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Evaluación del efecto de variantes en genes candidatos sobre la enfermedad del dengue en una

muestra de población colombiana

Efren Avendaño Tamayo Tesis de Doctorado

Universidad de Antioquia Medellín-Colombia

2013

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Evaluación del efecto de variantes en genes candidatos sobre la enfermedad del dengue en una

muestra de población colombiana

Efren Avendaño Tamayo Instituto de Biología, Biólogo Magíster

Tesis de Doctorado Presentada como requisito para optar al título de

doctor en Biología del laboratorio GENMOL

Tutor: Profesor Gabriel Bedoya Berrio,

Instituto de Biología, Universidad de Antioquia

Comité Tutorial: Profesora Berta Nelly Restrepo, Instituto Colombiano de Medicina

Tropical, Universidad CES Profesora Piedad Agudelo Florez, Facultad de Medicina,

Universidad CES Profesor Winston Rojas Montoya, Instituto de Biología, Universidad de

Antioquia

Universidad de Antioquia Instituto de Biología Medellín-Colombia

2013

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Agradecimientos

El autor agradece al instituto de Biología de la Universidad de Antioquia, especialmente al programa de Doctorado en Biología y al instituto Colombiano de Medicinal Tropical de la Universidad CES, por su acompañamiento durante el desarrollo del trabajo en laboratorio GENMOL. Gracias a Colciencias por el financiamiento.

Yo estoy particularmente agradecido con mi tutor el Profesor Gabriel Bedoya Berrío por guiar mi camino profesional y apoyarme como mentor. Agradezco a la profesora Berta Nelly Restrepo por colaborar activamente con el inicio de un camino de profundización intelectual.

Agradezco a la profesora Piedad Agudelo Florez y al profesor Winston Rojas por ser mis co-turores desde hace tanto tiempo contribuyendo enormemente a mi proceso formativo.

Agradezco a todas las personas del laboratorio GENMOL por permitirme evaluar los genes candidatos.

Finalmente yo quiero agradecer a mi familia quienes se esforzaron en ayudarme a completar la tesis.

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Tabla de Contenido

Página de título

Agradecimientos 3

Tabla de contenido 4

Resumen de la disertación 6

Capítulo 1: El virus del dengue (Agente etiológico) 7

Capítulo 2: Forma de transmisión (EL vector) 19

Capítulo 3: Epidemiología 23

Capítulo 4: Panorama de dengue en Colombia 27

Capítulo 5: Fisiopatología del dengue 35

Capítulo 6: El papel del Contexto genético del humano 48

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Capítulo 7: Evaluación del efecto de variantes en genes candidatos

sobre la enfermedad del dengue en una muestra de población

colombiana 53

Referencias 150

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Resumen de la disertación

La infección, desarrollo y progresión de dengue se caracteriza por una fuerte respuesta inmunológica asociada con la transmisión del virus dengue (DV) a través de la picadura del mosquito infectado cuya alta infestación promoverá la ocurrencia de infecciones secundarias conduciendo el aumento de la permeabilidad vascular que lleva a la extravasación de plasma y hemorragias que producen la muerte. La resistencia/susceptibilidad tanto a la progresión a dengue grave, así como a la infección con el DV, dependen de factores del virus, inmunológicos y genéticos del hospedero. Hallar los factores genéticos que predicen la infección y la severidad es de gran importancia en dengue para el diagnóstico molecular de la susceptibilidad e intervenciones asistidas con marcadores genéticos en campañas de prevención y medicación fármaco-genética. Varios polimorfismos en los genes codificantes de receptores víricos, citoquinas, quimoquinas y del complejo mayor de histo-compatibilidad confieren la resistencia/susceptibilidad a la infección por DV y a la progresión a dengue grave. El ajuste de asociaciones de variantes en genes candidatos a infección y progresión de dengue con variables de confusión como la edad, el sexo, los tipos de infección y la composición genética ancestral individual puede ser de gran utilidad para determinar grupos de riesgo y reducir las falsas asociaciones. La presente disertación presenta en el capítulo 1 las características del DV como agente etiológico de la enfermedad de su mismo nombre, junto con su relación con otros virus hemorrágicos. EL Capítulo 2 contiene una revisión de las formas de transmisión del virus con enfoque en mosquito del género Aedes. El capítulo 3 muestra los aspectos más relevantes de la epidemiología de dengue. El capítulo 4 describe el panorama de dengue en Colombia y el capítulo 5 presenta la fisiopatología de la enfermedad del dengue. El capítulo 6 resume el papel del contexto genético del humano en la epidemiología de dengue. Finalmente el capítulo 7 presenta el análisis de la evaluación del efecto de variantes en genes candidatos sobre la enfermedad del dengue en una muestra de población colombiana.

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Capitulo 1

El virus del dengue (Agente etiológico)

Efren Avendaño Tamayo

Genoma y estructural del virus dengue

EL virus dengue (DV), es un arbovirus,1 miembro del género Flavivirus de la familia Flaviviridae,2 del cual se han descrito 5 serotipos circulantes (DV-1 a DV-5).3 Los factores virales son determinantes de la enfermedad potencial, donde se combinan las proteínas virales, la estructura del virión, los genotipos y serotipos virales.1

Los flavivirus incluyendo a DV han desarrollado un genoma de ácido ribonucleico de cadena simple de polaridad positiva (ssRNA+) de 10.5-11Kb de longitud. Este genoma codifica una poliproteína que es clivada por proteasas propias y del hospedero en tres (3) proteínas estructurales y siete (7) no estructurales,4 flanqueadas por dos regiones no traducidas (UTRs en los extremos terminales 5' y 3').1 El extremo amino-acido terminal de la proteína, codifica las proteínas estructurales Cápside (C), pre-membrana (prM) y envoltura (E), mientras el extremo opuesto (extremo terminal carboxilo) de la proteína codifica las proteínas no estructurales (NS), NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5,2 (Figura 1).

Las células blanco de infección de dengue virus incluyen monocitos, macrófagos y células dendríticas. El virus se agarra a la superficie celular mediante la proteína E y entra por un mecanismo conocido como endocitosis mediada por receptores. El bajo pH al interior del endosoma dispara la fusión de las membranas virus-endosoma debido a la reorganización estructural de la proteína E, llevando a cabo la liberación de la nucleo-capside y posterior liberación del ARN viral al citoplasma. La replicación viral ocurre en el retículo endoplasmico, con la producción del ssARN- a partir de ssARN+ y las proteínas virales, y posterior conformación de ARN circular de doble cadena, que servirá de molde para generar la progenie de ssARN+, en concertación con vesículas de aparato de golgy, las nuevas hebras de ssARN+ viral serán empaquetadas en un virion o proteínas virales recién traducidas. En el retículo endoplasmico se formarán viriones inmanduros disponiendo de proteínas de pr-M, las cuales serán encaminadas en la vía secretora del golgy y a través de furinas se mediará el clivaje de la pr-M a M generando viriones maduros infecciosos liberados por exocitosis.4

Las proteínas de la E y prM son los blancos de la respuesta de anticuerpos en el curso de la infección.5 La glicoproteína E es la proteína más generosamente

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representada en la superficie del virus y es responsable del agarre y entrada a células blanco. De los tres dominios (D-I, D-II y D-III) presentes en la E, el D-III es el más inmunodomiante e importante para la unión de receptores, genera anticuerpos específicos y neutralizantes, mientras que los D-I y D-II tienen reactividad cruzada de anticuerpos entre serotipos incluso con otros virus, lo que puede llevar a la producción de anticuerpos no neutralizantes, lo cual está correlacionado a infecciones secundarias con serotipos heterólogos y presentación de formas clínicas severas cuando se desarrolla la enfermedad del dengue.1 A pesar de que la pr-M genera también anticuerpos específicos, esta es inaccesible cuando el virión está maduro, sugiriendo la relevancia de los anticuerpos que genera solo cuando en el virión está in-maduro,1 (Figura 2).

Por otra parte entre las proteínas no estructurales se encuentra la proteína NS1, cuya importancia radica en su reconocida implicación en el desarrollo de la extravasación de plasma durante el curso de la forma severa de la enfermedad. La reactividad cruzada de anticuerpos contra NS1 ha sido evidenciada en activación inflamatoria del endotelio resultando en daño celular,6 además se ha visto soluble interactuando con proteínas del complemento, inhibiéndolo.7

Figura 1. Genoma del virus dengue

Figura 1. Recurso: Leopoldo G. 2011. 5'UTR y 3'UTR: Regiones no traducidas 5' y 3' respectivamente; ORF: Marco de lectura abierta comprende proteínas estructurales (C-prM-E) y no estructurales (NS1-NS2AB-NS3-NS4AB-NS5); también son indicadas las localizaciones de las secuencias complementarias 5'-3'CS con la línea solida and 5'-3'UAR con la línea punteada. La estructura secundaria predicha en el extremo 5': Lupa más grande (SLA), lupa corta (SLB). En el extremo 3': las dos primeras lupas después del codón de parada son el dominio I (D-I), las dos siguientes son el D-II, y la última conteniendo el 3'UAR y 3'CS es el D-III. Los UTRs son responsables en primer lugar de la regulación y replicación del genoma viral. La secuencia o la estructura secundaria de los UTRs aunque influyen no son totalmente concordantes con la severidad de la enfermedad.1 El 5'-UTR tiene 95-101 nucleótidos de longitud y hacia el final contiene una estructura CAP (m7GpppAMp) y diferentes dominios de ARN con distintas funciones para

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llevar a cabo la síntesis del RNA.8 Uno de ellos de ~70 nucleótidos capacitado para formar una gran lupa llamada SLA (Figura 1).9 Este funciona como el promotor para la NS5 (RNA polimerasa RNA dependiente), necesaria para la replicación viral, también presente en otros flavivirus.10 Una segunda lupa (SLAB) contiene secuencias esenciales de interacción RNA-RNA para la replicación genómica,11 ambas estructuras están separadas por cadenas espaciadoras poli(U).12 El 3'-UTR con 450 nucleótidos de longitud, comprende tres dominios (Figura 1), el dominio I (D-I), más cerca del codón de parada,13 está ubicado en una región altamente variable, con diferencias específicas de serotipos, variando desde 50-120 nucleótidos.14 El dominio II, contiene secuencias conservadas (SC) y repeticiones de ella (RSC) junto con otros elementos presentes en flavivirus.15, 14 La interacción de estos dominios potencia la replicación viral.14, 16 El dominio 3 (D-III) es el más conservado y produce el elemento SC1 seguido de una estructura de lupa (3-SL). El SC1 contiene los elementos de interacción entre los extremos terminales del genoma viral.17

Figura 2. Estructura del virus dengue inmaduro y maduro.

Figura 2. Recurso: Lara J. Herrero 2013. El virión de dengue contiene un ARN genómico de cadena simple de polaridad positiva, la cual es encapsulada en una

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nucleo-cápside y envoltura en una bicapa-lipídica incrustada de glicoproteínas. El virión inmaduro tiene una concha glicoproteíca en punta de 60nm dispuesta en protuberancias en forma de icosaedro. EL virion maduro tiene las glicoproteínas lisas y dímeros de la proteína de la pr-M diseñadas en espiga. C: Capside: E: envoltura, prM: pre-membrana; NS: proteínas no estructural; ss-RNA: cadena simple de ácido ribonucleico. Entre los elementos de interacción RNA-RNA se encuentran dos pares de regiones complementarias y los ya mencionados nucleótidos adyacentes en ambos extremos del genoma, todos necesarios para la ciclación lo cual influye ampliamente sobre la replicación viral.18 Las regiones complementarias son conocidas como 5'-3'CS y el 3'-5'SC. De otro lado las 5'-UAR y el 3'-UAR localizados en el 5'-UTR y 3'-UTR respectivamente, hibridan en los terminales del genoma resultando en cambios de conformación en estructuras de ARN conservadas,2(Figura 1).

Malos apareamientos en las regiones complementarias no alteran la traducción del RNA viral pero si disminuyen ampliamente la síntesis, determinando en algunos casos niveles indetectables de la replicación viral, mutaciones complementarias pueden restaurar los niveles de síntesis demostrando la complementariedad de la secuencia nucleótidos del VD.19

En resumen aunque la epidemiología del dengue sugiere ser similar entre serotipos, ellos genéticamente y antigénicamente son distintos. La infección con un serotipo diferente confiere protección contra re-infecciónes homologas, pero los nuevos retos heterólogos confieren una breve protección. 20

Diversidad genética de serotipos, genotipos y virulencia diferencial

Se ha sugerido que los diferentes serotipos tienen diferencias en cuanto a la severidad de la enfermedad que generan en sus hospederos. En estudio realizado en población Tailandesa para dilucidar los factores inmunológicos y virales de la forma severa de la enfermedad, se propuso que los serotipos DV-2 y DV-4 circulantes necesitaron de anticuerpos circulantes de infecciones previas para causar la forma severa de la enfermedad. De otro lado se observó que DV-3 y DV-1 se observaron en mayor proporción en la formas graves de personas infectadas por primera vez, lo que llevó a pensar que estos dos serotipos (DV-3 y DV-1) proliferaron suficientemente para causar la forma grave de la enfermedad en una infección primaria. Concluyendo que DV-3 y DV-1 son más virulentos que DV-2 y DV-4 en Tailandia.21 Otro estudio realizado en Nicaragua evaluando el potencial patogénico de diferentes serotipos de dengue virus en poblaciones humanas se encontró en un período de tiempo dominado por la circulación de DV-2 se asoció a las manifestaciones clínicas más severas comparado con un período dominado por DV-1. El periodo dominado por DV-2 fue asociado con más síndrome de choque por dengue (alteración de la homeostasis con pulso cardiaco muy débil o

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imperceptible) y más manifestaciones hemorrágicas, mientras DV-1 se asoció a extravasación de plasma.22

Dentro de cada serotipo hay evidencia de variación genética, estos llamados genotipos de serotipos han sido explorados en relación a su asociación a diferentes fenotipos de la enfermedad, sin embargo merece más investigación.1 Estudiando tres aislados DV-1 de pacientes con diferentes grados de severidad del dengue en Cambodia, fueron caracterizados genéticamente. Se comparó la cinética de replicación en diferentes líneas celulares y la respuesta de la apoptosis agrupando aislados de pacientes con formas clínicas leves y severas, comparándolos con síndrome de choque por dengue, mostrando que los aislados de estos últimos presentaron bajos niveles de replicación en células de mamífero, alta apoptosis en células de mosquito y seis aminoácidos únicos en las proteínas de la M, en la E y en las NSs.23 Cuando se analizó la secuencia del genoma completo de DV en Vietnam permitió identificar un reemplazamiento temporal de genotipos DV-2 Asiático/Americano por el genotipo DV-2 Asiático I. Además se encontró que a pesar de que ambos genotipos mostraron niveles similares de fitness de infectividad en los mosquitos, los más altos niveles de viremia en plasma se asociaron a aislados de pacientes pediátricos infectados con el genotipo Asiático I comparado con el genotipo Asiático/Americano.24 En otro estudio comparando 240pb de las secuencia de la región del gen de la E y la NS1 se evidenció las relaciones evolutivas y origen geográfico de linajes del DV. Claramente se demostró la asociación entre la introducción del genotipo del sudeste asiático del DV-2 y la aparición de las forma severa del dengue a cuatro países Americanos (México, Venezuela, Brasil y Colombia), este genotipo importado a tenido desplazado al genotipo nativo Americano, el cual ha sido asociado solo a la forma menos severa.25

La eficiencia del control del virus dengue en todo el mundo requiere de la definición de recursos epidémicos precisos como la identificación de genotipos y serotipos virales, porque podría pararse la eficiente transmisión del dengue de tipos de virus virulentos y los estudios genéticos serán de uso poderoso para su control.25

Distribución de serotipos en el mundo

El virus dengue es la especie de flavivirus más ampliamente distribuida en el mundo, coincide en regiones tropicales y subtropicales donde habita su principal vector Aedes aegypti.26 Los análisis filogenéticos han soportado la hipótesis de la circulación de serotipos divergió desde sus ancestros selváticos aproximadamente hace 1.000 años.27 Un estudio determinó una alta diversidad genética en el sudeste de Asia donde los cuatro principales serotipos de dengue circulan desde la segunda guerra mundial.28 Esta población fue identificada como fuente de la rápida y dramática reemergencia de las virosis del dengue globalmente a mediados de la última centuria.29 Sin emargo el origen exacto del virus dengue discrepa alternativamente por atribuirse a Africa o Asia.30 Hay evidencia de que los cinco serotipos del virus dengue han emergido desde linajes selváticos en el bosque del

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sur-este de Asia, sin embargo a diferencia de las virosis VD-1 a 4, aún no hay evidencia de que el DV-5 se haya propagado fuera de Malasia.31, 30, 32 Hace seis décadas el incremento de la co-circulación a nivel mundial de múltiples virosis del dengue (serotipos de VD-1, 2, 3 y 4), ha sido acompañado de una -progresiva expansión de la forma severa de la enfermedad.33 La amplia distribución y simultánea circulación del DV-4 en varios países en America es un signo de alarma por la propagación de las formas severas de la enfermedad asociada con infecciones secundarias (Figura 3).33

Figura 3. Co-circulación de virosis del dengue en el hemisferio occidental entre 2006-2010.

Recurso: Organización panamericana de la Salud.

En América han sido reportados pacientes con síntomas clínicos similares a dengue desde 1780, pero las epidemias fueron raras, hasta 1963 solo se conocía la presencia del genotipo nativo americano, pero después la introducción de

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nuevos serotipos/genotipos fue aumentando en el tamaño y frecuencia de las epidemias, además también aumento el número de los casos severos del dengue asociados a la introducción del genotipos Asiático/Americano de DV-2 en 1981,29 Figura 4.

Figura 4. Tiempo de introducción de varios serotipos/genotipos dengue virus en America.

Recurso: Orchid M. Allicock 2012. Primeros países de reporte: BRA: Brasil; CUBA: cuba, DOM: Dominicana; JAM: Jamaica, NIC: Nicaragua; PAN: Panamá; PR: Puerto Rico y TRI: Trinidad y Tobago.

Presencia de serotipos en Colombia y patrones de dispersión en América

Colombia es un centro de diversidad de DV junto con Barbados, Puerto Rico, Suriname, Venezuela y Brasil. Estos países estuvieron repetidamente presentes en el flujo génico de DV hacia localizaciones distantes, presentando complejos patrones de movimiento geográfico Figura 5. Desde 1985 Colombia junto con Brasil, Venezuela y Argentina contribuyeron como fuentes poblacionales a otras regiones. En ese estudio resultó nueva evidencia que sugiere no solo la presencia de los DV1-4 en Colombia sino que también presenta a dicho país como una de las principales fuentes de DV-1 y DV2 en América.29 Los DV-1, 2, 3 y 4 han sido implicados en Colombia en diferentes epidemias aunque los DV1 y DV-2 han tenido la mayor tasa de circulación desde 1971. Además desde que se reportó el primer caso de la forma severa del dengue (dengue hemorrágico) en 1989, estos dos serotipos (DV1 y DV-2) fueron particularmente asociados con la forma severa del a enfermedad. DV-4 fue detectado por primera vez en 1984 y ha sido aislado esporádicamente de formas leves del dengue.34

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Figura 5. Dinámica espacio temporal de serotipos DC-1 a DV-4 circulando en América y Colombia.

Las líneas representan filogenias proyectadas desde la superficie. La intensidad del color indica la edad relativa de los patrones de dispersión, más obscura: más vieja

Por otra parte en Colombia DV-3 fue detectado por un tiempo corto en 1975 y desapareció (Boshell J, 1986), sin embargo su reintroducción se confirmó en 2001 en el departamento de Santander35 y oficialmente fue reportado al Instituto nacional de Salud a principios de 2002 en la Guajira. Méndez JA afirma que la co-circulación de DV-1, 2 y 3 viene incrementando particularmente en áreas endémicas. Evaluando la región 3' del gen de la proteína E se encontró co-circulación espacio temporal de distintos genotipos de DV-3 (genotipos I y III) lo cual puede tener valor

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epidemiológico en la enfermedad. Figura 6. Los genotipos I y III co-circularon en los departamentos de la Guajira, Huila y Guaviare, estando el genotipo III más ampliamente distribuido.34

Figura 6. Distribución de DV-3 genotipos I y III en Colombia.

En gris claro: presencia del genotipo I; líneas horizontales: genotipo III; gris obscuro: co-circulación de genotipos I y III; líneas cruzadas: DV-3 sin determinación de genotipo.

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El virus dengue y su relación con otros virus que causan fenotipos similares

El reconocimiento de la infección del virus dengue en el hospedero humano ha evolucionado de tal manera que no solo reconoce al virus dengue, sino también a otros virus biológicamente relacionados. En el caso de la producción de doble cadena de ARN viral (dsRNA) sintetizada durante el curso de la infección dispara mecanismos de respuesta antiviral. Los mecanismos involucrados en esta respuesta han sido en muchos casos comunes entre virosis de RNA con diferentes fenotipo de enfermedad como las fiebres hemorrágicas (Ebola, Marburg, Lassa fever, Lujo, Machupo, Junin, Guanarito, Crimean-Congo, Rift Valley fever y dengue) y enfermedad respiratoria severa (influenza, SARS, Hendra, Hantaan, Sin Nombre, Andes) y encefalitis (Nipah, West Nile). 36

Estas virosis han desarrollado estrategias para bloquear la detección de la sdRNA viral por receptores tipo acido retinoico (RLRs) nombradas como Hide, mask y hit y así antagonizar la producción de Interferón como principal respuesta celular antiviral. Hit, indica secuestro dsARN para prevenir su unión a RLRs, y así lograr inhibir la vía por competencia con RLRs. Mask, indica la supresión de la la habilidad de proteínas virales para procesar doble hélice y remover terminales fosforiladas blanco de RLRs. Hit involucra interacción física entre proteínas virales y RLRs para suprimir sus funciones. Estas soluciones fueron adoptadas por un gran número de virosis ARN que son altamente letales en humanos y necesita mayor investigación, algunas se muestran en la Tabla 1.36

Tabla 1. Virosis tipo ARN las cuales codifican proteínas que adoptan estrategias Hide, Mask y Hit para bloquear el reconocimiento de la dsARN.

Recurso: Luca Zinzula 2013. CCHFV, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus; DENV, dengue virus; EBOV, Ebola virus; HTNV, Hantaan virus; HeV, Hendra virus; IAVs, influenza A viruses; JUNV, Junin virus; LASFV, Lassa fever virus; MACV, Machupo virus; MARV, Marburg virus; NiV, Nipah virus; RVFV, Rift Valley fever virus; SARS-CoV, severe acute respiratory syndrome coronavirus; WNV, West Nile virus. Famila a la que pertenece cada virus: Arenaviridae OW: del viejo mundo,

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NW: del nuevo mundo; Bunyaviridae; Coronaviridae; Flaviviridae; Henipaviridae y Orthomyxoviridae.

Estas diferencias demuestran la que la respuesta inmune de vertebrados y en primera instancia la innata y posteriormente la adaptativa son una parte integral de la respuesta a infecciones virales (virosis ARN) para la producción de INF, llevando a un efectivo estado antiviral, lo que es determinante de virulencia, patogenicidad y letalidad.36

A pesar de las similitudes entre estas virosis ARN, también hay particularidades que marcan diferencias geográficas y epidemiológicas, incluso entre los virus más estrechamente relacionados. Por ejemplo miembros del mismo género y familia, como el caso de dengue y el virus de la fiebre amarilla (YFV) establecieron predominancia diferencial en ciclos de transmisión. Por ejemplo YFV ha establecido ciclos selváticos en América, pero está ausente en Asia, mientras que DV no se ha dispersado en ciclos selváticos en América pero si en África. Estas diferencias en el ciclo selvático, probablemente responden a disyunciones en la respuesta inmunitaria del hospedero, la competencia del vector y/o a la interacción entre las virosis, lo cual influye sobre su ecología, evolución propagación y entre humanos.37

Diagnóstico de infección por dengue

Hay dos tipos de diagnóstico de la exposición a dengue, uno refiere a los métodos directos, aislamiento, detección del genoma o antigénica viral), el otro a los métodos indirectos tale como las serologías IgM e IgG. En el orden en que se mencionaron varían de mayor grado a menor grado de especificidad de la prueba e inversamente varían en oportunidad de éxito de positividad después de ser infectado con DV. Las infecciones secundarias comúnmente se determinan alto títulos de IgG en relación a bajos o nulos títulos de IgM después de largos períodos de tiempo. La tabla a continuación presenta las pruebas diagnóstico y las ventajas y limitaciones de cada una de ellas.38 Tabla 2.

Tabla 2. Pruebas diagnóstico de la infección con dengue, ventajas y desventajas.

Prueba diagnóstica Ventajas Desventajas

Identificación por aislamiento viral

-Confirma infección -Específica -Identifica serotipos

-Requiere muestra de 0-5 días post Infección -Requiere experiencia - Toma más de una semana - No diferencia entre infección primaria o secundaria - Costosa

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Detección del ARN

-Confirma infección -Específica y sensible -Identifica serotipo y genotipo -Resultados de 24-48 horas

-Potencial falsos positivos por contaminación -Requiere muestra de 0-5 días post Infección - Requiere experiencia y equipamiento costoso -No diferencia entre infección primaria o secundaria

Detección antigénica

Especímenes clínicos (ensayo de NS1 en sangre)

-Confirma infección -Fácil de hacer -Menos costosa que el aislamiento viral o detección de ARN

-No es tan sencible como el aislamiento del virus o detección del ANR

Tejidos de casos fatales (ejemplo histoquímica) -Confirma infección

-No es tan sensible como el aislamiento del virus o detección del ANR

- Requiere experiencia en patología

Pruebas serológicas

Seroconversión IgM o IgG

-Confirma infección - La menos costosa - Fácil de hacer

-Los niveles de IgM pueden ser bajos en infecciones secundarias - Requiere confirmación en dos o más muestras - Pueden diferenciar infección primaria y secundaria

Detección de IgM

-Identifica casos probables de dengue -Muy usado, monitoreo de epidemias y efectividad de intervenciones

-Los niveles de IgM pueden ser bajos en infecciones secundarias

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Capitulo 2

Forma de transmisión (El vector) Efren Avendaño Tamayo

La especie Aedes aegypti del orden diptera, familia Culicidae, género Aedes, subgénero stigomiya, fue descubierta como vector de la fiebre Amarilla por Carlos Juan Finlay en 1881. Los virus dengue (DV) y fiebre amarilla (YFV) están estrechamente relacionados y comparten algunos aspectos de su historia natural; entre ellos se destaca que ambos arbovirus, flavivirus de la familia flaviviridae, comparten el mismo vector, Aedes aegypti, el cual para ambos es el principal agente transmisor,37 por esto son utilizados comúnmente en estas virosis los índices entomológicos para medir los esfuerzos de sobrevivencia del vector, llamados índices Stegomyia, la mayoría enfocados en las poblaciones inmaduras, lo cual podría ser desventajoso para calcular el riesgo real de transmisión, porque estos índices no pueden trasladarse directamente a las poblaciones adultas del vector y además porque muchos de ellos deberían considerar suficientes factores epidemiológicos, lo cual por ahora está limitado y es poco prometedor.39

EL virus dengue es la especie de flavivirus más ampliamente distribuida en todo el mundo, coincidiendo con las regiones donde sus vectores prosperan.29 A. aegypti es originario de África y se ha dispersado a través de los continentes sobre las zonas tropicales y subtropicales,40 entre las latitudes 35ºN y 35ºS,41 Figura 1, también hay otras especies que actúan como vectores potenciales, probablemente por la susceptibilidad diferencial de linajes del mosquito a DV, variando geográficamente. Linajes Africanos han mostrado baja susceptibilidad a DV-1, 2, 3 y 4 en ensayos de laboratorio.42 Esta reducción en la eficiencia de la transmisión explica en parte la baja prevalencia del dengue en Africa.

Los primeros indicios de la virulencia diferencial entre las virosis del dengue vienen desde las descripciones de los ciclos de transmisión en diferentes regiones geográficas.25 Existen dos distintos ciclos de transmisión: El primero es endémico / epidémico, el cual involucra el hospedero humano infectado virémico y la transmisión del virus a través de la saliva por de la picadura de la hembra infectada de A. aegypti, Aedes Albopictus y otros miembros de género a otro, o varios humanos.41 El segundo ciclo de transmisión selvático o zoonosis propia de habitantes selváticos de Africa y Malasia, involucran hospederos primates no humanos y diferentes mosquitos del género Aedes.25

Hay evidencia de una enorme variación en la susceptibilidad y eficiencia de la transmisión entre poblaciones geográficas de A. aegypti y A. Albopictus. Pese a

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que el vector secundario A. Albopictus se ha expandido dramáticamente en los últimos años,43 el vector primario A. aegypti ha reinfestado las regiones neotropicales ya que su erradicación a principio de siglo llevó a la reemergencia neutropical de dengue. En realidad los ciclos de transmisión merecen más estudio.

Figura 1. Dispersión global de A. aegypti.

Recurso: Karen A. Mangold 2013. Se indica el área comprendida entre las latitudes 35º Norte y 35º Sur.

En Africa, el DV-2 ha sido aislado desde Aedes (S.) africanus, Aedes (S.) leuteocephalus Aedes (S.) opok probablemente aislados de ciclos endemo/epidémicos y se cree son producto de distintos procesos evolutivos. En Malasia los cuatro serotipos son mantenidos por varias especies de mosquitos entre ellos Aedes niveus en primates no humanos; DV-1, 2 y 4 fueron aislados desde monos en los cuales se demostró seroconversión contra DV-1, 2 y 3. Estos hechos han sugerido que las diferencias en virulencia de los linajes del DV en sus distintos hospederos determinan ciclos de transmisión en diferentes regiones geográficas dependiendo de los vectores involucrados.31 De hecho hay evidencia de virosis de DV-2 analizadas genéticamente encontrando en ellas diferentes orígenes evolutivos.44 Estas virosis fueron transmitidas por vectores discretos (mosquitos habitando en el dosel), entre primates, y no han sido terminantemente implicadas como causa de las epidemias en las poblaciones humanas cercanas.25

Se desconoce cuando el A. aegypti comenzó a transmitir las virosis del dengue, no obstante análisis filogenético del DV-4, sugiere un origen del vector en África con la exportación de virus al hemisferio occidental hace aproximadamente 400 años, en múltiples eventos de introducción en asociación con la explotación de la trata de esclavos.45 La erradicación del vector en el hemisferio occidental se logró entre 1947-1970. Pero el uso de insecticidas como el TDT, llevó al deterioro de la salud

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pública, detectable en los programas de salud, desistiendo de esta forma de control llevando a un rápido restablecimiento del vector, asociado con el crecimiento poblacional, urbanización e importación de nuevas virosis del dengue.33 Además la globalización del comercio, en particular el comercio de neumáticos de vehículos usados, explica la dispersión de huevos y formas inmaduras de estos vectores de arbovirus en nuevos territorios,43 con disposición de sitios de cruzamiento como bidones metálicos, contenedores de reciclaje y contenedores de almacenamiento de agua doméstica.46

El secuenciamiento del genoma de A. aegypti, se logró en 2007,47 lo que ha permito el éxito en la identificación de genes para el desarrollo de linajes de insectos transgénicos con el potencial de prevenir la transmisión del dengue entre humanos.33 Específicamente se han intervenido genes involucrados en los procesos de reproducción y alimentación lo que eventualmente interrumpe la digestión de la sangre y las ovoposiciones. También se han visto como adecuados blancos génicos los controladores del vuelo en la hembra. El cruce de linajes silvestres con linajes de laboratorio ha afectado la sobrevivencia del vector y del virus en el mosquito.48 Además genes regulando la detoxificación por exposición a insecticidas han sido mapeados para fortalecer los esfuerzos de control,49 al igual que se han mapeado genes de olfato para desarrollar trampas y repelentes mejores y más efectivas como principal recurso de control en áreas endémicas.50

Estos esfuerzos por contralar la transmisión del virus dengue entre humanos se ha enfocado en el vector, usando algunos de los anteriormente mencionados recursos químicos y biológicos sobre el A. aegypti,51 sin embargo estos esfuerzos han fallado pues se ha documentado el incremento en la incidencia de las epidemias del dengue y expansión de su rango geográfico de transmisión endémica.52,53 Tal vez por la falta de interés en la inclusión de nuevas especies que sirven como vectores secundarios del dengue en los programas de control tales como A. Albupictus. A. Albupictus es originario del sudeste Asiático y fue reportado en América por primera vez en Texas, Estados Unidos desde 198554 y meses más tarde en Rio de Janeiro y Brasil,55 posteriormente su distribución se extendió a centro y suramérica incluyendo a Colombia.56 Figura 2.

A. albupictus, potencialmente puede servir como vector de mantenimiento de los serotipos del virus del dengue en zonas endémicas donde cohabita con A. aegypti, aumentando las posibilidades de que aparezcan nuevos focos de transmisión vertical.56, 57

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Figura 2. Distribución de A. albopictus en las Américas, 1985-2006.

Recurso: C.A. Morales. 2007. Se señala año y sitio del reporte.

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Capitulo 3

La epidemiología del dengue


Aunque la Organización Mundial de la Salud estima de 50-100 millones de infecciones por año,51 existe nueva y abundante evidencia que sugiere esta cifra puede ser sustancialmente mayor. Recientemente se colectó información de varios estudios realizados entre 1985-2010, de las tasas de las formas clínicas leve, severa y muerte por dengue y se estimó en promedio la ocurrencia de aparentemente 96 millones de infecciones anualmente en todo el mundo con un rango que puede variar entre 100-200 millones, pero inaparentemente podrían ser más de 400 millones/año.53

Aparentemente para 2010 hubo grandes diferencias continentales en la distribución del número de infecciones anuales. En primer lugar resultó Asia con 66.8 millones (intervalo de confianza 47.0-94.4 millones); en segundo y tercer lugar Africa y América con 15.7 (10.5-22.5) y 13.3 (9.5-18.5) millones respectivamente, finalmente en el último lugar Oceanía con 0.18 (67.1-135.6) millones de infecciones anuales.53

Dengue es endémico en todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo excepto en Europa,41 ha sido dispersada eficientemente por sus vectores que se cruzan en los trópicos y subtrópicos del mundo principalmente por su vector primario Aedes aegypti adaptado a zonas urbanas.43 La densidad poblacional de los vectores incrementa con la endemicidad facilitada por la rápida urbanización que provee de abundantes sitios de cría en comunidades urbanas en crecimiento.43

La Figura 1 muestra que la transmisión ocurre en todos los trópicos, pero las zonas de mayor riesgo son Asia y América (Figura 1-b). En el continente Americano después de Brasil, son Colombia y México los países que más aportan al número de infecciones anuales (Figura 1-c).53

Las epidemias de enfermedades tipo dengue en América han sido recurrentes desde principios del siglo XVII, pero el primer caso epidémico fue reportado en 1635 en las Islas del Caribe (Guadalupe y Martinica); en 1970 Benjamin Rush describió la eipidemia de dengue en Filadelfia, a la cual le dio el nombre de quiebra huesos.33 Desde entonces el número de infecciones ha ido en aumento a gran escala y en 1980 incrementó en 4.5 veces solo en América.58 Desde entonces ha incrementado el número de casos e incidencia Figura 2.59

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El continente Africano resalta porque a pesar de presentar relativamente áreas de poco número de infecciones (Figura 1-c) y baja o nula probabilidad de ocurrencia

Figura 1. Incidencia del dengue en países y continentes del mundo. 1985-2010.

Recurso: Samir Bhatt 2013. a. Presencia/ausencia de DV b. Probabilidad de ocurrencia de dengue c. Número de infecciones anuales.

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del dengue (Figura 1-b), tiene áreas de moderadas, buenas y en muchos casos completa presencia del virus dengue (Figura 1-a).53 Esto sugiere que los humanos Africanos podrían tener susceptibilidad diferencial a la infección, al igual que al desarrollo de la enfermedad del dengue con influencia de otros factores epidemiológicos, tales como el clima; en el mismo estudio se encontró que altos niveles de precipitación y temperatura, favorecieron la transmisión, asociados a elevado riesgo de ocurrencia de dengue.53 Esto sugiere la importancia del clima en su transmisión.

Figura 2. Incidencia de dengue en America, 1980-2010

Recurso: Olivia Brathwaite Dick, 2012. Tasa de incidencia x 100.000

El cambio climático puede afectar tanto a las virosis de DV, así como a las poblaciones de sus vectores.60 La temperatura en el vector influencia las tasas de desarrollo, mortalidad y comportamiento61 y la replicación viral dentro del mosquito.62 Las variaciones en la precipitación altera el hábitat de las larvas y pupas de A. aegypti y A. albopictus. Además la temperatura interactúa con el régimen de lluvias regulando la evaporación y por ende la viabilidad de los hábitats, lo cual junto con humedad relativa determina el uso de la tierra modulando el crecimiento de las poblaciones del vector.60 A pesar de que la relaciones causales entre condiciones climáticas, vectores del DV e incidencia de la enfermedad, no han sido dilucidadas completamente, se sugiere empíricamente que están relacionadas, lo cual limita evaluar las estrategias de intervención.60

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Se sabe también que no solo el factor climático puede influir sobre la ecología del dengue, pues están incluidos los factores humanos, como el comportamiento, uso del suelo, su intervención en el disminución de la vegetación, así como la inmunidad, los factores económicos y sociales, pueden influir en la incidencia.60 Además el trasporte de mosquitos y el incremento de viajeros viremicos entre países y las estrategias fallidas de control soportan la pandemia en la era moderna.43

La edad del hospedero ha mostrado ser clave de la vulnerabilidad a la infección con dengue.63 Aunque la situación en la mayoría de los países Asiáticos demostró una predominante infección primaria en población pediátrica, en América predomina en adultos,33 esto permite pensar que la infección secundaria en países Americanos podría tener un papel influyente sobre la presentación de formas severas del dengue en niños, lo que sería congruente con un reciente incremento en los reportes de menores con la forma clínica severa del dengue;33 en otras poblaciones la forma leve del dengue ha sido frecuentemente asociada con grupos jóvenes y se ha observado que la incidencia de la forma severa es más frecuente en adultos mayores.64 Estos resultados demuestran la variabilidad de la severidad en el curso de la infección con dengue de acuerdo a grupos etarios.

Hay estudios que plantean que la raza del hospedero es un factor que puede modular la resistencia/susceptibilidad a la infección del dengue. Algunos de estos afirman que los pacientes negros son más resistentes.63 Estudiando la epidemia de 1981 en Cuba se encontró que los blancos fueron mucho más susceptibles tanto a la infección, como a la severidad en el curso de dengue, además a la presentación de casos fatales; los individuos negros estuvieron sub-representados en todos los grupos comparados.65 En los Ángeles durante la epidemia de 1998 fueron reportados pacientes solo de ascendencia hispánica y blancos y se sugirió las variantes en genes de citoquinas y proteínas involucradas en los mecanismos de coagulación como potenciales causas de la resistencia en individuos negroides.64 Además recientemente se han revisado otros estudios que sugieren que las personas con elevado componente Africano en su grado de Mezcla genética ancestral, son menos susceptibles a las manifestaciones severas de la infección con dengue.66, 67

Los genotipos en genes del sistema inmune, la historia de exposición a dengue, al igual el género del hospedero parecen ayudar a configurar la severidad de la infección.66 En hembras son más comunes las formas severas y la muerte por dengue. En un estudio realizado en tres hospitales Asiáticos se encontró en una cohorte de dengue que las mujeres estaban sobre-representadas en los casos fatales, tasa de Odd (OR)=1.57 y las formas severas (OR=1.19), diferencias que fueron atribuidas al comportamiento por presentarse más tarde a la búsqueda de cuidados de salud que los hombres, sin embargo no se descarta que estas diferencia se deban a particularidades de los géneros en fisiopatología y/o inmunológía.68

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Capitulo 4

Panorama del dengue en Colombia


Después de la re-infestación de varias áreas de América por A. aegypti en los 70s, se registró en 1971 la primera epidemia de dengue en Colombia, país donde hay departamentos, ciudades y municipios con características ambientales y sociales propicias para la transmisión.39 En dicho país no solo se ha reportado la presencia del vector primario A. aegypti, sino también la presencia del vector secundario A. albopictus en varios municipios y departamentos de Colombia donde continúa incrementando su abundancia poblacional,56, 69 confirmando su gran potencial como vector.

Desde 1971 en Colombia fue común el reporte de las formas leves de la enfermedad, hasta diciembre de 1989, cuando en el municipio de Puerto Berrío, ubicado en el departamento de Antioquia, se reportó el primer caso confirmado de la forma severa de la enfermedad llamada dengue hemorrágico (esta clasificación se describirá con mayor detalle en el siguiente capítulo), convirtiéndose en endémica y rápidamente aumentaron los casos letales durante los años siguientes.70

Históricamente, Colombia es uno de los países con mayor número de epidemias en América, de hecho de acuerdo al Ministerio de Salud en 2006, hubo 31.362 casos reportados de dengue febril y 5.379 de dengue hemorrágico, mientras circulaban en este año los DV-1,2,3 y 4.71

De acuerdo a la Organización Panamericana de la Salud, entre 2001-2007, de los países Andinos (subregión que compromete a Bolivia, Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela), Colombia tuvo el mayor número de casos de dengue (81%) y casos de muerte (73%).72

Recientemente se estimó que desde 1985-2010 ocurren en Colombia en promedio 1-1.5 millones de infecciones anuales, ocupando el tercer lugar en las Américas después de Brasil y México. En ese mismo estudio Colombia resultó tener una de las mayores probabilidades de ocurrencia de dengue al interior de casi todo su territorio nacional y una completa presencia del virus en todo el país.53

Los reportes epidemiológicos semanales del consolidado de casos reportados en todos los departamentos y ciudades del país generados desde el sistema de vigilancia en Salud Pública del Instituto Nacional de Salud Colombiano, sugieren

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que la incidencia de los casos leves y severos de dengue, desde 1995-2011 y 1997-2011 respectivamente, se caracterizan por fuertes fluctuaciones Figura 1.72 Donde evidentemente resalta el año 2010.

Según comunicados del Instituto Nacional de Salud en 2010 ocurrió una de las más grandes epidemias de dengue, la cual registró 157,152 casos notificados y 217 muertes confirmadas en su mayoría causados por DV-2. DV-2 es uno de los serotipos más comunes circulando en Colombia desde 80s comparados con otros

Figura 1. Número de casos reportados de dengue febril y dengue hemorrágico en Colombia

Recurso: Claudia Torres 2014. Time [años]. Forma clínica leve a: dengue febril, forma clínica severa b: dengue hemorrágico.

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serotipos desde la emergencia de la forma severa.70 Mendez sugirió en 2012 específicamente la presencia del DV-2 genotipo Americano subtipo V y estimó su circulación en Colombia desde hace 21 años, antes que el el subtipo IIIb Asiático/Americano lo reemplazara, lo que coincide con la emergencia de la forma clínica severa debida a la virulencia potenciada que caracteriza este genotipo viral, el cual entró a Colombia probablemente desde Perú a través de la región Amazónica. En relación a esto se ha sugerido que se requieren más estudios para generar marcadores patogénicos virales para determinar su relación con nuevos signos atípicos del dengue como tropismo visceral o encefalitis, que vienen aumentando en los países hiperendémicos como Colombia y sus vecinos en América.70

Esta evolución a formas severas de la enfermedad ya había sido estudiada en Colombia y a pesar de que se atribuye a los mecanismos inmuno-patogénicos, también se ha reconocido que estos son poco claros y necesitan más investigación. Estudiando niños Colombianos con origen en la ciudad de Neiva, ubicada en el departamento del Huila, fueron comparados aquellos diagnosticados con la forma clínica leve con la severa, encontrando patrones de expresión génica diferencial entre los dos grupos de pacientes, brindando nuevas claves sobre los mecanismos que conducen a la enfermedad grave. Los pacientes con fiebre hemorrágica expresaron transcritos para mediadores inflamatorios e inhibidores de linfocitos e interacciones con genes centrales de coagulación y los pacientes con la forma leve, fiebre del dengue, expresaron inhibidores de inflamación.73

En Colombia han sido realizados estudios que intentan aclarar como el desarrollo del vector influye en la transmisión del dengue en este País.74 Muchos de estos estudios aportaron al desarrollo de herramientas y estrategias enfocadas en la relación de la comunidad con las poblaciones del vector, en sus urbanizaciones (vecindades y sus alrededores en espacios privados y públicos)75 para dilucidar tanto las más adecuadas formas de intervención en el control, así como para fortalecer el entendiendo de la dinámica del vector. Sin embargo en estos temas queda mucho por explorar. Comparando simultáneamente áreas de México (Acapulco), Colombia (Girardot), Ecuador (Machala), Brasil (Fortaleza) y Uruguay (Salto) desde 2010-2011 se encontraron varias particularidades en Colombia. Por ejemplo, en las áreas epidémicas de dengue hubo una fuerte tendencia en las personas al almacenamiento de agua con usual manejo doméstico destinado a limpieza, lo cual promovió la producción de mosquitos de A. aegypti probablemente por la poca frecuencia del lavado de tanques, los cuales en muchos casos llenos de agua de lluvia produjeron pupas; particularmente los tanques de cemento produjeron el 70% de las pupas en ambos periodos (seco y de lluvia). Lo que indicó la necesidad de dirigir las campañas de control a los tipos de contenedores. El 95% de las personas contestó que no hace nada para practicar la eliminación de los mosquitos del dengue, sin embargo el 80-93% saben que el dengue es transmitido por el mosquito, además 52-59% han visto larvas en el agua. La protección personal incluyó aerosoles de insecticidas y limpieza de basuras, solo el 16% cubre sus contenedores de agua, lo que explica porque estuvieron llenos con mayor frecuencia en los períodos de lluvias que en los periodos secos. El volumen de

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agua en los contenedores fue mayor en Colombia (1162 L) que los demás países (100-327 L), el 100% de las pupas de A. aegypti eclosionaron en laboratorio. Colombia tuvo junto con Ecuador los más altos índices del vector, los más altos índices entomológicos y más períodos de lluvia.76 Algunos de éstos resultados son consistentes con estudios previos, algunas variables climáticas como temperatura, humedad relativa y pluviosidad ya había mostrado asociación con la transmisión del dengue en otros municipios de Colombia como Montería.77

Según reportes del Ministerio de Protección Social del año 2012, en Colombia las estrategias de control durante las epidemias se ha enfocado en la aplicación de volúmenes extremadamente bajos de insecticidas en las casas alrededor de casos reportados de dengue severo y sobre las calles de las vecindades más afectadas, junto con campañas comunitarias para promover la remoción de contenedores inutilizados en y alrededor de las casas; los contenedores no removidos son tratados con larvicidas (Temephos). A pesar del control vectorial la transmisión del dengue no decreció en el país. Esta falla en el control vectorial pudo deberse a variaciones locales ambientales y epidemiológicas.69 De hecho en algunas ciudades de Colomiba tales como Cútuta el insecticida Temephos fue usado por varias décadas para el control larval hasta que aparecieron reportes de resistencia, esta resistencia fue atribuida a los mecanismos metabólicos que involucran enzimas claves de detoxificación de xenobióticos identificadas como potenciales de estudio en el futuro para el diseño de estrategias de control manejando la resistencia a insecticidas.78 Algunas enzimas tales como glutatión S-transferasa (GST), citocromo mono-oxigenasa P450 (CYP450) y carboxilesterasa (CE) han sido asociados con resistencia a temephos en A. aegypti.79 Esta resistencia se atribuye a mutaciones en los genes que codifican estas enzimas y a pesar de no haberse observado contundentemente en A. aegypti, ya se ha probado en otras especies como Culex pipiens y Anopheles gambiae.80 Recientemente comparando linajes de A. eegypti, tanto referentes como en poblaciones de mosquitos de Cúcuta, logró observarse resistencia diferencial a insecticidas relacionadas con genotipos en genes de este tipo de enzimas y fueron correlacionados con sobrevivencia a Temphos y otros insecticidas. Estos resultados son evidencia de linajes resistentes a insecticidas prosperando en Colombia y proveen nuevas claves en el entendimiento de los mecanismos que llevan a resistencia a insecticidas en este importante vector de la enfermedad del dengue.78

Las poblaciones de adultos del vector se han contralado en Colombia mediante aspersiones con otros insecticidas químicos, por ejemplo el organofosforado malatión, el cual ha sido el más utilizado en el país desde los 80s,81 seguido de piretroides como lambdacialotrina y deltametrina. Sin embargo la aparición de la resistencia en una de las causas del fracaso del control de vectores en Colombia.82 Los registros de resistencia de A. aegypti a malatión en Colombia ya han sido reportados en municipios del departamento de Antioquia82 y según Rojas W y colaboradores en 2003 en Barrancabermeja.

