver si el ozono causaba algún efecto sobre laestructura de los huevos de A. suum.

Método para concentrar los huevos de helmintos

Las muestras con huevos de Ascaris suum después de haber sido ozonadas se pasaronsolamente por un filtro de membrana de 47 mm de diámetro y poros de 8.0 mm, aplicandovacío máximo de 40 cm Hg; al termino se lavaron las paredes del recipiente que se metió alozonador y el embudo de filtración con solución salina isotónica y se pasaron estos lavadospor el mismo filtro.

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Se colocó la membrana sobre la pared interna de un vaso de precipitados y se raspoperfectamente con una espátula; se lavo la membrana y la espátula con solución salina,recibiendo todos los lavados en el mismo vaso e inmediatamente se colocó una gota delconcentrado en cada uno de cinco portaobjetos y se observaron los huevos en unmicroscopio óptico para ver si se presentaba alguna alteración en la estructura de los mismos.

Pruebas de desinfección con ozono de huevos de A. suum en exposición directa

Se sometieron los huevos de A. suum a exposición directa (en un sistema similar a la figura 1con la modalidad que en este caso no se utilizo medio líquido) de la siguiente manera: una gota(aproximadamente 500 huevos) de la suspensión de huevos recientemente extraídos fuecolocada en un porta objetos, la gota se distribuyó homogeneamente y se metió hasta el fondode un matraz de quitazato y se ozono aplicando una dosis constante de 60 mg O3/l en fasegas, con un difusor de O3 muy cercano al portaobjetos, durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30minutos (con 3 repeticiones por cada tiempo).

La muestra testigo se preparó igual que la tratada, sólo que se dejó al aire libre por un lapsode tiempo igual al que se metieron al ozonador las muetras tratadas.

Después de observar si el ozono provocaba algún efecto o no, a la estructura de los huevosde A. suum tanto en medio líquido como exposición directa, los huevos fueron incubados por21 días (al igual que el testigo que no fue expuesto al ozono) en ácido sulfúrico 0.1 N, paraver si se habia afectado la viabilidad de los huevos, según lo recomendado por la técnica deincubación in vitro de la US EPA, (1992).

Preparación de experimentos para evaluar el efecto de las radiaciones UV sobre laestructura y viabilidad de los huevos de A. suum

Para evaluar el efecto de las radiaciones UV se siguieron igual que para el ozono dos pruebas:

Pruebas de desinfección con radiaciones UV de huevos de A. suum en medio líquido

La primera prueba consistió en mezclar (por duplicado) aproximadamente 3,000 huevos (0.5ml de una suspensión de huevos recientemente extraidos de una hembra grávida de A. suum)en 20 litros de agua de la llave. Una de las suspensiones se dejo bajo agitación magnética y enluz natural, esta correspondio a la muestra testigo.

La segunda suspensión se metio a desinfectar (en un generador de luz ultravioleta"URMINUS") bajo radiación UV a una longitud de onda de 254 nm, entre lámparas de arcode mercurio-argón y tubos reflectores de metal pulido durante 10 minutos, este mismoprocedimiento se siguió, para los tiempos de exposición de 15, 20 y 30 minutos.

Al emplear solamente agua de la llave y la suspensión de huevos de helmintos, se aseguró queno hubiera turbidez y que los huevos estuvieran expuestos libremente a la radiación.

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Las muestras con huevos de A. suum después de haber sido sometidas a radiacionesultravioleta se les aplicó el mismo método para concentrar los huevos de helmintos, empleadoen los análisis de ozono.

Pruebas de desinfección de huevos de A. suum por radiaciones UV en exposicióndirecta

Se sometieron los huevos de helmintos a la acción desinfectante de los rayos UV a exposicióndirecta de la siguiente manera: una gota (aproximadamente 500 huevos) de la suspensión dehuevos recientemente extraídos fue colocada en un porta objetos, la gota se distribuyóhomogeneamente y se metió al equipo de radiación ultravioleta a una longitud de onda de 254nm sin ningún medio líquido, durante 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones paracada tiempo).

Los huevos después de haber sido expuestos a radiaciones UV, tanto en medio líquido comoexposición directa fueron observados y posteriormente incubados en obcuridad a 26 °Cdurante 21 días (al igual que el testigo que no fue expuesto a las radiaciones UV), para ver sise habia afectado la viabilidad de los huevos en los diferentes tiempos de contacto.