De acuerdo al Sistema de Vigilancia Nacional en Salud Pública en Colombia para la semana 44 del año 2012 se habían notificado 43.845 casos totales de dengue, lo

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cual aumentó en 151% para la misma semana (44) del año siguiente (2013, 110.036 casos totales de dengue). En 2013 de los casos totales el 97% correspondieron a la forma clínica leve, dengue febril y el 2.5% a la forma severa, dengue grave. La población en riesgo comprendió toda la población urbana del país.

De acuerdo al Ministerio de Salud, la reemergencia e intensa transmisión viral con tendencia creciente a la hiperendemia en 2013 puede deberse entre otros factores epidemiológicos a altas tasa de infestación por Aedes aegypti de más del 90% del territorio nacional por debajo de los 2.200 m.s.n.m, lo cual pone en riesgo a más de 25 millones de personas78 y a la circularon de cuatro serotipos DV-1, 2, 3 y 4, circulación que puede variar semana a semana en algunos departamentos Figura 2.

Figura 2. Circulación de serotipos en Colombia, semana 44 y semana 45, 2013.

Recurso: Laboratorio de virología – Instituto Nacional de Salud. Izquierda: semana 44, derecha: semana 45.

Es de notar que a mediados del año 2013 (semana 23) ya habían 81 municipios en brote con origen en 22 entes territoriales; para ese momento 110 municipios estaban presentando las notificaciones del aumento en el número de casos, según lo reportó el grupo de Enfermedades Transmitidas por Vectores Figura 3-izquierda. Con una letalidad estimada en 5.6% con los reportes de muertes confirmadas por las unidades de análisis (entomología, epidemiología, patología y virología). Ya para la semana 44 habían 75 municipios en brote procedentes de 25 entes

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territoriales y 100 municipios presentaban notificaciones del aumento en el número de casos, trasladándose en algunos casos los brotes y las alarmas a otras áreas del país. Figura 3-derecha.

Según el grupo de Enfermedades Transmitidas por Vectores el departamento de Antioquia se encontró entre los 10 departamentos que aportaron el 75.2% de los casos de dengue en Colombia para diciembre de 2012. Para este período en Colombia se registraba una letalidad del 3.9 %.

En el centro del departamento de Antioquia en Colombia, se encuentra el Área Metropolitana de Medellín ubicada en el Valle de Aburrá, que comprende varias ciudades con características sociales y ambientales que permiten la transmisión del dengue, entre ellas el municipio de Bello, donde se han realizados estudios entomológicos que contribuyeron al desarrollo e implementación de herramientas para la predicción de hábitats del mosquito en espacio y tiempo definidos, mostrando su correlación con la distribución de los picos en tasas de casos de dengue. Esta región es interesante particularmente por que es altamente endémica y han circulado los cuatro serotipos de dengue en los últimos años.39 Otros municipios vecinos han sido objeto de estudios similares (Medellín e Itaguí) generando modelos de nicho ecológico con buenas predicciones de lugares con condiciones ecológicas más adecuadas (Medellín y Bello) que otras (Itaguí) para presentar epidemias de dengue. Esto es congruente con la reconocida endemicidad del dengue en Medellín y Bello comparados con Itaguí, localidad que ha presentado casos esporádicos. Figura 483

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Figura 3 Distribución de municipios en situación de alarma y brote de dengue a semana 23 y 44, 2013.

Recurso: Sistema de Vigilancia Nacional en Salud Pública en Colombia, grupo de Enfermedades Transmitidas por Vectores. Izquierda: Semana 24, Derecha: semana 44.

Pacientes Colombianos con origen en el departamento de Antioquia, han sido comparados con pacientes del departamento del Chocó, los cuales fueron clasificados todos de acuerdo a su raza en Afro-Colombianos y Mestizos basados en características del cabello, la cara y el color de piel. Se encontró diferencias en la respuesta inmune a la infección por el DV entre grupos étnicos; por ejemplo la mayor producción de la enzima acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas (AH-FAP) fue en los pacientes Afro-colombianos. Lo que es congruente con el papel protector de esta enzima en el desarrollo de formas graves del dengue. Sin embargo la complejidad de la respuesta inmunitaria limitó la interpretación de los resultados, lo que hace necesario plantear nuevos proyectos para determinar la frecuencia de las variantes génicas relacionadas con la producción de los productos génicos que intervienen en las diferencias fisiopatológicas del dengue entre grupos étnicos.84

Estas diferencias epidemiológicas como la raza ya habían sido exploradas según las formas clínicas, encontrando efecto diferencia de las citoquinas, por ejemplo TNFA fue altamente producida tanto en los pacientes Afro-Colombianos diagnosticados con la forma clínica leve como en la severa e IL6 en la forma severa71 (dengue hemorrágico, ver siguiente capítulo), lo cual es congruente con

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los resultados de Blanton y otros,85 quienes reportaron etnicidad Afro-Brasilera y componente genético ancestral Africano, como factores de protección, por predisponer a mayor respuesta antiviral de células T CD4 que los Caucásicos americanos entre pacientes infectados crónicamente con HCV. Estos resultados sugirieron que el componente genético ancestral podría estar asociado con la respuesta inmune variable a la infección con DV en humanos.71 Figura 4. Mapa de Colombia mostrando a Bello, Medellín e Itaguí, con la ocurrencia de casos de dengue.

Recurso: Arboleda 2008. Bello está dividido en cuadrantes. Noroeste-sureste:

triángulos en líneas discontinuas; noreste al sudoeste: círculos en líneas continuas.

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Capitulo 5

Fisiopatología del dengue


Dengue es una enfermedad febril aguda causada por la infección con el virus dengue (DENV) 51. No hay vacuna o tratamiento terapéutico, ni control del vector, que pare la rápida dispersión en regiones Asió-pacificas, Africanas y Americanas41,

53 Dengue es frecuente en Colombia y otros países circundantes en América86 La Organización Mundial Salud estima de 50-100 millones de infecciones por año en el mundo,51 de las cuales ocurren ~1.5 millones en Colombia, país donde hay una completa presencia del virus y una de las más altas probabilidades de ocurrencia de la enfermedad.53 Según reporte del Instituto nacional de salud en Colombia durante las tres primeras semanas del año 2013 se registraron 4100 casos de dengue declarándolo como un país en zona de epidemia, cifra que resulta ser alta comparada con las reportadas para las mismas semanas de los dos años anteriores. Los infectados sintomáticos pueden ser diagnosticados con un auto-limitado dengue febril (DF) cuando hay fiebre aguda 2-7 días acompañada de dos o más manifestaciones hemorrágicas menores (hemorragia gingival y/o petequias) y/o manifestaciones de dolor (dolor de cabeza, retro-orbital, mialgia o artralgia). Con dengue hemorrágico febril (DHF) si hay fiebre muy alta, tendencia a hemorragia severa, hepatomegalia o evidencia de extravasación (Trombocitopenia y/o derrame pleural). Y con DHF/síndrome del choque por dengue (SCD) si hay alteración homeostática caracterizada por la in-detección del pulso cardiaco antes de muerte.51, 87 El DHF está además clasificado dentro de 4 grados de acuerdo a la severidad de los sangrados y la extravasación de plasma. El SCD refiere a los grados III y IV.87 DENV pertenece al género flavivirus, es una cadena simple de acido ribonucleico viral en sentido positivo (ssRNAv+) transmita entre humanos por la picadura de mosquitos infectados del género Aedes.88 Se han identificado cuatro serotipos DENV1-4.88 Su genoma comprende 11kb y codifica una poliproteína para producción por clivaje con NS2B y proteasas del hospedero, las proteínas estructurales como cápside (C), membrana (M), envoltura (E), junto con NS1 y otras proteínas no estructurales (NSs).89 El diagnóstico de infección por dengue puede realizarse a través de métodos de laboratorio directos como son el aislamiento viral y las detecciones tanto de su

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genoma como de sus antígenos e indirectos como las serologías IgM e IgG. Todos estos métodos en el orden en que se mencionaron aquí disminuyen en especificidad y aumentan en practicidad.38 Tanto los mecanismos de infección con DENV como los de progresión de DF a DHF/SCH son poco claros, pero se sabe de factores virales interactuando con productos genéticos del hospedero desafiando el sistema inmune.90 Entre los factores virales se destacan la virulencia del serotipo infectante, la infección secuencial con serotipos diferentes, tropismo tisular, de tejido y la carga viral.90-92 La respuesta inmune del hospedero involucra el potenciamiento de la infección dependiendo de anticuerpos preexistentes, estado autoinmune y las respuestas inmunes innata y celular.88, 93 También han sido asociados otros factores como los intervalos entre infecciones, la edad, la etnia y la composición genética humana. 88,

91 El sistema inmune innato es la primera línea de defensa inmunológica y responde inmediatamente con mecanismos protectores. Lo que involucra receptores proteicos para el reconocimiento viral sobre células del sistema inmune innato (Monocitos, macrófagos, células dendríticas y asesinas naturales NK). El éxito de la infección depende de la cinética de la respuesta inmune del hospedero, lo que incluye inducción de la producción de interferon tipo I, apoptosis y autofagia.4 Hay evidencia de variación en los niveles de viremia. Un estudio previo evaluó los títulos DENV y fueron mayores en los casos de DHF comparado con casos de DF,87 además los pacientes con DHF han sido correlacionados con infecciones secundarias.51, 88, 94 La epidemiología de dengue sugiere que los receptores celulares unidos a DENV directa (receptores connatos como molécula de adhesión intercelular específica de célula dendrítica para acoplar no integrina tres llamada CD209) e indirectamente (receptores Fc-γ de las inmunoglobulinas Gs) son internalizados vía endocitosis y activan sus vías de señalización95 para la producción de mediadores solubles que modifican la adherencia conduciendo el tropismo celular y de tejido.96 Involucrando la permeabilidad vascular y la extravasación de plasma.97 Las células dendríticas98 son una de las primeras poblaciones invadidas por DENV a través DC209, receptor que pertenece a la familia de receptores lectina tipo C (CLRs)90 su señalización incluye producción de citokinas pro-inflamatorias.99, 100 Estas células ligan la inmunidad innata y adaptativa siendo claves para una respuesta inmune efectiva.97 Las células detríticas infectadas con DENV migran a órganos linfoides para la presentación antigénica a células T. Una vez comenzado el proceso inflamatorio no solo secretan citoquinas inflamatorias si no también quimoquinas tales como IL-8 y la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP1) también conocida como CCL2 las cuales han sido vistas elevadas en pacientes infectados con DENV y pueden estar relacionadas con las manifestaciones clínicas severas como DHF.101 Pues ha

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sido observado antes que MCP1 puede participar en la patogénesis de la extravasación de plasma por su capacidad de reducir las uniones estrechas endoteliales.102 Recientemente surgió evidencia que sustenta que las células dendríticas infectadas con DENV incrementan los niveles del receptor de quimoquinas CC tipo 7 (CCR7) mimbro de la familia de proteínas acopladas a proteínas G y crítico buscador de blancos linfoides sobre las superficies celulares. En éste sentido la inhibición de la migración de células dendríticas a nodos linfoides es debida a la regulación negativa de CCR7 sobre su superficie, este evento puede estar correlacionado con la regulación negativa de la vía del factor nuclear kappa B (NFkB).101 La fosfoinosítido fosfolipasa C epsilon 1 (PLCE1) puede inducir actividad kinasa en la vía de proteínas acopladas y proteínas G. PLC1 es una isoenzima humana que cataliza la hidrólisis de polyfosfoinositídicos como el PtdIns (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) para generar segundos mensajeros y diacilglicerol conduciendo el crecimiento celular, diferenciación y expresión genética. PLCE1 está asociada con síndrome nefrítico y dado que la fuga de plasma, proteinuria e hipovolemia son rasgos de dengue severo, es probable que el síndrome nefrítico comparta los procesos fisiopatológicos de dengue. Además hay datos que han implicado a PLCE1 en la regulación homeostática de la presión sanguíenea.103 CD209 también puede ser expresado sobre plaquetas y une DENV lo cual ha sido involucrado con la producción de proteínas solubles en plasma capaces de alterar la adherencia de plaquetas afectando la coagulación. Anticuerpos anti-plaquetas o plaquetas asociadas a anticuerpos han sido detectadas en algunos pacientes con reactividad cruzada de antígenos plaquetarios104 induciendo apoptosis.96 Hay evidencia de la interferencia de la fribrinólisis por auto-anticuerpos inducidos por DENV.105 El dominio intracelular de CD209 conduce la activación de la señalización de las proteínas de reconocimientos de patrones asociados a patógenos (PPRAs) tales como los receptores tipo tol (TLR).90 Los TLRs median el inicio de la respuesta inmune innata efectora y activan mecanismos de protección.106 La activación de TLR3 inhibe la replicación de DENV en monocitos in vitro, indicando su potencial antiviral hacia DENV respondiendo con interferon tipo I vía NFkB.106-108 TLR3 reconoce RNAs de cadena doble (dsRNA) y DENV es una ssRNAv+ pero la replicación de DENV depende de conformación de dsRNAv intermedios esenciales para producir su progenie.87 Esta unión dispara la maduración y presentación antigénica viral sobre el complejo mayor de histo-compatibilidad clase I (HLA-I), estimulando la respuesta de células efectoras T CD8+.109 TLR3 ha sido co-localizado con DENV al interior de células dendríticas in vitro110 y se ha detectado aumentado en respuesta a infección con DENV en varios estudios.107 Comparando pacientes DENV infectados con controles saludables se observaron elevados niveles de expresión de TLR3,106 en

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contraste se detectaron disminuidos en otras células mono-nucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de pacientes con DHF contrastados con DF.106 El polipeptido B relacionado con el no clásico HLA-I (MICB) está asociado con la progresión a DHF. Esta proteína se expresa principalmente en el epitelio intestinal sobre la superficie celular y conduce la inducción de la actividad cito-lítica de células NK, células T alfa-beta y gama-delta, lo cual podría regular el desarrollo de los sintomáticos DF y DHF.111 Los DENV en forma de dsRNAv+ son también reconocidos por otros sensores PPRAs como es el caso del gen inducible de ácido retinoico (RIG-1) el cual es un receptor tipo RIG-1 (RLR). La interacción de RLRs y los RNA virales median la activación de los factores reguladores de interferon (IRF) a través de la señalización de la vía no clásica quinasa IKKE (IKBKE) y la clásica IKK, resultando en la expresión de interferones tipo I y activación de NFkB respectivamente,112 cargando la expresión de citoquinas y quimoquinas proinflamatorias como IL6 e IL8 respectivamente, en respuesta a la activación de la vía JAK/STAT desencadenada por la unión de interferones tipo I al receptor alfa del INF (INFAR).112, 113 Estableciendo en las célula un estado antiviral.112 Recientes estudios demuestran que miembros de la vía JAK/STAT están involucrados con la regulación positiva del factor estimulador de colonias CSF-3, glicoproteína que estimula la producción de granulocitos, esta citoquina tiene potencial uso terapéutico.114 CSF-3 ha resultado con niveles significativamente bajos en infecciones secundarias de DENV, además correlacionó con la ocurrencia de leucopenia y neutropenia en casos de dengue.115 Hace poco fueron descritos otros sensores de patógenos intracelulares tales como la familia de moléculas con dominios de oligomerización ricas en nucleótidos de leucina NOD1 y NOD2 los cuales al igual que los TLRs perteneces a las PPRAs, y pueden inducir respuestas protectoras. Estos receptores tipo NOD (NLRs) pueden unir ssRNA viral116 y activar la señalización vía NFkB para activar la respuesta inflamatoria a través de la capasa1, estimulando la producción de citokinas proinflamatorias como IL1B e inducción de apoptosis generando una respuesta inmune adaptativa efectiva.116 Esta respuesta inflamatoria es potenciada por la simultánea secreción de IL-18 principalmente por macrófagos expresando NLRs, RLRs y/o TLRs. La activación de TLRs y CLRs inducen piroptosis que puede incluir daño tisular en respuesta a la secreción de IL-17, activando células T ayudadoras Th17 lo cual tiene un papel crítico en el inflamosoma durante la fase aguda y crónica.117 Un estudio realizado en 2008 mostró que la respuesta inmune a la infección con DENV con resultado clínico severo reguló negativamente las citokinas asociadas con la vía NF-kB como lo son NF-kB1 y TNFA, correlacionando con resultados adversos tales como el derrame pleural y manifestaciones hemorrágicas, al igual que otras moléculas de la misma vía.118

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Otros daños graves ocurren en las células del hígado y han sido observados en pacientes con infección con DENV. Además en ensayos de infección con DENV in vitro e in vivo han sido observados células hepáticas entradas en apoptosis y se han afectado tanto las vías de receptores de muerte celular así como vías mitocondriales apoptóticas. Esto en parte por la señalización a través del (TRAIL) receptor ligando del factor de necrosis tumoral (TNFA) induciendo apoptosis el cual interactúa a través del dominio citoplasmático con la proteína de interacción con receptores kinasa 2 (RIPK2), la cual contiene al igual que NOD1 y NOD2 un dominio central de unión a CARD (dominio de reclutamiento de caspasas) activando la caspasa 1 y la respuesta vía NFKB conduciendo la apoptosis y autofagia.119 TRAIL también es expresado por células dendríticas y se puede encontrar soluble.97 Anticuerpos preexistentes causan rápida inmuno-patogenesis en un mecanismo conocido como ADE (antibody dependent enhancement).96 Se potencia la infección 4, 88, 91 debido a un reto inmune secundario promoviendo complejos DENV-anticuerpo con afinidad por los receptores sobre células dendríticas, macrófagos y linfocitos-B, desencadenando la respuesta de células T seguido de la tormenta de citoquinas como Interleuquina ocho (IL-8) y regulación positiva potenciada de IL-6.96, 106 Las citoquinas tienen un papel importante en la inmuno-patogénesis de dengue. Varias citoquinas han sido asociadas a dengue.94, 120 En general estos estudios muestran elevados niveles de algunas citoquinas las cuales pueden tener valor pronóstico a la severidad de la enfermedad. Se ha observado niveles de citoquinas afectando la coagulación y la tendencia a tener nivel más alto en DHF comparado con DF.121 La activación masiva de céculas T, macrófagos y mocitos precede a la producción de citoquinas en grandes cantidades lo cual causa disfunción celular e incremento de la permeabilidad vascular asociada a la extravasación de plasma.94 Los estudios de perfiles de citoquinas en muestras de suero de pacientes con DHF comparados con DF han mostrado producción de TNF-α, IL-6 e INF-γ y otras moléculas tales como IL-10, IL-1B, IL-4 y MIF. 94, 122 En particular IL-6, IL-10 y MIF se han encontrado elevadas en individuos fallecidos con dengue.94 IL-6 desencadena la inflamación, activa un amplio rango de células 123 e induce moléculas antiinflamatorias tales como IL6R y una iso-forma soluble de su receptor (sIL-6R), el cual es expresado por neutrófilos 124 y células T-CD4.123 sIL6R puede inducir la expresión de moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1) en células endoteliales 125 estudios previos sugieren las células endoteliales activadas vía ICAM-1 por el complejo NS1-anticuerpo están asociadas a rasgos autoinmunes.90,

99 Se ha observado pacientes con enfermedades autoinmunes con alta persistencia clínica de la infección por DENV.96 Hay citoquinas expresadas por células T en particular CD4+ dentro del desarrollo de células ayudadoras (Th1) y (Th2). Las Th1 producen INF-y, TNFA e IL-12. Las

40

células Th2 producen IL-4, IL-6, e IL-10. La regulación cruzada de su expresión es necesaria para asegurar una homeostasis normal. Sin embargo bajo algunas condiciones el exceso de algunas de ellas conducen la permeabilidad vascular y la severa extravasación de plasma vista en DHF.126 Tanto las citoquinas así como los receptores de citoquinas tales como IL-4R están intrínsecamente ligados a la generación y regulación de la respuesta inmune adaptativa.127 El sistema del complemento es un componente del sistema inmune innato que protege contra la patogénesis de la infección con DENV. La vía clásica es activada a través de la unión del componente uno del complemento C1q a complejos antígeno-anticuerpo, la vía lectina involucra el reconocimiento de carbohidratos sobre los patógenos por la lectina de unión a manosa (MBL), y la vía alternativa por la hidrólisis directa de C3 sobre la superficie de patógenos. Experimentos con modelos de pérdida de función para varias proteínas del complemento demostraron que la vía de MBL es crítica para la neutralización de DENV2 en líneas celulares derivadas de insectos y mamíferos. Además concentraciones elevadas de MBL en suero humano ha correlacionado positivamente con la actividad neutralizante de DENV2.93 Menos del 2% de las personas infectadas desarrollan DHF comparado con DF. Lo que sugiere pueden estar involucrados los factores genéticos del hospedero. De hecho hay ausencia de DHF/SCH en poblaciones hiperendémicas para la transmisión de todos los serotipos virales en Haití. Como este caso, África donde no se reportan casos de DHF/SCD y en cuba durante la epidemia de DENV la subpoblación de Afro-Colombianos requirió menos hospitalizaciones.128 El control de la expresión genética es importante para entender las diferencias individuales en la susceptibilidad genética a la patogénesis de la progresión a DHF. La expresión de TNF, INF e IL6 fueron mayores en DHF comparado con DF. Pero en diferentes poblaciones ha resultado en la coexpresión de grupos de diferentes RNAs, en respuesta a la infección con DENV.92, 107 Pese a haber 30.000 genes humanos más de 41.000 cambios en el transcriptoma del hospedero fueron observados en respuesta a infección con DENV. Esto sugiere mecanismos muy específicos de regulación de corte y empalme de genes alternativos que pueden ser críticos para su propagación principalmente en polimorfismos puntuales. Se implicaron las vías de apoptosis, autofagia, señalización de interferon, regulación de gránulos de estrés, modificación pos-transcripcional de RNAs, ubiquitinación, estrés de retículo endoplásmico y endocitosis entre otros.107 Un gran número de variantes genéticas con efecto sobre la trascripción han sido reportadas asociadas a dengue.128 El gen CD209 está localizado en el cromosoma diecinueve en una región de complejos sitios de corte y empalme alternativos generado iso-formas solubles, de membrana y truncadas. Las variantes genéticas del promotor -871 secuencia

41

referencia (rs) en el Centro Nacional de información Biotecnológica NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ número 735239, -336 (rs4804803) y -139 (rs2287886) influenciaron los niveles de expresión. Comparando casos de dengue con controles de población saludable fueron asociadas a infección por dengue el alelo rs2287886 G, el genotipo rs2287886 G/G y el haplotipo A-A-G. 90 El gen TLR3 está ubicado en el cromosoma cuatro, codifica el TLR3, mayor efector de la respuesta inmune contra patógenos virales.106, 129 TLR3 se encontró sobre la superficie de retículo endoplásmico, endosomas, lisosomas y endolisosomas.109 Los genotipos rs3775296 en el promotor se correlacionaron con diferencias en niveles de expresión de TLR3 (C/C Altos, C/A medios y A/A bajos).130 De otro lado Leu412Phe rs3775291 se encontró en DL con rs3775296 y rs3775290 en población China 130 rs3775291 afectó la estructura proteica y tiene una frecuencia de 30% en población con ancestría Europea y Asiática, pero no se observó en Africanos. 412Phe redujo la tasa de activación en múltiples enfermedades como miocarditis131 y nasofaríngea en respuesta a infección viral.129 El gen IL6R está localizado en el cromosoma uno y codifica a las iso-formas IL6R/sIL6R. sIL6R se produce por corte y empalme alternativo en el exón uno justo en la variante rs8192284 132 y por proteólisis de IL6R con la proteasa ADAM17 132 la cual reconoce la sustitución Asp358Ala rs8192284 C antes nombrada rs2228145.133 sIL6R es una citoquina multifuncional esencial para la respuesta inmune, hematopoyesis y reacciones de fase aguda, ejerce acciones a través de un receptor heterodimérico de proteínas (IL6 unido a IL6R reclutan a glicoproteína 130 (gp130) sobe la membrana disparan IL-6 de 100-1000 veces más que por separado134 provocando expresión de gp130, a este fenómeno se le conoce como señalización en trans. IL6 es una citoquina con pleio-tropismo, ubicada en el 7p21, es una mediadora mayor de fiebre, reacciones de fase aguda y es producida durante la respuesta inmune innata y humoral por linfocitos B y T, macrófagos, monocitos, fibroblastos y activa células tumorales y del endotelio. Hay estudios previos confirmando su participación en la disfunción de la coagulación y la fibrinólisis en dengue.135 Específicamente un polimorfismo en la región promotora del gen IL6, -174G/C, se ha visto afectando la transcripción in vitro y aumentando el producto genético funcional soluble.135, 136 Los pacientes infectados con dengue expresaron altos niveles de IL-6, asociados al genotipo -174 (G/G), lo cual fue un factor protector a dengue clásico comparado con controles saludables.135, 137 TNFA está ubicado en el cromosoma 6, codifica una importante citoquina pro-inflamatoria. Regula la diferenciación, proliferación, apoptosis, metabolismo de lípidos y coagulación. Participa en la RI innata y humoral.135 También ha sido asociada a altos niveles de replicación viral en monocitos y macrófagos. Se ha correlacionado con la presentación elevada de epítopes DENV a células T.128 Varios polimorfismos de TNFA se han observado influenciando la transcripción y la susceptibilidad a dengue. En un estudio realizado en Venezuela se comparó la distribución de frecuencias de una variante localizada en el promotor, TNF-308A

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

42

fue mayor en DHF comparado con DF (30% Vs. 5%) OR=7.58, CI95%(1.23–79.2) p=0.02. En un estudio reciente los pacientes étnicamente Tailandeses, presentaron el polimorfismo TNFA-238, el cual hace parte de un haplotipo en TNFA/LTA encontrado mayor en DHF contrastado con DF (15% Vs. 4%) OR=4.13, 9IC95%(1.59–11.17)p<0.001).128, 135 INFG está ubicado en el cromosoma 12. Es una citoquina tipo Th1, secretada por células T, asesinas naturales NK, y células NKT. Cumple un papel de defensa contra virus y otros patógenos intracelulares, induce respuesta inflamatoria por activación de macrófagos, células NK y células T. INF-γ puede inducir fiebre, se considera un pirógeno endógeno humano.138 Un polimorfismo en el promotor distal de INFG, rs2069705 (-1615C/T) ha sido asociado con el aumento en los niveles INF-γ, lo que sugiere su correlación con las diferencias en la expresión. El rs2069705, también se visto interactuando con inmunoglobulinas durante infección viral, modulando el riesgo a cáncer.138 En la Tabla X se presentan algunas variantes de los genes anteriormente mencionados junto con variantes en los productos génicos mencionados de este capítulo (5) de la fisiopatología del dengue. Para muchos de ellos hay previa evidencia del efecto sobre la inducción de la expresión diferencial de otros genes en diferentes poblaciones ancestrales (Europeos y Africanos) en bases de datos internacionales tales como SCANDB: http://www.scandb.org/newinterface/about.html. Tabla 1. La respuesta inflamatoria tiene marcadores diferentes entre diversas poblaciones humanas. En los estados unidos los niveles de IL6 y sIL6R son más altos en Europeos Americanos que en Africanos Americanos. Estas observaciones sugieren la contribución de la investigación a la dilucidación de las diferencias específicas de etnia en la epidemiología.133 Un estudio previo demostró que las diferencias epidemiológicas de dengue entre grupos étnicos y tendencias a resultados clínicos severos ocurren en mayor proporción en individuos con ancestría Europea comparados con Africanos co-habitando en países como Cuba y Brasil.65, 85, 104, 139

En resumen el modelo fisiopatológico de dengue sugiere que la genética del vector y su grado de infestación influyen sobre la propagación viral entre humanos. La infección humana con VD depende de las variantes en la proteínas de la envoltura viral y su interacción el sistema inmune innato del hospedero, lo cual lo hemos llamado módulo 1 del modelo fisiopatológico de dengue. En consecuencia la infección causará la producción de anticuerpos induciendo síntomas en pacientes susceptibles, habrán también quienes no tendrán síntomas, dependiendo de las variantes que modulen la replicación viral y la respuesta sistema inmune adaptativa, siendo parte del módulo 2 del modelo fisiopatológico de dengue, sin embargo aquellos sintomáticos cuyo curso de la enfermedad puede llevar a un autolimitado dengue, podría también progresar en severidad a dengue grave

43

dependiendo de las variantes en genes involucrados en la inflamación y permeabilidad vascular, lo cual se determinó como módulo 3 del modelo fisiopatológico. Es de anotar que los pacientes con dengue grave deben recibir atención médica usualmente con incorporación de líquidos para evitar la muerte.

44

Tabla 1. Predicción del efecto de variantes en posibles genes candidatos sobre la expresión de otros genes en diferentes poblaciones ancestrales. Secuencia referencia Gen Región genética

Gen en que induce expresión Población_ y _ Valor P reportado

rs2780895 JAK1 intron[NM_002227.2] HS3ST2 CEU 1e-05

rs17127114 JAK1 intron[NM_002227.2] NA

rs11208534 JAK1 intron[NM_002227.2] C9orf9 YRI 8e-05

TCTN1 YRI 0.0001

rs8192284 IL6R NA NA

rs1059704 IKBKE intron[NM_014002.2] FNTB YRI 7e-05

CCDC32 CEU 9e-05

MRPL42P5 CEU 9e-05

NSUN6 YRI 9e-05

C22orf37 YRI 0.0001

rs11118132 IKBKE intron[NM_014002.2] NA

rs3024498 IL10 utr-3[NM_000572.2] WFS1 CEU 5e-05

rs1518111 IL10 intron[NM_000572.2] TMEM199 CEU 0.0001

rs1800871 NA NA NA

rs1143634 IL1B reference[NM_000576.2] NA

rs1143627 IL1B near-gene-5[NM_000576.2] OSBP CEU 8e-05

rs16944 IL1B NA OSBP CEU 0.0001

rs365238 NA NA STRA6 CEU 1e-05

TMC8 CEU 0.0001

rs2227532 IL8 near-gene-5[NM_000584.2] NA


rs2227307 IL8 intron[NM_000584.2] NA

rs3775290 TLR3 reference[NM_003265.2] NA

rs3212227 IL12B utr-3[NM_002187.2] NA

rs2569253 IL12B intron[NM_002187.2] NA

rs3132468 MICB intron[NM_005931.3] HLA-DQB1 CEU 1e-05

HLA-DQB2 CEU 1e-05

HLA-DRB1 CEU 1e-05

HLA-DRB2 CEU 1e-05

HLA-DRB3 CEU 1e-05

HLA-DRB4 CEU 1e-05

HLA-DRB5 CEU 1e-05

HLA-DRB6 CEU 1e-05

LOC100133484 CEU 1e-05

LOC100133583 CEU 1e-05

LOC100133661 CEU 1e-05

LOC100133811 CEU 1e-05

LOC730415 CEU 1e-05

RNASE2 CEU 1e-05

ZNF749 CEU 1e-05

hCG_1998957 CEU 1e-05

45

HLA-DQB1 CEU 1e-05

HLA-DQB2 CEU 1e-05

HLA-DRB1 CEU 1e-05

HLA-DRB2 CEU 1e-05

HLA-DRB3 CEU 1e-05

HLA-DRB4 CEU 1e-05

HLA-DRB5 CEU 1e-05

LOC100133484 CEU 1e-05

LOC100133583 CEU 1e-05

LOC100133661 CEU 1e-05

LOC100133811 CEU 1e-05

LOC730415 CEU 1e-05

RNASE2 CEU 1e-05

ZNF749 CEU 1e-05

hCG_1998957 CEU 1e-05

rs1799964 LTA near-gene-3[NM_000595.2] GNAZ CEU 5e-05

rs1800750 TNF near-gene-5[NM_000594.2] NA

rs2275913 IL17A near-gene-5[NM_002190.2] PERP YRI 4e-06

MGC42105 YRI 6e-05

SLC6A4 YRI 6e-05

ARMC9 YRI 0.0001

RPS28 YRI 0.0001

PITX2 YRI 0.0001

rs763780 IL17F reference[NM_052872.3] NA


rs2069843 IL6 intron[NM_000600.2] C8orf59 YRI 1e-05

RNASEL YRI 3e-05

NPR2 YRI 8e-05

MAP3K13 YRI 9e-05

UNKL YRI 0.0001

rs5743336 NOD1 utr-5[NM_006092.1] NA

rs40457 RIPK2 NA NA

rs1800451 MBL2 missense[NM_000242.1] NA

rs1800450 MBL2 missense[NM_000242.1] NA

rs3765524 PLCE1 reference[NM_016341.3] MRPL45 CEU 3e-05

LOC541469 CEU 3e-05

FOS YRI 4e-05

NSMCE1 CEU 8e-05

SH3GL1 CEU 0.0001

LOC400451 CEU 0.0001

rs1834481 IL18 intron[NM_001562.2] NA

rs5744247 IL18 intron[NM_001562.2] SLC25A26 CEU 3e-05

BARX1 CEU 3e-05

GFRA4 CEU 6e-05

CAMK1D CEU 8e-05

46

LOC100128443 CEU 0.0001

MAST4 CEU 0.0001

ZNF597 CEU 0.0001

SLC9A9 CEU 0.0001

ST13 CEU 0.0001

rs1946518 NA NA DRAM YRI 6e-05

POU5F2 CEU 8e-05

SLC31A2 CEU 0.0001

SLC9A3R1 YRI 0.0001

GBA YRI 0.0001

GBAP YRI 0.0001

rs2069705 NA NA DAPK3 YRI 4e-05

NANOS1 YRI 6e-05

rs8904 NFKBIA utr-3[NM_020529.2] NA

rs2233409 NFKBIA near-gene-5[NM_020529.2] NA

rs1805010 IL4R reference[NM_001008699.1] NA

IL4R missense[NM_001008699.1]


IL4R reference[NM_000418.2]




rs1805016 IL4R missense[NM_000418.2] SAMD8 YRI 3e-05

rs8043770 NA NA NA

rs1024611 NA NA NPLOC4 CEU 5e-06

DDX3X CEU 6e-06

KCTD2 CEU 1e-05

ZNF434 CEU 5e-05

STK35 CEU 5e-05

PIP4K2C CEU 7e-05

ACTR1A CEU 7e-05

ADNP2 CEU 8e-05

TRIM35 CEU 9e-05

PSMD11 CEU 0.0001

ZNF235 CEU 0.0001

rs2227319 CSF3 near-gene-5[NM_000759.2] LIPG CEU 9e-05

CSF3 near-gene-5[NM_172220.1] C20orf108 CEU 0.0001

rs2023906 CCR7 intron[NM_001838.2] NA

rs3136685 CCR7 intron[NM_001838.2] TMEM199 YRI 6e-05

TMEM86B CEU 0.0001

rs7248637 CD209 utr-3[NM_021155.2] PSAP YRI 3e-05

COL4A4 CEU 0.0001

rs8105572 CD209 intron[NM_021155.2] ABLIM1 YRI 4e-05

LOC286167 YRI 8e-05

ST3GAL1 YRI 8e-05

47

CEU: Residentes de Utah con ascendencia del norte y occidente de Europa. YRI: Residente Yoruba Ibadán, Nigeria. NA: No reportes en la base de datos referencia. Missense: mutación sin sentido. near-gene-5: región promotora. Utr: región no traducida. Recurso: http://www.scandb.org/newinterface/about.html

http://www.scandb.org/newinterface/about.html

48

Capitulo 6

El papel del contexto genético humano

en la infección y la progresión del

dengue


Aunque ha incrementado el potencial uso de vacunas contra dengue, las pruebas

han sido restringidas a pocas áreas y pequeños grupos de riesgo en zonas

endémicas del mundo, como Malasia,140 lo cual limita su práctica global, razón por

la cual requiere más investigación. Tampoco existen terapias viables disponibles,

seguras y efectivas para tratar de prevenir la transmisión del dengue141 y

raramente los pacientes diagnosticados con la forma clínica severa cumplen todos

los requisitos del dengue hemorrágico. Estas limitaciones podrían estar influidas

por la genética del hospedero, la cual es uno de los factores epidemiológicos más

importantes que determinan la progresión a la forma clínica severa del dengue.87

De hecho existe evidencia alrededor del mundo (Cuba, Haiti y Africa) que sugieren

que las diferencias geográficas como la etnicidad, puede modular el

susceptibilidad/resistencia a las formas severas del curso de la infección por

dengue.128 En este sentido se ha estudiado las diferencias en la respuesta inmune

a DV entre grupos étnicos encontrando como varían sus mecanismos inmunes

para favorecer el desarrollo del dengue severo. Es así como han sido reportadas

variantes en el gen FCyR, asociadas con el más alto riesgo al desarrollo de dengue

hemorrágico en poblaciones Caucásicas.142 Estos factores del hospedero podrían

determinar los efectos en los mecanismos de respuesta a dengue que podrían

impactar sobre blancos de uso terapéutico o farmacéutico e influenciar el éxito o

fracaso de vacunas contra DV y desarrollo de anti-virales.1

Específicamente en Cuba se ha explorado este fenómeno en varias de sus

principales epidemias; resultados similares durante 1981,1997 y 2001, registraron

el riesgo reducido a dengue hemorrágico/síndrome del choque por dengue entre

individuos de raza Afro-cubana comparados con blancos, sin embargo pocos

estudios consideran la ancestralidad como variable de riesgo a formas severas del

49

dengue, y poco se ha hecho para desarrollar apropiados esquemas de

clasificación, el color de la piel muestra resultados prometedores. Los grupos

humanos son considerados antropológicamente diferentes y son también distintos

en frecuencias génicas.65 Las poblaciones Europeas y Africanas han estado

expuestas a diferentes fuerzas de selección ejercidas por epidemias. Esto podría

ser usado para analizar y observar la severidad diferencial a dengue entre grupos

étnicos porque estos genes controlando la susceptibilidad/resistencia a la forma

severa del dengue podrían estar distribuidos diferencialmente entre negros y

blancos, contribuyendo a las grandes diferencial globales en morbilidad y

mortalidad.65 Lo cual es congruente con estudios de Guzman y Gustavo Kouri

2008, quienes calcularon la tasa de infección en blancos comparados con negros

en 2.57 veces mayor riesgo a desarrollo de dengue hemorrágico.139 Además la tasa

de riesgo relativo en la incidencia de dengue febril en individuos de población

Asiática (China), es mayor que en Malayos, quienes a su vez, tienen mayor tasa de

riesgo relativo de la incidencia de dengue febril que los Indúes.104, 143, 144

Juntos estos estudios indican que la etnicidad es un determinante de la

susceptibilidad a DV, sugiriendo el papel de los factores genéticos del humano.145

El grado de mezcla genética ancestral es un importante factor de riesgo a dengue

severo y debería ser considerado como co-variable en estudios de genética del

dengue. Además esta variable en América puede capturar mejor que la

clasificación según la raza o la etnicidad, la contribución ancestral a la maqueta

genética individual. Un componente ancestral puede sugerir la presencia de genes

mayores, lo que estará caracterizado por una distribución desigual de

polimorfismos génicos dependiendo de la mezcla ancestral. La población de Brasil

en etnicidad y ancestría calculada con marcadores informativos de componente

genético ancestral, después de ajustar los ingresos, se asociaron con la forma

leve, dengue febril; el componente Africano fue un factor de protección a dengue

hemorrágico y los ingresos altos estuvieron mejor representados en grupo de

mayor riesgo, ancestría Europea.85

Se ha sugerido que poblaciones indígenas tienden a tener diferencias específicas

en cuanto al curso de la enfermedad del dengue determinada genéticamente por

variantes afectando su respuesta inmune a la infección con DV, de hecho el FCyR,

es el más ampliamente distribuido receptor para subclases de IgG y puede mediar

la potenciación de la infección dependiente de anticuerpos,146 la variante del gen

que codifica el 131R/R del la proteína es protectora contra síndrome del choque por

dengue en población de Vietnam,147 lo cual es congruente con resultados obtenidos

en Cuba,142 esto presenta entonces consistencia entre estos grupos étnicos

indígenas de Sudeste de Asia y Sur-América.92 Además la tasa de riesgo relativo

50

en la incidencia de dengue febril en individuos de población Asiática (China), es

mayor que en Malayos, en quienes a su vez la incidencia de dengue febril es mayor

que en Indúes.104, 143, 144

Explorando genes en orden de evaluar su asociación con la presentación clínica de

dengue en Brasil, fueron estudiados los casos de dengue hemorrágico, dengue

febril y asintomáticos, encontrando variantes del gen JAK1 asociadas a dengue

hemorrágico, esta variantes mostraron distribución diferencial por etnicidad y

componente genético ancestral, los cual es consistente con las observaciones

epidemiológicas en las Américas. Estas asociaciones fueron soportadas después

de controlar los ingresos y el componente genético ancestral. Además las

asociaciones de variantes en este gen, estuvo en concordancia con los perfiles de

expresión, mostrando disminución en los genes estimulados por INF tipo I en los

pacientes.148

En Colombia se realizó un estudio en el departamento de Antioquia por Restrepo

BN y colaboradores en 2008, comparo pacientes infectados con DV de dos

distintos grupos étnicos y encontraron que los individuos Afro-Colombianos

produjeron mayores niveles de de TNFA que los Mestizos y que los niveles de IL6

estuvieron más elevados en Mestizos que Afro-Colombianos, mientras los niveles

de INF fueron similares en ambos grupos durante la fase aguda. Sugiriendo que la

etnicidad pueden contribuir a diferencias en la respuesta inmune durante

infecciones con dengue y que además propusieron que la historia genética

ancestral puede tener un papel en la respuesta inmune a DV en humanos.71

La ciudad de Medellín ubicada en el Valle de Aburra en el centro del departamento

de Antioquia83 ha sido ampliamente explorada en cuando su composición genética

ancestral global Africana, Europea y Nativa-americana, encontrando a través de la

genotipificación con micro-arreglos que permiten la inferencia de las proporciones

de los componentes genéticos a nivel individual, diferentes distribuciones Figura

1,149 incluyeron secuencias individuales del proyecto mil genomas.150 Las medias

de los componentes genéticos ancestrales Nativo 39%, Africano 6% y Europeo

52% de estas muestras de Medellín, fueron similares a las proporciones medias

reportadas para el departamento de Antioquia.149 Los resultados apuntan a una

enorme heterogeneidad genética en las proporciones ancestrales en Colombianos

de Medellín, vista en otras poblaciones de America.151, 152 Esta heterogeneidad es

evidente observando la distribución del componente genético ancestral Nativo

Americano Figura 2, congruente con la estructura y diferenciación genética pre-

Colombina de Mestizos.153

La mezcla entre fundadores genéticamente similares Europeos de diferentes

poblaciones y Nativo-americanos altamente divergentes, puede tenerse en cuenta

51

para realizar asociaciones de variantes génicas raras evaluadas en cohortes

cosmopolitas. Además los componentes genéticos ancestrales en los que se

encuentran las variantes génicas de riesgo pueden guiar la replicación en el

componente Nativo americano, contribuyendo al desarrollo de nuevos métodos de

asociación que tomen ventaja de la alta diversidad genética.149

Figura 1. Distribución de las proporciones individuales de los componentes

genéticos Europeo, Amerindio y Africano para Colombianos de Medellín.

Proporciones de los componentes ancestrales

Individuales estimados con el programa Admixmap.

Recurso: Simon Gravel y colaboradores 2013.

52

Figura 2. Composición genética ancestral regional Nativa Americana de 13

poblaciones Mestizas considerando cada población nativa individualmente.

Recurso: Sijia Wang y colaboradores 2008. Cada barra Coloreada indica la

proporción relativa de parte que corresponde a un determinado componente Nativo

Americano. Los componentes Africano y Europeo no están mostrados.

53

Capítulo 7

Evaluación del efecto de variantes en

genes candidatos sobre la enfermedad

del dengue en una muestra de población

colombiana


En el presente estudio examinamos la asociación de 46 variantes en 26 genes candidatos con la infección y severidad de dengue en población Colombiana. En el capítulo 5, se describió la relación de los genes candidatos seleccionados con la fisiopatología del dengue. La hipótesis de trabajo plantea que las variantes en genes que han sido implicados, en otras poblaciones, en la resistencia/susceptibilidad a la infección con DV y la severidad de la enfermedad del dengue, tienen un papel semejante en población Colombiana en lo concerniente a dicha enfermedad.

54

Entre los objetivos planteados se encuentran:

Objetivo general

1. Determinar el efecto de 46 variantes en 26 genes candidatos involucrados en la infección viral y progresión de la enfermedad del dengue

Objetivos Específicos

1. Evaluar la asociación de 46 variantes en los genes CD209, NOD1, NOD2, MBL2, TLR3, INFG, IL-6, TNFA, IL18, IL12, IL1B, CSF3, IL17, IL10, IL6R, IL4R, TRAIL, IL-8, CCL2, CCR7, MICB, NFKB1A, IKBKE, JAK1, RIPK2, PLCE1 de los módulos (1, 2 y 3) del modelo fisiopatológico, con la infección del virus dengue.

2. Evaluar la asociación de 46 variantes en los genes CD209, NOD1, NOD2, MBL2, TLR3, INFG, IL-6, TNFA, IL18, IL12, IL1B, CSF3, IL17, IL10, IL6R, IL4R, TRAIL, IL-8, CCL2, CCR7, MICB, NFKB1A, IKBKE, JAK1, RIPK2, PLCE1 de los módulos (1, 2 y 3) del modelo fisiopatológico, con la progresión de la enfermedad del dengue.

METODOLOGÍA

Muestras de estudio

En el departamento de Antioquia, Colombia, se captaron 450 muestras de pacientes con diagnóstico presuntivo de dengue, las cuales fueron recolectadas desde julio de 2009 hasta marzo de 2013 en instituciones de salud del Valle de Aburrá. De ellas 159 pertenecen a individuos menores o iguales a 15 años de edad y 291 a mayores; 194 fueron hombres y 256 mujeres. Según el informe clínico se confirmó el diagnostico para 366 casos de dengue febril y 40 de dengue hemorrágico. Además considerando todos los casos en el curso de dengue 266 individuos evidenciaron presencia de hemorragias y 141 ausencias. Pareados por instituciones de salud se captaron 182 individuos controles seronegativos para dengue de los cuales 68 fueron menores y 114 mayores. Del total de seronegativos participaron 98 hombres y 84 mujeres. Además de incluyeron 407 individuos referentes de población general del Valle de Aburra sin estatus de infección por VD, todos adultos captadas en las I.PS de la empresa Sura de los cuales se distribuyeron por sexo en 118 hombres y 289 mujeres. Para llevar a cabo un estudio de asociación simple. Es importante anotar que en los estudios de

55

tipo genético cuanto el N en los casos es muy pequeño y el N en los controles en muy grande, el efecto de resistencia/susceptibilidad en grande.

Diagnostico de infección

La infección con VD en pacientes con diagnóstico presuntivo de dengue fue confirmada usando anticuerpos específicos disponibles comercialmente IgM y/o IgG (ELISA Dengue IgM e IgG Panbio, Sinnamon Park, Australia); otros fueron confirmados con la prueba de Transcripción Reversa en Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR), usando el protocolo definido por Lanciotti y colaboradores en 1992154 y adaptado por Harris en 1998.155 La infección secundaria fue determinada por los títulos de anticuerpos IgG en la fase aguda de la enfermedad. Los controles sin evidencia clínica de dengue fueron evaluados para IgM e IgG (ELISA Dengue IgM and IgG Panbio, Sinnamon Park, Australia) y todos fueron seronegativos. Los participantes infectados con malaria, confirmados por prueba de gota gruesa fueron excluidos del estudio. Los signos y síntomas fueron recolectados en encuestas junto con la información contenida en las historias clínicas. Dado el estatus de los individuos pertenecientes a la población general de del Valle de Aburrá no aplicó el diagnóstico de infección.

Genotipificación de variantes en genes candidatos y marcadores informativos de composición genética ancestral individual

El ADN fue aislado a partir de 5ml de muestra hemática, siguiendo un protocolo estándar fenol-cloroformo. Una alícuota de ADN fue posteriormente amplificada en experimentos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y tanto los polimorfismos de inserción/delección así como las variantes cuyos amplificados requirieron de incubación con enzimas para generar diferencias en longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), fueron resueltos en electroforesis. Los tipos de marcador, enzimas, fragmentos generados y cebadores para cada marcador genético se resumen para las 46 variantes en 26 genes candidatos en la Tabla 1, su respectiva ubicación en el gen Tabla 2 y se detallan los 30 marcadores informativos de componente ancestral individual en la Tabla 3.156, 157

Análisis de datos

La asociación fue hecha por comparación de los siguientes grupos y condiciones: Por una parte, para determinar la asociación de variantes en genes candidatos con la infección, se evaluó tanto la historia de exposición a dengue, comparando positivos en al menos una o más pruebas diagnóstico de infección por VD, con los seronegativos (IgM- e IgG-); así como para determinar la susceptibilidad a infección y desarrollo de dengue, se comparó los individuos referentes poblacionales con los mimos positivos (en al menos una o más pruebas diagnóstico de infección por VD).

56

Por otra parte para determinar la asociación de variantes en genes candidatos con la progresión en severidad del dengue, se compararon tanto los positivos diagnosticados con dengue febril comparados con dengue hemorrágico, así como se contrataron los positivos mostrando presencia de hemorragia con positivos con ausencia de hemorragias. La presencia/ausencia de hemorragias fue determinada con la presentación de al menos uno o más de los siguientes signos clínicos: petequias, purpura, epistaxis, hemorragia gingival, hematemesis, melenas, metrorragia, hematuria y/o positividad en la prueba de torniquete.

Construcción de redes de combinaciones de alelos

Para observar las relaciones evolutivas de las combinaciones alelicas se utilizó un algoritmo Median-joining (MJ) con la ayuda de algorimos de Kruskals 1956, el cual identifica tipos de grupos estrechamente relacionados e introduce una hipótesis ancestral, con el objetivo de unir los tipos de grupos dentro de un árbol parsimonioso o red, según lo afirma Bandelt 1999. El parámetro épsilon gobierna la agrupación inicial de tipos estrechamente relacionados cambiando consecuentemente el árbol más parsimonioso. Finalmente corre el algoritmo heurístico de máxima parsimonia de Farris (MP) para depurar la red.158

Construcción de modelos de redes de trascripción

Para modelar las interacciones físicas entre los genes que resultados con variantes asociadas a cada uno y en el total de fenotipos del dengue evaluados en este estudio, se realizó modelos de interacción de transcriptos de genes de interés teniendo en cuenta los trascriptos génicos del contexto de red en el que operan en el programa PeinNetwork. Esta búsqueda funcional se base en conocimiento previo de interacciones debidas a co-expresión de genes en los modelos humano, rata y ratón disponibles en conjunto en una página web interactiva. La información allí contenida incluye anotación génica ontológica, información de dominios proteicos, tejido en el cual el gen es expresado, mostrando su interacción por nodos de expresión diferencial basados en micro-arreglos y proteínas reportadas en las base de datos PubMed, OMIM, PGD, MINT, IntAct, BioGRID, DIP, HPRD, y Reactome Esta información en conjunto permite investigar el número de interacciones en una red a partir de una combinación génica que se introducen a manera de pregunta.159

57

Tabla 1. Descripción detallada de las 46 variantes en 26 genes candidatos evaluados en este estudio. Clasificación Cr Gen Variante

(rs) RFLP Enzima

Elegida Fragmentos Esperados

Cebador directo 5´– 3´

Cebador reverso 5´– 3´

Receptores complementarios del virus dengue

4 TLR3 rs3775290 R=G"/A TaqI 145, 84 GGAGCATCAGTCGTTGAAG CTCAACCTAACCAAGAATAA 7 NOD1 rs5743336 Y=T"/C SspI 135, 108 TTTTAAAATTATTCTCTTGCC CTTTAGAAAATCGGTTCATT

16 NOD2 rs8043770 G/C"=S Styl 106, 153 CAGTTTTGGAGGCTGGGAAG GACCTTGTCTGCCTGTTATGA 10

MBL2 rs1800450 R=G"/A BanI 118, 83 TGGCAGCGTCTTACTCAGAA CAGGCAGTTTCCTCTGGAAG MBL2 rs1800451 G/A"=R MboII 138, 63 TGGCAGCGTCTTACTCAGAA CAGGCAGTTTCCTCTGGAAG

19 CD209 rs7248637 R=G"/A Hpy166II 138,88 AGCCAAAGCTCCTCTAGATC CAGATGGGGTTTCTCCGTGTT CD209 rs8105572 C/T"=Y HpyAV 123, 109 CTGGTATACTAGGTCCTGAG GACCAGCAGTTAGGAAATGG

Citoquinas proinflamatorias

2 IL1B rs16944 R=G"/A AvaI 117, 86 ACTTAAGTTTAGGAATCTTCCC ACCCTGCATACCGTATGTTC IL1B rs1143627 C/T"=Y AluI 111, 125 CAGTTTATTAGTCCCCTCC GTCATACTTGAGCAATGAAG IL1B rs1143634 Y=C"/T TaqI 134, 121 TGTCATCAGACTTTGACCG GAGAGCTTTCAGTTCATATG

5 IL12B rs3212227 A/C"=M TaqI 145, 92 ACGGAATAGACCCAAAAAG GGCAGACAAACGTTAAATAA IL12B rs2569253 Y=T"/C DdeI 129, 111 TGATAATAATAACAGTATCTG GCAGAGAGAATGAAAATCTC

6 IL17A rs 2275913 G/A"=R XmnI 31, 208 ATTTCTGCCCTTCCCATTTT CCCAGGAGTCATCGTTGTTT IL17A rs763780 Y=T"/G NlaIII 126, 142 TTATTAAGAGTCCTGTGAAG GGAAGACATCTCCATGAAT

6

TNFA rs1800750 G/A"=R TasI 214, 579 CCAGGCTTGTCCCTGCTAC CCGGATCATGCTTTCAGTG TNFA rs1799964 T/C"=Y BbsI 124, 102 AAAAGGATAAGGGCTCAGAG CTACCCATTGCTGTGGTCAC

7 IL6 rs2069843 R=G"/A AvaI 104, 196 TCCTGCCTCTGCCATTTCT TCACCATCCCTTTAGGATCTG IL6 rs1800795 G/C"=S NIaIII 111, 153 TGACTTCAGCTTTACTCTTTG CATGGGAAAATCCCACATTTG

11 IL18 rs1834481 C/G"=S Hae III 27, 179 GGAGCGTTGCATAGGAAAAA ATGCCATGGTTTCTTTCAGC IL18 rs5744247 S=G"/C HinfI 112, 106 GATGGAAGCACTTTTTTATC GTATTCCTTGAGAAATATAAATA IL18 rs 1946518 G/T"=K MseI 95, 92 CTTTTCAGTGGAACAGGAG CTGGAAACTGCAAGTAAATAT

12 IFNG rs2069705 C/T"=Y Hpa I 180,65 AGTCATCCAATGTGCCAAAA ATTGCAGTTATGGGGCAAAC 17 CSF3 rs2227319 R=G"/A Tsp451 109,84 CAAGGTCCCTTCCAGCATTA GCTCACCTGACCTTCACCTC

Citoquinas antiinflamatorias

1 IL10 rs1800871 T/C"=Y MS1I 181, 59 TCAACTTCTTCCACCCCATC GTGCTCACCATGACCCCTAC IL10 rs1518111 G/A"=R HinfI 116, 98 GGACAACTTGTTGTTAAAGG GGACTGAGCCCTTTGTAAA IL10 rs3024498 A/G"=R Fnu4HI 91, 102 AAGCCTGACCACGCTTTCTA ATGAAGTGGTTGGGGAATGA

Receptores de citoquinas

1 IL6R rs8192284 A/C"=N HindIII 88, 182 AGCTTGTCAAATGGCCTGTTG CAGAACAATGGCAATGCAGAG 3 TRAIL rs365238 A/G"=R NspI 113, 105 AGCGAGACATTGTGATGGG CCATCTTGAATGTCAGAATCT 16 IL4R rs1805010 A/C"=N BsmAI 131, 113 GAGTCTGATGCGGTTCCTGG CTCGCTGGGCTTGAAGGAGC

IL4R rs1805016 K=T"/G AvaII 121, 118 TCTACTCAGCCCTTACCTGC GGATTTACTCTTCTCTGAGATGC

58

Quimoquinas 4 IL8 rs2227532 Y=T"/C AseI 43, 194 TGCCTTTGGAAGATTCTGCT AACAGAGTGAAGGGGCACAT IL8 rs2227307 T/G"=K SexAI 156, 61 TGCTTTGGTAACAAACATCCTTT CCGTGGTTCTCAATAGGACA IL8 rs4073 W=A"/T MfeI 83, 139 CTTGTTCTAACACCTGCCACTC GGCAAACCTGAGTCATCACA

17 CCL2 rs1024611 T/C"=Y PvuII 120, 121 CTACTTCAGGAAGGAGTTGTC GGGAACTTCCAAAGCTGCCT

Receptores de quimoquinas

17 CCR7 rs3136685 R=G"/A HphI 124, 57 GCCGCTGACAAGCTTTACTC CGTGAAAAAGGCCAGCTCAG CCR7 rs2023906 A/G"=R AlwNl 122, 112 ACGAGGCTCATGGTTCTATC GAAGAGGGGTTGCCACTGA

Complejo mayor de histocompatibilidad

6 MICB rs3132468 R=A"/G SmlI 158, 104 GATGGGGACAGAGCAGGTG GAGATGGGAAAGCTCCTTTCT

Inhibidores de NFKB

1 IKBKE rs1059704 T/C"=Y AciI 121, 74 CTGCTGTGAACATTGGTGTAC AGGATGAGTTCCTGGTGGTG IKBKE rs11118132 C/G"=S NcoI 107, 123 CCTACCTTGCCGCTTCTGA CACCGTAAGTGGGATAAATTC

14 NFKB1 rs2233409 C/T"=Y Hpy166II 168, 82 CCAGCCATCATTTCCACTCT CTGGAAAGTCCTTCCGACC NFKB1 rs8904 Y=C"/T HinP1I 137, 114 TATTTCCAGTAGTGGCCTCC GCAGTGTGGATATAAGTACAC

Proteinas kinasas 1 JAK1 rs11208534 A/G"=R BanI 135, 52 CGCCTCCTTTAGTGGTGAGA AGTGCAGGGTTGCTTCACTT JAK1 rs17127114 R=G"/A HpaII 109, 86 GGAACTTTAAACACAAAAAC GTTGGAGATGACGATGTTAA JAK1 rs2780895 Y=C"/T SnaBI 115, 130 TTGTTATTTTAGCCTAACTC GATTAAATAATGCATATAGAG

8 RIPK2 rs40457 A/G"=R AflII 120, 108 TGACTATTTCTATCAATTACC GATCATTTAAGCCACATGTT

Isoenzimas 10 PLCE1 rs3765524 C/T"=Y Sau3AI 112, 109 TCAACCCAACCACGTCCCTC CACAAGCTGTATCCCATGGAG

Cr: Cromosoma, rs: Secuencia de referencia RFLP: Polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción. NCBI: National Center for Biotechnology Information. Las comillas en la variante RFLP, indican el alelo de corte. La clasificación de los genes y variantes se realizó en base a su función molecular y proceso biológico en el que interviene.

59

Tabla 2. Ubicación de cada variante en su respectivo gen candidato. Variante Gen Ubicación Referencia

rs1834481 IL18 intrón Wu MF, 2013 rs3775290 TLR3 Exón Torres S, 2013

rs5744247 IL18 intrón Wu MF, 2013 rs3212227 IL12B utr-3' Maneekan P, 2013

rs1946518 IL18 referencia Wu MF, 2013 rs2569253 IL12B intrón Maneekan P, 2013

rs2069705 INFG Cercano-5' Malavige GN, 2012 rs3132468 MICB intrón Whitehorn J, 2013

rs8904 NFKBIA utr-3' de Kruif MD, 2008 rs1799964 TNFA Cercano-3' de Kruif MD, 2008

rs2233409 NFKBIA Cercano-5' de Kruif MD, 2008 rs1800750 TNFA Cercano-5' de Kruif MD, 2008

rs1805010 IL4R referencia Malavige GN, 2012 rs2275913 IL17A Cercano-5' Wu MF, 2013

rs1805016 IL4R Exón Malavige GN, 2012 rs763780 IL17A referencia Wu MF, 2013

rs8043770 NOD2 referencia Ghosh M, 2013 rs1800795 IL6 Cercano-5' Torres S, 2013

rs1024611 MCP1 Cercano-5' Lee YR, 2006 rs2069843 IL6 intrón Torres S, 2013

rs2227319 CSF3 Cercano-5' Rathakrishnan A, 2012 rs5743336 NOD1 utr-5' Ghosh M, 2013

rs2023906 CCR7 intrón Wu WL, 2011 rs40457 RIPK2 Cercano-3' Morchang A, 2011

rs3136685 CCR7 intrón Wu WL, 2011 rs1800451 MBL2 Exón Shresta S. 2012

rs7248637 CD209 utr-3' Van der Schaar HM, 2008 rs1800450 MBL2 sinsentido Shresta S. 2012

rs8105572 CD209 intrón Van der Schaar HM, 2008 rs3765524 PLCE1 referencia Whitehorn J, 2013

rs2780895 JAK1 intrón da Conceicao TM, 2013



rs8192284 IL6R intrón Marin V, 2001

rs1059704 IKBKE intrón da Conceicao TM, 2013

rs11118132 IKBKE intrón da Conceicao TM, 2013

rs3024498 IL10 utr-3' Malavige GN, 2012

rs1518111 IL10 intrón Malavige GN, 2012

rs1800871 IL10 referencia Malavige GN, 2012

rs1143634 IL1B intrón Ghosh M, 2013

rs1143627 IL1B Cercano-5' Ghosh M, 2013

rs16944 IL1B Cercano-5' Ghosh M, 2013

rs365238 TRAIL referencia Gandini M, 2013

rs2227532 IL8 Cercano-5' Torres S, 2013

rs4073 IL8 Cercano-5' Torres S, 2013

rs2227307 IL8 intrón Juffrie M, 2000

60

Tabla 3. Descripción detallada de 30 marcadores informativos (AIMs) usados para calcular los índices individuales de cada componente genético ancestral.

Marcador Cr Mega bases

Afri Eur Amer Poli-mor-fismo

Tama-ño Inser-ción (pb)

Tamaño alelos (pb)

Cebador directo (5’-3’) Cebador reverso (5’-3’)

MID1752 1 55.048.507 0,560 0,290 0,920 I/D 35 139, 104 TGTTTGTACCTTCCAAGTCTCT AGATTGACATTCCTTCCACA FY-NULL*1

1 160.000.000 0,001 0,998 1,000 RFLP (RsaI)

NA 172, (152/20) AGGCTTGTGCAGGCAGTG GGCATAGGGATAAGGGACT

AT3*1 1 174.800.000 0,858 0,282 0,061 I/D 68 572, 504 CCACAGGTGTAACATTGTGT GAGATAGTGTGATCTGAGGC MID1386 1 244.094.748 0,770 0,730 0,070 I/D 21 110, 89 AGAACACATGAGCTGAGAGG GGATTGATGTTCCAAGTCAG MID921 3 0.708934 0,690 0,090 0,060 I/D 4 141, 137 GAGGTTCCCTCTGTATGTAGC TAAATACAGACAAGCCCAGC MID1586 4 88.316.243 0,960 0,420 0,260 I/D 6 109, 103 GTTATGTGGGCAGTGTTTTC CCACAGAAGGCTCAGTCTTA MID52 4 104.623.399 0,740 0,840 0,140 I/D 3 118, 115 GCACAGGTGTTTTAGAGGC GTTCCAGTTGTTGGTGTGAC MID817 5 11.399.988 0,960 0,650 0,130 I/D 23 140, 117 ATTACCGGAACACATTCTGA CCTACATCCAACAGAAGGTG ID1039 5 34.009.660 0,980 0,270 0,830 I/D 40 128, 88 CGTTTCATCTCTTTGGGTTA GCTTTCTTCATTCCTTCACA MID1358 5 35.655.698 0,800 0,060 0,040 I/D 17 125, 108 GTTTTGGGAATTTAGGTTTTG AGACGCCAGGAATTTTCTAT MID856 5 65.320.596 0,660 0,150 0,690 I/D 26 112 , 138 AACATGGGAACTGCTCATTA TATTGTGCTCATTTTCTGGG MID943 5 82.581.213 0,810 0,200 0,680 I/D 4 114, 110 TGGCAGACTAAATTATTGGC TTCTTCTTCCTACCCCTGTT MID108 6 32.808.464 0,580 0,320 0,040 I/D 6 160, 154 CTCCTCCTCATCCAAAAATT GCATCTGTTGCCATTGTT MID104 6 32.810.633 0,560 0,350 0,110 I/D 5 126, 121 CAGAGGGTCTAGAGCAAAATT CCTTAGCTCAGTATGCTCCA MID2062 6 40.194.836 0,410 0,290 0,930 I/D 21 141, 120 GGCCTGCATGATAAATAGAA GAAGCCAGAACAATGAAAGA MID472 6 169.638.952 0,910 0,810 0,420 I/D 4 101, 97 GATGATATTGCCAAGGTCTG TCTGAGCTGCCTGTTCTAGT ID1066 7 30.374.603 0,840 0,280 0,260 I/D 19 103, 84 TCTTGGGACTCAGAGTTCAG CAGAAACCAAGGTGAAAGTG LPL*1 8 22.400.000 0,971 0,492 0,442 RFLP NA 319 (161/158) AGGCTTCACTCATCCGTGCCT

CC TTATGCTGCTTTAGACTCTTGTC

MID1780 11 35.103.812 0,740 0,230 0,690 I/D 3 148, 145 TGACTTCAGTGTCTGCTGAA ACACTTGCAGAGAGCTTTGT DRD2 11 118.400.000 0,135 0,670 0,045 RFLP

(Taq1) NA 300 (211/89) CCTCTGAGGCTTACTGTCTG AAAACTAGGGAGGGTCAGAG

APOA1*1 11 123.600.000 0,420 0,925 0,977 I/D (Alu)

301 409, 108 AAGTGCTGTAGGCCATTTAGATTAG

AGTCTTCGATGACAGCGTATACAGA

MID1723 12 79.546.987 0,900 0,180 0,150 I/D 5 150, 145 CTTCAAACTATGGTCTTCAAAAA

GAGCAAAAGTGTAATTTCCCT

RB2300*1 13 48.300.000 0,926 0,315 0,175 RFLP NA 196 (119/77) CAGGACAGCGGCCCGGAG CTGCAGACGCTCCGCCGT MID2264 13 62.676.757 1,000 0,300 1,000 I/D 4 245, 241 TGTGAGGTAAGGACCCAATT CCACTCACATTCCAATTTCA MID2269 13 85.138.935 0,900 0,400 0,900 I/D 4 171, 167 TTTCTCCACTGCGTTCAGTA ACCAGAGTGGCTACTTTTGG OCA2*1 15 24.900.000 0,115 0,746 0,488 RFLP NA 275 (191/84) CTTTCGTGTGTGCTAACTCC ACCTCTAGCATGGTTCTTGG

61

GC

MID818 16 2.140.559 0,090 0,780 0,980 I/D 24 143, 119 TAGAGCCAGTTAGAGGGAGG ACTTCAGTCGTCACTCCATC PV92*1 16 87.700.000 0,225 0,152 0,792 I/D

(Alu) 300 716, 416 GGATCTCAGGGTGGGTGGCA

ATGCT GAAAGGCAAGCTACCAGAAGCCCCAA

Sb19.3*1 19 27.200.000 0,415 0,903 0,645 I/D (Alu)

311 767, 456 TCTAGCCCCAGATTTATGGTAACTG

AAGCACAATTGGTTATTTTCTGAC

MID154 20 32.140.667 0,820 0,250 0,140 I/D 26 147, 121 GGCTCTGACTGAGAAACTGA AACAGGCAATCCTCCTAAGT

Cr: Cromosoma, pb: pares de bases. La frecuencia corresponde al alelo de mayor tamaño, equivalente a la inserción y a la ausencia de del sitio de corte en los RFLPs: polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción. Afri: Población ancestral Africanos. Eur: Europeos y Amer: Amerindios. Referencias de algunos de los marcadores informativos (Shriver MD, et al. 2003; Molokhia M, et al. 2003 y ttp: & www.marshfieldclinic.org/mgs/pages/default.aspx?page=didp.Human Insertion/Deletion Polymorphisms). 156, 157

62

La comparación de características de los individuos de estudio fueron realizadas usando pruebas de independencia en tablas de 2x2 para variables dicotómicas como sexo, diagnóstico de infección, tipo de infección y forma clínica, calculando el valor p a través de Chi cuadrado, estimando el riesgo e intervalo de confianza con 95% de confidencia. Para contrastar variables cuantitativas como la edad y los porcentajes de ancestría individual Europeo, Amerindio y Africano, se calculó el valor p con la prueba U-Mann-Whitney, en todo caso usando el programa SPSSV21. Tanto la estimación de las desviaciones genotípicas del equilibrio de Hardy-Weinberg así como las proporciones de alelos fueron determinadas y comparadas por Chi cuadrado. Los porcentajes de ancestría individual fueron calculados a partir de los 30 marcadores genéticos informativos de ancestría aplicando inferencia bayesiana tomando como prior las frecuencias alelicas en las poblaciones continentales (Europeo, Amerindio y Africano) reportadas en bases de datos internacionales usando el programa AdmixmapV3.7. Para las asociaciones de genotipos fueron modelados los patrones de herencia (Codominante, dominante, recesivo y sobre-domiante) en regresión logística usando el programa SNPstat. Para validar las asociaciones a alelos y genotipos se ajustó las probabilidades (Valor p), tasas de Odd (OR) e intervalos de confianza con 95% de confidencia (IC95%) con el tipo de infección, la edad, el sexo y los índices de ancestría individual Europeo, Amerindio y Africano como variables de confusión en las regresiones logísticas usando algoritmos de máxima verosimilitud contenidos en los programas GplinkV2.05 y SNPstat para alelos y genotipos respectivamente. En todos los casos los valores p<0.05 fueron considerados significativos y los más bajos fueron reportados.

Consideraciones éticas

Este proyecto fue aprobado tanto por el Comité de Bioética del Instituto Colombiano de Medicina Tropical adscrito a la universidad CES, así como por el comité de Bioética de la Sede de Investigación Universitaria de la Universidad de Antioquia y el consentimiento informado fue firmado por cada participante antes de tomar la muestra hemática.

63

RESULTADOS Población y genotipificación En nuestro estudio realizado en el valle de Aburrá, Colombia, del 100% (450) de los casos de dengue, el 98.8% (445) fueron confirmados como positivos en una o más de las pruebas diagnóstico de infección específica de DV. Los serotipos virales detectados fueron en su mayoría DV-2 (7 individuos), seguido de DV-3 (1 individuo), el resto fueron positivos por serología (IgM+ y/o IgG+). Al 26.6% (120) de los casos se logró determinarles el tipo de infección (primaria o secundaria). Del total de casos se logró diagnosticar el 8.8% con dengue hemorrágico y el 81.3% con dengue febril. Y durante el curso de dengue 31.3% presentaron ausencia de hemorragias y 59.1% presencia de hemorragias. De otro lado evaluando la historia de exposición a dengue en los individuos (182) sin evidencia previa de dengue resultaron el 100% seronegativos (IgM- e IgG-). Los porcentajes restantes y el número (N) en las comparaciones variaron dependiendo de los datos faltantes en algunos individuos. Entre las características generales que presentaron diferencias significativas se encuentran la distribución de individuos por sexo comparando positivos con seronegativos (mujer>hombre respectivamente), contrastando positivos con referentes, las mujeres están sub-representadas en ambos grupos y evaluando presencia/ausencia de hemorragias (mujer>hombre respectivamente). En cuanto a la edad, los más jóvenes se encontraron asociados con el diagnostico de dengue hemorrágico, igualmente a infección positiva comparados con referentes, sin embargo estuvieron sub-representados en los casos con presencia de hemorragias. Estos resultados pueden ser observados en la Tabla 4. También se encontraron diferencias significativas en cuanto a la distribución de los componentes de mezcla genética ancestral en los diferentes grupos de estudio. Evaluando la historia de exposición a dengue, comparando positivos con seronegativos, los primeros (positivos) mostraron mayores proporciones del componente genético Europeo y Amerindio, pero disminuyeron en Africano. Indicando la asociación del componente no Africano con la positivad en la pruebas diagnóstico. De otro lado evaluando la infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes se encontró los individuos positivos con menores proporciones de Europeo y Amerindio, mientras mayores de Africano. Esto sugiere asociación de Africano con infección y desarrollo de dengue. Por otra parte evaluando los fenotipos de progresión de la severidad del dengue, comparando se encontró en diagnosticados con dengue hemorrágico mayores niveles de componente Europeo y a pesar de que presentaron mayor proporción de Amerindio y menor de Africano los dos últimos no fueron significativos. Este resultado sugiere la asociación de Europeo con dengue hemorrágico. Finalmente cuando se evaluó las hemorragias en el curso de dengue, se encontró mayor proporción de los niveles de Europeo y Amerindio, pero bajos de Africano. Esto

64

indica la asociación de los componentes Europeo y Amerindio con la presencia de hemorragias en el curso del dengue. Tabla 5 y Figura 1. La genotipificación fue exitosa en 82.2% de los marcadores en el 100% de las muestras. De los marcadores exitosos 95.7% fueron polimórficos excepto rs1805010 y rs365238. EL desequilibrio de Hardy Weimberg se presentó en 4.3% de los marcadores y por esto fueron excluidos del análisis (rs8043770 y rs1143634). Las frecuencias alelicas y genotípicas reportadas en poblaciones ancestrales continentales (Europeos, Amerindios y Africanos), además de las alelicas calculadas para la población referente de nuestro estudio y esperadas para Colombianos de Medellín reportadas en mil genomas,150 para cada marcador de los genes candidatos y solo alelicas reportadas en poblaciones ancestrales para marcadores informativos de cada componente ancestral (AIMs) y calculadas en los mismos referentes de nuestro estudio, son presentadas en las Tablas 6 y 7 respectivamente. Es de anotar que en cada tabla se presenta la frecuencia del alelo de mayor peso molecular. Análisis de alelos y genotipos Asociaciones de variantes en genes del módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue Del análisis de asociación de 7 variantes en 5 genes candidatos directamente interviniendo en el modulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue, mostraron asociación 5 variantes en 4 genes. Cuatro de ellas (rs3775290, rs5743336, rs1800451 y rs7248637) en los genes (TLR3, NOD1, MBL2 y CD209 respectivamente) no solo se encontraron asociadas a fenotipos de infección con VD, sino también a fenotipos de progresión en el curso de dengue. Solo una variante (rs8105572 del gen CD209) de éste módulo 1, resultó exclusivamente asociada a progresión. Una variante rs1800450 del gen MBL2 no se encontró asociada a ninguno de los fenotipos evaluados. Más específicamente rs5743336 resultó asociada a positivos comparados con seronegativos y con referentes y también a dengue hemorrágico; rs3775290 y rs1800451 fueron asociadas a positivos comparados con referentes y a presencia de hemorragias; rs7248637 se encontró asociada a positivos comparados con referentes y a dengue hemorrágico. Finalmente rs8105572 se asoció solo a presencia hemorragias. No hubo asociación de la variante rs8105572, ni con positivos comparados con seronegativos, ni con referentes y tampoco con dengue hemorrágico; tampoco se asociaron las dos variantes rs3775290 y rs1800451, ni con positivos comparados con seronegativos ni con dengue hemorrágico; ni la variante rs7248637 con positivos comparados con seronegativos tampoco con presencia de hemorragias; finalmente tampoco la variante rs5743336 con presencia de hemorragias.

65

Tabla 4. Descripción de las características de la población de estudio.

Resultado

Infección

Tipo de

muestra

Forma

clínica

Hemorragias

Característica

Ser

(-)

Pos

(+)

OR

(IC95%)

Valor P

Refe-

rentes

Pos

(+)

OR

(IC95%)

Valor P

DF DH OR

(IC95%)

Valor P

Ausencia Presen-

cia

OR

(IC95%)

Valor P N=

182

N=

430

N=

407

N=

445

N=

366

N=

40

N=

141

N=

266

Hombre N 98 185 1,545

(1,091+2

,189)

0,014

118 192 1,321

(1,71+1,5

04)

<0,000

154 20 0,726

(0,378-1,397)

0,336

71 104 1,58

(1,04-

2,385)

0,029

Sexo % 53,8 43 29 43,1 42.1 50 50.4 39.1

Mujer N 84 245 289 253 212 20 70 162

% 46,2 57 71 56,9 57.9 50 49.6 60.9

Media 25,3 26,8 NA(NA)

0,514

39,2 26,8 NA(NA)

<0,000

27.4 20.5 NA(NA)

0,017

24.8 27.8 NA (NA)

0,041

Edad (DE) 18,4 19,4 20,5 19,4 19.5 18.0 20.4 18.9

Mediana 20 20 NA(NA)

NA

32 20 NA(NA)

NA

21 16 NA(NA)NA 18 21

(RI) 25 32 38 32 33 23 31 33

Prim N NA NA

NA(NA)

NA

NA NA 111 9

2,224

(0,982-5,035)

0,051

68 52

2,314

(1,409-

3.799)

0,001

Tipo

infec-

ción

% NA NA NA NA NA(NA)

NA

47.6 29.0 56.7 36.1

Sec N NA NA NA NA 122 22 52 92

% NA NA NA NA 52.4 71.0 43.3 63.9

Valores p de variables cuantitativas calculadas con U-Mann Witney y de variables dicotómicas con Chi-cuadrado. Proporción mujeres/hombres: en

Ser (-): seronegativos vs Pos (+): positivos=1,162; en referentes vs positivos =1,82; en DF: dengue febril vs DH: dengue hemorrágico=1,33 y en

ausencia/presencia de hemorragias=1.326. Prim: Primaria, Sec: Secundaria; OR: tasa de Odd; IC95%: intervalo de confianza con 95% de

confidencia.

66

Tabla 5. Proporciones de mezcla promedio en los diferentes grupos de estudio.

Componente Diagnóstico Infección Media DE Valor p Tipo de muestra Media DE Valor p

Europeo Positivos 0,51898 0,2584 <0,00 Positivos 0,52285 0,2562 <0,00 Seronegativos 0,42017 0,2644 Referentes 0,68345 0,0874 Total 0,48961 0,2639 Total 0,59885 0,2112

Amerindio Positivos 0,15917 0,0963 0,038 Positivos 0,15895 0,0964 0,001 Seronegativos 0,14602 0,0987 Referentes 0,17321 0,0627 Total 0,15526 0,0972 Total 0,1657 0,0825

Africano Positivos 0,32189 0,2986 <0,00 Positivos 0,31824 0,2952 <0,00 Seronegativos 0,43381 0,3084 Referentes 0.14336 0.0766 Total 0,35515 0,3057 Total 0,23548 0,2372

Componente Forma clínica Media DE Valor P Hemorragias Media DE Valor P

Europeo Dengue febril 0.50852 0.267316 0.019 Ausencia 0.31313 0.277858 <0.000 Dengue hemorrágico 0.62375 0.183515 Presencia 0.62967 0.171951 Total 0.51988 0.262346 Total 0.52001 0.262037

Amerindio Dengue febril 0.15626 0.097940 0.214 Ausencia 0.11667 0.100985 <0.000 Dengue hemorrágico 0.17325 0.082276 Presencia 0.18042 0.086886

Total 0.15793 0.096553 Total 0.15834 0.096780 Africano Dengue febril 0.33525 0.312457 0.164 Ausencia 0.57030 0.327757 <0.000

Dengue hemorrágico 0.20298 0.171307 Presencia 0.18989 0.185145 Total 0.32222 0.303926 Total 0.32168 0.303747

DE: Desviación estándar. Valores p calculados con U-Mann Whitney. En total del total de muestras (Europeo: 0,564+/-

0,234, Amerindio: 0,162+/-0,086 y Africano: 0,274+/-0,265.

67

Figura 1. Distribución de los componentes genéticos ancestrales en los diferentes grupos de estudio.

Total de muestras Positivos Seronegativos Referentes

Dengue febril Dengue hemorrágico Ausencia de Hemorragias Presencia de Hemorragias

Proporciones de los componentes ancestrales individuales b Africano=WAfr, Amerindio=NAm y Europeo=Eur

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

68

Tabla 6. Frecuencias alélicas y genotípicas calculadas y esperadas en 46 variantes de 26 genes candidatos en diferentes grupos referentes y poblaciones ancestrales.

Gen Variante RFLP Referentes

Europeo

Amerindio/ Asiático

Africano

CLM 1000 Genomas

IL6 rs1800795 G/C"=S 0.50 0.467 1 1 0.7167

C/C C/G G/G

0.319 0.434 0.248

0 0 1

0 0 1

IL6 rs2069843 R=G"/A 0,04 0,013 0,080 0,146 0,092

JAK1 rs11208534 A/G"=R 0,85 0,887 0,700 0,743 0,883

G/G A/G A/A

0 0.225 0.775

0.10 0.40 0.50

0.053 0.407 0.54

JAK1 rs17127114 R=G"/A 0,15 0,125 0,317 0,127 0,108

A/A G/A G/G

0 0.211 0.789

0.071 0.381 0.548

0.017 0.155 0.828

JAK1 rs2780895 Y=C"/T 0,33 0,232 0,420 0,743 0,217

T/T C/T C/C

0.045 0.375 0.580

0.180 0.480 0.340

0.559 0.369 0.072

MBL2 rs1800450 R=G"/A 0,17 0,150 0,150 0,009 0,183

MBL2 rs1800451 G/A"=R 0,96 0,982 0,939 0,748 0,975

A/A A/G G/G

0 0.035 0.965

0 0.012 0.988

0.062 0.381 0.558

IL8 rs2227532 Y=T"/C 0,05 0,00 0,040 0,080 0,017

IL8 rs2227307 T/G"=K 0,64 0,567 0,630 0,525 0,658

G/G G/T T/T

0.130 0.435 0.435

Aún no reportado

0.250 0.625 0.125

IL8 rs4073 W=A"/T 0,56 0,659 0,522 0,266 0,608

T/T A/T A/A

0.367 0.467 0.167

0.333 0.556 0.111

0.017 0.317 0.667

IL10 rs1800871 T/C"=Y 0,38 0,208 0,708 0,458 0,317

IL10 rs1518111 G/A"=R 0,72 0,788 0,620 0,527 0,692

IL10 rs3024498 A/G"=R 0,87 0,707 0,780 0,912 0,875

G/G A/G A/A

0.081 0.423 0.495

0 0 1

0.014 0.156 0.830

IL17 rs2275913 G/A"=R 0,82 0,646 0,720 0,934 0,750

A/A

0.124 0.209 0

69

G/A G/G

0.460 0.416

0.488 0.302

0.133 0.867

IL17 rs763780 Y=T"/G 0,04 0,049 0,100 0,080 0,033

IL18 rs1834481 C/G"=S 0,13 0,226 0,100 0,000 0,0917

IL18 rs5744247 S=G"/C 0,88 0,908 0,600 0,992 0,908

C/C G/C G/G

0.817 0.183 0

0.267 0.400 0.333

0.983 0.017 0

IL18 rs 1946518 G/T"=K 0,54 0,608 0,540 0,655 0,517

TRAIL rs365238 A/G"=R 1,00 0,896 0,920 0,934 0,892

NFKB1 rs2233409 C/T"=Y 0,82 0,775 0,850 0,900 0,775

T/T C/T C/C

0.067 0.317 0.671

0.022 0.222 0.756

0 0.200 0.800

NFKB1 rs8904 Y=C"/T 0,34 0,388 0,340 0,704 0,225

T/T C/T C/C

0.161 0.455 0.384

0.093 0.360 0.547

0.467 0.467 0.067

TLR3 rs3775290 R=G"/A 0,29 0,217 0,408 0,102 0,325

A/A A/G G/G

0.074 0.387 0.539

TNFA rs1800750 G/A"=R 0,94 0,991 0,950 0,996 0,958

A/A G/A G/G

0 0.018 0.982

0 0 1

0 0.009 0.991

TNFA rs1799964 T/C"=Y 0,79 0,788 0,750 0,876 0,825

IL1B rs16944 R=G"/A 0,48 0,358 0,500 0,580 0,458

A/A G/A G/G

0.133 0.451 0.416

0.244 0.465 0.291

0.372 0.416 0.212

IL1B rs1143627 C/T"=Y 0,53 0,500 0,483 0,354 0,467

IL1B rs1143634 Y=C"/T 0,18 0,208 0,110 0,093 0,158

IL12B rs3212227 A/C"=M 0,69 0,810 0,630 0,673 0,708

C/C A/C A/A

0.009 0.363 0.628

0.326 0.465 0.209

0.133 0.389 0.478

IL12B rs2569253 Y=T"/C 0,47 0,513 0,360 0,204 0,383

C/C T/C T/T

0.248 0.531 0.221

0.198 0.395 0.407

0.088 0.230 0.681

CD209 rs7248637 R=G"/A 0,15 0,129 0,110 0,358 0,133

70

A/A G/A G/G

0.036 0.188 0.777

0.058 0.360 0.581

0.159 0.398 0.442

CD209 rs8105572 C/T"=Y 0,90 0,819 0,860 0,783 0,917

T/T C/T C/C

0.035 0.292 0.673

0.040 0.200 0.760

0.08 0.274 0.646

RIPK2 rs40457 A/G"=R 0,60 0,544 0,490 0,217 0,567

G/G G/A A/A

0.301 0.487 0.212

0.058 0.442 0.500

0.619 0.327 0.053

CCR7 rs3136685 R=G"/A 0,21 0,142 0,220 0,531 0,217

A/A G/A G/G

0.018 0.248 0.735

0.070 0.372 0.558

0.274 0.513 0.212

CCR7 rs2023906 A/G"=R 0,91 0,673 0,880 1,000 0,875

G/G A/G A/A

0.106 0.442 0.451

0.106 0.442 0.451

0 0.178 0.822

IKBKE rs1059704 T/C"=Y 0,79 0,763 0,620 0,327 0,658

C/C C/T T/T

0.062 0.348 0.589

0.235 0.600 0.165

0.451 0.442 0.106

IKBKE rs11118132 C/G"=S 0,49 0,292 0,633 0,892 0,475

G/G C/G C/C

0.567 0.283 0.150

0.133 0.489 0.378

0.033 0.150 0.817

IL4R rs1805010 A/C"=N 1,00 0,509 0,459 0,549 0,592

IL4R rs1805016 K=T"/G 0,15 0,063 0,020 0,363 0,058

G/G T/G T/T

0 0.126 0.874

0 0 1

0.106 0.513 0.381

NOD1 rs5743336 Y=T"/C 0,04 0,00 0,020 0,265 0,008

C/C T/C T/T

0 0 1

0 0.040 0.960

0.062 0.407 0.531

NOD2 rs8043770 G/C"=S 0,65 0,700 0,083 0,375 0,508

IL6R rs8192284 A/C"=N 0,51 0,646 0,500 0,938 0,533

C/C A/C A/A

0.142 0.425 0.434

0.141 0.471 0.388

0.009 0.106 0.885

MICB rs3132468 R=A"/G 0,17 0,319 0,200 0,212 0,142

A/A A/G G/G

0.469 0.425 0.106

0.721 0.267 0.012

0.611 0.354 0.035

PLCE1 rs3765524 C/T"=Y 0,75 0,712 0,830 0,571 0,783

CCL2 rs1024611 T/C"=Y 0,58 0,695 0,540 0,796 0,583

C/C

0.053 0.372 0.053

71

T/C T/T

0.504 0.442

0.512 0.116

0.301 0.646

IFNG rs2069705 C/T"=Y 0,51 0,376 0,590 0,464 0,442

CSF3 rs2227319 R=G"/A 0,36 0,379 0,520 0,035 0,342

La frecuencia reportada es la del alelo 1, equivalente al alelo de mayor peso molecular, es decir la ausencia del sitio de corte en los RFLPs (alelo con ausencia de comillas " en la tabla). La letra con comillas indica el alelo de corte. Rs: Secuencia de referencia reportada en NCBI: National Center for Biotechnology Information. CLM: Colombianos de Medellín reportados en la base de datos del proyecto 1000 Genomas. En negrilla variantes monomórficas. Tabla 7. Frecuencias alélicas de 30 marcadores informativos de componente ancestral (AIM’s) calculadas en los referentes poblacionales de Antioquia y reportadas en diferentes poblaciones ancestrales continentales.