Los criterios para determinar si un huevo permanecia viable o no después de ser ozonado oen su caso expuestos a las radiaciones UV fue la movilidad de las larvas dentro del huevo y laeclosión de las mismas después de incubarlas in vitro.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en este trabajo fueron los siguientes:

Los resultados obtenidos al pasar inmediatamente las muestras ozonadas (en los diferentestiempos de contacto por un filtro de membrana de 47 mm de diámetro y poros de 8.0 mm), einmediatamente observadas, mostraron que algunos huevos de A. suum, presentabanvacuolación en el citoplasma, destrucción de una porción de la parte externa de la cubiertaprotéica, perdida de la cubierta externa y desintegración del huevo por completo (fig. 2), porlo que se pensó inicialmente, que el ozono si provocaba efectos sobre los huevos dehelmintos. Debido a que también se observaron una buena cantidad de huevos íntegros (fig.3) después de todos los tratamiento con ozono, se procedio a verificar el efecto sobre suviabilidad (ya que los huevos viables son los que determinan la capacidad de un huevo dedesarrollarse asta etapa infectiva), para ello se incubaron (según la US EPA, 1992) y seobservaron cada ocho días durante un mes y medio, hasta comprobar si se llegaban aformarse larvas después de aplicarles el desinfectante.

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Figura 2. Huevo de Ascaris suum no viable, en donde se observa la perdida de la cubiertaexterna y la desintegración completa al ponerlo en contacto con el ozono por 30 minutos.

Figura 3. Huevo de Ascaris suum sin ningún daño aparente después de ver estado expuestoal ozono por 30 minutos.

Por lo que respecta a los resultados de las radiaciones UV se observo que apesar que lalongitud de onda de 253 nm es considerada muy fuerte para la inactivación microbiana nomuestra daños aparentes sobre los huevos de A. suum, podría ser que hubiera algún dañofotoquímico del ADN Y ARN como en otros casos, sólo que no se tuvo la infraestructurapara evaluar si se presentaba este efecto, por lo que lo más conveniente fue evaluar el efectosobre la viabilidad de los huevos.

Después de una observación exhaustiva (mes y medio), se pudo constatar que las alteracionesprovocadas por el ozono sobre los huevos de A. suum (como la pérdida de la cubiertaexterna, vacuolación en el citoplasma y destrucción de una porción de la parte externa de lacubierta protéica) sólo se presentaban en los huevos no viables ya que los huevos viables semantenian íntegros y llegaron a formar larvas (fig.4) aunque en un período mayor a los 21días, por lo que se podría decir que la embrionación se retardo por el empleo de losdesinfectantes, más no destruyo a los huevos viables ya que al final de la embrionación laslarvas eclosionaron (fig. 5) aún después de haber sido expuestos al ozono y las radiacionesultravioleta por 30 minutos tanto en medio líquido como exposición directa.

Figura 4. Huevo de Ascaris suum en fase larval móvil (ozonado por 30 minutos) observadodespués de un més y medio de incubación.

Figura 5. Eclosión de un huevo de Ascaris suum (expuesto a radiaciones ultravioleta por 30minutos) observado después de un més y medio de incubación.

Según Rogers (1958) y Clark (1981) cuando un huevo se desarrolla hasta su fase larval y lalarva eclosiona aún después de que se le agrege cualquier desinfectante químico quiere decirque esta viable y en este caso se demuestra que el ozono y las radiaciones UV no les causaefecto alguno a los huevos viables.

La resistencia extraordinaria a los desinfectantes químicos, desecación y penetración desustancias polares es el resultado de la capa de lípidos de la cubierta de los huevecillos dehelmintos. Al menos en Ascaris, esta capa esta compuesta del 25 % de proteínas y 75 % deascarósidos. Los ascarósidos son glucósidos muy interesantes y únicos (compuestos conazúcar y alcohol unidos por un puente glucosídico). En los ascarósidos, el azúcar esascarilosa (3, 6-didesoxy- L - arabinohexosa), y los alcoholes son una serie de manoles ydioles secundarios que contienen de 22 a 37 átomos de carbono. Los ascarósidos hacen quela cubierta del huevecillo sea virtualmente impermeable a todas las sustancias que no seansolventes de lípidos (Hinck, 1972;Schmidt y Roberts, 1981; Schmidt y Roberts, 1984).