Frecuencias alélicas*

Marcador Alelos Referentes Africanos Europeos Amerindios

MID1752 139/104 0,614 0,560 0,290 0,920

FYNULL T/C 0,900 0,001 0,998 1,000

AT3 572/504 0,317 0,858 0,282 0,061

MID1386 110/89 0,667 0,770 0,730 0,070

MID921 141/137 0,354 0,690 0,090 0,060

MID1586 T/G 0,500 0,960 0,420 0,260

MID52 G/T 0,618 0,740 0,840 0,140

MID817 109/103 0,641 0,960 0,650 0,130

MID1039 118, 115 0,554 0,980 0,270 0,830

MID1358 140/117 0,261 0,800 0,060 0,040

MID856 128/88 0,324 0,660 0,150 0,690

MID944 25/108 0,718 0,890 0,390 0,950

MID108 138/112 0,426 0,580 0,320 0,040

MID104 140/110 0,489 0,560 0,350 0,110

MID2062 160/154 0,543 0,410 0,290 0,930

MID472 141/120 0,644 0,910 0,810 0,420

MID1066 103/84 0,329 0,840 0,280 0,260

LPL C/T 0,511 0,971 0,492 0,442

MID1780 148/145 0,340 0,740 0,230 0,690

DRD2 T/C 0,540 0,135 0,670 0,045

APOA 409/108 0,857 0,420 0,925 0,977

MID1723 150/145 0,330 0,900 0,180 0,150

72

RB2300 G/A 0,321 0,926 0,315 0,175

MID2264 45/241 0,500 1,000 0,300 1,000

MID2269 71/167 0,580 0,900 0,400 0,900

OCA2 A/G 0,554 0,115 0,746 0,488

MID818 143/119 0,726 0,090 0,780 0,980

PV92 716/416 0,420 0,225 0,152 0,792

SB19.3 767/456 0,795 0,415 0,903 0,645

MID154 147/121 0,404 0,820 0,250 0,140

* El alelo reportado corresponde al de mayor peso molecular, como se reporta usualmente para los AIM’s.

Asociaciones de variantes en genes de los módulos 2 y 3 del modelo fisiopatológico del dengue

Del análisis de asociación de 39 variantes en 21 genes candidatos directamente interviniendo en los módulos 2 y 3 del modelo fisiopatológico del dengue, mostraron asociación 26 variantes en 18 genes. De un lado se encontraron asociadas a fenotipos de infección con VD 10 variantes (rs16944, rs3212227, 2275913, rs2069843, rs3024498, rs2227307, rs3132468, rs1059704, rs8904, rs17127114) en 10 genes (IL1B, IL12B, IL17, IL6, IL10, IL8, MICB, IKBKE, NFKB1 y JAK1 respectivamente). Por otro lado se encontró 4 variantes (rs2227319, rs1024611, rs3136685, rs2233409) en 4 genes (CSF3, CCL2, CCR7, NFKB1A respectivamente) asociadas a fenotipos de progresión en el curso de dengue. Además se encontraron 12 variantes (rs2569253, rs1800750, rs1800795, rs5744247, rs8192284, rs1805016, rs4073, rs2023906, rs11118132, rs40457, rs11208534 y rs2780895 ) en 11 genes (IL12B, TNFA, IL6, IL18, IL6R, IL4R, IL8, CCR7, IKBKE, RIPK2 y las últimas dos en JAK1, respectivamente) asociadas a ambos fenotipos , es decir evaluando tanto fenotipos involucrados en la infección, así como en la progresión del dengue). No se encontraron asociadas 10 variantes en 8 genes a ninguno de los fenotipos evaluados, ellas son las variantes rs1799964, rs1143627, rs763780, rs2069705, rs22277532 y rs3765524 de los genes TNFA, IL1B, IL17, IFNG, IL8 y PLC1 respectivamente. Tampoco las rs1800871 y rs1518111 del gen IL10, ni las variantes rs1834481 y rs1946518 del gen IL18.

Específicamente en los fenotipos relacionados con la infección si resultaron asociadas: 2 variantes (rs2275913 y rs8904) a positivos comparados con seronegativos; 6 variantes (rs16944, rs2069843, rs3024498, rs2227307, rs3132468, rs17127114) a positivos comparados con referentes y 2 variantes

73

(rs3212227, rs1059704) asociadas con positivos comparados con seronegativos y con referentes. Detalladamente evaluando los fenotipos implicados en progresión del dengue se encontraron asociadas las siguientes: 1 variante (rs2227319) a dengue hemorrágico; 1 variante (rs2233409) a presencia de hemorragias y 2 variantes (rs1024611 y rs3136685) con dengue hemorrágico y a presencia de hemorragias.

Las variantes asociadas con ambos, infección y progresión, se desglosan de la siguiente manera: 2 variantes (rs2569253 y rs11208534) asociadas a positivos comparados con seronegativos y también a presencia de hemorragias; 1 variante (rs1800750) asociada con positivos comparados con seronegativos y a dengue hemorrágico; 3 variantes (rs1800795, rs5744247 y rs8192284) asociadas con positivos comparados con referentes y presencia de hemorragias; 4 variantes (rs1805016, rs2023906, rs2780895 y rs40457) asociadas con positivos comparados con seronegativos, con referentes y asociadas también con presencia de hemorragias; 1 variante (rs4073) asociada a positivos comparados con referentes, también a dengue hemorrágico y presencia de hemorragias; finalmente 1 variante (rs11118132) asociada a positivos comparados con seronegativos, con referentes y también asociada a dengue hemorrágico y a presencia de hemorragias. No se encontró asociación de las siguientes variantes en las respectivas comparaciones: No hubo asociación de una 1 variante (rs2233409), ni con positivos comparados con seronegativos, ni con referentes y tampoco con dengue hemorrágico; tampoco se asociaron 3 variantes (rs1800795, rs5744247 y rs8192284) ni con positivos comparados con seronegativos ni con dengue hemorrágico; no se encontró asociación de 6 variantes (rs16944, rs2069843, rs3024498, rs2227307, rs3132468 y rs17127114) ni con positivos comparados con seronegativos ni con dengue hemorrágico ni tampoco con presencia de hemorragias; tampoco se encontró asociación de 2 variantes (rs3212227 y rs1059704) con dengue hemorrágico ni con hemorragias; ni asociación en 2 variantes (rs2569253 y rs1800750) a positivos comparados con referentes ni tampoco con presencia de hemorragias; no hubo asociación de 2 variantes (rs2275913 y rs8904 ) a positivos comparados con referentes ni tampoco con dengue hemorrágico ni presencia de hemorragias; no se encontró asociación de 1 variante (rs2227319) ni con positivos comparados con seronegativos, ni con referentes y tampoco con presencia de hemorragias; ni asociación de 2 variantes (rs1024611 y rs3136685) con positivos comparados con seronegativos ni con referentes; tampoco hubo asociación de 1 variante (rs11208534) a positivos comparados con referentes ni a dengue hemorrágico; tampoco asociación de 4 variantes (rs1805016, rs2023906, rs2780895 y rs40457) a dengue hemorrágico; ni asociación de1 variante (rs4073) a positivos comparados seronegativos.

74

El resumen del total de asociaciones y no asociaciones alelicas y genotipicas significativas pueden ser observadas en la Tabla 8, comparando positivos con seronegativos resultaron asociadas 13 variantes en 11 genes, contrastando positivos con referentes se encontraron 21 variantes en 17 genes asociadas, 8 variantes en 8 genes asociadas a dengue hemorrágico y finalmente 17 variantes en 11 genes asociadas a presencia de hemorragias, el resto del panel (casillas en blanco de la tamba 8, resultaron con diferencias significativas en sus distribuciones. Allí, en dicha tabla se señalan las asociaciones a riesgo o protección y si está asociado a un alelo y/o a genotipo(s). Además si dio o no dio asociación teniendo en cuenta uno, dos o tres componentes ancestrales (Europeo, Amerindio y/o Africano) en ensayos independientes; señalando además los más significativos. El detalle de los resultados más significativos (tasas de Odd, intervalos de conciencia con 95% de confidencia, valores P y frecuencias) están en extenso así: asociaciones alelicas a positivos comparados con seronegativos en la Tabla 9, a positivos comparados con referentes en la Tabla 10; a dengue hemorrágico en la Tabla 11 y a hemorragias en la Tabla 12. También el detalle de asociaciones genotípicas pueden ser observadas en positivos comparados con seronegativos en la Tabla 13, a positivos comparados con referentes en la Tabla 14; a dengue hemorrágico en la Tabla 15 y a presencia de hemorragias en la Tabla 16. El detalle de las no asociaciones a alelos y genotipos son datos no mostrados por ser tablas muy extensas. Análisis de haplotipos y combinaciones alelicas El análisis de haplotipos y combinaciones alelicas fue hecho agrupando las variantes génicas encontradas asociadas a fenotipos de infección y/o progresión del dengue en las anteriores comparaciones de acuerdo a los diferentes módulos de nuestro modelo fisiopatológico del dengue, además en la mayoría de los casos, agrupadas considerando el número del cromosoma y en todo caso el orden donde se encuentran ubicadas dentro de los cromosomas.

Por un lado evaluando la historia de exposición a dengue resultaron asociados 8 haplotipos y 4 combinaciones alelicas a positivos comparados con seronegativos (IgM- e IgG-) de la siguiente manera: En el cromosoma 1, tres de los haplotipos generados por las variantes (rs2780895-rs11208534-rs1059704-rs11118132)

75

Tabla 8. Resumen de las 31 variantes en 22 genes asociadas y 9 variantes en 11 genes no asociadas en los diferentes grupos de comparación.

Clasificación functional

Cr Gen Variante Positivos Vs Seronegativos = 13 en 11 genes

Positivos Vs Referentes =21 en 17 genes

DHF Vs DC =8 en 8 genes

Presencia de Hemorragias Vs Ausencia = 17 en 15genes

RFLP

Alelos Genoti-pos

Alelos Genoti- pos

Alelos Genoti-pos

Alelos Genoti-pos

Recep

tor

co

mp

lem

en

ta-

rio

del

vir

us

den

gu

e

4 TLR3 rs3775290 R=G"/A R*3 R*3 RAmr 7 NOD1 rs5743336 Y=T"/C *3 *3 R*3 R*3 PEur P3 10 MBL2 rs1800450 R=G"/A MBL2 rs1800451 G/A"=R R*Amr R*Amr P*Amr P*3 16 NOD2 rs8043770 G/C"=S NA NA NA NA NA NA NA NA 19 CD209 rs7248637 R=G"/A PEurAfr P*EurAfr PAmr CD209 rs8105572 C/T"=Y PAmr

Cit

oq

uin

a p

ro-i

nfl

am

ato

ria

2 IL1B rs16944 R=G"/A PAmr IL1B rs1143627 C/T"=Y IL1B rs1143634 Y=C"/T NA NA NA NA NA NA NA NA

5 IL12B rs3212227 A/C"=M PAmr PAmr PEurAfr PEurAfr IL12B rs2569253 Y=T"/C R*AfrAmr RAfrAmr PEur

6 IL17 rs 2275913 G/A"=R RAmr R*Amr IL17 rs763780 Y=T"/G

6 TNFA rs1800750 G/A"=R P*3 P*3 RAmr 6 TNFA rs1799964 T/C"=Y 7 IL6 rs2069843 R=G"/A RAmr

IL6 rs1800795 G/C"=S P3 R*Amr R*Amr 11 IL18 rs1834481 C/G"=S

IL18 rs5744247 S=G"/C R*3 REur IL18 rs 1946518 G/T"=K

12 IFNG rs2069705 C/T"=Y 17 CSF3 rs2227319 R=G"/A P3

Cit

oq

uin

a

an

ti-i

nfl

a-

mato

ria

1 IL10 rs1800871 T/C"=Y IL10 rs1518111 G/A"=R IL10 rs3024498 A/G"=R PEurAmr

76

Recep

-

tor

de

cit

oq

ui-

na

1 IL6R rs8192284 A/C"=N P*Amr P*Amr R*Amr R*Amr 3 TRAIL rs365238 A/G"=R NA NA NA NA NA NA NA NA 16 IL4R rs1805010 A/C"=N NA NA NA NA NA NA NA NA

IL4R rs1805016 K=T"/G RAmrEur R3 R*Amr PAfr

PAmr

Qu

imo

-

qu

inas

4 IL8 rs2227532 Y=T"/C IL8 rs2227307 T/G"=K R*3 IL8 rs4073 W=A"/T RAmr R*Amr P3*

R3 RAmr RAmr

17 CCL2 rs1024611 T/C"=Y P3 REur

Recep

-

tore

s

de

qu

imo

-

qu

inas

17 CCR7 rs3136685 R=G"/A PAmr RAfr PAmr CCR7 rs2023906 A/G"=R

RAmr R3 REurAfr REurAfr RAmr

Co

mp

lejo

mayo

r d

e

his

toco

m-

pati

bilid

ad

6 MICB rs3132468 R=A"/G PAfr

Inh

ibi-

do

r d

e

NF

KB

1 IKBKE rs1059704 T/C"=Y P*3 P*3 R*3 R3 IKBKE rs11118132 C/G"=S RAmr RAmr P*Amr P*Amr RAmr R*Amr R*Amr

14 NFKB1 rs2233409 C/T"=Y RAmr NFKB1 rs8904 Y=C"/T PAmr PAmr

Pro

tein

a

kin

asa

1 JAK1 rs11208534 A/G"=R RAmr R3 PAmr

JAK1 rs17127114 R=G"/A RAfr PEurAfr

JAK1 rs2780895 Y=C"/T PAmr P3 PEurAfr PEurAfr P*Amr PAmr 8 RIPK2 rs40457 A/G"=R PAmr PAmr RAmr R*Afr RAfr

Iso

en

-

zim

a d

e

PL

C

10 PLCE1 rs3765524 C/T"=Y

Cr: cromosoma, RFLP: polimorfimos en longitud de los grafmentos de restricción, rs: secuencia de referencia en NCBI: National center for biotecnology information, *: altamente significativo; R: riesgo, P: Protección; Eur: asociado teniendo en cuenta el componente Africaco, Amr: Amerindio y Afr: Africano; 3: asociado teniendo en cuenta los tres componentes en ensayos independientes; NA: no aplica.

77

Tabla 9. Asociaciones alelicas a positivos comparandos con seronegativos justado edad, sexo y componente ancestral.

CHR=Cromosoma, SNP=Polimorfismo de un solo nucleótido A1=Alelo de menor frecuencia (MAF). F_A: Frecuencia del alelo A1 en afectados. F_U: Frecuencia del alelo A1 en no afectados. OR: Tasa de Odd. L95: Límite inferior de intervalo de confianza. U95: Límite superior del intervalo de confianza. P: significancia de la regresión logística. En negrilla los ORs de riesgo.

Tabla 10. Asociaciones alecas a positivos comparado con referentes justado edad, sexo y componente ancestral.

Europeo

CHR GEN SNP A1 FA FU OR L95 U95 P

1 JAK1 rs2780895 T 0,352 0,329 0.7671 0.5888 0.9994 0.04944 1 IKBKE rs1059704 C 0,261 0,215 1.48 1.113 1.97 0.00709 4 TLR3 rs3775290 A 0,346 0,287 1.515 1.177 1.949 0.001257 5 IL12B rs3212227 C 0,283 0,317 0.7216 0.5594 0.9308 0.01199 7 NOD1 rs5743336 C 0,275 0,044 5.257 3.08 8.972 1,17E-06

17 CCR7 rs2023906 G 0,108 0,089 1.565 1.041 2.355 0.03148 19 CD209 rs7248637 A 0,153 0,157 0.6479 0.4587 0.9151 0.01374

Amerindio


1 IL6R rs8192284 C 0,372 0,486 0.6468 0.5136 0.8146 0.0002133 1 IKBKE rs1059704 C 0,261 0,215 1.44 1.091 1.899 0.009904 1 IKBKE rs11118132 G 0,404 0,520 0.7154 0.5685 0.9003 0.004302 4 IL8 rs4073 A 0,527 0,443 1.34 1.069 1.679 0.01107 4 TLR3 rs3775290 A 0,346 0,287 1.334 1.051 1.692 0.01791

Europeo

CHR GEN SNP A1 F_A F_U OR L95 U95 P

1 IKBKE rs1059704 C 0,261 0,368 0.6116 0.4563 0.8198 0.001002 6 TNFA rs1800750 A 0,047 0,150 0.4233 0.2323 0.7714 0.004992 7 NOD1 rs5743336 C 0,275 0,628 0.2369 0.1424 0.394 2,92E-05 16 IL4R rs1805016 G 0,194 0,127 1.626 1.008 2.624 0.04622

Amerindio


1 JAK1 rs2780895 T 0,352 0,439 0.7227 0.5535 0.9436 0.01703 1 IKBKE rs1059704 C 0,261 0,368 0.6082 0.4552 0.8128 0.0007744 1 IKBKE rs11118132 G 0,404 0,317 1.377 1.046 1.812 0.02262 5 IL12B rs3212227 C 0,283 0,353 0.7131 0.5393 0.9427 0.01761 5 IL12B rs2569253 C 0,444 0,349 1.47 1.127 1.918 0.004546 6 TNFA rs1800750 A 0,047 0,150 0.3816 0.2115 0.6883 0.001371 6 IL17 rs2275913 A 0,183 0,122 1.594 1.092 2.328 0.01574 7 NOD1 rs5743336 C 0,275 0,628 0.2971 0.1906 0.4631 8,35E-05 8 RIPK2 rs40457 G 0,458 0,541 0.752 0.574 0.9852 0.0386 14 NFKB1 rs8904 T 0,353 0,443 0.7103 0.5443 0.9268 0.01174 16 IL4R rs1805016 G 0,194 0,127 1.705 1.064 2.734 0.0266 17 CCR7 rs2023906 G 0,108 0,066 1.756 1.066 2.895 0.02719

Africano


1 IKBKE rs1059704 C 0,261 0,368 0.6147 0.459 0.8233 0.001098 5 IL12B rs2569253 C 0,444 0,349 1.334 1.01 1.762 0.04241 6 TNFA rs1800750 A 0,047 0,150 0.4341 0.2366 0.7965 0.007042 7 NOD1 rs5743336 C 0,275 0,628 0.2548 0.1557 0.417 5,35E-05

78

7 IL6 rs2069843 A 0,079 0,044 1.67 1.024 2.726 0.04004 7 NOD1 rs5743336 C 0,275 0,044 5.087 2.984 8.67 2,26E-06

10 MBL2 rs1800451 A 0,084 0,038 2.2 1.299 3.724 0.003335

Africano


1 JAK1 rs2780895 T 0,352 0,329 0.7511 0.5759 0.9797 0.03475 1 IKBKE rs1059704 C 0,261 0,215 1.497 1.124 1.992 0.005706 4 TLR3 rs3775290 A 0,346 0,287 1.525 1.186 1.961 0.001004 5 IL12B rs3212227 C 0,283 0,317 0.7461 0.5792 0.9611 0.02339 6 MICB rs3132468 G 0,145 0,165 0.7079 0.5019 0.9983 0.04886 7 NOD1 rs5743336 C 0,275 0,044 5.222 3.054 8.929 1,54E-06

17 CCR7 rs2023906 G 0,108 0,089 1.621 1.079 2.434 0.02003 19 CD209 rs7248637 A 0,153 0,157 0.6158 0.433 0.8758 0.006972


Tabla 11. Asociaciones alelicas a dengue hemorrágico ajustado edad, sexo y componente ancestral.

Europeo


7 NOD1 rs5743336 C 0.06818 0.2663 0.3512 0.1229 1.003 0.05067

Amerindio


1 IKBKE rs11118132 G 0.4857 0.3828 1.713 1.025 2.863 0.04004


Tabla 12. Asociaciones alelicas a presencia de hemorragias ajustado edad, sexo y componente ancestral.

Europeo


5 IL12B rs2569253 C 0.458 0.3993 0.6592 0.4458 0.9747 0.03676

Amerindio


1 JAK1 rs2780895 T 0.286 0.4731 0.6178 0.4397 0.8681 0.005527 1 IL6R rs8192284 C 0.4309 0.2481 1.698 1.189 2.426 0.003592 1 IKBKE rs11118132 G 0.4621 0.2852 1.726 1.204 2.473 0.002954 4 IL8 rs4073 T 0.5302 0.3843 1.405 1.022 1.931 0.03611 7 IL6 rs1800795 C 0.1837 0.05435 4.173 1.456 11.96 0.007819

10 MBL2 rs1800451 A 0.04938 0.1591 0.3685 0.2026 0.6703 0.001073 16 IL4R rs1805016 G 0.1542 0.2654 0.6076 0.3881 0.9512 0.02936

Africano

CHR GEN SNP- A1 F_A F_U OR L95 U95 P

8 RIPK2 rs40457 G 0.4561 0.4959 1.843 1.183 2.871 0.006851

79

17 CCR7 rs3136685 A 0.2437 0.3514 1.78 1.039 3.049 0.03571


Tabla 13. Asociaciones genotípicas a positivos comparados con seronegativos ajustado sexo, edad y componente genético ancestral.

Europeo

Modelo Genotipo Seronegativos Positivos OR (IC 95%) Valor P

JAK1 SNP: rs2780895 Sobredominante C/C-T/T 78 (47.6%) 226 (59.8%) 1.00 0.016

C/T 86 (52.4%) 152 (40.2%) 0.63 (0.43-0.92) IKBKE SNP: rs1059704 Codominante T/T 66 (39%) 203 (53.4%) 1.00 0.0041

T/C 82 (48.5%) 156 (41%) 0.63 (0.43-0.94) C/C 21 (12.4%) 21 (5.5%) 0.36 (0.18-0.70)

TNFA SNP: rs1800750 Recesivo G/G-G/A 53 (89.8%) 316 (99.7%) 1.00 1,00E-04

A/A 6 (10.2%) 1 (0.3%) 0.04 (0.00-0.30) NOD1 SNP: rs5743336 Codominante T/T 3 (6.4%) 131 (62.7%) 1.00 <0.0001

T/C 29 (61.7%) 41 (19.6%) 0.02 (0.00-0.07) C/C 15 (31.9%) 37 (17.7%) 0.02 (0.01-0.11)

IL4R SNP: rs1805016 Dominante T/T 79 (75.2%) 235 (63%) 1.00 0.039

T/G-G/G 26 (24.8%) 138 (37%) 1.68 (1.02-2.78) CCR7 SNP: rs2023906 Recesivo A/A-A/G 173 (100%) 327 (98.2%) 1.00 0.041

G/G 0 (0%) 6 (1.8%) NA (0.00-NA)

Amerindio

Modelo Genotipo Seronegativos Positivos OR (IC 95%) Valor P

JAK1 SNP: rs2780895 Dominante C/C 49 (29.9%) 169 (44.7%) 1.00 0.002

C/T-T/T 115 (70.1%) 209 (55.3%) 0.54 (0.36-0.80) JAK1 SNP: rs11208534 Codominante A/A 78 (63.9%) 237 (69.7%) 1.00 0.04

A/G 43 (35.2%) 89 (26.2%) 0.70 (0.45-1.11) G/G 1 (0.8%) 14 (4.1%) 4.85 (0.62-

38.03) IKBKE SNP: rs1059704 Codominante T/T 66 (39%) 203 (53.4%) 1.00 0.0031

T/C 82 (48.5%) 156 (41%) 0.64 (0.43-0.94) C/C 21 (12.4%) 21 (5.5%) 0.35 (0.18-0.68)

IKBKE SNP: rs11118132 Dominante C/C 83 (48.5%) 132 (36.7%) 1.00 0.033

C/G-G/G 88 (51.5%) 228 (63.3%) 1.52 (1.04-2.23) IL12B SNP: rs3212227 Dominante A/A 69 (41.6%) 202 (51.5%) 1.00 0.033

A/C-C/C 97 (58.4%) 190 (48.5%) 0.67 (0.46-0.97) IL12B SNP: rs2569253 Dominante T/T 72 (42.9%) 125 (31.9%) 1.00 0.016

80

T/C-C/C 96 (57.1%) 267 (68.1%) 1.59 (1.09-2.32) TNFA SNP: rs1800750 Recesivo G/G-G/A 53 (89.8%) 316 (99.7%) 1.00 1,00E-04

A/A 6 (10.2%) 1 (0.3%) 0.03 (0.00-0.27) IL17A SNP: rs2275913 Dominante G/G 134 (77.9%) 241 (66.4%) 1.00 0.0072

G/A-A/A 38 (22.1%) 122 (33.6%) 1.77 (1.16-2.71) NOD1 SNP: rs5743336 Codominante T/T 3 (6.4%) 131 (62.7%) 1.00 <0.0001

T/C 29 (61.7%) 41 (19.6%) 0.02 (0.01-0.08) C/C 15 (31.9%) 37 (17.7%) 0.04 (0.01-0.16)

RIPK2 SNP: rs40457 Dominante A/A 32 (20.4%) 112 (30.3%) 1.00 0.034

A/G-G/G 125 (79.6%) 258 (69.7%) 0.62 (0.39-0.97) NFKB1A SNP: rs8904 Dominante C/C 51 (32.1%) 167 (43.6%) 1.00 0.017

C/T-T/T 108 (67.9%) 216 (56.4%) 0.62 (0.42-0.92) IL4R SNP: rs1805016 Dominante T/T 79 (75.2%) 235 (63%) 1.00 0.021

T/G-G/G 26 (24.8%) 138 (37%) 1.77 (1.07-2.90) CCR7 SNP: rs2023906 Codominante A/A 151 (87.3%) 267 (80.2%) 1.00 0.024

A/G 22 (12.7%) 60 (18%) 1.55 (0.91-2.65) G/G 0 (0%) 6 (1.8%) NA (0.00-NA)

Africano

Modelo Genotipo Negativos Positivos OR (IC 95%) Valor P

JAK1 SNP: rs2780895 Sobredominante C/C-T/T 78 (47.6%) 226 (59.8%) 1.00 0.016

C/T 86 (52.4%) 152 (40.2%) 0.63 (0.43-0.92) IKBKE SNP: rs1059704 Codominante T/T 66 (39%) 203 (53.4%) 1.00 0.0045

T/C 82 (48.5%) 156 (41%) 0.64 (0.43-0.95) C/C 21 (12.4%) 21 (5.5%) 0.36 (0.18-0.71)

IL12B SNP: rs2569253 Codominante T/T 72 (42.9%) 125 (31.9%) 1.00 0.12

T/C 75 (44.6%) 186 (47.5%) 1.27 (0.84-1.91) C/C 21 (12.5%) 81 (20.7%) 1.83 (1.02-3.31)

TNFA SNP: rs1800750 Recesivo G/G-G/A 53 (89.8%) 316 (99.7%) 1.00 2,00E-04

A/A 6 (10.2%) 1 (0.3%) 0.04 (0.00-0.34) NOD1 SNP: rs5743336 Codominante T/T 3 (6.4%) 131 (62.7%) 1.00 <0.0001

T/C 29 (61.7%) 41 (19.6%) 0.02 (0.00-0.07) C/C 15 (31.9%) 37 (17.7%) 0.03 (0.01-0.12)

IL4R SNP: rs1805016 Dominante T/T 79 (75.2%) 235 (63%) 1.00 0.046

T/G-G/G 26 (24.8%) 138 (37%) 1.65 (1.00-2.73) CCR7 SNP: rs2023906 Recesivo A/A-A/G 173 (100%) 327 (98.2%) 1.00 0.04

G/G 0 (0%) 6 (1.8%) NA (0.00-NA)

SNP: Polimorfismo simple de un solo nucleótido, OR: Tasa de Odd. IC: Intervalo de confianza con 95% de confidencia. El Valor P: significancia estadística. El IC, OR y Valor P, se calcularon mediante regresión logística co-variando sexo, edad y porcentaje de ancestría individual de cada componente.

81

Tabla 14. Asociaciones genotípicas a positivos comparados con referentes ajustado sexo, edad y componente genético ancestral.

Europeo

Modelo Genotipo Referentes Positivos OR (IC 95%) Valor P


C/T-T/T 149 (53.8%) 209 (55.3%) 0.69 (0.49-0.99) JAK1 SNP: rs17127114 Sobredominante

G/G-A/A 246 (75.7%) 307 (77.3%) 1.00 0.046 G/A 79 (24.3%) 90 (22.7%) 0.67 (0.45-0.99)

IKBKE SNP: rs1059704 Dominante T/T 186 (61.8%) 203 (53.4%) 1.00 0.01

T/C-C/C 115 (38.2%) 177 (46.6%) 1.57 (1.11-2.23) IL10 SNP: rs3024498 Recesivo A/A-A/G 88 (96.7%) 98 (100%) 1.00 0.039

G/G 3 (3.3%) 0 (0%) 0.00 (0.00-NA) IL8 SNP: rs2227307 Recesivo T/T-T/G 222 (90.6%) 260 (83.6%) 1.00 0.0089

G/G 23 (9.4%) 51 (16.4%) 2.10 (1.19-3.72) TLR3 SNP: rs3775290 Recesivo G/G-G/A 286 (92.6%) 340 (85.9%) 1.00 7,00E-

04 A/A 23 (7.4%) 56 (14.1%) 2.54 (1.46-4.42) IL12B SNP: rs3212227 Dominante A/A 151 (47.6%) 202 (51.5%) 1.00 0.014

A/C-C/C 166 (52.4%) 190 (48.5%) 0.66 (0.47-0.92) NOD1 SNP: rs5743336 Codominante T/T 155 (91.2%) 131 (62.7%) 1.00 <0.0001

T/C 15 (8.8%) 41 (19.6%) 3.35 (1.72-6.53) C/C 0 (0%) 37 (17.7%) NA (0.00-NA)

IL18 SNP: rs5744247 Recesivo C/C-G/C 307 (100%) 381 (97.9%) 1.00 6,00E-

04 G/G 0 (0%) 8 (2.1%) NA (0.00-NA) CCR7 SNP: rs2023906 Dominante A/A 260 (83.6%) 267 (80.2%) 1.00 0.033

A/G-G/G 51 (16.4%) 66 (19.8%) 1.64 (1.04-2.59) CD209 SNP: rs7248637 Dominante G/G 222 (70.7%) 274 (72.5%) 1.00 0.0091

G/A-A/A 92 (29.3%) 104 (27.5%) 0.60 (0.41-0.88) IL6 SNP: rs1800795 --- G/G 0 (0%) 103 (72%) 1.00 0.016

G/C 3 (100%) 40 (28%) 0.00 (0.00-NA)

Amerindio


IL6R SNP: rs8192284 Dominante A/A 78 (25.4%) 163 (40.5%) 1.00 2,00E-

04 A/C-C/C 229 (74.6%) 239 (59.5%) 0.52 (0.36-0.73) IKBKE SNP: rs1059704 Dominante T/T 186 (61.8%) 203 (53.4%) 1.00 0.0089

T/C-C/C 115 (38.2%) 177 (46.6%) 1.55 (1.11-2.16) IKBKE SNP: rs11118132 Dominante C/C 72 (23%) 132 (36.7%) 1.00 0.0082

C/G-G/G 241 (77%) 228 (63.3%) 0.61 (0.43-0.88)

IL10 SNP: rs3024498

82

Recesivo A/A-A/G 88 (96.7%) 98 (100%) 1.00 0.033 G/G 3 (3.3%) 0 (0%) 0.00 (0.00-NA)

IL1B SNP: rs16944 Recesivo A/A-G/A 226 (71.5%) 306 (80.1%) 1.00 0.037

G/G 90 (28.5%) 76 (19.9%) 0.67 (0.47-0.98) IL8 SNP: rs4073 Recesivo T/T-A/T 239 (81%) 255 (69.1%) 1.00 0.002

A/A 56 (19%) 114 (30.9%) 1.83 (1.24-2.70) IL8 SNP: rs2227307 Recesivo T/T-T/G 222 (90.6%) 260 (83.6%) 1.00 0.01

G/G 23 (9.4%) 51 (16.4%) 2.03 (1.17-3.53) TLR3 SNP: rs3775290 Recesivo G/G-G/A 286 (92.6%) 340 (85.9%) 1.00 0.0048

A/A 23 (7.4%) 56 (14.1%) 2.12 (1.24-3.63) IL6 SNP: rs1800795 --- G/G 0 (0%) 103 (72%) 1.00 0.0063

G/C 3 (100%) 40 (28%) 0.00 (0.00-NA) NOD1 SNP: rs5743336 Codominante T/T 155 (91.2%) 131 (62.7%) 1.00 <0.0001

T/C 15 (8.8%) 41 (19.6%) 3.43 (1.79-6.57) C/C 0 (0%) 37 (17.7%) NA (0.00-NA)

RIPK2 SNP: rs40457 Recesivo A/A-A/G 278 (86.3%) 290 (78.4%) 1.00 0.035

G/G 44 (13.7%) 80 (21.6%) 1.58 (1.03-2.44) MBL2 SNP: rs1800451 Dominante G/G 271 (92.2%) 301 (84.3%) 1.00 0.0043

G/A-A/A 23 (7.8%) 56 (15.7%) 2.17 (1.26-3.76) IL18 SNP: rs5744247 Recesivo C/C-G/C 307 (100%) 381 (97.9%) 1.00 0.0021

G/G 0 (0%) 8 (2.1%) NA (0.00-NA) IL4R SNP: rs1805016 Sobredominante T/T-G/G 233 (76.6%) 242 (64.9%) 1.00 0.0036

T/G 71 (23.4%) 131 (35.1%) 1.70 (1.18-2.43)

Africano



C/T-T/T 149 (53.8%) 209 (55.3%) 0.68 (0.48-0.97) JAK1 SNP: rs17127114 Recesivo

G/G-G/A 320 (98.5%) 383 (96.5%) 1.00 0.033 A/A 5 (1.5%) 14 (3.5%) 3.10 (1.04-9.25)

IKBKE SNP: rs1059704 Dominante T/T 186 (61.8%) 203 (53.4%) 1.00 0.0081

T/C-C/C 115 (38.2%) 177 (46.6%) 1.60 (1.13-2.26) IL8 SNP: rs2227307 Recesivo T/T-T/G 222 (90.6%) 260 (83.6%) 1.00 0.0074

G/G 23 (9.4%) 51 (16.4%) 2.14 (1.21-3.78) TLR3 SNP: rs3775290 Recesivo

G/G-G/A 286 (92.6%) 340 (85.9%) 1.00 5,00E-04 A/A 23 (7.4%) 56 (14.1%) 2.57 (1.48-4.47)

IL12B SNP: rs3212227 Dominante A/A 151 (47.6%) 202 (51.5%) 1.00 0.022

A/C-C/C 166 (52.4%) 190 (48.5%) 0.68 (0.49-0.95) IL6 SNP: rs1800795 --- G/G 0 (0%) 103 (72%) 1.00 0.017

83

G/C 3 (100%) 40 (28%) 0.00 (0.00-NA) NOD1 SNP: rs5743336 Codominante T/T 155 (91.2%) 131 (62.7%) 1.00 <0.0001

T/C 15 (8.8%) 41 (19.6%) 3.39 (1.74-6.59) C/C 0 (0%) 37 (17.7%) NA (0.00-NA)

IL18 SNP: rs5744247 Recesivo C/C-G/C 307 (100%) 381 (97.9%) 1.00 5,00E-

04 G/G 0 (0%) 8 (2.1%) NA (0.00-NA) IL4R SNP: rs1805016 Recesivo T/T-T/G 295 (97%) 366 (98.1%) 1.00 0.035

G/G 9 (3%) 7 (1.9%) 0.27 (0.08-0.94) CCR7 SNP: rs2023906 Dominante A/A 260 (83.6%) 267 (80.2%) 1.00 0.022

A/G-G/G 51 (16.4%) 66 (19.8%) 1.70 (1.08-2.68) CD209 SNP: rs7248637 Dominante G/G 222 (70.7%) 274 (72.5%) 1.00 0.0032

G/A-A/A 92 (29.3%) 104 (27.5%) 0.56 (0.38-0.83)


Tabla 15. Asociaciones genotípicas a dengue hemorrágico ajustado sexo, edad y componente genético ancestral.

Europeo

Modelo Genotipo DC DHF OR (IC 95%) Valor P

IL8 SNP: rs4073 Sobredominante A/A-T/T 108 (51.9%) 22 (75.9%) 1.00 0.0021

A/T 100 (48.1%) 7 (24.1%) 0.24 (0.09-0.64) NOD1 SNP: rs5743336 Recesivo T/T-T/C 80 (88.9%) 19 (100%) 1.00 0.02

C/C 10 (11.1%) 0 (0%) 0.00 (0.00-NA) MCP1(CCL2) SNP: rs1024611 Sobredominante T/T-C/C 114 (51.1%) 20 (71.4%) 1.00 0.014

T/C 109 (48.9%) 8 (28.6%) 0.34 (0.14-0.84) CSF3 SNP: rs2227319 Sobredominante G/G-A/A 86 (59.3%) 22 (78.6%) 1.00 0.028

G/A 59 (40.7%) 6 (21.4%) 0.35 (0.13-0.94)

Amerindio


IL8 SNP: rs4073 Recesivo A/A-A/T 174 (83.7%) 17 (58.6%) 1.00 0.0026

T/T 34 (16.4%) 12 (41.4%) 3.91 (1.65-9.27) NOD1 SNP: rs5743336 Recesivo T/T-T/C 80 (88.9%) 19 (100%) 1.00 0.031


T/C 109 (48.9%) 8 (28.6%) 0.39 (0.16-0.94) CSF3 SNP: rs2227319

Sobredominante G/G-A/A 86 (59.3%) 22 (78.6%) 1.00 0.048 G/A 59 (40.7%) 6 (21.4%) 0.39 (0.15-1.05)

84

CCR7 SNP: rs3136685 Recesivo G/G-G/A 152 (85.9%) 21 (100%) 1.00 0.017

A/A 25 (14.1%) 0 (0%) 0.00 (0.00-NA) CD209 SNP: rs7248637 Modelo Genotipo DC DHF OR (IC 95%) Valor P Dominante G/G 137 (67.5%) 26 (86.7%) 1.00 0.037

G/A-A/A 66 (32.5%) 4 (13.3%) 0.34 (0.11-1.03) TNFA SNP: rs1800750 Sobredominante G/G-A/A 174 (92.5%) 21 (80.8%) 1.00 0.037

G/A 14 (7.5%) 5 (19.2%) 3.84 (1.17-12.57)

Africano


IL8 SNP: rs4073 Sobredominante A/A-T/T 108 (51.9%) 22 (75.9%) 1.00 0.0014

A/T 100 (48.1%) 7 (24.1%) 0.23 (0.09-0.61) NOD1 SNP: rs5743336 Recesivo T/T-T/C 80 (88.9%) 19 (100%) 1.00 0.022


T/C 109 (48.9%) 8 (28.6%) 0.37 (0.15-0.90) CSF3 SNP: rs2227319 Sobredominante G/G-A/A 86 (59.3%) 22 (78.6%) 1.00 0.029

G/A 59 (40.7%) 6 (21.4%) 0.35 (0.13-0.95)


Tabla 16. Asociaciones genotípicas a presencia de hemorragias ajustado sexo, edad y componente genético ancestral.

Europeo

Modelo Genotipo (-)Hemorragia (+)Hemorragia OR (IC 95%) Valor P

JAK1 SNP: rs11208534 Recesivo A/A-A/G 105 (99.1%) 107 (95.5%) 1.00 0.047


G/A-A/A 29 (32.2%) 8 (6.3%) 0.26 (0.10-0.67) IL18 SNP: rs5744247 Recesivo C/C-G/C 106 (100%) 130 (97%) 1.00 0.05

G/G 0 (0%) 4 (3%) NA (0.00-NA) MCP1(CCL2) SNP: rs1024611 Recesivo T/T-T/C 98 (86.7%) 108 (78.3%) 1.00 0.038

C/C 15 (13.3%) 30 (21.7%) 2.45 (1.03-5.87)

Amerindio


JAK1 SNP: rs11208534

Codominante A/A 63 (59.4%) 80 (71.4%) 1.00 0.012

85

A/G 42 (39.6%) 27 (24.1%) 0.55 (0.29-1.04) G/G 1 (0.9%) 5 (4.5%) 8.02 (0.82-78.20)

MBL2 SNP: rs1800451 Dominante G/G 61 (67.8%) 119 (93.7%) 1.00 <0.0001

G/A-A/A 29 (32.2%) 8 (6.3%) 0.16 (0.06-0.40) JAK1 SNP: rs2780895 Dominante C/C 30 (26.8%) 63 (51.2%) 1.00 0.022

C/T-T/T 82 (73.2%) 60 (48.8%) 0.50 (0.27-0.91) IL6R SNP: rs8192284 Dominante A/A 72 (62.6%) 43 (32.6%) 1.00 0.0051

A/C-C/C 43 (37.4%) 89 (67.4%) 2.31 (1.28-4.17) IKBKE SNP: rs11118132 Porcentaje de muestras genotipificadas: 339/407 (83.29%) Dominante C/C 63 (57.3%) 39 (32.2%) 1.00 0.028

C/G-G/G 47 (42.7%) 82 (67.8%) 1.94 (1.07-3.52) IL8 SNP: rs4073 Codominante A/A 49 (43%) 35 (28.5%) 1.00 0.13

A/T 50 (43.9%) 57 (46.3%) 1.24 (0.66-2.33) T/T 15 (13.2%) 31 (25.2%) 2.29 (1.01-5.17)

TLR3 SNP: rs3775290 Dominante G/G 61 (53%) 49 (38%) 1.00 0.046 G/A-A/A 54 (47%) 80 (62%) 1.79 (1.01-3.18) IL6 SNP: rs1800795 --- G/G 31 (93.9%) 19 (59.4%) 1.00 0.0012 G/C 2 (6.1%) 13 (40.6%) 14.60 (2.20-96.67) IL18 SNP: rs5744247 Recesivo C/C-G/C 106 (100%) 130 (97%) 1.00 0.035

G/G 0 (0%) 4 (3%) NA (0.00-NA) NFKB1A SNP: rs2233409 Recesivo C/C-C/T 110 (100%) 108 (96.4%) 1.00 0.031

T/T 0 (0%) 4 (3.6%) NA (0.00-NA) CCR7 SNP: rs2023906 Dominante A/A 104 (92%) 97 (77.6%) 1.00 0.026

A/G-G/G 9 (8%) 28 (22.4%) 2.52 (1.08-5.89) CCR7 SNP: rs3136685 Dominante G/G 36 (37.9%) 65 (63.1%) 1.00 0.033

G/A-A/A 59 (62.1%) 38 (36.9%) 0.48 (0.25-0.94) CD209 SNP: rs8105572 Dominante C/C 77 (68.1%) 99 (81.2%) 1.00 0.049

C/T-T/T 36 (31.9%) 23 (18.9%) 0.52 (0.27-1.00)

Africano


JAK1 SNP: rs11208534 Recesivo A/A-A/G 105 (99.1%) 107 (95.5%) 1.00 0.033


G/A-A/A 29 (32.2%) 8 (6.3%) 0.28 (0.10-0.75) RIPK2 SNP: rs40457 Dominante A/A 28 (27.2%) 38 (31.7%) 1.00 0.034

A/G-G/G 75 (72.8%) 82 (68.3%) 2.27 (1.05-4.91)


86

nombrados como haplotipos 3, 8 y 10 se encontraron asociados a protección, y 3 haplotipos raros 12, 13 y 14 fueron asociados a riesgo. Los 8 haplotipos restantes (1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 11) no resultaron asociados. En el cromosoma 5, solo un haplotipo generados por las variantes (rs3212227 y rs2569253, llamado haplotipo 2, se encontró asociado protección y los haplotipos 1, 3 y los raros no resultaron asociados. En el cromosoma 6, uno de los haplotipos generados por las variantes (rs1800750 y rs2275913) nombrado como haplotipo 3 se encontró asociado a protección, y los 2 haplotipos restantes 1, 2, junto con los raros no resultaron asociados. Respecto a combinaciones alelicas conformadas por las variantes rs5743336-rs40457-rs8904-rs1805016 -rs2023906, tres (combinaciones alelicas 2, 3 y 6) se encontraron asociadas a protección y 1 (combinación alelica 15) a riesgo. Las 8 combinaciones aelelicas restantes (1, 4, 5 y 7-14) junto con las raras, no resultaron asociadas. Las asociaciones y no asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a positivos comparados con seronegativos pueden ser observadas en la Tabla 17.

Por otro lado evaluando la infección y desarrollo de dengue resultaron asociados 5 haplotipos y 7 combinaciones alelicas a positivos comparados con referentes de la siguiente manera: En el cromosoma 1, dos de los haplotipos generados por las variantes (rs2780895, rs17127114, rs8192284 , rs1059704, rs11118132 y rs3024498) nombrados como haplotipos 2 y 4 se encontraron asociados a riesgo, y los 18 haplotipos restantes (1, 3 y 5-20) no estuvieron asociados. En el cromosoma 4, dos haplotipos generados por las variantes (rs4073 y rs2227307, llamados haplotipos 3 y 4 resultaron factores de riesgo y los dos haplotipos restantes nombrados 1 y 2 no asociados. En el cromosoma 7, uno de los haplotipos generados por las variantes rs1800795 y rs2069843) nombrado como haplotipo 2 se encontró asociado a riesgo, y los 2 haplotipos restantes 1, 3 no resultaron asociados.

Es importante aclarar que evaluando la asociación de los haplotipos de los Cromosomas 1, 4 y 7 en positivos contrastados con referentes se tuvieron en cuenta las variantes implicadas en los módulos 2 y 3 de nuestro modelo fisiopatológico del dengue y las combinaciones alelicas a continuación fueron evaluadas de acuerdo a su implicación en los módulos 1 o 2 y 3 del mismo modelo fisiopatológico.

Respecto a combinaciones alelicas del módulo 1, conformadas por las variantes rs3775290-rs5743336- rs1800451-rs7248637, cinco (combinaciones alelicas 2, 4, 5, 6 y 8) se encontraron asociadas a riesgo. Las tres combinaciones alelicas restantes (1, 3 y 7) junto con las raras, no resultaron asociadas. Finalmente las combinaciones alelicas implicadas más directamente en los módulos 2 y 3, conformadas por las variantes rs3212227-rs3132468-rs40457-rs5744247-rs1805016, se encontraron dos combinaciones alelicas, nombradas 4 y 11, a riesgo y protección respectivamente. Las quince restantes (1-3, 5-10 y 12-17) junto con las raras, no estuvieron asociadas. Las asociaciones y no asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a positivos comparados con referentes pueden ser observados en la Tabla 18.

87

Por otra parte evaluando dengue hemorrágico se asociaron dos combinaciones alelicas (nombradas 2 y 4) a riesgo, conformadas por las variantes rs11118132 -rs4073-rs1800750, implicadas directamente en los módulos 2 y 3 modelo fisiopatológico del dengue. Las combinaciones alelicas 1, 3 y 5-7 no estuvieron asociadas. Tampoco asociadas las combinaciones alelicas (llamadas 1-4) conformadas por las variantes rs5743336-rs7248637 del módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue, ni tampoco los haplotipos (nombrados 1-8) del cromosoma 17, generados por las variantes de los módulo 2 y 3 (rs1024611-rs2227319-rs3136685, estos hallazgos pueden ser vistos en la Tabla 19.

Por último resultaron dos combinaciones alelicas asociadas a la presencia de hemorragias, una del módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue a protección y otra de los módulos 2 y 3 a riesgo. La del módulo 1 conformadas por las variantes rs3775290-rs1800451-rs8105572 (nominada 3) y la de los módulos 2 y 3 compuesta por las variantes rs4073-rs1800795-rs40457-rs2233409 (nombrada 10). Ni las combianciones alelicas 1, 2, 4-6 junto con las raras del módulo 1, ni las combinaciones alelicas 1-9 y 11-13 del los módulos 2 y 3, se encontraron asociadas a presencia de hemorragias. Tampoco hubo asociación de los haplotipo llamados 1-12 generados por las variantes rs2780895-rs11208534-rs8192284-rs11118132 del cromosoma 1, ni asociación de los haplotipos 1-6 generados por las variantes rs1024611-rs2023906-rs3136685 del cromosoma 17. Las asociaciones y no asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a presencia de hemorragias pueden ser observadas en la Tabla 20. Redes de combinaciones alelicas Debido al elevado número de asociaciones encontradas de las combinaciones alelicas del módulo 1 del modelo fisiopatológico de dengue, nos planteamos obtener una representación visual del menor número de pasos mutacionales para pasar de una combinación alelica a otra, a partir de las frecuencias de cada una de las combinaciones y así comprender mejor el efecto de las diferencias en pacientes positivos comparados con referentes. Las frecuencias en cada grupo son presentadas en la Tabla 21 y la representación en el Figura 2 del presente estudio. Tanto en ambos puede observarse que la combinación alelica ancestral está en mayor frecuencia (esta combinación no asociada al rasgo), puede observarse además que tiende a estar más elevada en referentes. Las combinaciones 3 y 7 están a uno (rs7248637) y dos (rs7248637 y rs3775290) pasos mutaciones respectivamente de la combinación alelica ancestral, sin embargo los haplotipos de susceptibilidad 2, 4 y 6 están a solo un paso mutacional en rs3775290, rs5743336 y rs1800451 respectivamente. Lo que sugiere que un solo cambio mutacional en cualquiera de los inmediamente mencionados canales respecto a la combinación ancestral (1) predisponen a la infección y desarrollo de dengue. La combinación 5, la cual está mucha más elevada en positivos que en referentes, comparadas relativamente con las combinaciones 2, 4 y 6, requiere de dos pasos mutacionales (rs3775290 y rs5743336) desde la combinación ancestral,

88

Tabla 17. Asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a positivos comparados seronegativos (IgM- e IgG-).

Hap Cr: 1

Variantes OR (IC 95%) Valor P

rs2780895

rs11208534

rs1059704

rs11118132

Frec Europeo Amerindio Africano

1 C A T C 0.2231 1.00 ()--- 1.00 ()--- 1.00()--- 2 C A T G 0.2127 0.89 (0.52 - 1.53)0.67 0.97 (0.57 - 1.67)0.92 0.89 (0.52 - 1.54)0.69 3 C A C C 0.1339 0.53 (0.27 - 1.05)0.068 0.51 (0.26 - 1.00)0.049 0.54 (0.27 - 1.06)0.073 4 T A T C 0.1093 0.61 (0.31 - 1.21)0.16 0.52 (0.27 - 1.00)0.052 0.62 (0.31 - 1.23)0.17 5 T G T C 0.0729 4.23 (0.94 - 19.03)0.06 3.14 (0.76 - 13.04)0.12 4.29 (0.95 - 19.43)0.059 6 C A C G 0.0486 1.41 (0.50 - 3.99)0.51 1.78 (0.62 - 5.16)0.29 1.46 (0.51 - 4.16)0.48 7 T G T G 0.0479 0.47 (0.21 - 1.03)0.061 0.53 (0.25 - 1.14)0.1 0.48 (0.22 - 1.05)0.066 8 T A C C 0.0442 0.43 (0.16 - 1.16)0.094 0.36 (0.14 - 0.96)0.042 0.44 (0.16 - 1.19)0.11 9 T A T G 0.0385 0.88 (0.31 - 2.51)0.81 0.94 (0.33 - 2.67)0.91 0.90 (0.31 - 2.60)0.85 10 T G C C 0.0376 0.16 (0.05 - 0.50)0.0016 0.16 (0.05 - 0.47)0.001 0.16 (0.05 - 0.50)0.0016

11 T A C G 0.0211 0.78 (0.19 - 3.26)0.73 0.63 (0.14 - 2.75)0.54 0.78 (0.18 - 3.31)0.73 12* T G C G 0.0066 >7467 (7467 - 7468)

<0.0001 >9777 (97772- 97773) <0.0001

>20864 (20865 - 20866) <0.0001

13* C G T C 0.0015 14* C G T G 0.0015

Hap Cr: 5


rs3212227 rs2569253 Frec Europeo Amerindio Africano

1 A C 0.4101 1.00 () --- 1.00 ()--- 1.00 ()--- 2 C T 0.3036 0.74 (0.54 - 1.02) 0.07 0.65 (0.48 - 0.88) 0.0059 0.73 (0.53 - 1.00) 0.052 3 A T 0.2837 0.83 (0.59 - 1.15) 0.26 0.73 (0.53 - 1.01) 0.055 0.82 (0.59 - 1.14) 0.23 Raros* * * 0.0027 0.45 (0.03 - 7.52) 0.58 0.37 (0.02 - 6.22)0.49 0.43 (0.03 - 7.08)0.55

Hap Cr: 6



1 G G 0.7705 1.00() --- 1.00 () --- 1.00 ()--- 2 G A 0.1561 1.22 (0.80 - 1.87) 0.36 1.37 (0.90 - 2.06)0.14 1.24 (0.81 - 1.89) 0.32 3 A G 0.0645 0.29 (0.15 - 0.56) 3,00E-04 0.29 (0.14 - 0.59) 6,00E-04 0.29 (0.15 - 0.57) 3,00E-04 Raros* * * 0.0088 2.71 (0.28 - 25.99) 0.39 3.04 (0.31 - 30.16)0.34 2.82 (0.29 - 27.39) 0.37

89

Ca

Variantes Frec

OR (IC 95%) Valor P

rs5743336

rs40457

rs8904

rs1805016

rs2023906

Europeo Amerindio Africano

1 T A C T A 0.1667 1.00 () --- 1.00 () --- 1.00 ()--- 2 T G C T A 0.1338 0.24 (0.06 - 0.95)0.042 0.24 (0.07 - 0.83)0.024 0.22 (0.05 - 0.89)0.034 3 C A C T A 0.1066 0.04 (0.00 - 0.41)0.0063 0.04 (0.01 - 0.25)5,00E-04 0.04 (0.00 - 0.43)0.0085 4 T G T T A 0.0772 0.58 (0.13 - 2.63)0.48 0.49 (0.10 - 2.52)0.39 0.62 (0.13 - 2.99)0.56 5 T A T T A 0.0768 0.45 (0.09 - 2.27)0.33 0.38 (0.08 - 1.70)0.2 0.39 (0.07 - 2.05)0.27 6 C G T T A 0.0759 0.02 (0.00 - 0.21)0.0015 0.01 (0.00 - 0.11)1,00E-04 0.01 (0.00 - 0.21)0.0023 7 T G C G A 0.0676 0.39 (0.09 - 1.59)0.19 0.30 (0.07 - 1.33)0.11 0.37 (0.09 - 1.58)0.18 8 C G C T A 0.0612 0.63 (0.11 - 3.81)0.62 0.81 (0.14 - 4.77)0.82 0.70 (0.10 - 4.77)0.72 9 C A T T A 0.0521 0.31 (0.08 - 1.23)0.096 0.30 (0.07 - 1.21)0.092 0.34 (0.08 - 1.41)0.14 10 T G T G A 0.0473 1.07 (0.02 - 51.80)0.97 0.82 (0.09 - 7.80)0.86 1.10 (0.01 - 122.43)0.97 11 T A C T G 0.0297 0.35 (0.06 - 1.99)0.24 0.37 (0.07 - 1.89)0.24 0.31 (0.05 - 1.76)0.19 12 T A T G A 0.0231 0.20 (0.01 - 3.47)0.27 0.18 (0.02 - 1.68)0.13 0.18 (0.01 - 4.12)0.28 13 C A C T G 0.0168 1.50 (0.02 - 109.89)0.85 4.18 (0.00 - 3959.08)0.68 2.36 (0.01 - 462.68)0.75 14 T A T T G 0.0124 0.49 (0.04 - 5.72)0.57 0.59 (0.06 - 5.35)0.64 0.46 (0.04 - 5.40)0.54 15 C A C G A 0.0115 NA()NA 509> (5097 - 5097)<0.0001 NA()NA raros * * * * * 0.0413 NA() NA 0.46 (0.10 - 2.16)0.32 NA() NA

Hap: Haplotipos; Cr: Cromosoma; *: Haplotipos o combinaciones alelicas raras (x<1%); Ca: Combinaciones alelicas. Frec: frecuencia de cada hap o Ca calculados desde el total de individuos incluidos en cada comparación; NA: no se pudo calcular; OR: tasa de Odd; IC 95%: Intervalo de confianza con 95% de confidencia; P: significancia estadística; el OR, IC95% y valor P, fueron calculados mediante regresión logística covariando sexo, edad e índices individuales de cada componente genético ancestral en ensayos independientes.

90

Tabla 18. Asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a positivos comparados con referentes.

Hap Cr.1

Variantes – Módulos 2 y 3 del MFD

Frec

OR (IC95%) Valor P

rs2780895

rs17127114

rs8192284

rs1059704

rs11118132

rs3024498


1 C G C T G A 0.1446 1.00 ()--- 1.00 ()--- 1.00()--- 2 C G A T C A 0.1324 1.48 (0.77 - 2.87)0.24 1.83 (1.00 - 3.32)0.049 1.30 (0.71 - 2.41)0.4 3 C G A T G A 0.0831 1.82 (0.73 - 4.56)0.2 1.55 (0.67 - 3.56)0.31 1.54 (0.64 - 3.69)0.34 4 T G A T C A 0.0759 1.41 (0.58 - 3.44)0.45 3.63 (1.54 - 8.55)0.0033 1.14 (0.47 - 2.76)0.78 5 C G C T C A 0.0708 0.94 (0.36 - 2.46)0.91 0.93 (0.36 - 2.39)0.88 0.96 (0.38 - 2.46)0.94 6 C G A C C A 0.0658 1.28 (0.56 - 2.90)0.56 1.66 (0.77 - 3.58)0.2 1.20 (0.53 - 2.72)0.65 7 T A A T C A 0.0396 1.15 (0.34 - 3.91)0.82 1.91 (0.61 - 5.93)0.26 0.82 (0.22 - 2.97)0.76 8 C G C C C A 0.0395 1.83 (0.59 - 5.61)0.29 1.96 (0.70 - 5.50)0.2 1.55 (0.51 - 4.70)0.44 9 T G A T G A 0.0377 0.58 (0.18 - 1.87)0.37 0.99 (0.36 - 2.76)0.99 0.52 (0.17 - 1.57)0.24 10 C G A C G A 0.0341 1.97 (0.59 - 6.61)0.27 1.63 (0.47 - 5.65)0.44 1.63 (0.51 - 5.16)0.41 11 C G A T G G 0.0313 0.27 (0.05 - 1.34)0.11 0.56 (0.14 - 2.24)0.41 0.32 (0.07 - 1.41)0.13 12 C G C T C G 0.0292 0.97 (0.27 - 3.41)0.96 1.08 (0.31 - 3.77)0.91 0.94 (0.27 - 3.28)0.93 13 T A A T G A 0.0248 0.88 (0.27 - 2.86)0.84 1.15 (0.40 - 3.30)0.8 1.04 (0.31 - 3.48)0.95 14 T G C T C A 0.0197 0.69 (0.12 - 3.98)0.68 0.77 (0.15 - 4.02)0.76 0.41 (0.05 - 3.68)0.43 15 C G C C G A 0.0191 5.13 (0.62 - 42.25)0.13 4.63 (0.52 - 41.57)0.17 3.78 (0.54 - 26.76)0.18 16 T A C T C A 0.0176 0.52 (0.05 - 5.00)0.57 0.60 (0.06 - 5.71)0.66 0.94 (0.14 - 6.19)0.95 17 T A C T G A 0.0168 1.72 (0.20 - 14.53)0.62 1.44 (0.14 - 14.96)0.76 0.97 (0.15 - 6.37)0.97 18 T A A C C A 0.0145 1.75 (0.20 - 14.96)0.61 5.25 (0.28 - 97.63)0.27 1.99 (0.19 - 20.65)0.57 19 T A C C C A 0.0132 0.72 (0.10 - 5.03)0.74 0.75 (0.09 - 5.90)0.78 0.41 (0.03 - 5.06)0.48 20 T G C T G G 0.0114 0.05 (0.00 - 4.99)0.21 NA()NA 0.04 (0.00 - 2.85)0.14

Hap Cr.4

Variantes– Módulos 2 y 3 del MFD

OR (IC95%) Valor P


1 T T 0.4639 1.00 ( )--- 1.00 ( ) --- 1.00 ( ) --- 2 A G 0.3465 1.19 (0.90 - 1.57)0.23 1.28 (0.98 - 1.67)0.068 1.15 (0.87 - 1.51) 0.33 3 A T 0.1424 1.68 (1.10 - 2.58)0.017 2.53 (1.66 - 3.85)<0.0001 1.65 (1.08 - 2.54)0.022 4 T G 0.0472 3.86 (1.63 - 9.13)0.0022 4.51 (1.92 - 10.59)0,0006 3.67 (1.58 - 8.48)0.0025

91

Hap Cr.7

Variantes Módulos 2 y 3 del MFD

Frec

OR (IC95%) Valor P

rs1800795 rs2069843 Europeo Amerindio Africano

1 G G 0.8431 1.00 ( ) --- 1.00 ( ) --- 1.00 ( )---

2 C G 0.0933 7.28 (1.62 - 32.64)0.0097 0.28 (0.06 - 1.40)0.12 5.54 (1.27 - 24.04)0.023

3 G A 0.0634 1.63 (0.93 - 2.86)0.091 1.27 (0.64 - 2.52)0.5 1.70 (0.92 - 3.13)0.09

CA

Variantes - modulo 1 del MFD Frec

OR (IC95%) Valor P

rs3775290

rs5743336

rs1800451

rs7248637


1 G T G G 0.4456 1.00 ( ) --- 1.00 ( )--- 1.00 ( )--- 2 A T G G 0.2153 1.80 (1.22 - 2.66)0.003 1.83 (1.23 - 2.70)0.0027 1.87 (1.26 - 2.77)0.0019 3 G T G A 0.0898 0.64 (0.34 - 1.21)0.17 0.95 (0.52 - 1.75)0.87 0.51 (0.26 - 1.01)0.055 4 G C G G 0.0815 4.63 (2.09 - 10.23)2,00E-04 4.93 (2.23 - 10.89)1,00E-04 4.72 (2.11 - 10.56)2,00E-04 5 A C G G 0.0541 6.63 (2.09 - 21.05)0.0014 5.89 (1.93 - 17.98)0.0019 6.17 (1.84 - 20.69)0.0033

6 G T A G 0.0335 3.43 (1.07 - 11.03)0.039 9.48 (2.26 - 39.82)0.0022 3.44 (0.99 - 11.99)0.053 7 A T G A 0.0283 0.81 (0.31 - 2.08)0.66 0.90 (0.35 - 2.31)0.82 0.86 (0.32 - 2.26)0.75 8 G C G A 0.016 104109424.90

(104109422.12 - 104109427.68) <0.0001

1078.80 (1076.28 - 1081.32) <0.0001

337056995553.42 (337056995547.97 - 337056995558.88) <0.0001

Raros* * * * * 0.0361 1.34 (0.50 - 3.62) 0.56 1.36 (0.53 - 3.49) 0.52 1.08 (0.38 - 3.04) 0.89

Ca

Variantes - - módulos 2 y 3 del MFD OR (IC95%) Valor P

rs3212227

rs3132468

rs40457

rs5744247

rs1805016

Frec Europeo Amerindio Africano

1 A A A C T 0.2675 1.00 () --- 1.00 ( )--- 1.00 ( )--- 2 A A G C T 0.1876 0.89 (0.54 - 1.47)0.65 0.92 (0.58 - 1.47)0.73 0.88 (0.54 - 1.43)0.6 3 C A A C T 0.1167 0.79 (0.46 - 1.35)0.39 0.93 (0.54 - 1.63)0.81 0.79 (0.46 - 1.35)0.39 4 A A G C G 0.0542 3.85 (1.26 - 11.76)0.018 3.96 (1.44 - 10.87)0.0077 2.96 (0.92 - 9.53)0.069 5 C A G C T 0.053 0.87 (0.42 - 1.80)0.7 0.97 (0.47 - 2.02)0.93 0.90 (0.43 - 1.87)0.77 6 A A A G T 0.0519 0.96 (0.45 - 2.06)0.91 0.83 (0.42 - 1.66)0.6 0.92 (0.45 - 1.90)0.83 7 A G A C T 0.034 0.76 (0.19 - 2.93)0.69 0.60 (0.21 - 1.74)0.35 0.61 (0.22 - 1.69)0.34 8 A G G C T 0.0331 1.09 (0.30 - 3.94)0.9 1.31 (0.48 - 3.57)0.6 0.96 (0.33 - 2.80)0.93 9 C A A C G 0.0308 0.48 (0.16 - 1.43)0.19 0.61 (0.23 - 1.63)0.33 0.48 (0.16 - 1.48)0.2 10 C A G C G 0.0254 0.63 (0.19 - 2.13)0.46 1.30 (0.47 - 3.62)0.62 0.57 (0.14 - 2.30)0.43 11 C G G C T 0.0235 0.26 (0.07 - 0.89)0.032 0.36 (0.11 - 1.14)0.082 0.22 (0.06 - 0.81)0.023

92

12 A A A C G 0.0216 0.35 (0.08 - 1.45)0.15 0.55 (0.15 - 2.04)0.37 0.38 (0.07 - 2.06)0.26 13 C G A C T 0.0161 0.68 (0.16 - 2.94)0.61 0.56 (0.08 - 3.90)0.56 0.69 (0.17 - 2.74)0.59 14 C A G G T 0.016 1.40 (0.43 - 4.58)0.58 1.05 (0.33 - 3.38)0.93 1.25 (0.38 - 4.09)0.71 15 A A G G T 0.0132 1.91 (0.23 - 16.17)0.55 1.58 (0.25 - 10.01)0.63 1.51 (0.25 - 9.25)0.66 16 A G A C G 0.0124 0.96 (0.18 - 5.27)0.96 0.64 (0.13 - 3.06)0.58 0.93 (0.18 - 4.88)0.93 17 A G G C G 0.0106 0.53 (0.06 - 4.50)0.56 1.75 (0.26 - 11.80)0.56 0.34 (0.04 - 3.09)0.34 Raros* * * * * * 0.0327 0.90 (0.28 - 2.89)0.86 1.23 (0.46 - 3.29)0.68 1.28 (0.43 - 3.81)0.66

Hap: Haplotipos; Cr: Cromosoma; *: Combinaciones alelicas raras (x<1%); Ca: Combinaciones alelicas. MFD: Modelo fisiopatológico del dengue; Frec: frecuencia de cada hap o Ca calculados desde el total de individuos incluidos en cada comparación; NA: no se pudo calcular; OR: tasa de Odd; IC 95%: Intervalo de confianza con 95% de confidencia; P: significancia estadística; el OR, IC95% y valor P, fueron calculados mediante regresión logística covariando sexo, edad e índices individuales de cada componente genético ancestral en ensayos independientes.

93

Tabla 19. Asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a dengue hemorrágico.

Hap Cr.17


Frec

OR (IC 95%) Valor P

rs1024611 rs2227319 rs3136685 Europeo Amerindio Africano

1 T G G 0.2868 1.00 ( )--- 1.00 () --- 1.00 ()--- 2 C G G 0.1688 0.49 (0.15 - 1.63)0.24 0.64 (0.15 - 2.72)0.55 0.43 (0.13 - 1.47)0.18 3 C A G 0.1216 0.77 (0.26 - 2.34)0.65 0.66 (0.15 - 2.85)0.58 0.67 (0.22 - 2.03)0.47 4 T G A 0.1211 0.19 (0.02 - 1.77)0.15 0.17 (0.02 - 1.44)0.1 0.17 (0.02 - 1.65)0.13 5 T A G 0.1131 0.53 (0.15 - 1.90)0.33 0.70 (0.16 - 3.07)0.63 0.54 (0.15 - 1.99)0.36 6 C G A 0.096 2.69 (0.66 - 10.96)0.17 1.32 (0.23 - 7.54)0.75 3.56 (0.72 - 17.69)0.12 7 T A A 0.0652 0.67 (0.13 - 3.37)0.63 0.45 (0.06 - 3.50)0.45 0.75 (0.14 - 4.02)0.74 8 C A A 0.0274 0.00 (NA-NA)1 0.08 (0.00 - 81473)0.92 NA () NA

Ca

Variantes – Módulo 1 del MFD

Frec

OR (IC 95%) Valor P

rs5743336 rs7248637 Europeo Amerindio Africano

1 T G 0.72 1.00 () --- 1.00 () --- 1.00 () --- 2 T A 0.1218 0.68 (0.22 - 2.12)0.51 0.45 (0.15 - 1.35)0.16 0.71 (0.23 - 2.18)0.55 3 C G 0.1114 0.43 (0.11 - 1.71)0.23 0.44 (0.10 - 1.86)0.27 0.44 (0.11 - 1.77)0.25 4 C A 0.0468 0.00 (NA)1 0.00 (NA)1 0.00 (NA)1

Ca


Frec

OR (IC 95%) Valor P

rs11118132 rs4073 rs1800750 Europeo Amerindio Africano

1 C A G 0.3893 1.00 () --- 1.00 () --- 1.00 ()---

2 C T G 0.2204 2.05 (0.79 - 5.29)0.14 2.66 (1.07 - 6.61)0.036 2.06 (0.79 - 5.38)0.14

3 G T G 0.1776 1.47 (0.53 - 4.11)0.46 1.84 (0.66 - 5.08)0.24 1.43 (0.51 - 4.02)0.5

4 G A G 0.1644 2.26 (0.79 - 6.49)0.13 3.27 (1.18 - 9.02)0.023 2.29 (0.79 - 6.67)0.13

5 C A A 0.0254 1.95 (0.16 - 23.81)0.6 2.53 (0.22 - 29.24)0.46 2.17 (0.17 - 27.97)0.55

6 C T A 0.0124 2.66 (0.18 - 38.40)0.47 3.43 (0.13 - 89.64)0.46 2.50 (0.16 - 39.66)0.52

7 G T A 0.0106 5.45 (0.40 - 73.73)0.2 14.57 (0.60 - 355.84)0.1 5.89 (0.41 - 84.76)0.19

Hap: Haplotipos; Cr: Cromosoma; Ca: Combinaciones alelicas. MFD: Modelo fisiopatológico del dengue; Frec: frecuencia de cada hap o Ca calculados desde el total de individuos incluidos en cada comparación; NA: no se pudo calcular; OR: tasa de Odd; IC 95%: Intervalo de confianza con 95% de confidencia; P: significancia estadística; el OR, IC95% y valor P, fueron calculados mediante regresión logística covariando sexo, edad e índices individuales de cada componente genético ancestral en ensayos independientes.

94

Tabla 20. Asociaciones de haplotipos y combinaciones alelicas a presencia de hemorragias.

Hap Cr.1

Variantes - Módulos 2 y 3 del MFD

OR (IC 95%) Valor P rs2780895 rs11208534 rs8192284 rs11118132 Freq Europeo Amerindio Africano

1 C A A C 0.229 1.00 () --- 1.00 () --- 1.00 () --- 2 T A A C 0.1469 0.94 (0.37 - 2.39)0.9 0.61 (0.26 - 1.46)0.27 1.26 (0.47 - 3.40)0.65 3 C A C C 0.1345 1.62 (0.60 - 4.33)0.34 2.44 (0.97 - 6.16)0.06 1.28 (0.46 - 3.56)0.63 4 C A A G 0.1226 0.77 (0.27 - 2.15)0.61 1.53 (0.61 - 3.80)0.36 0.73 (0.25 - 2.15)0.56 5 C A C G 0.1129 2.56 (0.73 - 8.95)0.14 3.04 (0.91 - 10.15)0.072 1.93 (0.57 - 6.58)0.29 6 T G A C 0.0887 1.73 (0.58 - 5.16)0.33 1.56 (0.58 - 4.18)0.38 2.47 (0.72 - 8.44)0.15 7 T G A G 0.0415 1.46 (0.37 - 5.82)0.59 1.51 (0.38 - 6.01)0.56 1.15 (0.28 - 4.79)0.85 8 T A A G 0.0359 2.46 (0.45 - 13.52)0.3 1.21 (0.24 - 5.99)0.82 2.86 (0.33 - 24.45)0.34 9 T G C C 0.0359 0.32 (0.06 - 1.86)0.21 0.06 (0.00 - 4.64)0.21 0.22 (0.03 - 1.67)0.14

10 T A C G 0.0225 0.82 (0.15 - 4.50)0.82 1.79 (0.23 - 14.10)0.58 0.70 (0.13 - 3.80)0.68 11 T G C G 0.0149 0.64 (0.03 - 13.31)0.77 2.69 (0.34 - 21.21)0.35 0.86 (0.07 - 10.37)0.91 12 T A C C 0.0147 3.72 (0.22 - 62.68)0.36 8.18 (0.34 - 195.83)0.2 3.95 (0.27 - 58.21)0.32

Hap

Cr.17

Variantes - Módulos 2 y 3 del MFD

OR (IC95) Valor P

rs1024611 rs2023906 rs3136685 Freq Europeo Amerindio Africano

1 T A G 0.357 1.00 ()--- 1.00 ()--- 1.00 ()---

2 C A G 0.2538 2.14 (0.92 - 4.98)0.079 1.42 (0.72 - 2.79)0.32 1.84 (0.75 - 4.50)0.18

3 T A A 0.1778 1.57 (0.59 - 4.18)0.37 0.73 (0.34 - 1.58)0.43 1.84 (0.62 - 5.47)0.27

4 C A A 0.1268 0.99 (0.40 - 2.44)0.99 0.74 (0.34 - 1.64)0.46 1.07 (0.39 - 2.96)0.9

5 T G G 0.0529 2.36 (0.58 - 9.55)0.23 2.97 (0.83 - 10.57)0.095 1.96 (0.49 - 7.90)0.34

6 C G G 0.0316 0.97 (0.17 - 5.63)0.97 1.19 (0.26 - 5.45)0.83 1.18 (0.19 - 7.21)0.86

Ca Variantes– Módulo 1 del MFD

Frec OR (IC95%) Valor P

rs3775290 rs1800451 rs8105572 Europeo Amerindio Africano 1 G G C 0.5041 1.00 () --- 1.00 () --- 1.00 () --- 2 A G C 0.2902 1.05 (0.59 - 1.88)0.87 1.41 (0.83 - 2.38)0.2 1.07 (0.58 - 1.95)0.83 3 G A C 0.0693 0.36 (0.11 - 1.18)0.092 0.23 (0.08 - 0.70)0.01 0.36 (0.10 - 1.27)0.11

95

4 G G T 0.0628 0.85 (0.27 - 2.65)0.78 0.71 (0.23 - 2.17)0.55 0.90 (0.28 - 2.86)0.86 5 A G T 0.0488 0.81 (0.27 - 2.43)0.7 0.56 (0.20 - 1.58)0.27 0.70 (0.23 - 2.15)0.54 6 G A T 0.0211 0.16 (0.00 - 6.16)0.32 0.08 (0.00 - 2.34)0.14 0.21 (0.01 - 5.82)0.36 Raros* * * * 0.0038 0.14 (0.00 - 7007.26)0.72 0.04 (0.00 - 7845795.34)0.75 0.24 (0.00 - 2368.37)0.76

Ca


OR (IC 95%) Valor P rs4073 rs1800795 rs40457 rs2233409 Freq Europeo Amerindio Africano

1 A G G C 0.2244 1.00 ()--- 1.00 () --- NA(NA)NA 2 A G A C 0.2222 0.41 (0.12 - 1.37)0.15 0.64 (0.24 - 1.73)0.38 NA(NA)NA 3 T G A C 0.1698 0.22 (0.04 - 1.21)0.084 0.24 (0.01 - 4.32)0.33 NA(NA)NA 4 T G G C 0.1485 1.01 (0.34 - 2.97)0.99 1.37 (0.45 - 4.16)0.58 NA(NA)NA 5 A G G T 0.0511 0.18 (0.03 - 1.03)0.055 0.60 (0.11 - 3.35)0.56 NA(NA)NA 6 T C A C 0.0445 3.09 (0.18 - 54.31)0.44 23.62 (0.42 - 1328.39)0.13 NA(NA)NA 7 A C A C 0.0346 3.48 (0.16 - 76.13)0.43 21.54 (0.04 - 10865.31)0.33 NA(NA)NA 8 A G A T 0.0242 0.24 (0.03 - 2.28)0.21 0.71 (0.08 - 6.00)0.75 NA(NA)NA 9 A C G C 0.0224 0.80 (0.01 - 75.86)0.92 2.88 (0.09 - 91.77)0.55 NA(NA)NA 10 T G A T 0.0198 2.48 (0.09 - 65.03)0.59 >41086 (41086- 410866)<0.0001 NA(NA)NA 11 T C G C 0.0161 3.38 (0.06 - 192.11)0.56 10.44 (0.22 - 504.67)0.24 NA(NA)NA 12 T C A T 0.0113 1.35 (0.02 - 99.55)0.89 0.00 (-NA -NA )1 NA(NA)NA 13 T G G T 0.011 0.50 (0.00 - 58.40)0.77 2.10 (0.09 - 50.88)0.65 NA(NA)NA Hap: Haplotipos; Cr: Cromosoma; *:Combinaciones alelicas raras (x<1%); Ca: Combinaciones alelicas. MFD: Modelo fisiopatológico del dengue; Frec: frecuencia de cada hap o Ca calculados desde el total de individuos incluidos en cada comparación; NA: no se pudo calcular; OR: tasa de Odd; IC 95%: Intervalo de confianza con 95% de confidencia; P: significancia estadística; el OR, IC95% y valor P, fueron calculados mediante regresión logística covariando sexo, edad e índices individuales de cada componente genético ancestral en ensayos independientes.

96

Tabla 21. Frecuencias de las combinaciones alelicas de variantes del módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue en positivos y referentes.

Ca rs3775290 rs5743336 rs1800451 rs7248637 Total Referentes Positivos

1 G T G G 0.4403 0.5604 0.3521 2 A T G G 0.2148 0.2106 0.2169 3 G T G A 0.0949 0.1021 0.0682 4 G C G G 0.0846 0.0288 0.1284 5 A C G G 0.0553 0.0121 0.0844 6 G T A G 0.035 0.0146 0.0473 7 A T G A 0.027 0.047 0.0174 8 G C G A 0.0119 NA 0.0365 9* G T A A 0.0097 0.0073 0.0143 10* A C G A 0.0079 5,00E-04 0.012 11* A T A G 0.0071 0.013 0.0042 12* G C A G 0.0044 0 0.0081 13* A C A G 0.0032 0.0032 0.0045 14* A C A A 0.0023 NA 3,00E-04 15* A T A A 0.0018 4,00E-04 0.0052 16* G C A A 0 NA 0

Ca: Combinación alelica; * combinaciones alelicas raras (X<1%).

predisponiendo fuertemente a infección y desarrollo de dengue. La combinación 8 la cual presentó el mayor OR, también requiere dos pasos mutacionales (rs5743336 y rs7248637) a partir del ancestral. Tanto la combinación 5, así como la combinación 8, tiene dos formas alternativas de generar sus respectivas combinaciones alelicas. Para la combinación 5 tomando la vía CH2 y luego CH1 o CH1 y luego CH2; y la combinación 8 tomando la vía CH2 y luego CH4 o CH4 y luego CH2. Modelos de redes de expresión. Asociaciones diferenciales funcionales de expresión en los fenotipos de infección y progresión del dengue

Para generar los posibles modelos de regulación de la respuesta inmunitaria en los distintos fenotipos del dengue evaluados, los genes que resultaron asociados a uno o más de los grupos de comparación y los asociados a cada uno de los fenotipos de estudio (positivos con seronegativos, positivos con referentes, dengue hemorrágico y hemorragias) se analizaron en peinNetwork,159 Este tipo de análisis ayuda a crear e identificar redes de interacción biológica, usando algoritmos para extraer el conocimiento desde interacciones moleculares conocidas en los modelos humano y ratón entre los genes o sus productos. El resumen de los resultados de interacción se muestra en la Figura 3. Es de anotar que además de presentar las relaciones entre transcriptos de los genes de la pregunta a la red, también puede observarse otros productos génicos que hacen parte del contexto y tienen interacciones físicas con los de la pregunta, para disparar la señalización de la regulación de la expresión génica.

97

La red de productos de genes asociados a positivos comparados con seronegativos (IgM- e IgG-) se puede observar en la Figura 4, se destaca el papel central de NOD1 con menos cantidad de interacciones que RIPK2, IKBKE y TNFA, éste último en dos contextos aclarando que la interacción de IKBKE con TNFA está mediada por NFKB1A, de la misma manera que TNFRSF1A media la interacción entre TNFA y JAK1; también se observan papeles centrales de JAK1 que puede interactuar directamente con IL4R. A pesar de que IL12B, CCR7 e IL17A no tienen conectividad física con la red, están cerca a la vía, probablemente a través de mediadores indirectos. En la Figura 5, se muestra los resultados de la red de los transcriptos de genes asociados a positivos comparados con referentes y sus contextos. Esta red es evidentemente más extensa que la anterior, por involucrar un mayor número de genes. Aparentemente se destacan tres módulos importantes. EL primer módulo resalta el papel central de IKBKE, RIPK2 y NOD1 y aunque no hay conectividad física aparente con MICB y CCR7, estos dos deben estar conectados con IKBKE, RIPK2 y NOD1 indirectamente a través de otros mediadores. El segundo módulo contiene a IL6 e IL6R con interacción física directa a través del mediador IL6ST a JAK1, el cual junto con IL4R tienen papeles centrales en la vía, seguido de la interacción física directa con IL10RA y subsecuente interacción con IL10. En el tercer módulo puede observarse la vía de interacción física directa de IL1B e IL18 a través del mediador CASP1. Además a pesar de que IL8 tiene un papel central importarte pierde conectividad física con la vía, al igual que TLR3, CD209, MBL2 e 12B, sin embargo en ellos resalta su proximidad a la vía, la cual debe responder a otros mediadores indirectos. Respecto a la red de transcriptos de genes asociados a dengue hemorrágico, en la Figura 6, es sorprendente que a pesar de que la pregunta a red está compuesta por solo 8 genes (menos número de genes asociados considerando todas las evaluaciones estudiadas), la red que genera es bastante extensa. Se encontró el papel central de TNFA en dos contextos y su interacción directa con NFKB1 mediando físicamente la interacción con IKBKE, el cual también presentó un papel central y la vez sirve de mediador directo para interactuar con IKBKE y NOD1. Los transcriptos de los genes IL8, CCR7, CD209 y CCL2 pierden conectividad con la vía, sin embargo presentan proximidad entre ellos y con la vía, lo puede estar relacionado con otras interacciones no directas (no físicas). De otro lado, considerando los transcriptos de los genes que resultados asociados

a hemorragias en el curso de dengue, logró observarse 2 módulos relevantes. El

primero presenta el papel central de las interacciones físicas entre IL4R, JAK1 y a

través de IL6ST, la interacción directa con IL6 y subsecuente interacción con IL6R.

Y aunque CCL2 pierde conectividad muestra proximidad a la vía, el cual junto con

IL8 en iguales condiciones, muestran también proximidad al segundo módulo, que

contiene tanto la vía de IKBKE así como la vía RIPK2, los cuales tienen papeles

centrales. Los transcriptos de los genes IL18, CD209, TLR3, MBL2 , IL12B y

98

CCR7, pierden conectividad, sin embargo presentan proximidad entre ellos, lo cual

puede responder a implicaciones de efectos de otros transcriptos no directos entre

ellos. Figura 7

Figura 2. Redes de combinaciones alelicas de variantes del módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue, en positivos comparados con referentes.

Red Neighbor Joining. SQ= Número de la combinación alelica, CH#: variante que cambia para pasar de un haplotipo a otro; CH1= rs3775290, CH2= rs5743336, CH3= rs1800451 y CH4= rs7248637. Rojo: positivos, amarillo: referentes; tamaño del circulo: frecuencia relativa del haplotipo. Las cajas indican los haplotipos y componente ancestral asociados a susceptibilidad descritos en la Tabla 18.

Por último analizando las interacciones de transcriptos de todos los genes asociados en este estudio en al menos uno de los grupos de comparación, se logró observar un panorama general de señalización de transcriptos génicos en el curso de dengue, los cuales presentan un gran número de interacciones físicas, esto puede verse en la Figura 8. De derecha a izquierda resalta el papel central de NOD1 y su interacción con RIPK2 e IKBKE, a través de UBC y XIAP respectivamente, además IKBKE a través de NFKB1A, interactúa con TNFA, y aunque IL17A y MIC, pierden conectividad muestran proximidad a la señalización de NFKB1A y RIPK2 respectivamente. Continuando la vía a través de TNFA en contexto con TNFRSF1B, NP_0733387 interactuaron a través de TNFRSF1A, con JAK1, el cual a puede interactuar directamente con IL4R y por medio de IL6ST, con

Europeo y Amerindio

Los tres componentes




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IL6, seguido de la interacción de IL6 con IL6R. A pesar de que CSF3 pierde conectividad con la vía está próximo a TNFA, el cual a través de FYN y en contexto con LYN, interactúa con IL1B, la cual a través de la CASP1 interactúa con IL18. Es de anotar que CCR7, CD209, IL12B, MBL2, CCL2, TLR3 e IL8, a pesar de pierden conectividad con la vía muestran proximidad con IL6R, IL6, TNFA contexto con TNFRSF1A, TNFA contexto LYN, mismo contexto de TNFA anterior, IL1B e IL18 en el orden respectivo de derecha a izquierda.

100

Figura 3. Resumen de las redes de genes asociados y sus contextos.

Positivos Vs Seronegativos Positivos Vs Referentes

13 variantes en 10 genes 21 variantes en 17 genes

101

Continuación Figura 3

Dengue hemorrágico Hemorragias

8 variantes en 8 genes 17 variantes en 15 genes

102

Continuación Figura 3

Asociados en una o más de las comparaciones de los fenotipos evaluados

31 variantes en 22 genes

103

Figura 4. Red de genes asociados a positivos comparados con seronegativos y sus contextos.

Elaborado en peinnetwork. pregunta: JAK1, IL12B, IKBKE, TNF, IL17A, NOD1, RIPK2, NFKB1A,

IL4R, CCR7. Estos genes fueron involucrados en la historia de exposición a dengue en este estudio

104

Figura 5. Red de genes asociados a positivos comparados con referentes y sus contextos.

105

Continuación Figura 5.

106


Elaborado en peinnetwork. pregunta: JAK1, IL6, IL12B, IKBKE, IL6R, IL8, IL10, IL1B, TLR3, MICB,

NOD1, RIPK2, MBL2, IL18, IL4R, CCR7, CD209. Estos genes fueron involucrados en la infección y

desarrollo de dengue en este estudio.

107

Figura 6. Red de genes asociados a dengue hemorrágico y sus contextos.

108


Elaborado en peinnetwork. pregunta: IKBKE, IL8, TNF, NOD1, CCL2, CSF3, CCR7, CD209. Estos

genes fueron involucrados en la progresión a dengue hemorrágico en este estudio.

109

Figura 7. Red de genes asociados a hemorragias y sus contextos.

Elaborado en peinnetwork. pregunta: JAK1, IL6, IL12B, IKBKE, IL6R, IL8, TLR3, RIPK2, MBL2,

IL18, NFKB1A, IL4R, CCL2, CCR7, CD209. Estos genes fueron involucrados en la progresión a

hemorragias en el curso de dengue en este estudio.

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Figura 8. Red de los 22 genes asociados en uno o más de los fenotipos evaluados del dengue y sus contextos.

111

Elaborado en peinnetwork. pregunta: JAK1, IL6, IL12B, IKBKE, IL6R, IL8, IL10, IL1B, TNF,, TLR3, MICB, IL17A, NOD1, RIPK2, MBL2, IL18, NFKB1A, IL4R, CCL2, CSF3, CCR7, CD209. Estos genes fueron involucrados en la historia de exposición y/o la infección y desarrollo de dengue y/o dengue hemorrágico y/o hemorragias en el curso de dengue en este estudio.

112

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Descripción de la muestra En los grupos de riesgo, positivos y presencia de hemorragias se encontró mayor proporción de mujeres, congruente con resultados previos que sugieren las mujeres son más comunes en las formas severas del dengue.68 De la misma manera en estos dos grupos de riesgo, fueron mejor representados por los pacientes más jóvenes, lo que incluyó a dengue hemorrágico, estos eventos de formas clínicas severas en menores de edad con formas clínicas severas del dengue en poblaciones de America.33 De otro lado los pacientes con presencia hemorragias en el curso de dengue mostraron mayor proporción de eventos de infecciones secundarias, esto ha sido visto previamente en pacientes infectados con dengue en Americanos.33 Tabla 4. Esto sugiere que personas jóvenes, mujeres y casos de infección secundaria son factores de riesgo para formas severas del dengue en población Colombiana. Componentes ancestrales La Tabla 5 y la Figura 1. Muestran que hay una alta correspondencia de la distribución de las proporciones de los componentes genéticos ancestrales entre los referentes de Antioquia y los previamente reportados por Gravel S y colaboradores 2013.149 Algunos grupos de riesgo presentan menores porciones del componente Africano, estos son positivos comparados con seronegativos, presencia de hemorragias comparado con ausencia y dengue hemorrágico comparado con dengue clásico. El último aunque mostró una fuerte tendencia no fue significativo. Lo que es congruente con el aumento de componente no Africano (Europeo) y disminución del Africano, asociados a fenotipos de susceptibilidad a dengue en poblaciones de America.85, 148 En la misma tabla y figura puede observarse como aumenta el Europeo y Amerindio en los mimos tres grupos de riesgo, con la salvedad que en forma clínica la tendencia del Amerindio es fuerte, pero no significativa. Estos resultados demuestran que el contexto ancestral puede determinar grupos de riesgo a distintos fenotipos de dengue en Colombia.

113

Módulo 1 y su influencia sobre los módulos 2 y 3 del Modelo fisiopatológico del dengue de acuerdo al contexto genético ancestral.

La infección con dengue y su incidencia varía dependiendo de la localización geográfica, estos diferencias demográficas podrían ser explicadas por diferencia en los efectos de variantes genéticas sobre la respuesta inmune específicamente en vías de reconocimiento de patógenos determinando diferencialmente la fisio-patogénesis de la enfermedad. En el módulo 1 nosotros evaluamos la influencia de la variación genética humana en algunos sensores y genes receptores anti-virales (respuesta inmune innata) sobre la susceptibilidad a la infección y progresión de dengue.

La infección con VD depende de las variantes en la proteína de la envoltura viral y su interacción con el sistema inmune innato del hospedero, lo cual determinará la calidad de la respuesta inmune adaptativa. Se ha observado que la señalización de los receptores de reconocimientos de patrones asociados a patógenos, incrementa la internalización viral y estimula la producción de más sensores virales y mediadores solubles.160

Polimorfismos en los genes aquí estudiados TLR3, NOD1, NOD2, MBL2 y CD209 han sido reportados con influencia sobre un gran números de enfermedades infecciosas, incluyendo dengue, HIV-1, cytomegalovirus, tuberculosis y virus de hepatitis C entre otras infecciones con un papel relevante en la defensa del hospedero contra patógenos.129

De las siete variantes en 5 genes candidatos evaluados del módulo 1 del Modelo fisiopatológico, resultaron cinco variantes asociadas a resistencia/susceptibilidad con la infección y/o la progresión de dengue en este estudio (rs3775290, rs5743336, rs1800451, rs7248637 y rs8105572).

Aunque poco es conocido a cerca de la función biológica de la variante rs7248637, localizada en el 3'-UTR del gen CD209, ha sido postulada como mediadora de la regulación y reconocimiento de un micro RNA de interferencia (miRNA) involucrado en la protección a desarrollo de enfermedad en respuesta a infección viral en población Africana bajo un modelo de herencia dominante. Una similar composición genética Africana fue confirmada en poblaciones de Marruecos y Tunes, con influencia de la ancestría Europea.129 Esta variante en nuestro estudio tuvo un papel semejante pues de igual manera fueron asociados el alelo A así como los genotipos G/A y A/A bajo un modelo dominante, con la protección a la infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes teniendo en cuenta los componentes Africano y Europeo en ensayos independientes, más significativamente Africano, contexto en el cual hay la mayor probabilidad de haber originado el alelo de protección pues tanto el MAF como los genotipos que lo contienen presentan mayor frecuencia en población Africana seguida de poblaciones Amerindia y Europea respectivamente (Tabla 6). Es importante anotar que considerando el componente Amerindio esta variante (rs7248637) no tuvo efecto sobre fenotipos relacionados con la infección, sin embargo evaluando

114

progresión del dengue, los genotipos G/A y A/A bajo un modelo dominante si fueron factores de protección a dengue hemorrágico, exclusivamente en este último contexto (Amerindio).