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Es de suma importancia recalcar que la concentración de ozono de 31.3 mg/l y la de 60 mg/len fase gaseosa empleadas en este trabajo, serían rápidamente fatales para conejillos de indiay para el humano, por lo que es necesario continuar con este tipo de investigaciones sobreestos indestructibles parasitos intestinales hasta que se logre encontrar, la manera dedestruirlos y así disminuir los riesgos de infección.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Los resultados muestran que el ozono y las radiaciones ultravioleta no ocasionan ningún efectosobre la estructura y viabilidad de los huevos fértiles de helmintos aún exponiendolos durante30 minutos a los desinfectantes, ya que se observarón larvas móviles dentro del huevo y sueclosión, al igual que en el testigo.

Aunque los huevecillos viables son extremadamente resistentes a la desinfección por ozono ya las radiaciones ultravioleta, la embrionación se retarda por dichos factores.

Los resultados obtenidos son la respuesta de huevos de Ascaris suum (parasito intestinal decerdo), debido a que las respuestas son diferentes según el tipo de microorganismo, no esconveniente generalizar los resultados observados, para todas las especies de helmintos, yaque posiblemente en otras especies si se presente algún efecto sobre los huevos por el empleode dichos desinfectantes, es algo que faltaría probar.

Es importante determinar la viabilidad de los huevos de helmintos después de aplicar cualquiertipo de desinfectante ya que esta característica es la que demuestra que un huevo tiene vida ono y por lo tanto si el desinfectante es efectivo o no.

BIBLIOGRAFÍA

Clark, P. R. (1981) Parasistismo Animal Ed. C.E.C.S.A. págs. 148-161.

Harris, D. G., Adams, D.A., Sorensen, L.D. and Curtis, S. M. (1987). Ultravioletinactivation of selected bacteria and virus with photoreactivation of the bacteria. Wat.Res. 21(6):687-692.

Hinck, L.W. (1972) Enzyme studies with hatching fluid and developmental stages ofAscaris suum. Doctoral dissertation. University of Oklahoma.

Jagger, J. (1967). Introduction to research in ultraviolet photobiology. Prentice-Hall, Inc.,Englewood Cliffs, NJ.

Mechsner, Kl., Fleischmann, T., Mason, C.A. and Hamer, G. (1991) UV desinfection:Short term inactivation and revival. Wat. Scie. Tech. 24(2):339-342.

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Odda, R.; Jiménez-Albarran, M. (1987) NOTA PARASITOLOGICA Viabilidad de loshuevos de Ascaris lumbricoides. Rev. Ibér. Parasitol., 47(2):159-160.

Orta, L.M.T., Galván, G.M., Ramírez, G.A., Flores, T.R.C., Díaz, A.N., Castillo, H.Z. yMiranda, F. (1990) Efecto del cloro en un efluente biológico aplicado al suelo concondiciones insaturadas. Instituto de Ingeniería, UNAM. Proyecto 8365, julio.

Orta, L.M.T., Monge, I y Lopéz, E. (1995). Estudios de desinfección del agua residualproveniente del Valle de México. Instituto de Ingeniería, UNAM. Proyecto 4340,diciembre.

Rogers, W.P. (1958) Physiology of the hatching of eggs of Ascaris lumbricoides. Nature181:1410-1411.

Schmidt, G.D. y Roberts, L.S. (1981). Foundations of parasitology. Second Edition. Ed.C.V. Mosby Company.

Schmidt, D.G. y Roberts, L. S. (1984) Fundamentos de parasitología Ed. Continental, S.A. de C. V. págs. 439-441 y 495-498.

Shephard, M.R.N. (1987) Helminthological aspects of sewage treatment in hot climates.In: Water, wastes and health in hot climates. R. Feachem, M. McGarry and D. Mara, Editors.John Wiley and Sons, New York.

Tebbutt, T.H.Y. (1990). Fundamentos de control de la calidad del agua Ed. Limusa, S.A.de C.V. México, D.F. pág. 181-182.

U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (1992). "EnvironmentalRegulations and Technology Control of Pathogens and Vector Attraction in SewageSludge" (Including domestic septage ) under 40 CFR part 503. Appendix I AnalyticalMethod for Viable Helmith Ova. Washinton, D.C.