Otro hecho que liga el componente Amerindio con la asociación a protección a formas severas del dengue, conferida por variantes recientemente descritas en el gen CD209, son los genotipos rs8105572 C/T y T/T, los cuales en este estudio bajo un modelo dominante resultaron disminuyendo el riesgo a presencia de hemorragias teniendo en cuenta particularmente el componente Amerindio. Hay evidencia de que el alelo T y los genotipos C/T y T/T están en mayor proporción en la población Africana (Tabla 6), por lo tanto estas variantes de protección pueden tener su origen al igual que rs7248637 del mismo gen (CD209) en dicha población. Parece que la introducción de variantes del gen CD209 con origen Africano a un contexto Amerindio, confiere protección a la progresión a formas severas del dengue. Hecho que es congruente con la previamente descrita protección atribuible al componente genético ancestral Africano contra dengue hemorrágico en poblaciones Americanas.85

Atreves de poblaciones Americanas como por ejemplo Brasil donde hay bastante presencia de etnia Africana se encontró el genotipo de otra variante del gen CD209 (rs4804803 GG) asociada con la protección a dengue severo (OR-2.25; p=0.03).160

Estas diferencias en la asociación de variantes en genes candidatos a protección o severidad de dengue de acuerdo al contexto genético ancestral, ya se han visto previamente en dengue, y se propone efecto de presiones selectivas específicas de población en diferentes regiones geográficas ejercida principalmente por patógenos que están moldeando la maqueta genética humana y su impacto sobre las vías de respuesta a dengue.160 Lo cual puede ser observado desde las diferencias en frecuencias alelicas de diferentes poblaciones ancestrales.

CD209 es crucial para la infección de células dendríticas para los cuatro principales serotipos de dengue y variantes en sus regiones reguladoras han sido descritas con variación funcional, regulando los niveles del receptor,160 los polimorfismos aquí estudiados pueden afectar su afinidad y la vida media del transcrito, por ubicarse en región codificante (rs8105572) y 3-UTR (rs7248637) respectivamente.

Los polimorfismos del gen CD209 podrían influenciar la adhesión de DENV a plaquetas evitando la trombocitopenia.90 Evidencia de esto es la destrucción de plaquetas y megacariocitos por apoptosis encontrada en infecciones con DV in vitro predisponiendo a la variación de la homeostasis.104

Algunos investigadores piensan que CD209 solo sirve para unir DENV a la superficie de las células y que la endocitotis depende de otras moléculas.87 De hecho, recientes estudios documentan nuevas moléculas que están involucradas en el reconocimiento de DV.104

CD209 activa la señalización de TLRs, conduciendo la respuesta de células dendríticas a infección viral, desencadenando mecanismos de protección.129

115

Comparando positivos con referentes nuestros datos genéticos sugieren fuertemente que la variante rs3775290 en el gen TLR3, más específicamente el alelo A y el genotipo A/A bajo un modelo recesivo predisponen a la infección con VD, más significativamente en el contexto genético Africano, seguido de Europeo y Amerindio respectivamente. Es de anotar el MAF:A está más elevado en Asiáticos, seguido de Europeos y Africanos (Tabla 6). Por lo tanto el MAF tiene alta probabilidad de origen Asiático. También es importante anotar que en nuestro estudio los genotipos A/A y G/A resultaron factores de riesgo a presencia de hemorragias teniendo en cuenta particularmente el contexto Amerindio.

No parece entonces coincidencia que por un lado en Chinos haya alta incidencia de dengue hemorrágico comparado con Malayos, esto indica que las personas asiáticas tienen diferencias específicas en cuanto al curso de la enfermedad del dengue dirigida por su respuesta inmune a infección con DV.104 Por otro lado el cambio sinónimo (Phe) rs3775290 G/A del gen TLR3 está localizado en la posición 1377 de la región codificante y se ha reportado que tiene efecto funcional. El alelo A está en DL con rs3775296G, rs3775291G y rs5743312T en población asiática (Chinos) y confieren riesgo a inflación crónica articular.130

Además recientemente rs3775290 ha sido asociada con otros síndromes que involucran reacción vesicular de la piel y mucosas en respuesta a infecciones bacterianas y virales (Mycoplasma pneumoniae, herpes, Epstin-Barr y Cytomegalovirus). Pacientes que progresan a formas clínicas graves experimentan necrosis epidérmica y daño hasta incluso pérdida de la visión. El genotipo A/A fue de riesgo a SJS-TEN, comparando casos con controles saludables y combinada con el alelo HLA-A*0206 mostró incremento del riesgo al mismo rasgo.161

TLR3 puede estar relacionado con efectos sobre otros módulos del modelo fisiopatológico porque influye en la señalización de otros genes tales como INF.129 El cual induce la producción de megacariocitos estrechamente relacionados a la fisiopatología de las coagulopatías en infecciones por DV.104 En un estudio in silico, en el promotor de TLR3 fueron encontrados elementos estimuladores de INF como los factores reguladores de interferon (IRFs). La hipótesis planteó la influencia de estos promotores sobre la respuesta de citoquinas, las cuales en sinergia con TNFA e INFG estimulan su producción en células endoteliales.130

Además células que expresan grandes cantidades de TLR3 como células dendríticas y CD8+, usualmente tienen alta actividad fagocítica de células entradas en apoptosis. Estas procesos biológicos pueden ser alterados por variantes en TLR3 que induzcan la deficiencia de TLR3 desistiendo de la respuesta de células T CD8+ cuando hay ingesta de células cargadas con sdRNA viral o infectadas con virus.109

Al igual que TLR3 y CD209, MBL2 juega un papel de sensor viral interviniendo el control, la patogénesis y el resultado de la infecciones virales.129 Variantes en el gen MBL2 han sido reportadas afectando los niveles de proteína en suero con variación entre individuos. El exón 1 contiene un alelo mutante en el codón 57 (alelo C: G→A / Gly→Glu) asociado a bajos niveles de la proteína en suero. La

116

presencia del MAF:A en el genotipo heterocigoto reduce significativamente los niveles de la proteína en suero y en estado homocigoto la reduce completamente hasta su ausencia.162 Esta deficiencia es común en poblaciones humanas y hay evidencia de su influencia sobre el aumento la susceptibilidad a enfermedades infecciosas bacterianas, fúngicas y virales como HIV-1 y hepatitis C.163 Deficiencia que también ha modulado la evolución de la infección o la enfermedad del dengue potenciando la protección o la susceptibilidad.164

La variante rs1800451 en el presente estudio tuvo un papel semejante pues de igual manera fueron asociados el alelo A así como los genotipos que lo contienen (G/A y A/A) bajo un modelo dominante, con el riesgo a la infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes teniendo en cuenta el componente Amerindio, sin embargo no tuvo efecto teniendo en cuenta Europeo o Africano. El origen más probable del alelo de riesgo es en población Africana quienes tienen el MAF, en mayor frecuencia comparados con Europeos y Amerindios, así como en mayor frecuencia el genotipo de riesgo heterocigoto (Tabla 6). Parece ser que la introducción de variantes del gen MBL2 con origen Africano a un contexto Amerindio, confiere riesgo a la infección con el virus dengue. Polimorfismos en el gen MBL2 ya habían sido correlacionados con grupos étnicos específicos. Se observó que la frecuencia del alelo A estaba presente de 14-44% en Africanos subsaharianos pero es raro en Asia, produciendo fenotipos bajos productores en población Vietnamita.164 La fisiología de dengue sugiere que la infección por DENV podría ser potenciada por la unión de viriones a células susceptibles de infección, de hecho los megacariocitos y plaquetas expresan grandes cantidades de receptores del complemento lo cual podría facilitar la unión a través de complejos virus-MBL2-complemento.165

De otro lado en este estudio la misma variante (rs1800451) se encontró asociada con presencia de hemorragias. El alelo A resultó un factor protector teniendo en cuenta el componente Amerindio, igualmente protectores los genotipos G/A y A/A bajo un modelo dominante teniendo en cuenta los tres componentes (Europeo, Amerindio y Africano) en ensayos independientes, más significativamente en Amerindio, seguido de Europeo y Africano respectivamente. Puede observarse entonces que a pesar del riesgo potenciado por el alelo A y los genotipos G/A y AA a la infección por DV, protegen contra la susceptibilidad a la hemorragia durante el curso de dengue. Este resultado podría estar correlacionado con los bajos niveles de MBL2 en suero de pacientes infectados quienes portan el alelo mutado disminuyendo la probabilidad de desarrollar trombocitopenia que quienes portan el alelo silvestre, sugiriendo el rol protector de variantes del gen MBL2 hacia complicaciones durante la infección con dengue (trombocitopenia).164 Este mismo estudio referente documenta la reducción de plaquetas, independientemente de diferencias ambientales. Describe que dengue virus suprime los procesos fisiológicos de médula ósea, retardando la maduración de megacariocitos y en consecuencia la producción de plaquetas.166 Además ratones produciendo anticuerpos con reactividad cruzada con plaquetas, después de la infección con VD, degradan plaquetas en presencia del complemento.167 La hipótesis entonces plantea que pacientes con el genotipo silvestre son más susceptibles a

117

trombocitopenia por efecto sobre el reconocimiento de carbohidratos de la superficie viral, lo cual promueve la activación del complemento, promoviendo la lisis de plaquetas asociadas a anticuerpos.

Los dominios de oligomerización NOD1 y NOD2, al igual que TLR3, MBL2, junto con CD209 son receptores de reconocimiento que activan la inmunidad innata. Específicamente el sensor NOD2 une ssRNA viral y péptido-glicanos de bacterias, con la subsecuente oligomerización y señalización del sensor NOD1, lo cual es potenciado con la presencia de MAVS (señalizador mitocondrial antiviral), facilitando la activación de IRF3 y producción de INF. La comunicación cruzada entre NOD1 y NOD2 facilitará el reconocimiento viral, conduciendo un fuerte efecto sobre la viremia.168

Se ha propuesto que variantes en el gen NOD1 pueden estar relacionados con diferentes resultados de la infección por patógenos. La variante 796 (rs5743336) ubicada en el 5-UTR ha sido asociada con ulcera gástrica en repuesta a infección bacteriana en población caucásica.169 Resultados similares publicados en 2011 cuando el genotipo CC fue reportado en población de Alemania asociada al incremento del riesgo a gastritis atrófica.169

En nuestro estudio la variante rs5743336 tuvo un papel semejante, pues de igual manera fueron asociados el alelo C así como los genotipos C/C y T/C bajo un modelo más significativamente codominante, con el riesgo a la infección por VD y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes más significativamente teniendo en cuenta el componente Amerindio, seguido de Europeo y Africano respectivamente en ensayos independientes. El origen más probable del alelo de riesgo es en población Africana quienes tienen el MAF (C), en mayor frecuencia comparados con Europeos y Amerindios, así como la mayor frecuencia el genotipo heterocigoto (Tabla 6).

De otro lado en este estudio evaluando la historia de exposición al virus dengue se observó una la elevada frecuencia del MAF (rs5743336 del gen NOD1) en seronegativos (IgM- y/o IG-) (MAF=0.627) comparados con positivos (MAF=0.2874) y referentes (MAF=0.0442). El MAF resultó de protección a positivos comparados con seronegativos teniendo en cuenta el componente Europeo, seguido en significancia de Africano y Amerindio respectivamente, igualmente protectores los genotipos T/C y C/C bajo un modelo codominante teniendo en cuenta los tres componentes ancestrales en el mismo orden de significancia.

A pesar de la expresión constitutiva de los genes NOD1 y NOD2, pueden ser modulados (aumentados o disminuidos) por otras proteínas de su vía de señalización tal como IL1B.116 Nosotros proponemos la hipótesis de que el MAF (rs5743336 del gen NOD1) y los genotipos que lo contienen facilitan la infección con VD por predisponer a una respuesta inefectiva vía INF impidiendo el montaje de un eficaz estado antiviral, debido a su efecto reductor de la capacidad de producción de la proteína (NOD1) por la inestabilidad estructural del transcrito conferida por el alelo mutante, probablemente por la disminución de su afinidad por el ribosoma. Esto reduce la calidad de la respuesta inmune adaptativa conduciendo

118

la baja producción de anticuerpos, reduciendo la probabilidad de presentar severidad del dengue dependiente de anticuerpos pre-existentes o dependiente de infecciones prolongadas. De hecho otros estudios han sugerido que NOD1 es importante para la activación de células T y producción de anticuerpos. La estimulación de NOD1 solo con sus agonistas fue suficiente para dirigir la polarización inmune específica antigénica Th2. Además ratones deficientes en NOD1 mostraron una reducida frecuencia de INF-y con poca producción de células T CD4+ y CD8+ y con baja producción de anticuerpos, sugiriendo que NOD1 es requerido para una optima repuesta celular T y B.168

Congruentemente con esta hipótesis en este estudio observamos la asociación de la misma variante rs5743336, alelo C teniendo en cuenta Europeo y el genotipo CC bajo un modelo recesivo, teniendo en cuenta los tres componentes, más significativo Europeo que Africano y Amerindio respectivamente, a protección contra la progresión a dengue hemorrágico, probablemente debido al ineficiente montaje de la inmunidad adaptativa, incluyendo el desarrollo de anticuerpos, por la disminución de la calidad de la respuesta inmune innata, lo cual evita un completo montaje de la respuesta inflamatoria protegiendo contra complicaciones en el curso de la enfermedad. En este sentido el alelo silvestre (T) podría estar relacionado con la susceptibilidad a la severidad del dengue. En un estudio realizado en Hungría los homocigotos T/T incrementaron el riesgo a ulceras en respuesta a infección de otros patógenos tales como bacterias.170

Recientemente fue estudiado en Brasil la asociación de los genotipos rs2066843 y rs751271 en NOD2 comparando casos de dengue severo con controles saludables y no se encontraron diferencias significativas, sin embargo hubo una notable tendencia del genotipo TT (homocigoto para MAF) a la protección contra las formas severas de dengue.160

Después del reconocimiento de patógenos, los receptores tipo NOD deficientes, tendrán una tasa baja de activación de la vía NFkB, al igual que una pobre señalización de vías MAPK para activar las caspasas y baja estimulación de la producción de citoquinas y quimoquinas proinflamatorias con reducidos eventos de apoptosis.116

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Módulo 2 y su relación con el módulo 3 del modelo fisiopatológico del dengue de acuerdo al contexto genético ancestral.

La señalización de receptores de reconocimiento de patógenos (módulo 1 del modelo fisiopatológico) estimula la producción de citoquinas, quimoquinas, sus receptores y mediadores de la señal, para dirigir y efectuar mecanismos de protección160 contra la replicación viral, lo que nombramos como módulo 2 del modelo fisiopatológico del dengue (comprende mecanismos efectores del sistema inmune innato y sobre todo mecanismos de señalización y efectores del sistema inmune adaptativo).160 Finalmente el tipo de infección y el completo montaje de la inflamación, determinaran el grado de permeabilidad vascular y daño celular que conducirán a extravasación y hemorragias que anteceden la muerte (lo que hemos llamado Módulo 3).

Después de la unión de DV a CD209, TLR3, NOD2 y MBL2 son activadas las vías de señalización de JAK1 y NFKB

En el año 2010 Luciano K Silva exploró variantes en el gen JAK1 encontrando una fuerte asociación genética con dengue hemorrágico comparado con dengue clásico, determinando la importancia de JAK1 sobre la presentación clínica en el curso de dengue. De 18 variantes evaluadas 11 resultaron con asociación significativa, entre ellas rs11208534. Después de ajustar el valor p de la asociación con variables de confusión como la composición genética ancestral, ingresos, la edad y el sexo, el homocigoto (rs11208534 AA) mantuvo el riesgo. Además cuando se comparó solo los pacientes diagnosticados con dengue hemorrágico que presentaron sangrado espontáneo con los de dengue clásico, el mismo genotipo rs11208534 AA resultó incluso incrementando aún más el riesgo mientras que otras variantes de JAK1 como es el caso de rs310196 fueron de protección. La variante rs2780831, la cual también incrementó el riesgo a dengue hemorrágico independientemente se encontró en el mismo bloque de ligamiento con rs11208534. Con el componente genético ancestral como variable dependiente se encontraron los genotipos del rs11208534 presentando asociación significativa con el Africano; en AA menos elevado (0.41+/-0.22) que los GG (0.61+/-0.18) y los G/A (0.50+/-0.22) respectivamente. En otro estudio en el Salvador el MAF:G se presentó con mayor frecuencia en auto-identificados Negros que en Blancos. Los genotipos susceptibles mostraron menos Africano consistente con la asociación de la protección a dengue hemorrágico con el componente ancestral Africano.148

En nuestro estudio a pesar de que la variante rs11208534 no presentó efecto sobre dengue hemorrágico tuvo un papel semejante e importante en la fisiopatología del dengue, pues tuvo un fuerte efecto sobre otros fenotipos de dengue evaluados. A pesar de que estadísticamente el genotipo A/G asociado a protección y G/G a riesgo a presencia de hemorragias en el curso de dengue bajo un modelo codominante teniendo en cuenta el componente Amerindio, el genotipo G/G se

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confirmó asociado a riesgo teniendo en cuenta los componentes Europeo y más significativo Africano de manera independiente ambos bajo modelos recesivos. De otro lado evaluando la historia de exposición a dengue, el mismo genotipo G/G resultó de riesgo comparando positivos con controles seronegativos (IgM- e IgG-) bajo el modelo de herencia codominante teniendo en cuenta el componente ancestral Amerindio, no tuvo efecto sobre este último rasgo teniendo en cuenta Africano o Europeo.

Hay evidencias previas de las frecuencias de los genotipos rs11208534 G/G y A/G. Estos genotipos son raros en Europeos y de alta frecuencia en Africanos y Asiáticos, el MAF:G ligeramente mayor en Asiáticos que en Africanos (Tabla 6), estos reportes permiten pensar en el posible origen Asiático del alelo G o que ha incrementado su frecuencia en Asiáticos por efecto de deriva, después de un efecto fundador de portadores del alelo G, que migraron de poblaciones con alto Africano a Asia y luego a América.

Esta susceptibilidad a fenotipos severos del dengue (positivos y presencia de hemorragias) conferida por la variante rs11208534 (G/G) en JAK1, podría variar en forma de gradiente de acuerdo al grado de proporción de la ancestría Africana seguida de diferencias inmunológicas y epidemiológicas observadas en dengue.148

Polimorfismos de protección (rs11208534 A/G) en JAK1 conteniendo el alelo silvestre podría determinar una adecuada señalización de su productor genético. JAK1 es una de las dos proteínas asociadas a el receptor de interferon tipo I, potente señal para la inducción de interferon tipo I y II (INF-gama) capaces de contrarestar la infección con flavivirus.148 La producción de INF-gamma generará células tipo Th1 y la maduración de macrófagos señalizando moléculas anti-patógenos.171

Los polimorfismos de susceptibilidad encontrados en JAK1 podrían producir los patrones de regulación negativa de JAK1 vista en dengue severo.148 Dado que la variante rs11208534 está ubicada en el intrón 3, puede estar afectando la estabilidad del mensaje lo que se reflejaría en un fenotipo poco productor de JAK1, reduciendo la capacidad efectiva de contrarrestar la infección con DV. Polarizando la respuesta hacia la vía TKY2, esta falta de balance en la respuesta podría aumentar el riesgo de hemorragias en población mestiza.

La débil respuesta de JAK1 a otras proteínas de la vía pueden afectar los mecanismos de coagulación. Se ha observado en modelos animales tales como cerdos de nueva guinea que los niveles de IL6 potencian de manera dosis dependiente la activación de JAK1 y estimulan la formación de megacariocitos y plaquetas. Regulación negativa de esta vía podrá asociarse con Trombocitopenia,172 la cual ha sido correlacionada con bajo niveles de INF predisponiendo a las coagulopatías en infecciones con dengue.104

Otra variante en el gen JAK1 es rs2780895, la cual ya había mostrado variación moderada entre sujetos de población China en orden de dilucidar los factores

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genéticos del hospedero que afectan el resultado de la infección con el virus de la hepatitis B en repuesta a terapia con INF-alfa.173

En nuestro estudio la variante rs2780895 tuvo un papel semejante, pues evaluando la historia de exposición a dengue, tanto el alelo rs2780895 T como el genotipo C/T bajo el modelo sobredomiante fueron protectores comparando positivos con seronegativos (IgM- e IgG-). Para el alelo T teniendo en cuenta el componente Amerindio y para el genotipo C/T los componentes Europeo y Africano; teniendo en cuenta el Amerindio fue más significativo bajo un modelo dominante (C/T y T/T) igualmente asociados a protección, seguido en significancia de Europeo y Africano respectivamente. De otro lado el mismo alelo rs2780895 T y los genotipos C/T y T/T bajo un modelo principalmente dominante fueron protectores a desarrollo de hemorragias teniendo en cuenta particularmente el componente Amerindio. Evaluando la misma variante entre positivos con referentes resultó tanto el alelo rs2780895 T, así como los genotipos C/T y T/T bajo el mimo modelo de herencia (dominante), asociados a protección a infección con DV y desarrollo de dengue, más significativamente teniendo en cuenta Africano que Europeo, mientras en Amerindio no tuvo efecto.

El MAF:T rs2780895 se encontró en alta frecuencia en población Africana, seguido de población Asiática y Europea respectivamente, sin embargo el heterocigoto es más frecuente en Asiáticos (Tabla 6). Indicando que el MAF tiene un probable origen Africano. Esto es congruente con variantes genéticas de protección a fenotipos severos de dengue correlacionados con el componente Africano en poblaciones Americanas.148

Finalmente el genotipo G/A de la variante rs17127114 del gen JAK1 fue de protección a infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes teniendo en cuenta el componente Europeo bajo el modelo sobredominante, mientras fue asociado a riesgo más significativamente el genotipo A/A bajo un modelo recesivo teniendo en cuenta Africano. EL MAF:A está en mayor frecuencia en Asiáticos y Africanos así como el genotipo heterocigoto (Tabla 6).

La mayoría de asociaciones de variantes encontradas en este estudio en el JAK1 resultaron de protección. Esto puede ser debido a que JAK1 es una llave de la regulación de la vía INF. INF (alfa, beta y gama) modulando activamente la actividad antiviral en el cuerpo humano.173

Los miembros de la familia de JAK son cruciales para la señalización de receptores de citoquinas, regulación de la formación de sangre y la respuesta inmune.173 JAK1 interactúa con la cadena gama común de los interferones, para conducir las señales de las familias de receptores de citoquinas tales como IL-4 (IL-4R), gp130 (IL6R) entre otros. Lo cual es importante para transducir las señales de los INFs y de las citoquinas antiinflamatorias tales como IL-10.174

RIPK2 pertenece a la familia de proteínas que interactúan con receptores tipo serina/treorina kinasas y activa las vías NFKB y MAPK, las cuales inducen apoptosis y autofagia respectivamente.171 RIPK2 se produce después de la

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infección con VD.119 Y media la señal de NOD2-NOD1 y sus ligandos a través de ubiquitinación.171

Un reciente estudio demostró que variantes en el gen RIPK2 pueden afectar la respuesta inmune, modulando el resultado de la infección con patógenos bacterianos como M. Leprae. Es así como evaluando controles no afectados con enfermos infectados en población Asiática (Chinos) se encontraron los alelos rs4290 A y rs40457 G asociados a protección a la enfermedad.171

En nuestro estudio la variante rs40457 tuvo un comportamiento semejante evaluando la historia de exposición a dengue. El alelo G fue protector a positivos comparados con seronegativos (IgG- e IgM-) teniendo en cuenta el componente Amerindio, los componentes Africano y Europeo para esta evaluación no tuvieron efecto. De igual manera resultaron asociados a protección al mimo rasgo los genotipos G/G y A/G bajo un modelo de herencia dominante teniendo en cuenta el mismo componente ancestral (Amerindio).

Tanto el MAF:G, así como los genotipos que lo contienen están en mayor frecuencia en población Africana, seguida de población Europea y de en quienes son alelos y genotipos raros (Asiáticos) respectivamente (Tabla 6). Dicho alelo tiene un probable origen Africano, lo cual es congruente con la protección conferida por el componente genético ancestral Africano al desarrollo de formas severas de dengue en poblaciones de America.85

Nosotros proponemos la hipótesis de que el alelo G previene el desarrollo de anticuerpos por predisponer a la inhibición de células B. El complejo NOD2-RIPK2 puede promover la degradación de las proteínas (NFKB1A y NFKB1B) inhibitorias de células B.171 Mutaciones el RIPK2 podrían reducir la cantidad de expresión de RIPK2 y con ello disminuir la eficiencia del complejo (NOD2-RIPK2) sobre la degradación de estas proteínas inhibitorias de células B, aumentando la probabilidad de inhibición de este tipo celular, el cual es crucial para el desarrollo de anticuerpos. Esto es congruente con el hecho de que en este estudio la misma variante (genotipo G/G en un modelo de herencia recesivo) teniendo en cuenta el mismo componente Amerindio resultara de riesgo evaluando positivos con referentes, pues al no producirse anticuerpos neutralizantes habrá mayor posibilidad de infección a través de receptores y procesos de autofagia; el desarrollo de dengue será en consecuencia de la apoptosis.

De otro lado, pero en este mismo sentido, tanto el alelo rs40457 G como los genotipos A/G y G/G fueron asociados a presencia de hemorragias bajo un modelo de herencia dominante, teniendo en cuenta el componente Africano; en Europeo y Amerindio no tuvo efecto. Esto puede ser posible debido al daño de células vasculares y otros tipos celulares infectados y entradados en apoptosis durante el curso de la enfermedad. Un estudio realizado en 2011, evaluó el papel de RIPK2 en infecciones con VD, encontrando disminución de la expresión de RIPK2 en respuesta al tratamiento con fármacos, disminuyendo la apoptosis mediada por DV, demostrando su importancia en la apoptosis durante las infecciones con dengue.119

123

IKBKE es uno de los mediadores más importantes de la respuesta inmune innata, en el cual convergen las señales de receptores tipo RIG112 y receptores tipo NOD168 conduciendo la activación de NFKB y su respuesta (producción de INFs, HLAs, citoquinas, quimoquinas, receptores de citoquinas y receptores de quimoquinas). Recientemente evaluando polimorfismos en el gen IKBKE en una muestra de población del Brasil, fueron asociadas a dengue hemorrágico comparados con dengue clásico las variantes rs1059704 y rs11118132, localizadas ambas en intrones.148

En nuestro estudio las variantes rs1059704 y rs11118132 tuvieron un papel semejante. En primer lugar el alelo rs11118132 G fue asociado con riesgo a dengue hemorrágico teniendo en cuenta el componente Amerindio. Además el mismo alelo G y los genotipos que lo contienen (G/G y C/G) bajo un modelo de herencia dominante, fueron de riesgo a presencia de hemorragias solo en el mismo contexto ancestral (Amerindio). Incluso cuando se evalúo la historia de exposición a dengue tanto el MAF como los genotipos que lo contienen bajo el mismo modelo de herencia (dominante) teniendo en cuenta el mismo componente (Amerindio) fueron de riesgo a positivos comparados con seronegativos (IgM- e IgG-). Estos resultados sugieren la fuerte relación entre el MAF y los genotipos que lo contienen con la susceptibilidad a las formas severas del dengue. Sin embargo cuando se comparó la población referente con los positivos tanto el alelo G como los genotipos (G/G y C/G) resultaron de protección (mismo modelo de herencia y componente ancestral), lo cual sugiere que de un lado estas variantes pueden determinar la transmisión de la señal adecuadamente para la producción de anticuerpos,171 citoquinas, quimoquinas y sus receptores,168 necesarios para contrarrestar la infección, pero por otro lado pueden predisponer a la progresión a las formas severas del dengue. Tanto el AMF:G como los genotipos que lo contienen están con mayor frecuencia en poblaciones Europeas, seguidas de Amerindios y Africanas (Tabla 6). Esto indica el MAF puede tener origen en población Europea, consistente con la susceptibilidad a formas severas de dengue conferida por el aumento en la proporción de componente ancestral no Africano.148

De otro lado la variante rs1059704 del mismo gen (IKBKE) en nuestro estudio tuvo un papel semejante al estudio de referencia148, pues tanto el alelo C, como los genotipos T/C y C/C bajo el modelo de herencia dominante, resultaron de riesgo a infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes, más significativamente teniendo en cuenta Africano, seguidos de Amerindio y Europeo. Tanto el MAF:C como los genotipos que lo contienen, presentan mayor frecuencia en población Africana, seguida de poblaciones Amerindias y Europeas respectivamente (Tabla 6). Sin embargo estas mismas variantes (alelo G, como los genotipos T/C y C/C, pero bajo un modelo de herencia más significativamente codominante) fueron asociadas a protección evaluando su historia de exposición al virus dengue, comparando positivos con seronegativos (IgM- e IgG-) teniendo en cuenta los tres contextos ancestrales, más significativo Amerindio, seguido de Europeo y Africano. Esta susceptibilidad a la severidad del dengue conferida por las variantes en genes candidatos a dengue, podrían variar en forma de gradiente

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de acuerdo al grado de proporción de la ancestría Africana seguida de diferencias inmunológicas y epidemiológicas.148

La fisiopatología de dengue junto con nuestros datos genéticos sugieren que durante la infección con VD, las variantes en IKBKE podrían estar modulando las vías de producción de anticuerpos,171 señalización de mecanismos de apoptosis119 y autofagia,171 tal como ya se describieron para los genes de la vía de receptores tipo RIG112 y receptores tipo NOD168, conduciendo la señal de RIPK2 y la posterior activación de NFKB y su respuesta (producción de INFs, HLAs, citoquinas, quimoquinas, receptores de citoquinas y receptores de quimoquinas).

Nosotros proponemos como hipótesis que específicamente el alelo rs1059704 C, podría tener efecto funcional, y en DL con otras variantes, promover el aumento en su transcripción, afectando la tasa de poli-Ubiquitinación de IKBKE promovida por la actividad del complejo TAK1, su elevada producción superaría la velocidad de degradación del represor del factor nuclear Kb (IKBKE), impidiendo la traslocación de NFKB al núcleo para transcripción de genes proinflamatorios,168 este hecho aumentaría la susceptibilidad a la infección y reduciría la capacidad de neutralización del virus por la pobre producción anticuerpos y otros factores antivirales, principalmente INFs, y reducida presentación antigénica (transcripción de HLAs). En contraparte el efecto que produce el MAF:G de la variante rs11118132 promueve la producción de anticuerpos aumentando la eficiencia de transducción de la señal de NOD1 y potenciando su función biológica, aumentando la posibilidad de presentar hemorragias en el curso de dengue. Mediadores solubles como anticuerpos con reactividad cruzada con plaquetas han mostrado aumento en los eventos de apoptosis llevando a trombocitopenia en las coagulopatías de dengue.104 Además polimorfismos en IKBKE han sido asociadas al desarrollo de condiciones autoinmunes (lupus, AR) en diferentes poblaciones.175

NFKB1A es una proteína que en mamíferos impide el secuestro de la vía de NFKB en el citoplasma celular disociando a IKBKE de NFKB, promoviendo la señalización nuclear de los genes trascriptos por NFKB. Polimorfismos en NFKB1A han sido evaluados en cuanto a su asociación a enfermedad grave en polacos caucásicos, encontrando que el alelo rs2233409 T es de riesgo a oftalmopatía clínica evidente.175 Esta variante está ubicada la región promotora del gen -826; en nuestro estudio tiene un papel semejante, puesto que el genotipo T/T resultó asociado a riesgo de presencia de hemorragias bajo un modelo de herencia recesivo teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. En otro estudio el genotipo C/T ya había sido asociado previamente a enfermedades autoinmunes en población de Taiwan.175 También esta misma variante (rs2233409) ya había sido asociada con repuesta inmune innata positiva contra patógenos en sangre mediada por la proteína G-CSF (factor estimulador de colonias).176 Podría entonces asumirse que las variantes en el gen NFKB1A pueden afectar la expresión de otros genes en la vía de NFKB influyendo en la regulación de la respuesta inflamatoria.175 Tanto el MAF:T como los genotipos que lo contienen están en mayor frecuencia en Europeos, seguido de Amerindios y Africanos

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respectivamente (Tabla 6). Lo cual indica un probable origen Europeo del MAF. Congruente con genotipos susceptibles relacionados con ancestría no Africana.148

Otra variante (rs2233406, -297) está en DL con rs2233409 en población caucásica, está ubicada cerca del sitio de unión a NFKB en el promotor de NFKB1, esta mutación altera el sitio de unión putativo del factor de transcripción GATA-2. Es de anotar que rs2233406 también está asociado a oftalmopatía clínica evidente independientemente, como también asociado al mismo rasgo el haplotipo que genera con rs2233409.175

De otro lado evaluando la historia de exposición a dengue y el mismo gen (NFKB1A) en nuestro estudio, tanto el alelo rs8904 T, así como los genotipos C/T y T/T bajo un modelo de herencia dominante se asociaron a protección, comparando positivos con seronegativos (IgM- e IgG-) teniendo en cuenta el componente ancestral Amerindio. El MAF:T de la variante rs8904, al igual que los genotipos que lo contienen, están en mayor frecuencia en población Africana, seguidos de poblaciones Europea y Amerindia respectivamente. Este probable origen Africano del MAF:T, es congruente con la protección a formas severas de dengue correlacionado a la ancestría Africana en poblaciones Americanas.148

Después del reconocimiento de la infección a través de receptores y sensores innatos (CD209, MBL2, NOD2 y TLR3) y de la señalización de mediadores de la respuesta inmune innata (JAK1, NFKB1A, RIPK2, IKBKE), se efectuará el montaje completo de las respuesta efectora innata y adaptativa (Th1, Th2, Th17) a través de la transcripción de citoquinas, quimokinas, sus receptores y HLAs.

En respuesta a interferones tipo I y II señalizados por receptores tipo RIG, receptores tipo Tol, receptores tipo leptina y receptores tipo NOD, se activará la vía de JAK1 potenciando la producción de citoquinas proinflamatorias como INF-gamma e IL6172, sus receptores como gp130 (IL6R) e IL-4 (IL-4R) y citoquinas antiinflamatorias tales como IL-10 e IL-4.174

La estimulación de receptores tipo NOD enviará la señal mediada por RIPK2,171 y la estimulación de receptores tipo RIG, conducirá la señal mediada por IKBKE112,

119, 168, 171 ambas moduladas por NFKB1A,175, 176 controlan la traslocación de NFKB al núcleo promoviendo la transcripción de anticuerpos, citoquinas, quimoquinas sus receptores y HLAs.

El control de la transcripción y la comunicación de productos genéticos de ambas vías (JAK y NFKB) determinarán la resistencia/susceptibilidad a la infección y/o progresión del dengue.

Los patrones de citoquinas Th1 producidos por pacientes en respuesta a la infección con el virus dengue ha sido relacionada a la resolución de la infección,

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mientras que los patrones de citoquinas Th2 han sido observados promoviendo la severidad de la sintomatología.177 En el presente estudio analizamos variantes en algunos genes que pueden dirigir la respuesta Th1/Th2, en orden de verificar la ocurrencia de la asociación entre ellas y la susceptibilidad/resistencia a la infección y/o progresión de dengue.

Varios genes de citoquinas muestran variantes en regiones reguladoras, directamente afectando la transcripción y en consecuencia la producción del perfil de citoquinas. Estas diferencia influyen sobre la epidemiología de muchas enfermedades infecciosas, incluyendo dengue hemorrágico.137

Hay evidencia de niveles elevados del receptor de IL6 soluble (sIL6R) en varias enfermedades, por ejemplo evaluando pacientes HIV-1 positivos con controles saludables;178, 179 también durante la fase aguda en infecciones con hongos y bacterias,180 así como en pacientes con peritonitis con etiología bacteriana con marcado daño hepático.181 Se ha propuesto que variantes del gen podrían estar regulando su producción y función. De hecho evaluando pacientes con la enfermedad de Castleman HIV-I negativos comparados con controles saludables con similar descendencia Europea, resultó asociada la variante rs8192284,182 antes conocida como rs2228145,133 donde el alelo C resultó de riesgo y correlacionado con elevados niveles de expresión (sIL6R) en células dendríticas. Este mismo alelo se correlacionó con los niveles más bajos del receptor atado a la membrana (mIL6R).182

En nuestro estudio la variante rs8192284 presentó comportamiento semejante. El alelo C y los genotipos CC y A/C bajo un modelo de herencia dominante, fueron asociados a presencia de hemorragias en el curso de dengue, exclusivamente teniendo en cuenta el componente Amerindio.

De otro lado evaluando positivos con referentes tanto el alelo C y los genotipos que lo contienen (CC y A/C) bajo el mismo modelo (dominante) teniendo en cuenta el mismo componente ancestral (Amerindio) resultaron de protección.

Estos resultados sugieren la importancia de rs8192284 frente a la progresión de la enfermedad y su papel protector contra la infección con DV.

Tanto el MAF, como los genotipos que lo contienen están en mayor frecuencia en población Asiática, seguida de Europeos y Africanos respectivamente (Tabla 6). Lo cual indica el probable origen asiático del MAF:C. Reichet y colaboradores ha mapeado el componente ancestral en adultos Africanos asociando la variante rs8192284 con bajos niveles de componente Africano comparado con el componente Europeo. Identificando variantes respondiendo a picos de Mezcla genética.133 Esto es congruente con variantes de riesgo con bajos porcentajes de componente Africano en genotipos de susceptibilidad a severidad del dengue en poblaciones de América, tales como Brasil.148

Nosotros proponemos la hipótesis de que el MAF:C y los genotipos que lo contienen predisponen a severidad (coagulopatias) en el curso de dengue por predisponer a la amplificación de la repuesta inflamatoria. Lo cual es congruente

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con la protección contra la infección por activar procesos antivirales como apoptosis y piroptosis en tejidos infectados.

La variante rs8192284 ya había sido asociada a enfermedades autoinmunes en población Europea, quienes mostraron altos niveles de sIL6R. El dolor articular se ha correlacionado con la unión de sIL6R a gp130 expresado sobre sinoviocitos y condrocitos.132

La amplificación de la inflamación está conducida por la activación de tejidos de órganos a gran distancia, por la unión sIL6R a gp130, en los cuales gp130 es expresado constitutivamente, incluyendo corazón, bazo, riñón, hígado, pulmones y cerebro. Estos procesos inflamatorios están correlacionados con los mecanismos de regulación de la transcripción de gp130 e IL6R.20

Hay evidencia que demuestra la potenciación de la expresión de IL6, en respuesta a la activación de gp130 e IL6R diferencialmente regulados por IL6 e interferones en múltiples líneas celulares. Además gp130 es usado para señalizar la producción de IL4 y CSF.20

Se ha observado que IL6R es expresado en células T antes de su diferenciación a CD4+ y CD8+, lo cual ocurre en la presencia de IL-6, la cual actúa como factor de proliferación y factor de diferenciación de células T.20

Variantes en el promotor genético de IL6 han sido evaluadas en poblaciones Americanas. En Brasil se evaluó su asociación con dengue leve sin hemorragias y choque por dengue comparados con controles saludables, encontrando el genotipo rs1800795 (-174) G/C asociado a protección.

En nuestro estudio esta variante (rs1800795) tuvo un comportó semejante, el genotipo G/C resultó asociado a protección a infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes, teniendo en cuenta los tres componentes en ensayos independientes, más significativamente Amerindio, seguido de Europeo y Africano respectivamente. De otro lado el alelo C y el genotipo G/C fueron de riesgo a presencia de hemorragias en el curso de dengue, teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio.

Tanto el MAF como los genotipos que lo contienen han sido reportados de mayor frecuencia el población Europea y prácticamente ausentes o raros en poblaciones de Africa y Asia (Tabla 6).

Estos resultados sugieren el rol protector del MAF a la infección, pero también la fuerte susceptibilidad a la que predispone contra la presencia de hemorragias. Esto es posible porque algunos autores han asociado el genotipo G/C a altos niveles de IL-6183 y los niveles de IL-6 se han observado altos en pacientes con dengue.184 La acción de la erradicación viral puede ser por la estimulación de la respuesta Th1. Aunque IL-6 dispara la inflamación y activa un amplio rango de células, 123 también puede promover la disminución secuencial de los síntomas a la infección, ya que tardíamente inhibe la inducción de citoquinas antagonistas de la actividad pro-inflamatoria tales como IL1R y el receptor de TNFA. Estas vías pueden asociarse

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entonces con la protección a los síntomas del dengue leve en pacientes con alta producción de IL6R, portando el genotipo GC.137

Las diferencias en las frecuencias en los genotipos de la variante rs1800795 de susceptibilidad/resistencia entre la sujetos estudiados aquí y el estudio de referencia pueden deberse a diferencias en el componente racial de las dos poblaciones.137

Variantes en IL6 pueden estar asociadas con coagulopatías en el curso de la infección con dengue por ser una citoquina de respuesta adaptativa inducida por la presencia de IL1, TNFA y la infección viral. La actividad biológica incluye hematopoyesis y reacciones de fase aguda,137 de hecho hay evidencia de la asociación de la variante intrónica rs2069843 G/A del gen (IL6) con la disminución del riesgo a expectoración de sangre fresca en el esputo del área subglótica en población estadounidense.185 Lo cual confirma su intervención en la modulación de las coagulopatías humanas.

IL6 junto con otras citoquinas inflamatorias pueden regular la cascada de coagulación.135 Se sabe de los niveles de IL-6 pueden afectar la transcripción y la expresión del fribrinógeno y del inhibidor del activador del plasminógeno-1 en hepatocitos humanos durante estados tempranos de la infección con el virus de la fiebre amarilla. Ambas proteínas han sido encontradas en dengue. La infección del hígado está asociada con manifestaciones hemorrágicas de la enfermedad como petequias, equimosis y hematemesis las cuales están estrechamente ligadas con las anormalidades en la coagulación, las cuales incluyen tiempos prolongados en la coagulación, reducción de los factores de coagulación, formación de dímeros de fibrina y elevados niveles de protrombina.186

En nuestro estudio al alelo rs2069843 A, está asociado al riesgo de infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes, teniendo en cuenta el componente genético Amerindio. Esto puede deberse el efecto de la variante sobre la regulación de su producto genético predisponiendo a fenotipos de dengue leve. Evidencia de esto algunos sangrados en las barreras cerebro inducidas por citoquinas pro-inflamatorias produciendo migraña. Esto fue encontrado en respuesta a infecciones con otros virus como HTLV1. Similar a lo que ocurre en dengue, esto puede desarrollar síntomas como fiebre, dolor de cabeza, dolor retro-orbital, mialgia y petequias. Sin embargo algunos individuos desarrollan rápidamente fiebre hemorrágica.187

TNFA es una citoquina pro-inflamatoria reconocida por los efectos de sus variantes sobre la regulación de su producto genético, el cual conduce varios procesos biológicos en la fisiopatología de dengue.188 Recientemente han sido evaluadas variantes genéticas en el promotor del gen determinando su importancia en la fisiopatología de enfermedades infecciosas causadas por bacterias y virus tales como H1N1.189 La variante rs1800750 resultó asociada a susceptibilidad de infección con H1N1 comparando casos con controles saludables en mestizos Mexicanos.189 Además dicha variante se encontró asociada a malaria, comparando pacientes diagnosticados con malaria clínica con asintomáticos, el genotipo AA

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bajo un modelo recesivo fue de protección a asíntomáticos.190 En nuestro estudio mostró un comportamiento semejante debido a que el genotipo rs1800750 G/A bajo un modelo más significativamente sobredomiante fue de riesgo a dengue hemorrágico teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. Además de otro lado evaluando la historia de exposición a dengue se encontraron asociados a protección tanto el alelo A, así como el genotipo A/A bajo un modelo de herencia recesivo, comparando positivos con seronegativos (IgM- e IgG-), teniendo en cuenta los tres componentes independientemente, más significativamente teniendo en cuenta Amerindio, seguido de Europeo y Africano. Es de anotar que tanto el MAF:A, como los genotipos que lo contienen están en mayor frecuencia en poblaciones de origen Europeo, seguido de Africano y Asiáticas respectivamente. Pero hay que aclarar que el genotipo A/A es de baja frecuencia en todas las poblaciones (Tabla 6).

La variante rs1800750 (-376) del gen TNFA se ha encontrado asociado a enfermedad causada por patógenos por afectar la unión alelo específica al factor de transcripción OCT-1.190 Además ha sido correlacionada con el aumento en los niveles de bio-marcadores de severidad durante infección viral tales como Creatina fosfoquinasa.189

Notros proponemos la hipótesis de que el alelo A, induce mayor afinidad por el factor de transcripción OCT-1 conduciendo el aumento del producto genético, predisponiendo a la defensa efectiva contra la infección pero favorece la progresión de la enfermedad del dengue. Recientemente un estudio en 2011 documentó que aunque TNFA actúa como una molécula antiviral para proteger la célula del hospedero puede también inducir daño celular.191 TNFA es conocida por estar regulada positivamente en casos de dengue hemorrágico y por potenciar la permeabilidad vascular, rasgo que diferencia el dengue leve del dengue hemorrágico. El daño celular está asociado con apoptosis inducida por altos niveles de TNFA en células endoteliales y ha sido asociada también con hemorragias en el modelo ratón del dengue hemorrágico.192

Tanto los genes HLA como TNFA están localizados en cromosoma 6 de humanos. Hay evidencia de variantes en HLA y TNFA asociados con dengue en diferentes poblaciones. En la India el alelo HLA—DRB1*07 fue asociado con riesgo a dengue hemorrágico.188 Sin embargo el alelo HLA-DRB1*07 fue asociado con protección a dengue hemorrágico en infección secundaria, en un estudio realizado en Mexico.188

En 2013 se evaluó la asociación del genoma completo (GWAS) con fenotipos de dengue y se encontró el genotipo rs3132468 C/T del gen HLA clase I - secuencia relacionada con el poli-péptido B (MICB), asociado a susceptibilidad a síndrome de choque por dengue en población Vietnamita. Pero también se asocia con fenotipos clínicos menos graves de dengue, como dengue leve en infantes.103 En nuestro estudio tuvo un resultado semejante puesto que el alelo C se encontró disminuyendo el riesgo a infección comparando positivos con referentes teniendo en cuenta el componente Africano. Sin embargo no se asoció con fenotipos de progresión. Esto es congruente con fenotipos de protección a dengue correlacionados con el componente ancestral Africano en poblaciones

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Americanas.148 Lo cual sugiere el que el comportamiento de esta variante en la susceptibilidad/resistencia a fenotipos de dengue puede estar asociada a otros factores tales como factores demográficos.103 Hay evidencia del posible origen Europeo del MAF. Tanto el MAF como los genotipos que lo contienen están en mayor frecuencia en poblaciones Europeas seguidas de Africanos y en último lugar Asiáticas (Tabla 6).

Esta predisposición a la protección determinada por el alelo C ubicado en un intrón del gen MICB se debe a que en Contextos Africanos favorece la regulación positiva del producto genético y también puede ser posible determine junto con otras variantes la predisposición a un adecuado reconocimiento de células infectadas que serán destruidas por mecanismos efectores de la respuesta inmune a la infección con DV. El MICB codifica un ligando activador de células asesinas naturales (NK) y posiblemente CD8+ y células T, controlando tempranamente la infección. Mutaciones en este gen podrían promover las funciones efectoras antivirales de células NK, parece que esta variante no se asocia justamente con la enfermedad severa de dengue.103

La inmunopatogénesis de dengue involucra la respuesta inmune del hospedero activando células para la liberación de citoquinas (IL1B, IL10) y quimoquinas (IL-8, MCP-1) entre otros.193 Variantes en el gen de IL1B han sido asociadas con fenotipos relacionados con infecciones virales en mestizos de México. Específicamente el genotipo rs16944 AA fue asociado con un elevado número de leucocitos durante el curso de la infección con H1N1, mientras disminuidos para los genotipos G/G y G/A. G/G también resultó asociado a la susceptibilidad de la infección de H1N1. Sin embargo en nuestro estudio tuvo un comportamiento diferente pues el genotipo G/G se encontró asociado a protección a infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes bajo un modelo de herencia recesivo teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. Es de anotar que tanto el MAF:A así como los genotipos que lo contienen se encuentran en alta frecuencia en población Africana, seguida de poblaciones Europeas y Asiáticas respectivamente (Tabla 6). Lo cual sugiere un probable origen Africano de MAF. Esto es congruente con genotipos de protección a formas severas de dengue relacionadas con poblaciones de descendencia Africana.148 La variante rs16944 está ubicada en el promotor del gen IL1B, cuyos alelos y genotipos se observaron modulando niveles diferenciales de su producto génico, sugiriendo un fuerte efecto sobre la transcripción. El incremento en la transcripción determinados por estos polimorfismos en particular pueden estar asociados a daño orgánico es respuesta a la infección viral.189 El daño de células infectadas puede reducir la probabilidad de replicar viriones de DV, lo cual se refleja en la protección a la infección comparando positivos con referentes en este estudio.

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La respuesta inflamatoria es potenciada por la simultánea secreción de las citoquinas proinflamatorias IL1B e IL-18 principalmente por macrófagos expresando NLRs, RLRs y/o TLRs.117 La IL-18 es una citoquina multifuncional capaz de polarizar la respuesta Th1 o Th2 dependiendo del medio ambiente. IL-18 junto con IL1B y quimoquinas tales como CCL2 (MCP1) y simultánea activación del complemento están involucrados en la inmunopatogénesis de la infección de DV,193 como con otros virus (H1, HIV)194, 195 y bacterias (Micobacterium).196 Donde se ha explorado ampliamente el efecto de sus variantes genéticas sobre la inmunomodulación de la respuesta inmune. Recientemente se evaluó en Asiáticos la variante rs5744247 del gen IL-18 con la resistencia/susceptibilidad a tuberculosis, encontrando que el alelo C fue de protector y el genotipo G/G de riesgo.196 En nuestro estudio la variante rs5744247 tuvo un comportamiento semejante, pues el genotipo G/G se encontró de riesgo a infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes, bajo un modelo recesivo, más significativo teniendo en cuenta Africano, seguido de Europeo y Amerindio. El mismo genotipo (G/G) resultó de riesgo a presencia de hemorragias en el curso de dengue, bajo el mismo modelo de herencia (recesivo) más significativo teniendo en cuenta Amerindio que Europeo y en Africano no tuvo efecto. Hay evidencia del MAF y los genotipos que lo contienen en mayor frecuencia en Africanos, seguidos de Europeos y Amerindios respectivamente. Lo que sugiere el probable origen Africano de dicho MAF (Tabla 6). Se ha propuesto previamente que la variante rs5744247 tiene efectos funcionales específicos de población China (Asiáticos) sobre la enfermedad causada por patógenos.196 La variante rs5744247 tiene efecto sobre los niveles de transcripción.196 Mutaciones en esta región intrónica podrían disminuir los niveles de IL-18, predisponiendo al riesgo de infección y desarrollo de dengue, por el montaje de una respuesta inefectiva antiviral y de otro lado produciría acumulación de IL-1, IL1B y caspasa-1, que conducirán una inflamación desbalanceada conduciendo daños por apoptosis, llevando a fenotipos de severidad del dengue, incluyendo hemorragias en el curso de la enfermedad o que a pesar de altas concentraciones su acción esté bloqueada por otras moléculas. Evidencia de esto la producción de IL-18 e IL1-B activas, las cuales comparten homología estructural y son generadas a partir del mismo precursor inactivo clivado por una endoproteasa llamada enzima convertidora de IL-1B (ICE o caspasa-1). Ratones deficientes en IL-18 y su receptor producen una fuerte respuesta Th1 jugando un papel crítico en la expulsión de patógenos intracelulares.196 Existe una amplia cantidad de estudios que demuestran la habilidad de IL-18 para generar una respuesta Th1, a menudo en concertación con IL-12 y a través de la producción de INF-gama.197 Además estudios en otras infecciones con virus como HIV-1 sugieren los fuertes efectos antivirales de IL-18 en células mono-nucleares de sangre periférica.198 Se encontró en general una correlación negativa entre los niveles de IL-18 y el conteo de células T CD4+ consistente con resultados en poblaciones Europeas y

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Canadienses.197 Las funciones de IL-18 también pueden ser bloqueadas por una proteína de unión de alta afinidad con IL-18 (IL-18BP).199 Esto sugiere que a pesar de altas concentraciones de IL-18 no se inducirían sus efectos antivirales. Lo que sería congruente con la reciprocidad encontrada entre concentraciones de IL-18 con la carga viral en el estudio de referencia.197 También hay evidencia de la influencia de sus concentraciones (IL-18) sobre la modulación de otros citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNFA, IL-2, IL5 e IL-4, todas producidas durante el curso de otras enfermedades tales como cardiovasculares.197 Otras citoquinas antiinflamatorias como IL-10 han sido observadas mediando la respuesta inmune a infección con DV, demostrando tener un papel importante en la fisiopatología del dengue.160 Entre los polimorfismos estudiados en el gen de IL10 ha sido explorada la variante rs3024498, evaluando su efecto sobre la infección viral,200 y de otros patógenos tales como bacterias201 y gusanos. El alelo G ha sido fuertemente asociado con la protección a infección con helmintos en Brasil.202

En nuestro estudio la variante rs3024498 tuvo un comportamiento semejante, pues el genotipo G/G se encontró asociado a protección a infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes, bajo un modelo de herencia recesivo teniendo en cuenta los componentes más significativamente Amerindio que Europeo de manera independientemente. El MAF y los genotipos que lo contienen están en mayor frecuencia en Europeos, seguido de poblaciones Africanas; en Asiáticas es casi inexistente (raro). Lo cual sugiere que el MAF tiene un probable origen Europeo (Tabla 6). Se ha observado previamente que el efecto de ésta variante sobre la infección por patógenos está sujeto al grado de mezcla genética Europea y Africana en poblaciones Americanas como Brasil, demostrando la importancia de los ajustes con los índices de mezcla individual, calculados con marcadores informativos de cada componente ancestral.202

La variante rs3024498 se encuentra ubicada en el 3-UTR probablemente influyendo sobre la regulación del producto genético. El alelo G fue asociado negativamente con los niveles de IgE específicos del agente infeccioso (en diferentes especies de helmintos) y también a niveles negativos de IgG (infección pasada). Es posible que al igual que ocurre en este tipo de infecciones con gusanos, la infección con VD esté determinada por el genotipo G/G predisponiendo a una regulación quizá negativa de IL-10, lo que puede influir positivamente sobre otras moléculas mediadoras, protegiendo contra la infección dengue, lo cual debe estar correlacionado con la diferenciación de células T a Th2 para contrarrestar efectivamente la infección. Hay evidencia de la inversa correlación entre los niveles de IL-10 y la respuesta de células T. In vitro, IL-10 bloqueada potenció la respuesta de células T específicas de VD y fue significativamente asociada con la reducción de la apoptosis de células T en la fase aguda de dengue. Otros han encontrado que la restauración del número de células T, proliferación y producción de citoquinas coincidió con la ausencia de viremia en pacientes con dengue. Además IL-10 boqueada incrementó significativamente las funciones antivirales de células T específicas de DV como la producción de INF-gama, TNFA y degranulación in vitro.203

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La degranulación en la defensa contra patógenos puede estar influenciada por la producción de granulocitos los cuales se producen en presencia del factor estimulador de colonias (CSF-3),114 el cual al igual que IL-10, junto con otras citoquinas como IL-4 han sido encontradas elevadas en pacientes con dengue hemorrágico comparados con dengue leve y pueden tener valor predictivo de severidad del dengue.203 La variante rs2227319 del gen CSF-3 mostró tendencia a un efecto negativo sobre la activación de la respuesta inmune en sangre completa evaluando pacientes diagnosticados con sépsis.

En nuestro estudio dicha variantes (rs2227319) tuvo un comportamiento semejante dado que el genotipo G/A se encontró asociado a protección a dengue hemorrágico, en un modelo de herencia sobredominante, teniendo en cuenta más significativamente Europeo, seguido de Africano y Amerindio respectivamente en ensayos independientes. Hay evidencia de tanto el MAF:A así como los genotipos que lo contienen en mayor frecuencia en Asiáticos, seguido de Europeos, mientras en Africano es raro (Tabla 6). Lo que sugiere el posible origen Asiático del MAF. Nuestra hipótesis plantea que el genotipo heterocigoto predispone a bajo niveles de CSF-3, estimulando pobremente la inflamación, lo cual protege contra formas severas del dengue. Evidencia de esto bajos niveles de CSF-3 encontrados en infecciones secundarias con VD, además CSF-3 influenció la trombocitopenia y leucopenia.115 El receptor de IL-4 (IL-4R) une la citoquina anti-inflamaroria IL4. IL-4 es secretada por linfocitos Th2. Actúa través de su ligando (IL-4R) activando células B, estimula la producción de IgE y suprime la respuesta Th1.204 Variantes en el gen de IL-4R han sido evaluadas en diferentes enfermedades humanas, por su importante papel inmunomodulador.205 Evaluando la historia de exposición a dengue en nuestro estudio la variante rs1805016 del IL-4R se encontró asociada a positivos comparados con seronegativos (IgM- e IgG-), el alelo G se encontró asociado a riesgo teniendo en cuenta Amerindio y menos significativo Europeo. También los genotipos T/G y G/G bajo un modelo dominante fueron asociados a riesgo en los tres contextos genéticos evaluados independientemente en el siguiente orden de significancia (Amerindio, Europeo y Africano). Congruentemente evaluando positivos con referentes el genotipo T/G se encontró asociado a riesgo bajo un modelo sobredominante teniendo en cuenta el Amerindio. Pero el genotipo G/G se encontró asociado a protección teniendo en cuenta el Africano bajo un modelo recesivo. Variantes de protección a severidad del dengue, correlacionadas con el componente Africano ya se han reportado en poblaciones Americanas.148 Consecuentemente el alelo G, se encontró asociado a protección a presencia de hemorragias teniendo en cuenta el componente Amerindio. La variante rs1805016 (Ser752Ala) está ubicada en el exón 11 del gen IL-4R y puede reducir la afinidad por su ligando (IL-4). Si no hay una adecuada señalización de IL-4, habrá baja o nula activación de células B, poca estimula la producción de IgE y aumento de la respuesta Th1.204 Lo cual predispone a una

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respuesta antiviral inefectiva aumentando el riesgo a infección y reduciendo la inflamación por la actividad antiinflamatoria que protegerá contra fenotipos severos como las hemorragias en dengue. EL MAF tiene un probable origen Africano, se encontró mayor en Africanos significativamente comparado con Europeos, lo cual puede repercutir en la asociación diferencial de resistencia/susceptibilidad a enfermedades humanas por contribución de la variante a diferencias en las vías de inflamación de acuerdo a la distribución de la variante según la raza.204 Recientemente se encontraron los genotipos A/G y G/G de la variante rs4804803 del gen CD209 (módulo 1 del modelo fisiopatológico de dengue propuesto por nosotros) asociados con el riesgo a dengue hemorrágico en Asiáticos (Taiwan). Además las células dendríticas de individuos A/G con significativamente elevada expresión de CD209 en su superficie tuvieron los más altos niveles de TNFA e IL-12p40 (subunidad agononista de IL12, codificada por el gen IL-12B) pero bajos niveles de infección de VD.206 La diferenciación de células T a Th17 se ha visto potenciada por anticuerpos monoclonales unidos a IL-12p40, subunidad que forma heterodímeros con IL-12p35 para formar IL12 y activar la señal a través del receptor de IL-12R.207 La concertada producción y transcripción del IL-17A, IL1B e IL12 ha sido detectada en enfermedad humana durante la expansión de clones haciendo fenotipos Th1 y Th17.207 IL-12 también ha sido implicada en varias enfermedades autoinmunes como artritis.207 Variantes en el gen de IL-12 han sido explorados para evaluar su asociación con la susceptibilidad/resistencia a enfermedad causada por patógenos, tales como diferentes tipos de virus208, 209 y bacterias.210 En poblaciones con alto Africano (muestras de África y replicado en Africanos Americanos) se evaluó la susceptibilidad a tuberculosis comparando casos y controles; en ambos estudios se encontraron en el gen IL-12B, tanto el MAF rs3212227 C como los genotipos A/C y C/C bajo un modelo dominante asociados a protección, más significativo en Africanos Americanos que en Africanos. En la muestra de casos y controles con origen en Argentina no tuvo efecto. Estos resultados sugieren que esta variante es un factor de protección a tuberculosis en población con alto componente genético Africano.210 En nuestro estudio tuvo un comportamiento semejante, dado que evaluando la historia de exposición a dengue comparando positivos con seronegativos (IgM- e IgG-) tanto el MAF:C, así como los genotipos que lo contienen (A/C y C/C) bajo un modelo dominante resultaron de protección teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. Además, cuando se comparó positivos con referentes el mismo alelo (C) y los mismos genotipos (A/C y C/C) bajo el mismo modelo de herencia (dominante) resultaron de protección a infección y desarrollo de dengue, teniendo en cuenta el Europeo y menos significativo Africano. Hay evidencia del MAF y los genotipos que lo contienen en mayor proporción en población Asiática y Africana seguidas de Europeas (Tabla 6). Lo que sugiere que MAF tiene un probable origen Asiático. Estas diferencia en la asociación de las variantes a fenotipos de protección de acuerdo al componente ancestral Africano puede ser

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debida al grado de mezcla con niveles de Europeo.210 En Colombia ya se había explorado esta variante y su efecto sobre la periodontitis pero no se encontró asociación, la frecuencia del MAF:C fue bastante congruente con nuestros resultados.211 La variante rs3212227 (3-UTR) del gen IL-12 previamente había mostrado asociación con respuesta de anticuerpos específicos inducida por infección con el virus de influenza H1 dependiendo del número de alelos MAF. Por ejemplo el alelo C resultó en la disminución de anticuerpos específicos (H1).209 Al igual que ocurre en infección con virus H1, durante la respuesta a DV, podría verse reducción de anticuerpos específicos (VD) debido a que muchos de estos anticuerpos estarán unidos a IL12, promoviendo producción de Th1 generando una respuesta efectiva contra DV, dando lugar a pocos anticuerpos libres, similar a como se observa en las infecciones con el virus H1,209 pero suficientes para neutralizar la infección activando diferentes mecanismos de protección por la circulación concomitante de IL-12, entre ellos, la estimulación de las células asesinas naturales (NK) y la comunicación entre las respuestas inmune innata y adaptativa por la producción de INF-gamma estableciendo una fuerte actividad antiviral.208 Otra variante rs2569253 junto con otras del mismo gen (IL-18) han sido exploradas en otras enfermedades infecciosas como malaria, encontrando que rs2569253 no está asociada en población Africana.212 Sin embargo en población estadounidense esta variante se asoció de manera dosis dependiente del genotipo a los niveles de IL-6 en respuesta a la vacuna de rubeola, tendiente a aumentar con el número de alelos C.213 En nuestro estudio tanto el alelo C, así como los genotipos C/C y T/C en un modelo dominante, se encontraron asociados a riesgo cuando se evaluó la historia de exposición a dengue, comparando positivos con seronegativos (IgG- e IgM-) teniendo en cuenta el componente Amerindio, seguido en significancia de Africano. Estas diferencias pueden deberse al nivel de porcentaje no Africano (en este caso Amerindio y Europeo) influyendo sobre la fisiopatogénesis del dengue. Se sabe del MAF y los genotipos que lo contienen en mayor frecuencia en poblaciones Europeas, seguidas de Asiáticos y Africanos respectivamente (Tabla 6). Se han observado genotipos que predisponen a la susceptibilidad de la severidad del dengue cuando aumenta el componente genético no Africano y disminuye el Africano en población Americana.148 Sin embargo cuando se evaluó la presencia de hemorragia el alelo C disminuyó el riesgo teniendo en cuenta Europeo. Este alelo (C) debe estar influyendo de manera específica de Europeo sobre los niveles de IL-6 y sus efectos, predisponiendo a la protección a las coagulopatías en el curso de dengue. Evidencia de esto IL-6 puede regular la cascada de coagulación,135 formación de megacariocitos y plaquetas 172 y promover la disminución secuencial de la sintomatología.137 Por otra parte IL-17A induce diferenciación a Th17 y tiene potente actividad pro-inflamatoria asociada con desordenes autoinmunes y enfermedades causadas por virus214 y bacterias.215 Existen estudios que soportan su influencia sobre la infección con el virus de la hepatitis B (HBV). Variantes genéticas en su promotor han correlacionado con los niveles de su producto genético (IL-17A) y

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enfermedades causadas por infección viral comparados con controles saludables o recuperados espontáneamente en población Asiática (Chinos). Más específicamente el genotipo A/G de la variante rs2275913 fue de riesgo a enfermedad clínica causada por infección con HBV correlacionando con los niveles elevados de IL-17A.214 La variante rs2275913 está ubicada dentro de un motivo de unión a un factor nuclear de células T activadas, identificado como un regulador crítico en el promotor de IL-17.216 En nuestro estudio la variante rs2275913 tuvo un comportamiento semejante. Evaluando la historia de exposición a dengue, tanto el A, así como los genotipos G/A y A/A bajo un modelo dominante fueron de riesgo teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. Hay evidencia de que el MAF pero sobre todo los genotipos que lo contienen están mayor frecuencia en población Asiática, seguidas de Europeos y Africanos. La variante rs2275913 del gen IL-17A ya había sido correlacionada previamente con la producción de de inmunoglobulinas en el curso de la infección viral (HBV).214 Esto permite pensar que al igual que ocurre en la infección con HBV, durante infecciones con DV la variante rs2275913 podría determinar la producción de inmunuglobulinas. Además que la activación de células B es común en este tipo de infecciones (virales).214 De otro lado sabiendo del genotipo AA asociado con bajos niveles de IL17A en infecciones HBV214 y que la producción de IL-17A tiene un rol central en la protección contra otros patógenos tales como M. tuberculosis,215 podría pensarse que el curso de la infección con otros agentes infecciosos como dengue, el alelo A, predispone a riesgo a infección, por determinar bajos niveles de IL-17A reduciendo la inmunidad protectora contra dengue. Ratones deficientes en IL-17 han mostrado incapacidad de controlar la infección.215 Interesantemente ratones deficientes en IL-17 con problemas para formar granulomas ayudaron a demostrar el papel esencial de IL-17 en promover el reclutamiento temprano de neutrofilos. IL-17 es reconocida como una citoquina capaz de inducir gradientes de quimoquinas en la inflamación inicial. Los macrófagos y los neutrófilos cooperan eficientemente para la destrucción de los patógenos intracelulares.215 EL gen de IL-8, el cual codifica una quimoquina atrayente de neutrófilos contiene polimorfismos asociados con resistencia/susceptibilidad a infección y desarrollo de enfermedad causada por patógenos. Estas variantes podrían estar asociadas también con diferencias en la fisiopatología de dengue y otros virus. En mestizos Mexicanos el genotipo rs4073 A/A del gen IL-8 fue asociado con altos valores de PaO2mmHg, sugiriendo indirectamente su correlación con poco daño respiratorio agudo en respuesta a infección viral (H1N1). Sin embargo en el mismo estudio el genotipo A/T resultó directamente asociado a riesgo de infección con H1N1 comparado con controles saludables189 En otro estudio a través de población Africana el genotipo TT se encontró asociado a protección a tracoma, la cual es una inflamación de la conjuntiva causada por la bacteria Chlamydia trachomatis, esta infección se contagia y se transmite por contacto directo con el ojo, nariz o

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secreciones de la garganta infectados.217 Evaluando el efecto de esta misma variante en pacientes que desarrollaron sépsis en población de Iowa (USA) se encontró que el genotipo heterocigoto predispone a infección.218

En nuestro estudio la variante rs4073 del gen IL-8 tuvo un comportamiento que contrasta ampliamente con los resultados anteriores. De un lado evaluando la infección con dengue, comparando positivos con referentes se encontraron asociados tanto el alelo A, así como el genotipo A/A bajo un modelo de herencia recesivo asociados a riesgo teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio, sugiriendo la predisposición genética que confieren el MAF y el genotipo heterocigoto que lo contiene, a la infección y desarrollo de dengue en población Colombiana. Lo cual contrasta el hecho de la variante rs4073 predisponiendo a una leve protección a resultados poco favorables en infecciones virales en Mestizos Americanos.189 Esto puede deberse a las diferencias específicas de los mecanismos de respuesta del hospedero a VD comparados con los activados con H1N1, los cuales son poco claros.

De otro lado en este estudio el genotipo rs4073 A/T, se encontró asociado a protección a dengue hemorrágico tanto teniendo en cuenta el componente Europeo como más significativamente Africano en ensayos independientes, ambos bajo modelo sobredomiante. Lo cual es congruente con variantes de protección a enfermedad causada por patógenos en población con alto Africano.217 De la misma manera que en otros estudios correlacionaron el componente Africano con variantes de protección a formas severas del dengue.85, 148 Pero el genotipo TT bajo un modelo recesivo fue de riesgo al mismo rasgo (dengue hemorrágico) teniendo en cuenta el componente Amerindio.

Además evaluando el efecto de la misma variante sobre la presentación de hemorragias en el curso de dengue, resultaron asociados a riesgo tanto el alelo rs4073 T, así como el genotipo T/T bajo un modelo codominante, teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio.

Existe evidencia del MAF y de los genotipos que lo contienen en mayor frecuencia en poblaciones Asiáticas y Europeas que en Africanas (Tabla 6). Sugiriendo un origen no Africano del MAF.

La variante rs4073 está ubicada en la región promotora (-251) de IL8. Los efectos de esta variante sobre la enfermedad causada por patógenos pueden variar debido a factores ambientales como la historia demografía.217

El alelo rs4073 A ya había sido correlacionado con alta expresión del IL8 in vitro y también con una marcada susceptibilidad a infección con virus respiratorios (RSV), caracterizada por una marcada infiltración de neutrófilos a el epitelio.217 Es posible que -251 TT así como AA, genéticamente controlen la producción alta de niveles de IL8 en células infectadas, aumentando la activación del epitelio y la migración de neutrófilos al sitio de la infección respectivamente. El subsecuente aumento de la inflamación y daño epitelial cito-toxico pueden predisponer al desarrollo de formas

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severas de dengue, como el dengue hemorrágico y aumentar el número de células blanco de infección por DV del sistema inmune quimioatraídas a los nidos de infección. El genotipo heterocigoto (A/T), podría predisponer a bajos niveles de IL8, a través de los mismos mecanismos anteriores y así proteger contra dengue hemorrágico. Sin embargo no se descarta la influencia del componente Amerindio sobre el efecto de la variante rs4073 en la regulación de los niveles de expresión de IL8, promoviendo los siguientes (A/A: bajos niveles, lo que predispone a infección positiva; A/G: niveles medios, lo que predispone a protección contra dengue hemorrágico y T/T: altos niveles, lo que predispone a susceptibilidad a dengue hemorrágico y presencia de hemorragias en el curso de dengue). Estos efectos deben ser investigados in vitro e in vivo en contexto Amerindio, contrastados con otros contextos ancestrales continentales.

Hay evidencia previa del desequilibrio de ligamiento entre el alelo rs4073 A (en promotor) y rs2227307 T (+396 en intrón) en población Africana interactuando para modular riesgo/resistencia a enfermedades causadas por bacterias.217 A y T (alelo silvestre) respectivamente fueron encontrados en haplotipos de riesgo, sin embargo independientemente rs2227307 no tuvo efecto.

En nuestro estudio el genotipo rs22277307 G/G (homocigoto para MAF) se encontró asociado a riesgo de infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes bajo un modelo recesivo teniendo en cuenta los tres componentes independientemente, más significativo Africano, seguido de Europeo y Amerindio respectivamente. Es de anotar que el MAF así como los genotipos que lo contienen se encuentra en mayor frecuencia en población Africana, seguida de Europeos y Amerindios.

Durante el proceso inflamatorio el tejido activado secreta quimoquinas, no solo IL-8, si no también la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP1 o CCL2).193 MCP1 se ha visto elevada en paciente con dengue y puede estar relacionada con dengue hemorrágico,101 debido a que puede participar en la extravasación de plasma por su capacidad de reducir las uniones estrechas endoteliales aumentando la permeabilidad vascular (módulo 3 de nuestro modelo fisiopatológico de dengue).102 Además CCL2 puede modular la actividad de L-18 en concierto con IL1B y el complemento en la inmunopatogénesis de la infección de DV.193 MCP1 también se ha observado interviniendo en la inmunomodulación de otras enfermedades causadas por otros patógenos como el caso de Citomegalovirus (HCMV)219 y HIV-1.220 Donde se han explorado un gran número de variantes genéticas con importancia funcional. Su promotor contiene sitios de unión para el factor de transcripción NFKB, modificaciones en su gen pueden influenciar los mecanismos efectores de la inmunidad innata (módulo 2 de nuestro modelo fisiopatológico de dengue). La variante rs1024611 (-2581 (T/C)) en el promotor ya había sido asociado a positivos para infección con HCMV comparado con controles, ambos con origen en población caucásica de estados unidos. También significativo para riesgo comparando pacientes con reactivación de la infección con controles.219

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En nuestro estudio la variante rs1024611 presento un comportamiento semejante. El genotipo C/C se encontró asociado a riesgo de presencia de hemorragias en el curso de dengue, bajo un modelo recesivo teniendo en cuenta exclusivamente el componente Europeo. Sin embargo el genotipo T/C resultó asociado a protección a dengue hemorrágico bajo un modelo sobredomiante teniendo en cuenta los tres componentes independientemente, más significativo Europeo, seguido de Africano y Amerindio. Hay evidencia del MAF, en mayor frecuencia en Asiáticos, seguido de Europeos y Africanos respectivamente (Tabla 6). Lo cual sugiere el probable origen Asiático del MAF:C. Respecto al MAF, nuestros resultados son congruentes con genotipos de susceptibilidad a severidad del dengue correlacionados con el componente no Africano.148 Y las diferencias con el grado de asociación pueden ser debidas al grado de mescla de otros componentes con la ancestría Africana.85 Nuestra hipótesis plantea que el aumento en el número de MAF, disminuye la afinidad por el factor de transcripción (NFKB) conduciendo la disminución de los niveles de MCP1, lo cual regulará negativamente la cantidad de uniones estrechas endoteliales, conduciendo la permeabilidad vascular que contribuye a hemorragias en el curso de dengue. El porte de al menos un alelo silvestre (heterocigoto), aumentará la transcripción de gen y por ende sus niveles elevados de MCP1 que determinarán el aumento de las uniones estrechas endoteliales protegiendo contra la extravasación, característica esencial que diferencia y determina la progresión a dengue hemorrágico desde dengue clásico. La regulación de la respuesta inmune del hospedero durante infecciones virales incluye la producción de quimoquinas como MCP1 y sus receptores, algunos de estos receptores son de tipo CC como CCR5, y su producción altera la resistencia/susceptibilidad a la infección y progresión de la enfermedad, tal como ocurre en infecciones virales como por ejemplo HIV-1,220 así como también durante la respuesta a infección con VD se producen otros receptores de quimoquinas como por ejemplo CCR7, inducida por la activación de la vía de señalización de NFkB.101 La supresión de NFKB ha explicado en parte la disminución de la expresión de CCR7 observada en células dendríticas infectadas en otros virus como HCMV.101 CCR7 contribuye a la migración de células linfoides al sitio de infección, lo cual es crucial para la inducción y mantenimiento de la tolerancia periférica a virus y bacterias. La expresión de CCR7 puede ser inducida por tratamiento con INFs (alfa y beta), IL1B, TNFA y por proteínas bacterianas o por interacción con células tumorales apotóticas.221 Este mecanismo de expresión de MCP1 debe estar estrictamente regulado por variantes en el gen que la codifica. De hecho se ha explorado la asociación de la resistencia/susceptibilidad a enfermedades humanas con variantes puntuales en el gen CCR7. En población Afro-descendiente se encontró la asociación del genotipo rs3136685 A/A con la protección a cáncer de próstata; 222 esta misma variante (rs3136685) resultó de protección a cáncer de seno en Asiáticos (Población de Taiwan),223 previo a esto A/G y A/A ya habían sido asociados a reducción de mielanoma multiple.222

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En nuestro estudio esta variante (rs3136685) del gen CCR7 tuvo un papel semejante. El genotipo A/A se encontró de protección a dengue hemorrágico en un modelo recesivo teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. Además cuando se evaluó la presencia de hemorragias, los genotipos A/A, así como G/A resultaron de protección teniendo en cuenta particularmente el componente Amerindio bajo un modelo dominante. Sin embargo es importante mencionar que el alelo A resultó de riesgo a presencia de hemorragias en el curso de dengue teniendo en cuenta el componente Africano. Hay evidencia del MAF rs3136685 en mayor frecuencia en Africanos, seguidos de Amerindios y Europeos respectivamente (Tabla 6). Lo cual sugiere que el MAF tiene un probable origen Africano. Esto es congruente con fenotipos de protección a dengue hemorrágico, correlacionados con el componente Africano circulando en población de América.148 El comportamiento del MAF teniendo en cuenta el Africano puede deberse a la interacción o grado de mezcla entre los niveles de Europeo con Africano.210 Existen otras variantes del gen CCR7 con importancia epidemiológica. Evaluando la calidad de vida en Amsterdam, se encontró una fuerte asociación de la variante rs2023906 con la variabilidad en la vitalidad (niveles de energía).224 En nuestro estudio esta variante tuvo gran implicación en diferentes fenotipos del dengue. Por un lado evaluando la historia de exposición a dengue comparando positivos con seronegativos (IgM- e IgG-) se encontraron tanto el alelo G, así como el genotipo G/G en un modelo codominante, teniendo en cuenta Amerindio y el mismo genotipo G/G bajo un modelo recesivo teniendo en cuenta los componentes Africano seguido en significancia de Europeo independientemente en todo caso asociados a riesgo. Congruentemente evaluando positivos con referentes tanto el alelo G, así como los genotipos A/G y G/G bajo un modelo dominante, en ambos casos teniendo en cuenta los componentes Africano, seguido en significancia de Europeo, se encontraron asociados a riesgo de infección y desarrollo de dengue. Consecuentemente los mismos genotipos (A/G y G/G) resultaron de riesgo a presencia de hemorragias teniendo en cuenta particularmente el componente Amerindio bajo un modelo dominante. Hay evidencia del MAF rs2023906 y los genotipos que lo contienen en mayor frecuencia en Europeos, seguidos de Amerindios y Africanos respectivamente (Tabla 6). Lo cual sugiere que el MAF tiene un probable origen Europeo. Estos resultados genéticos son congruentes con genotipos de susceptibilidad a severidad del dengue en población Americana de acuerdo a los niveles de Europeo, al igual que rs3136685 el comportamiento del MAF rs2023906 depende del grado de mescla de los niveles de Africano con los niveles de Europeo.210 Estas dos variantes intrónicas (rs3136685 y rs2023906) podrían tener implicación funcional, alterando la afinidad por factores de transcripción como NFKB, alterando los niveles de MCP1 predisponiendo a susceptibilidad a severidad del dengue

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dependiendo de factores demográficos como el grado de mezcla de los componentes genéticos ancestrales. Evidencia de esto son las observaciones previas del aumento en la expresión de CCR7 resultando en el potenciamiento de la migración de células dendríticas in vivo e in vitro. Se ha visto también que la inhibición de inducción de la expresión de CCR7 produce niveles elevados de TNFA y pocos niveles del receptor de TNFA (TNFAR), además la presencia de CCR7 induce la ausencia de inhibidores de NFKB durante la infección viral.221

Combinaciones alelicas y haplotipos de acuerdo al contexto genético ancestral

Evaluando la historia de exposición a dengue y teniendo en cuanta la edad, sexo y componente genético ancestral se observaron en el cromosoma 1, tres asociaciones de haplotipos (números 3, 8 y 10) como factores de protección a positivos comparados con seronegativos teniendo en cuenta el componente Amerindio y solo una asociación (número 10) teniendo en cuenta Europeo y Africano en ensayos independientes. El haplotipo 3, contiene el alelo rs1059704 C asociado previamente a protección al mismo rasgo (positivos comparados con seronegativos), los haplotipos 8 y 10, contienen dos alelos previamente asociaciados a protección al mismo rasgo rs2780895 T y rs1059704 C. En el contexto Amerindio portar el alelo A o G de la variante rs11208534 en el mismo haplotipo con rs2780895 T y rs1059704 C, junto con rs11118132 C predispondrá a la protección. Considerando los tres componentes los haplotipos raros (12, 13 y 14) resultaron de susceptibilidad. Estos haplotipos de susceptibilidad continen todos el alelo rs11208534G, el cual como genotipo (G/G) fue previamente asociado estadísticamente a riesgo a positivos comparados con seronegativos, además do de ellos (haplotipos 12 y 14) contienen el alelo rs11118132 identificado previamente como factor de riesgo al mimos rasgo. Ver Tablas 17, Tabla 9 y Tabla 13. Estos resultados de análisis de hapltipos confirman el fuerte efecto de las cuatro variantes rs2780895, rs1059704 y rs11118132) por separado sobre la resistencia/susceptibilidad a positivos comparados con seronegativos evaluando la historia de exposición a dengue. Estas diferencias en el número de haplotipos del cromosoma 1, en genes como JAK1 (variantes rs2780895 y rs11208534) e IKBKE (variantes rs1059704 yrs11118132), asociados a fenotipos del dengue en nuestro estudio, ya habían sido explorados en función del componente genético ancestral Africano, mostrando distribución diferencial en función del grado de mezcla genética consistente con la epidemiología del dengue en America. En el estudio al que me refiero se encontraron homocigotos de alto riesgo generando haplotipos (variantes rs11208534, rs2780831 y rs310196 de JAK1) asociados a dengue hemorrágico. Además las variantes rs11208534, rs2780831 mostraron fuerte

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desequilibrio de ligamiento en esta población Brasileña. Estos resultados fueron consistentes después de controlar las variables como edad, sexo y componente genético ancestral en regresión logística. La variante rs11208534 fue genotipificada en poblaciones de Hapmap, mostrando diferencia significativas entre Europeos y Africanos. Las mutaciones en JAK1 y otros genes que regulan la producción de INF podrían afectar negativamente produciendo la sub-expresión de JAK1 visto en formas severas de dengue.148 Por otra parte evaluando la infección y desarrollo de dengue comparando positivos con referentes las variantes en los genes JAK1 (rs2780895 y rs17127114), IL16R (rs8195284), IKBKE (rs1059704 y rs11118132) e IL10 (rs3024498), del módulo 1 del modelo fisiopatológico de dengue, mostraron dos haplotipos de susceptibilidad (haplotipos 2 y 4). Tabla 18. Estos dos haplotipos tienen en común las variantes que según nuestros datos genético podrían estar implicadas en la susceptibilidad (rs8192284 A, rs11118132 C y rs3024498 A) dado que los dos primeros alelos complementarios C, G respectivamente se encontraron asociados a protección Tabla 10 y el tercero como genotipo homocigoto de riesgo A/A Tabla 14, todos al mismo rasgo. El haplotipo 2 a diferencia del haplotipo 4, también porta el alelo que podría ser de susceptibilidad (rs2780895 C), dado que también el alelo T de la misma variante ya había sido asociado a protección al mismo rasgo en nuestro estudio Tabla 14. La suma de estos pequeños efectos de manera independiente generaron los haplotipos 2 y 4 de susceptibilidad a infección y desarrollo de dengue teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio. Lo cual puede ser debido a efecto específico de las variantes mencionadas combinadas con el grado de mezcla con el componente no Africano.148 Para finalizar con las variantes ubicadas en el cromosoma 1, mencionaremos que evaluando la asociación a dengue hemorrágico, las combinaciones alelicas 2 y 4 generadas por las variantes implicadas en los módulos 2 y 3 del modelo fisiopatológico del dengue, se encontraron asociadas a riesgo. Dichas combinaciones contienen las variantes rs11118132 del gen IKBKE del cromosoma 1, a lo largo con la variante rs4073 del gen IL8 del cromosoma 4 y la variante rs1800750 del gen TNFA ubicado en el cromosoma 6 Tabla 19. La combinación alelica 4, contiene el alelo rs11118132 G previamente asociado con dengue hemorrágico Tabla 11, además contiene al igual que la combinación alelica 2 el alelo rs1800750 G cuyo heterocigoto ya había sido asociado a dengue hermorragico y esta combinación 4 a diferencia de la combinación alelica 2 no contiene el alelo rs4073 T que homocigoto (T/T) ya había sido asociado al mismo rasgo (dengue hemorrágico) Tabla 15. Estas dos combinaciones de alelos sumaron efectos observados en la predisposición a dengue hemorrágico. Evaluando la historia de exposición a dengue se encontró otro haplotipo asociaciado a protección comparando positivos con seronegativos, esta vez en el cromosoma 5 compuesto por las variantes del gen IL12B rs3212227 y rs2569253 teniendo en cuenta Africano, análisis que resultó más significativo que en Amerindio, mientras en Europeo no tuvo efecto Tabla 17. Este haplotipo nombrado

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como 2, contiene de un lado el alelo rs3212227 C el cual resultó ser un factor protector al mismo rasgo en nuestro estudio, además de otro lado contiene el alelo rs2569253 T que podría considerarse de protección puesto que su complementario C fue asociado a susceptibilidad al mismo rasgo Tabla 9. La variante rs3212227 del gen IL12B ubicado en el cromosoma 5, a lo largo con otras variantes del los módulos 2 y 3 del modelo fisiopatológico del dengue, tales como rs3132468 del gen MICB, rs40457 del gen RIPK2, rs5744247 del gen IL18 y rs1805016 del gen IL4R, ubicados en los cromosomas 7, 8, 11 y 16 respectivamente, se encontraron involucradas en dos combinaciones alelicas asociadas a infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes. Estas combinaciones alelicas nombradas como 4 y 11 resultaron de riesgo y protección respectivamente, la 4 teniendo en cuenta Europeo y Amerindio y la 11 teniendo en cuenta Europeo y Africano. Tabla 18. El haplotipo 11 contiene muchos pequeños efectos protectores que sumados resultan en la protección a infección y desarrollo de dengue, de un lado contiene los alelos asociados previamente a protección en este estudio (rs3212227 C, rs3132468 G) y por otra parte contiene el alelo rs5744247 C que especulamos es de protección al mismo rasgo dado que su alelo alternativo rs5744247 G se encontró significativamente elevado en positivos comparado con referentes, la suma de estos efectos neutralizaron la fuerte tendencia a riesgo a que predispone el alelo rs40457 G Tabla 10 cuyo homocigoto si resultó previamente asociado a riesgo al mismo fenotipo de dengue Tabla 14. Esto contrasta con el haplotipo 2, el cual contiene además del alelo rs40457 G, los alelos que podrían ser de susceptibilidad tales como rs3212227 A, rs3132468 A. Sumando pequeños efectos que resultan en una combinación alelica de susceptibilidad a infección y desarrollo de dengue, en población con ascendencia no Africana, es decir en nuestro caso Europeo y Amerindio. Continuando con la evaluación de la historia de exposición a dengue resultó el haplotipo 3 del cromosoma 6 asociado a protección teniendo en cuenta los tres componentes ancestrales independientemente comparando positivos con seronegativos. Este haplotipo está compuesto por las variantes rs1800750 del gen TNFA y rs2275913 del gen IL17 Tabla 17. Este haplotipo contiene el alelo rs1800750 A previamente asociado a protección al mismo rasgo en este estudio a lo largo con el alelo rs2275913 G que presumimos de protección dado que su alelo alternativo A fue un factor de riesgo a positividad en la historia de exposición a dengue Tabla 9. Por último para mencionar en relación a la evaluación de la historia de exposición a dengue se encontraron las 10 asociaciones de las combinaciones alelicas 2, 3, 6 y 15, las cuales resultaron todas de protección teniendo en cuenta los tres componentes ancestrales excepto la combinación alelica 15, la cual fue de riesgo exclusivamente en el contexto Amerindio, sin embargo hay que aclarar que en Europeo y Africano no se puedo calcular dada la frecuencia del marcador y el N de los individuos genotipificados para las mismas cinco variantes que componen estas combinaciones Tabla 17. Las combinaciones con mayor efecto protector 3 y 6

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contienen en común el alelo rs5743336 C del gen NOD1 previamente asociada con este mismo efecto sobre el mismo rasgo Tabla 9, ambas combinaciones (3 y 6) al igual que la combinación alelica 2, contienen también los alelos rs1805016 T del gen IL4R y rs2023906 A del gen CCR7 que sospechamos de protección dado que sus alelos alternativos G y G respectivamente se encontraron de susceptibilidad al mismo rasgo, por otra parte las combinaciones alelicas 2 y 6 comparten el alelo rs40457 G del gen RIPK2 también con el documentado mismo efecto en este estudio y además la combinación alelica 6 contiene el alelo rs8904 T del gen NFKB1A igualmente asociado al mismo rasgo Tabla 9. Respecto a la combinación alelica 15 es de anotar que contiene la variante rs1805016 G asociada a susceptibilidad a positividad en la historia de exposición a dengue previamente Tabla alelos, además contiene los alelos rs40457 A y rs8904 C que pensamos podrían ser de riesgo dado que sus alelos alternativos G y T respectivamente se encontraron asociados a protección al mismo rasgo en este estudio Tabla 9. La misma variante rs5743336 del gen NOD1, a lo largo con otras variantes en genes del módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue generaron 5 combinaciones elelicas asociadas a riesgo de infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes teniendo en cuenta los tres componentes genéticos ancestrales excepto para la combinación alelica 6 la cual no tuvo efecto significativo en Amerindio, sin embargo tuvo una fuerte tendencia a riesgo en este contexto Tabla 18. La combinación 5 mostró el mayor efecto sobre la infección y desarrollo de dengue. Este efecto puede ser debido a que a diferencia de las combinaciones 2, 4, 6 y 8, la combinación alelica 5 contiene dos alelos (rs3775290 A y rs5743336 C) asociados a riesgo fuertemente previamente descritos Tabla 10, las combinaciones alelicas 2, 4, 6 y 8 contienen solo un alelo asociado previamente a riesgo (rs3775290 A del gen TLR3, rs5743336 C del gen NOD1, rs1800451 A del gen MBL2 y rs5743336 C del gen NOD1 respectivamente), es de notar que el alelo rs5743336 C esta en ambas combinaciones alelicas (4 y 8). También es importante notar que el alelo rs7248637 G del gen CD209 está compartido por cuatro de los cinco combinaciones alelicas de susceptibilidad a infección y desarrollo de dengue, lo que lo convierte en un probable factor de riesgo y más aún considerando que su alelo alternativo A ya había sido asociado a protección Tabla 10. La red de combinaciones alelicas Figura 2, permite observar que la mayoría de las combinaciones alelicas de susceptibilidad están solo a un paso mutacional del ancestral y tienen elevadas frecuencias Tabla 21 y grandes proporciones Figura 2, en positivos comparados con referentes, lo que demuestra que estas variantes tienen un papel crítico en la infección y desarrollo de la enfermedad del dengue. Algunas de las anteriores variantes entre las que se encuentran rs3775290, rs1800451, junto a rs8105572) de los genes TLR3, MBL2 y CD209 respectivamente, todos con implicaciones directas en el módulo 1 del modelo fisiopatológico del dengue, se encontraron en una (1) combinación alelica (nombrada como 3) asociada a protección a presencia de hemorragias teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio Tabla 20. Esta combinación 3, contiene principalmente el alelo rs1800451 A, previamente asociado con protección a presencia de hemorragias y además contiene el alelo rs3775290 G que podría

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ser un factor protector, dado que su alelo alternativo A en estado homocigoto genotipo A/A, ya había sido asociado a riesgo en este estudio al mismo fenotipo severo de dengue (progresión a presencia de hemorragias) Tabla 16. Finalmente entre los últimos haplotipos asociados significativamente con la infección y desarrollo de dengue, comparando positivos con referentes se encuentran los de los cromosomas 4 y 7 los cuales están compuestos por variantes directamente implicadas en los módulos 2 y 3 del modelo fisiopatológico del dengue Tabla 18. En el cromosoma 4 se encontraron dos haplotipos de riesgo nombrados como 3 y 4 teniendo en cuenta los tres componentes (Europeo, Amerindio y Africano independientemente) compuestos por las variantes rs4073 y rs2227307 del gen IL8. El haplotipo 4 de mayor riesgo contiene el alelo rs2227307 G, cuyo homocigoto fue previamente asociado al mismo fenotipo en este estudio Tabla 14. Por otro lado el haplotipo 3 contiene el alelo rs4073 A previamente asociado al mismo fenotipo (infección y desarrollo de dengue) en este estudio Tabla 10, confirmando el papel crítico de las variantes del gen IL-8 en la resistencia /susceptibilidad a fenotipos del dengue. Respecto al cromosoma 7 se encontró el haplotipo número 2 en el gen IL-6 asociado a riesgo de infección y desarrollo de dengue conteniendo los componentes Europeo y Africano independientemente, pero no tuvo efecto en Amerindio Tabla 18. El haplotipo 2 contiene el alelo rs1800795 C cuyo heterocigoto previamente fue encontrado de predisposición a infección y desarrollo de dengue Tabla 14. Las mismas variantes anteriores rs4073 y rs1800795 a lo largo con otras variantes en genes implicados en los módulos 2 y 3 del modelo fisiopatológico del dengue, rs40457 del gen RIPK2 y rs2233409 del gen NFKB1, resultaron en un una (1) combinación alelica (número 10) asociada con el riesgo a presencia de hemorragias teniendo en cuenta exclusivamente el componente Amerindio Tabla 20, en Europeo no tuvo efecto y en Africano no se puedo calcular. Esta combinación 10 contiene el alelo rs4073 T previamente asociado a presencia de hemorragias Tabla 12 y el alelo rs2233409 T el cual como homocitogo ya había sido asociado al mismo fenotipo del dengue (presencia de hemorragias) Tabla 16. Las variantes que no presentaron asociación ni a alelos, ni a genotipos, ni a combinaciones alelicas o hapltipos en los diferentes fenotipos de dengue evaluados, se debió en la mayoría de los casos al número de casos, incluidos en cada comparación pero sobre todo a la frecuencia tan baja en la población estudiada (Tabla). Modelos de redes

Hay mucho por dilucidar en cuanto a la forma en que los receptores, mediadores y efectores del sistema inmune interactúan para producir anticuerpos específicos de DV, predisponer a la infección y desarrollo de dengue y determinar la progresión a dengue hemorrágico y hemorragias en el curso de la enfermedad. Para intentar generar posibles modelos de interacción de los genes asociados en los diferentes

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grupos evaluados en este estudio, fueron modelados en un análisis de vías de expresión génica en el programa peinNetork,159 estos análisis generaron redes de interacciones de transcriptos de los genes de interés y sus contextos en los que operan en humano y ratón. La red de genes asociados a positivos comparados con seronegativos (IgM- e IgG-) observados en la Figura 4, demuestra la alta conectividad de los genes JAK1, IKBKE, TNFA, NOD1, RIPK2, NFKB1A e IL4R, y la interacción al menos no directa sino a través de otros mediadores con CCR7, IL17A e IL12B. Sus interacciones podrían favorecer o desfavorecer la producción de anticuerpos, modulando la posibilidad de resultar positivo/negativo en una prueba diagnóstica. Desde el punto de vista fisiopatológico de dengue, después de que NOD1/NOD2 unen las partículas de ARN virales pueden desencadenar sus mecanismos de señalización de mediadores, lo que incluye los eventos de ubiquitinización en los que está involucrado RIPK2. Una vez que entre en contexto NFKB1A, IKBKE liberará a el factor de transcripción NFKB, el cual podrá traslocarse al núcleo para la producción de citoquinas tales como TNFA e IL17A; TNFA en contexto con bajo niveles TNFRSF1A, promoverá la regulación positiva de la vía de JAK/STAT, la cual también es susceptible de ser inducida por la presencia de IL4R activado, generando la producción de citoquinas como IL12A y receptores de quimoquinas como CCR7. La presencia de moléculas como IL17, IL12, IL4R y TNFA sugiere predominantes respuestas celulares tipo Th1 y Th17. Ver capítulo 5 y discusión de alelos y genotipos del Capitulo 7. Los resultados de este estudio en conjunto, sugieren que mutaciones que alteren los niveles de transcriptos en esta vía pueden predisponer a anticuerpos circulantes IgM o IgG bajos, nulos o de poca duración en lo concerniente a la historia de exposición a dengue, no obstante contrario a esto pueden ser potenciados dependiendo de las interacciones entre variantes génicas. Aparentemente TNFA tiene potencial uso terapéutico (respondedores a drogas, gran tamaño de los círculos o formas de diamante en la Figura 4) en los casos de severidad, dependiendo del momento durante el curso de la infección o el tiempo de una infección pasada. No se descarta el potencial terapéutico de IL12B. EL transcripto de TNFA ya había sido encontrado en una red molecular interactuando con otros mediadores inflamatorios como citoquinas y quimoquinas.73 TNFA predispone al inicio de alteraciones de pacientes durante el curso de infecciones.225 Esto podría estar relacionado con el desarrollo de formas severas del dengue durante infecciones primarias226 y en este tipo de casos la circulación de anticuerpos no neutralizantes ya ha sido involucrada con el aumento de células infectadas.227 La red de genes asociados a positivos comparados con referentes puede ser vista en la Figura 5. Estas interacciones podrían ser las responsables de favorecer la infección y posterior desarrollo de dengue. La fisiopatogénesis del dengue sugiere que los productos génicos involucrados en esta red, aparentemente tiene tres momentos importantes. En principio el DV es reconocido directamente por su receptor complementario CD209, cuya activación señalizará el TLR3. El TLR3 reconocerá sdARN viral, iniciando la señal de dos vías alternas de mediadores. Una de ellas inducirá la traslocación del factor NFKB al núcleo para la promover la

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presentación antigénica en complejo mayor de histo-compatibilidad tipo B (MICB) y producción de moléculas efectoras como citoquinas pro-inflamatorias tales como IL1B e IL18, entre otras; la otra vía señalizada por TLR3 promoverá la regulación positiva de la vía JAK/STAT, previa señalización de los genes estimuladores de interferon, favoreciendo la producción de citoquinas (IL12B, IL6, IL10), receptores de citoquinas (IL6R, IL4R), quimoquinas (IL8) y receptores de quimoquinas (CCR7). Por otra parte las proteínas citosólicas NOD2/NOD1 pueden recocer ssARN viral, activando su señalización, lo que incluye a RIPK2 e IKBKE potenciando la traslocación de NFKB al núcleo y sus efectos sobre la transcripción de genes blanco de NFKB, HLAs y genes blanco de INFs, lo que eventualmente también potenciará la señalización positiva de la vía JAK/STAT y sus efectos. Finalmente la unión del virus a MBL2, activará la respuesta del complemento a través de la vía unión a lectinas, en sinergia con IL1B e IL18. Aparentemente esta respuesta a DV está dominada por células tipo Th2 (presencia de IL10, IL4 IL6 e IL18) y respuesta anti-inflamatoria (IL10 e IL4). Ver capítulo 5 y discusión de alelos y genotipos del Capítulo 7. Los transcriptos de IL1B e IL8 son potentes mediadores de la inflamación y han sido recurrentemente reportados en la infección por dengue y en pacientes que desarrollaron la forma leve y severa.73 Evaluando pacientes infectados con DV estos transcriptos se han encontrado junto con inhibidores inflamatorios,228 sugiriendo que la infección y desarrollo de dengue se caracteriza por la expresión concomitante de transcriptos, cuyos productos son activadores y supresores del sistema inmunitario.73 IL6 e IL1B se han encontrado previamente mediando la interacción molecular en redes de fenotipos del dengue,73 específicamente IL1B ha sido esencial para el inicio de alteraciones en pacientes con infecciones en curso.225 Por último previamente se ha visto que la respuesta del complemento es otra manifestación clínica del desarrollo del dengue.229 Estos resultado en conjunto sugieren que la infección está aparénteme determinada por transcriptos inhibidores de inflamación. La red de genes asociados a dengue hemorrágico puede ser vista en la Figura 6. Estas interacciones podrían ser las responsables de la progresión a dengue severo en el curso de la infección. La epidemiología molecular del dengue, junto con los resultados de esta red sugiere que aparentemente hay dos vías de señalización importantes para la progresión a dengue hemorrágico. En principio el DV es reconocido por CD209, transduciendo la señal que resultará en la producción de moléculas quimio-atrayentes de monocitos y macrófagos como CCL2 (MCP1) y de granulocitos como como IL8, además de inducir la expresión de los receptores de estas moléculas quimio-atrayentes tales como CCR7. Por otro lado la unión de DV a NOD2/NOD1 activará una potente vía mediada por IKBKE y NFKB1A para la producción de moléculas pro-inflamatorias tales como TNFA. En esta respuesta predomina una respuesta de células tipo Th1 mediada por la presencia de TNFA. Ver capítulo 5 y discusión de alelos y genotipos del Capítulo 7. Previamente ya han sido reportados TNFA y CCL2 (MCP1) mediando interacciones moleculares en una red de transcriptos de pacientes previamente asociados con dengue hemorrágico, donde un factor tisular presentó un papel central.73 Este factor tisular es el principal regulador de la homeostasis.230 La citoquina TNFA ha sido involucrada con dengue hemorrágico/síndrome del choque por dengue y varias

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alteraciones vasculares.231 Por ejemplo la permeabilidad vascular, extravasación de plasma y desequilibrio homeostático que caracteriza el dengue hemorrágico.232 Este tipo de pacientes también han expresado (CCL2) MCP1, asociados a severidad y aumento de la permeabilidad vascular y desequilibrio homeostático en dengue hemorrágico,102 al igual que transcriptos de MCP1 e IL8 han sido encontrados en pacientes con el dengue severo.233 Estos resultados en conjunto sugieren la interacción de citoquinas, quimoquinas y receptores de quimoquinas junto con otros mediadores y receptores virales predisponiendo a la progresión a dengue hemorrágico.

La red de genes asociados a hemorragias en este estudio puede ser vista en la Figura 7. Estas interacciones podrían ser las responsables de favorecer las coagulopatías en el curso de dengue. Desde la inmuno-patogénesis del dengue se sugiere que los productos génicos involucrados en esta red, aparentemente tiene tres momentos relevantes. En principio DV es reconocido directamente por su receptor complementario CD209 y activa su señalización, la cual incluye a TLR3 y el reconocimiento de sdARN viral, esta señal facilita la liberación de IKBKE de NFKB por la acción de NFKB1A, lo cual favorece la traslocación a nucleo de NFKB, evento que puede ser modulado por la presencia/ausencia de RIPK2, este contexto induce la transcripción de citoquinas (IL6, IL12B, IL18) receptores de citoquinas (IL6R, IL4R), quimoquinas (IL8, MCP1) y receptores de quimoquinas (CCR7). En segundo lugar la acción simultánea del mediador JAK1 tendrá un efecto sinérgico sobre la producción de estas moléculas efectoras. Finalmente la unión del DV a MBL2 activará el complemento y sus efectos. Estos resultados sugieren una predominante respuesta de células Th2 por la presencia de IL18, IL12B e IL6, potenciación de los efectos del complemento por sinergismo de MBL2 e IL18, una evidente ausencia de la respuesta anti-inflamatoria y células inmunes quimio-atraídas a sitios de inflamación aumentando la cinética molecular de la respuesta a la infección. Ver capítulo 5 y discusión de alelos y genotipos del Capítulo 7. IL6 y MCP1 han sido detectados en redes de transcripción interactuando con el factor tisular, previamente asociados a dengue hemorrágico,73 estos mimos trascriptos han sido involucrados en la extravasación vascular y el desequilibrio homeostático que caracteriza el dengue hemorrágico.232 De otro lado factor tisular es responsable de iniciar la coagulación y su expresión errada puede favorecer la alteración homeostática, por ejemplo desencadenando la coagulación vascular diseminada.230 IL6 es esencial para el inicio de la coagulación y fibrinólisis.225 vistas en dengue.231 Por otra parte IL8 correlacionó con dengue hemorrágico junto con MCP1.233 Finalmente la señalización del complemento ha sido asociada a la enfermedad severa en dengue.73 La red que resume los genes asociados a pacientes positivos, dengue hemorrágico y/o hemorragias en este estudio pueden ser vista en la Figura 8. Estas interacciones podrían ser las responsables de la infección y progresión de dengue. El consolidado de resultados aquí presentados sugieren que en la infección primaria, una vez el DV ha sido reconocido por los receptores virales predominará una respuesta Th1/Th17, mediada por la producción de citoquinas, quimoquinas y receptores de quimoquinas; si se prolonga la infección o si se da el inicio de una

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infección secundaria, se polarizará la respuesta a Th2, debido a que después de la detección viral a través de otros sensores virales, habrá una elevada presentación antigénica en contexto HLAB, se potenciará la producción de citoquinas, quimoquinas y sus receptores, activación del complemento y producción simultánea de moléculas antiinflamatorias, lo cual puede modular los niveles de viremia y el desarrollo de dengue leve o rápidamente contribuir al desarrollo de dengue hemorrágico. La progresión a dengue hemorrágico estará caracterizada por el potenciamiento de la respuesta Th1, mediada por la producción de citoquinas y reclutamiento de células inmunitarias a los sitios de infección. Finalmente la hemorragia en el curso dengue, será facilitada por una respuesta Th2 con marcado daño vascular, mediada por citoquinas, quimoquinas y sus receptores, activación del complemento y ausencia de los efectos de transcriptos anti-inflamatorios. En conclusión las 31 variantes en los 22 genes asociados a la infección y/o progresión del dengue en este estudio, podrían predisponer a la polarización de la señalización de la respuesta inmune para favorecer la presencia/ausencia de distintos fenotipos del dengue. Esto podría tener utilidad en la orientación del uso fármacos y desarrollo consiente de estrategias de intervención poblacional para intentar frenar la transmisión del dengue y/o reducir los efectos severos del dengue en Colombia, dependiendo de las características epidemiológicas como el contexto genético ancestral en distintas zonas geográficas. Es notorio que las variantes génicas asociadas a la protección a hemorragias en el curso de la infección de VD, se destacaron por su ausencia cuando se consideró el contexto genético ancestral Africano, contrario a ello fueron frecuentes teniendo en cuenta el contexto Amerindio y en menor proporción Europeo. Esto sugiere que los individuos con altos componentes Amerindio y Europeo, es decir no Africano, tendrán mayor capacidad de coagulación.

150

Referencias

1. Herrero LJ, Zakhary A, Gahan ME, Nelson MA, Herring BL, Hapel AJ, et al.

Dengue virus therapeutic intervention strategies based on viral, vector and host factors

involved in disease pathogenesis. Pharmacol Ther. 2013 Feb;137(2):266-82.

2. Gebhard LG, Filomatori CV, Gamarnik AV. Functional RNA elements in the dengue

virus genome. Viruses. 2011 Sep;3(9):1739-56.

3. Normile D. Tropical medicine. Surprising new dengue virus throws a spanner in

disease control efforts. Science. 2013 Oct 25;342(6157):415.

4. Ye J, Zhu B, Fu ZF, Chen H, Cao S. Immune evasion strategies of flaviviruses.

Vaccine. 2013 Jan 7;31(3):461-71.

5. Rothman AL. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical

cytokine storms. Nat Rev Immunol. 2011 Aug;11(8):532-43.

6. Lin CF, Chiu SC, Hsiao YL, Wan SW, Lei HY, Shiau AL, et al. Expression of

cytokine, chemokine, and adhesion molecules during endothelial cell activation induced by

antibodies against dengue virus nonstructural protein 1. J Immunol. 2005 Jan 1;174(1):395-

403.

7. Kurosu T, Chaichana P, Yamate M, Anantapreecha S, Ikuta K. Secreted complement

regulatory protein clusterin interacts with dengue virus nonstructural protein 1. Biochem

Biophys Res Commun. 2007 Nov 3;362(4):1051-6.

8. Daffis S, Szretter KJ, Schriewer J, Li J, Youn S, Errett J, et al. 2'-O methylation of

the viral mRNA cap evades host restriction by IFIT family members. Nature. 2010 Nov

18;468(7322):452-6.

9. Gritsun TS, Gould EA. Origin and evolution of flavivirus 5'UTRs and panhandles:

trans-terminal duplications? Virology. 2007 Sep 15;366(1):8-15.

10. Yu L, Nomaguchi M, Padmanabhan R, Markoff L. Specific requirements for

elements of the 5' and 3' terminal regions in flavivirus RNA synthesis and viral replication.

Virology. 2008 Apr 25;374(1):170-85.

11. Alvarez DE, Lodeiro MF, Luduena SJ, Pietrasanta LI, Gamarnik AV. Long-range

RNA-RNA interactions circularize the dengue virus genome. J Virol. 2005 Jun;79(11):6631-

43.

12. Lodeiro MF, Filomatori CV, Gamarnik AV. Structural and functional studies of the

promoter element for dengue virus RNA replication. J Virol. 2009 Jan;83(2):993-1008.

13. Alvarez DE, De Lella Ezcurra AL, Fucito S, Gamarnik AV. Role of RNA structures

present at the 3'UTR of dengue virus on translation, RNA synthesis, and viral replication.

Virology. 2005 Sep 1;339(2):200-12.

14. Silva RL, de Silva AM, Harris E, MacDonald GH. Genetic analysis of Dengue 3

virus subtype III 5' and 3' non-coding regions. Virus Res. 2008 Aug;135(2):320-5.

15. Shurtleff AC, Beasley DW, Chen JJ, Ni H, Suderman MT, Wang H, et al. Genetic

variation in the 3' non-coding region of dengue viruses. Virology. 2001 Mar 1;281(1):75-87.

151

16. Men R, Bray M, Clark D, Chanock RM, Lai CJ. Dengue type 4 virus mutants

containing deletions in the 3' noncoding region of the RNA genome: analysis of growth

restriction in cell culture and altered viremia pattern and immunogenicity in rhesus

monkeys. J Virol. 1996 Jun;70(6):3930-7.

17. Hahn CS, Hahn YS, Rice CM, Lee E, Dalgarno L, Strauss EG, et al. Conserved

elements in the 3' untranslated region of flavivirus RNAs and potential cyclization

sequences. J Mol Biol. 1987 Nov 5;198(1):33-41.

18. Villordo SM, Gamarnik AV. Genome cyclization as strategy for flavivirus RNA

replication. Virus Res. 2009 Feb;139(2):230-9.

19. Alvarez DE, Filomatori CV, Gamarnik AV. Functional analysis of dengue virus

cyclization sequences located at the 5' and 3'UTRs. Virology. 2008 May 25;375(1):223-35.

20. Wang XJ, Taga T, Yoshida K, Saito M, Kishimoto T, Kikutani H. gp130, the

cytokine common signal-transducer of interleukin-6 cytokine family, is downregulated in T

cells in vivo by interleukin-6. Blood. 1998 May 1;91(9):3308-14.

21. Anantapreecha S, Chanama S, A An, Naemkhunthot S, Sa-Ngasang A,

Sawanpanyalert P, et al. Serological and virological features of dengue fever and dengue

haemorrhagic fever in Thailand from 1999 to 2002. Epidemiol Infect. 2005 Jun;133(3):503-

7.

22. Balmaseda A, Hammond SN, Perez L, Tellez Y, Saborio SI, Mercado JC, et al.

Serotype-specific differences in clinical manifestations of dengue. Am J Trop Med Hyg.

2006 Mar;74(3):449-56.

23. Tuiskunen A, Monteil V, Plumet S, Boubis L, Wahlstrom M, Duong V, et al.

Phenotypic and genotypic characterization of dengue virus isolates differentiates dengue

fever and dengue hemorrhagic fever from dengue shock syndrome. Arch Virol. 2011

Nov;156(11):2023-32.

24. Vu TT, Holmes EC, Duong V, Nguyen TQ, Tran TH, Quail M, et al. Emergence of

the Asian 1 genotype of dengue virus serotype 2 in viet nam: in vivo fitness advantage and

lineage replacement in South-East Asia. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4(7):e757.

25. Rico-Hesse R, Harrison LM, Salas RA, Tovar D, Nisalak A, Ramos C, et al. Origins

of dengue type 2 viruses associated with increased pathogenicity in the Americas. Virology.

1997 Apr 14;230(2):244-51.

26. Halstead SB. Dengue virus-mosquito interactions. Annu Rev Entomol. 2008;53:273-

91.

27. Twiddy SS, Holmes EC, Rambaut A. Inferring the rate and time-scale of dengue

virus evolution. Mol Biol Evol. 2003 Jan;20(1):122-9.

28. Gubler DJ. Dengue/dengue haemorrhagic fever: history and current status. Novartis

Found Symp. 2006;277:3-16; discussion -22, 71-3, 251-3.

29. Allicock OM, Lemey P, Tatem AJ, Pybus OG, Bennett SN, Mueller BA, et al.

Phylogeography and population dynamics of dengue viruses in the Americas. Mol Biol

Evol. 2012 Jun;29(6):1533-43.

30. Diallo M, Sall AA, Moncayo AC, Ba Y, Fernandez Z, Ortiz D, et al. Potential role of

sylvatic and domestic African mosquito species in dengue emergence. Am J Trop Med Hyg.

2005 Aug;73(2):445-9.

31. Wang E, Ni H, Xu R, Barrett AD, Watowich SJ, Gubler DJ, et al. Evolutionary

relationships of endemic/epidemic and sylvatic dengue viruses. J Virol. 2000

Apr;74(7):3227-34.

152

32. Back AT, Lundkvist A. Dengue viruses - an overview. Infect Ecol Epidemiol.

2013;3.

33. Laughlin CA, Morens DM, Cassetti MC, Costero-Saint Denis A, San Martin JL,

Whitehead SS, et al. Dengue research opportunities in the Americas. J Infect Dis. 2012 Oct

1;206(7):1121-7.

34. Usme-Ciro JA, Mendez JA, Tenorio A, Rey GJ, Domingo C, Gallego-Gomez JC.

Simultaneous circulation of genotypes I and III of dengue virus 3 in Colombia. Virol J.

2008;5:101.

35. Ocazionez RE, Cortes FM, Villar LA, Gomez SY. Temporal distribution of dengue

virus serotypes in Colombian endemic area and dengue incidence. Re-introduction of

dengue-3 associated to mild febrile illness and primary infection. Mem Inst Oswaldo Cruz.

2006 Nov;101(7):725-31.

36. Zinzula L, Tramontano E. Strategies of highly pathogenic RNA viruses to block

dsRNA detection by RIG-I-like receptors: hide, mask, hit. Antiviral Res. 2013

Dec;100(3):615-35.

37. Hanley KA, Monath TP, Weaver SC, Rossi SL, Richman RL, Vasilakis N. Fever

versus fever: the role of host and vector susceptibility and interspecific competition in

shaping the current and future distributions of the sylvatic cycles of dengue virus and yellow

fever virus. Infect Genet Evol. 2013 Oct;19:292-311.

38. Peeling RW, Artsob H, Pelegrino JL, Buchy P, Cardosa MJ, Devi S, et al. Evaluation

of diagnostic tests: dengue. Nat Rev Microbiol. 2010 Dec;8(12 Suppl):S30-8.

39. Arboleda S, Jaramillo ON, Peterson AT. Spatial and temporal dynamics of Aedes

aegypti larval sites in Bello, Colombia. J Vector Ecol. 2012 Jun;37(1):37-48.

40. Amarasinghe A, Kuritsk JN, Letson GW, Margolis HS. Dengue virus infection in

Africa. Emerg Infect Dis. 2011 Aug;17(8):1349-54.

41. Mangold KA, Reynolds SL. A review of dengue Fever: a resurging tropical disease.

Pediatr Emerg Care. 2013 May;29(5):665-9.

42. Diallo M, Ba Y, Faye O, Soumare ML, Dia I, Sall AA. Vector competence of Aedes

aegypti populations from Senegal for sylvatic and epidemic dengue 2 virus isolated in West

Africa. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008 May;102(5):493-8.

43. Simmons CP, Farrar JJ, Nguyen v V, Wills B. Dengue. N Engl J Med. 2012 Apr

12;366(15):1423-32.

44. Rico-Hesse R. Molecular evolution and distribution of dengue viruses type 1 and 2 in

nature. Virology. 1990 Feb;174(2):479-93.

45. Gubler DJ. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and

economic problem in the 21st century. Trends Microbiol. 2002 Feb;10(2):100-3.

46. Maciel-de-Freitas R, Codeco CT, Lourenco-de-Oliveira R. Daily survival rates and

dispersal of Aedes aegypti females in Rio de Janeiro, Brazil. Am J Trop Med Hyg. 2007

Apr;76(4):659-65.

47. Nene V, Wortman JR, Lawson D, Haas B, Kodira C, Tu ZJ, et al. Genome sequence

of Aedes aegypti, a major arbovirus vector. Science. 2007 Jun 22;316(5832):1718-23.

48. Turley AP, Moreira LA, O'Neill SL, McGraw EA. Wolbachia infection reduces

blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis.

2009;3(9):e516.

49. Saavedra-Rodriguez K, Strode C, Flores Suarez A, Fernandez Salas I, Ranson H,

Hemingway J, et al. Quantitative trait loci mapping of genome regions controlling

permethrin resistance in the mosquito Aedes aegypti. Genetics. 2008 Oct;180(2):1137-52.

153

50. Rapley LP, Johnson PH, Williams CR, Silcock RM, Larkman M, Long SA, et al. A

lethal ovitrap-based mass trapping scheme for dengue control in Australia: II. Impact on

populations of the mosquito Aedes aegypti. Med Vet Entomol. 2009 Dec;23(4):303-16.

51. WHO. Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. Special

Programme for Research and Training in Tropical Diseases (TDR). 2009.

52. Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev. 1998

Jul;11(3):480-96.

53. Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, Messina JP, Farlow AW, Moyes CL, et al. The

global distribution and burden of dengue. Nature. 2013 Apr 25;496(7446):504-7.

54. Sprenger D, Wuithiranyagool T. The discovery and distribution of Aedes albopictus

in Harris County, Texas. J Am Mosq Control Assoc. 1986 Jun;2(2):217-9.

55. Forattini OP. Identification of Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) in Brazil. Rev

Saude Publica. 1986 Jun;20(3):244-5.

56. Cuellar-Jimenez ME, Velasquez-Escobar OL, Gonzalez-Obando R, Morales-

Reichmann CA. [Detection of Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) in the city of

Cali, Valle del Cauca, Colombia]. Biomedica. 2007 Jun;27(2):273-9.

57. Gratz NG. Critical review of the vector status of Aedes albopictus. Med Vet

Entomol. 2004 Sep;18(3):215-27.

58. San Martin JL, Brathwaite O, Zambrano B, Solorzano JO, Bouckenooghe A, Dayan

GH, et al. The epidemiology of dengue in the americas over the last three decades: a

worrisome reality. Am J Trop Med Hyg. 2010 Jan;82(1):128-35.

59. Brathwaite Dick O, San Martin JL, Montoya RH, del Diego J, Zambrano B, Dayan

GH. The history of dengue outbreaks in the Americas. Am J Trop Med Hyg. 2012

Oct;87(4):584-93.

60. Morin CW, Comrie AC, Ernst K. Climate and dengue transmission: evidence and

implications. Environ Health Perspect. 2013 Nov-Dec;121(11-12):1264-72.

61. Tun-Lin W, Burkot TR, Kay BH. Effects of temperature and larval diet on

development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland,

Australia. Med Vet Entomol. 2000 Mar;14(1):31-7.

62. Watts DM, Burke DS, Harrison BA, Whitmire RE, Nisalak A. Effect of temperature

on the vector efficiency of Aedes aegypti for dengue 2 virus. Am J Trop Med Hyg. 1987

Jan;36(1):143-52.

63. Were F. The dengue situation in Africa. Paediatr Int Child Health. 2012 May;32

Suppl 1:18-21.

64. Guha-Sapir D, Schimmer B. Dengue fever: new paradigms for a changing

epidemiology. Emerg Themes Epidemiol. 2005 Mar 2;2(1):1.

65. de la CSB, Kouri G, Guzman MG. Race: a risk factor for dengue hemorrhagic fever.

Arch Virol. 2007;152(3):533-42.

66. Whitehorn J, Simmons CP. The pathogenesis of dengue. Vaccine. 2011 Sep

23;29(42):7221-8.

67. Guzman MG, Kouri G. Dengue: an update. Lancet Infect Dis. 2002 Jan;2(1):33-42.

68. Anders KL, Nguyet NM, Chau NV, Hung NT, Thuy TT, Lien le B, et al.

Epidemiological factors associated with dengue shock syndrome and mortality in

hospitalized dengue patients in Ho Chi Minh City, Vietnam. Am J Trop Med Hyg. 2011

Jan;84(1):127-34.

154

69. Ocampo CB, Mina NJ, Carabali M, Alexander N, Osorio L. Reduction in dengue

cases observed during mass control of Aedes (Stegomyia) in street catch basins in an

endemic urban area in Colombia. Acta Trop. 2014 Jan 2;132C:15-22.

70. Mendez JA, Usme-Ciro JA, Domingo C, Rey GJ, Sanchez JA, Tenorio A, et al.

Phylogenetic reconstruction of dengue virus type 2 in Colombia. Virol J. 2012;9:64.

71. Restrepo BN, Ramirez RE, Arboleda M, Alvarez G, Ospina M, Diaz FJ. Serum

levels of cytokines in two ethnic groups with dengue virus infection. Am J Trop Med Hyg.

2008 Nov;79(5):673-7.

72. Torres C, Barguil S, Melgarejo M, Olarte A. Fuzzy model identification of dengue

epidemic in Colombia based on multiresolution analysis. Artif Intell Med. 2014

Jan;60(1):41-51.

73. Houghton-Trivino N, Martin K, Giaya K, Rodriguez JA, Bosch I, Castellanos JE.

[Comparison of the transcriptional profiles of patients with dengue fever and dengue

hemorrhagic fever reveals differences in the immune response and clues in

immunopathogenesis]. Biomedica. 2010 Oct-Dec;30(4):587-97.

74. Quintero J, Carrasquilla G, Suarez R, Gonzalez C, Olano VA. An ecosystemic

approach to evaluating ecological, socioeconomic and group dynamics affecting the

prevalence of Aedes aegypti in two Colombian towns. Cad Saude Publica. 2009;25 Suppl

1:S93-103.

75. Sommerfeld J, Kroeger A. Eco-bio-social research on dengue in Asia: a multicountry

study on ecosystem and community-based approaches for the control of dengue vectors in

urban and peri-urban Asia. Pathog Glob Health. 2012 Dec;106(8):428-35.

76. Quintero J, Brochero H, Manrique-Saide P, Barrera-Perez M, Basso C, Romero S, et

al. Ecological, biological and social dimensions of dengue vector breeding in five urban

settings of Latin America: a multi-country study. BMC Infect Dis. 2014;14(1):38.

77. Cassab A, Morales V, Mattar S. [Climatic factors and cases of dengue in Monteria,

Colombia: 2003-2008]. Rev Salud Publica (Bogota). 2011 Feb;13(1):115-28.

78. Grisales N, Poupardin R, Gomez S, Fonseca-Gonzalez I, Ranson H, Lenhart A.

Temephos resistance in Aedes aegypti in Colombia compromises dengue vector control.

PLoS Negl Trop Dis. 2013;7(9):e2438.

79. Marcombe S, Poupardin R, Darriet F, Reynaud S, Bonnet J, Strode C, et al.

Exploring the molecular basis of insecticide resistance in the dengue vector Aedes aegypti: a

case study in Martinique Island (French West Indies). BMC Genomics. 2009;10:494.

80. Alout H, Berthomieu A, Cui F, Tan Y, Berticat C, Qiao C, et al. Different amino-

acid substitutions confer insecticide resistance through acetylcholinesterase 1 insensitivity in

Culex vishnui and Culex tritaeniorhynchus (Diptera: Culicidae) from China. J Med Entomol.

2007 May;44(3):463-9.

81. Ocampo CB, Salazar-Terreros MJ, Mina NJ, McAllister J, Brogdon W. Insecticide

resistance status of Aedes aegypti in 10 localities in Colombia. Acta Trop. 2011

Apr;118(1):37-44.

82. Santacoloma L, Chaves B, Brochero HL. [Susceptibility of natural populations of

dengue vector to insecticides in Colombia]. Biomedica. 2012 Sep;32(3):333-43.

83. Arboleda S, Jaramillo ON, Peterson AT. Mapping environmental dimensions of

dengue fever transmission risk in the Aburra Valley, Colombia. Int J Environ Res Public

Health. 2009 Dec;6(12):3040-55.

155

84. Restrepo BN, Arboleda M, Ramirez R, Alvarez G. [Serum platelet-activating factor

acetylhydrolase activity in dengue patients of African or mestizo descendency]. Biomedica.

2011 Oct-Dec;31(4):599-607.

85. Blanton RE, Silva LK, Morato VG, Parrado AR, Dias JP, Melo PR, et al. Genetic

ancestry and income are associated with dengue hemorrhagic fever in a highly admixed

population. Eur J Hum Genet. 2008 Jun;16(6):762-5.

86. Cruz CD, Forshey BM, Juarez DS, Guevara C, Leguia M, Kochel TJ, et al.

Molecular Epidemiology of American/Asian genotype DENV-2 in Peru. Infect Genet Evol.

2013 May 3.

87. Sun P, Kochel TJ. The battle between infection and host immune responses of

dengue virus and its implication in dengue disease pathogenesis. ScientificWorldJournal.

2013;2013:843469.

88. Khan MI, Anwar E, Agha A, Hassanien NS, Ullah E, Syed IA, et al. Factors

predicting severe dengue in patients with dengue Fever. Mediterr J Hematol Infect Dis.

2013;5(1):e2013014.

89. Morrison J, Laurent-Rolle M, Maestre AM, Rajsbaum R, Pisanelli G, Simon V, et al.

Dengue Virus Co-opts UBR4 to Degrade STAT2 and Antagonize Type I Interferon

Signaling. PLoS Pathog. 2013 Mar;9(3):e1003265.

90. Alagarasu K, Damle I, Bachal R, Mulay A, Shah P, Dayaraj C. Association of

promoter region polymorphisms of CD209 gene with clinical outcomes of dengue virus

infection in Western India. Infect Genet Evol. 2013 Apr 26.

91. Guzman MG, Alvarez M, Halstead SB. Secondary infection as a risk factor for

dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome: an historical perspective and role of

antibody-dependent enhancement of infection. Arch Virol. 2013 Mar 8;2013.

92. Lan NT, Hirayama K. Host genetic susceptibility to severe dengue infection. Trop

Med Health. 2011 Dec;39(4 Suppl):73-81.

93. Shresta S. Role of complement in dengue virus infection: protection or pathogenesis?

MBio. 2012;3(1).

94. Malavige GN, Huang LC, Salimi M, Gomes L, Jayaratne SD, Ogg GS. Cellular and

cytokine correlates of severe dengue infection. PLoS One. 2012;7(11):e50387.

95. van der Schaar HM, Rust MJ, Chen C, van der Ende-Metselaar H, Wilschut J,

Zhuang X, et al. Dissecting the cell entry pathway of dengue virus by single-particle

tracking in living cells. PLoS Pathog. 2008 Dec;4(12):e1000244.

96. Wan SW, Lin CF, Yeh TM, Liu CC, Liu HS, Wang S, et al. Autoimmunity in dengue

pathogenesis. J Formos Med Assoc. 2013 Jan;112(1):3-11.

97. Gandini M, Gras C, Azeredo EL, Pinto LM, Smith N, Despres P, et al. Dengue virus

activates membrane TRAIL relocalization and IFN-alpha production by human

plasmacytoid dendritic cells in vitro and in vivo. PLoS Negl Trop Dis. 2013 Jun;7(6):e2257.

98. Tassaneetrithep B, Burgess TH, Granelli-Piperno A, Trumpfheller C, Finke J, Sun

W, et al. DC-SIGN (CD209) mediates dengue virus infection of human dendritic cells. J Exp

Med. 2003 Apr 7;197(7):823-9.

99. Nielsen DG. The relationship of interacting immunological components in dengue

pathogenesis. Virol J. 2009;6:211.

100. Juffrie M, van Der Meer GM, Hack CE, Haasnoot K, Sutaryo, Veerman AJ, et al.

Inflammatory mediators in dengue virus infection in children: interleukin-8 and its

relationship to neutrophil degranulation. Infect Immun. 2000 Feb;68(2):702-7.

156

101. Wu WL, Ho LJ, Chen PC, Tsai YT, Hsu ST, Chang DM, et al. Immunosuppressive

effects and mechanisms of leflunomide in dengue virus infection of human dendritic cells. J

Clin Immunol. 2011 Dec;31(6):1065-78.

102. Lee YR, Liu MT, Lei HY, Liu CC, Wu JM, Tung YC, et al. MCP-1, a highly

expressed chemokine in dengue haemorrhagic fever/dengue shock syndrome patients, may

cause permeability change, possibly through reduced tight junctions of vascular endothelium

cells. J Gen Virol. 2006 Dec;87(Pt 12):3623-30.

103. Whitehorn J, Chau TN, Nguyet NM, Kien DT, Quyen NT, Trung DT, et al. Genetic

variants of MICB and PLCE1 and associations with non-severe dengue. PLoS One.

2013;8(3):e59067.

104. Cox D SM, Zapata JC. The Role of Platelets in Viral Hemorrhagic Fevers. J Bioterr

Biodef. 2013;S12(003).

105. Huang YH, Chang BI, Lei HY, Liu HS, Liu CC, Wu HL, et al. Antibodies against

dengue virus E protein peptide bind to human plasminogen and inhibit plasmin activity. Clin

Exp Immunol. 1997 Oct;110(1):35-40.

106. Torres S, Hernandez JC, Giraldo D, Arboleda M, Rojas M, Smit JM, et al.

Differential expression of Toll-like receptors in dendritic cells of patients with dengue

during early and late acute phases of the disease. PLoS Negl Trop Dis. 2013 Feb;7(2):e2060.

107. Sessions OM, Tan Y, Goh KC, Liu Y, Tan P, Rozen S, et al. Host cell transcriptome

profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl Trop Dis. 2013

Mar;7(3):e2107.

108. Tolfvenstam T, Lindblom A, Schreiber MJ, Ling L, Chow A, Ooi EE, et al.

Characterization of early host responses in adults with dengue disease. BMC Infect Dis.

2011;11:209.

109. Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:

update on Toll-like receptors. Nat Immunol. 2010 May;11(5):373-84.

110. Tsai YT, Chang SY, Lee CN, Kao CL. Human TLR3 recognizes dengue virus and

modulates viral replication in vitro. Cell Microbiol. 2009 Apr;11(4):604-15.

111. Garcia G, del Puerto F, Perez AB, Sierra B, Aguirre E, Kikuchi M, et al. Association

of MICA and MICB alleles with symptomatic dengue infection. Hum Immunol. 2011

Oct;72(10):904-7.

112. Pythoud C, Rodrigo WW, Pasqual G, Rothenberger S, Martinez-Sobrido L, de la

Torre JC, et al. Arenavirus nucleoprotein targets interferon regulatory factor-activating

kinase IKKepsilon. J Virol. 2012 Aug;86(15):7728-38.

113. da Conceicao TM, Rust NM, Berbel AC, Martins NB, do Nascimento Santos CA, Da

Poian AT, et al. Essential role of RIG-I in the activation of endothelial cells by dengue virus.

Virology. 2013 Jan 20;435(2):281-92.

114. Zgheib A, Pelletier-Bonnier E, Levros LC, Jr., Annabi B. Selective JAK/STAT3

signalling regulates transcription of colony stimulating factor-2 and -3 in Concanavalin-A-

activated mesenchymal stromal cells. Cytokine. 2013 Aug;63(2):187-93.

115. Rathakrishnan A, Wang SM, Hu Y, Khan AM, Ponnampalavanar S, Lum LC, et al.

Cytokine expression profile of dengue patients at different phases of illness. PLoS One.

2012;7(12):e52215.

116. Ghosh M, Shen Z, Fahey JV, Crist SG, Patel M, Smith JM, et al. Pathogen

recognition in the human female reproductive tract: expression of intracellular cytosolic

sensors NOD1, NOD2, RIG-1, and MDA5 and response to HIV-1 and Neisseria gonorrhea.

Am J Reprod Immunol. 2013 Jan;69(1):41-51.

157

117. Wu MF, Chen ST, Hsieh SL. Distinct regulation of dengue virus-induced

inflammasome activation in human macrophage subsets. J Biomed Sci. 2013;20:36.

118. de Kruif MD, Setiati TE, Mairuhu AT, Koraka P, Aberson HA, Spek CA, et al.

Differential gene expression changes in children with severe dengue virus infections. PLoS

Negl Trop Dis. 2008;2(4):e215.

119. Morchang A, Yasamut U, Netsawang J, Noisakran S, Wongwiwat W, Songprakhon

P, et al. Cell death gene expression profile: role of RIPK2 in dengue virus-mediated

apoptosis. Virus Res. 2011 Mar;156(1-2):25-34.

120. Gandini M, Reis SR, Torrentes-Carvalho A, Azeredo EL, Freire Mda S, Galler R, et

al. Dengue-2 and yellow fever 17DD viruses infect human dendritic cells, resulting in an

induction of activation markers, cytokines and chemokines and secretion of different TNF-

alpha and IFN-alpha profiles. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2011 Aug;106(5):594-605.

121. Castro JE, Vado-Solis I, Perez-Osorio C, Fredeking TM. Modulation of cytokine and

cytokine receptor/antagonist by treatment with doxycycline and tetracycline in patients with

dengue fever. Clin Dev Immunol. 2011:370872.

122. Perry ST, Buck MD, Lada SM, Schindler C, Shresta S. STAT2 mediates innate

immunity to Dengue virus in the absence of STAT1 via the type I interferon receptor. PLoS

Pathog. 2011 Feb;7(2):e1001297.

123. Ferreira RC, Freitag DF, Cutler AJ, Howson JM, Rainbow DB, Smyth DJ, et al.

Functional IL6R 358Ala Allele Impairs Classical IL-6 Receptor Signaling and Influences

Risk of Diverse Inflammatory Diseases. PLoS Genet. 2013 Apr;9(4):e1003444.

124. Marin V, Montero-Julian FA, Gres S, Boulay V, Bongrand P, Farnarier C, et al. The

IL-6-soluble IL-6Ralpha autocrine loop of endothelial activation as an intermediate between

acute and chronic inflammation: an experimental model involving thrombin. J Immunol.

2001 Sep 15;167(6):3435-42.

125. Erta M, Quintana A, Hidalgo J. Interleukin-6, a major cytokine in the central nervous

system. Int J Biol Sci. 2012;8(9):1254-66.

126. Maneekan P, Leaungwutiwong P, Misse D, Luplertlop N. T helper (Th) 1 and Th2

cytokine expression profile in dengue and malaria infection using magnetic bead-based bio-

plex assay. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2013 Jan;44(1):31-6.

127. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Vierkant RA, Pankratz VS,

Jacobson RM, et al. Associations between single nucleotide polymorphisms and haplotypes

in cytokine and cytokine receptor genes and immunity to measles vaccination. Vaccine.

2011 Oct 19;29(45):7883-95.

128. Loeb M. Genetic susceptibility to west nile virus and dengue. Public Health

Genomics. 2013;16(1-2):4-8.

129. Moumad K, Lascorz J, Bevier M, Khyatti M, Ennaji MM, Benider A, et al. Genetic

Polymorphisms in Host Innate Immune Sensor Genes and the Risk of Nasopharyngeal

Carcinoma in North Africa. G3 (Bethesda). 2013 Apr 5.

130. Yang HY, Lee HS, Lee CH, Fang WH, Chen HC, Salter DM, et al. Association of a

functional polymorphism in the promoter region of TLR-3 with osteoarthritis: a two-stage

case-control study. J Orthop Res. 2012 May;31(5):680-5.

131. Sironi M, Biasin M, Cagliani R, Forni D, De Luca M, Saulle I, et al. A common

polymorphism in TLR3 confers natural resistance to HIV-1 infection. J Immunol. 2012 Jan

15;188(2):818-23.

158

132. Lamas JR, Rodriguez-Rodriguez L, Tornero-Esteban P, Villafuertes E, Hoyas J,

Abasolo L, et al. Alternative splicing and proteolytic rupture contribute to the generation of

soluble IL-6 receptors (sIL-6R) in rheumatoid arthritis. Cytokine. 2013 Mar;61(3):720-3.

133. Reich D, Patterson N, Ramesh V, De Jager PL, McDonald GJ, Tandon A, et al.

Admixture mapping of an allele affecting interleukin 6 soluble receptor and interleukin 6

levels. Am J Hum Genet. 2007 Apr;80(4):716-26.

134. Rose-John S. IL-6 trans-signaling via the soluble IL-6 receptor: importance for the

pro-inflammatory activities of IL-6. Int J Biol Sci. 2012;8(9):1237-47.

135. Harapan Harapan JKF, Nur Wahyuniati, Jay R. Anand, Lavanya Nambaru, Kurnia

F. Jamil. Non-HLA gene polymorphisms and their implications on dengue virus infection.

The Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 2013;14(1):1-11.

136. Woo P, Humphries SE. IL-6 polymorphisms: a useful genetic tool for inflammation

research? J Clin Invest. 2013 Apr 1;123(4):1413-4.

137. Moreira ST CD, Visentainer JE, Fonzar UJV, Moliterno RA. The Possible Protective

Role of the Il6-174 GC Genotype in Dengue Fever. The Open Tropical Medicine Journal.

2008;1:87-91.

138. He JR, Chen LJ, Su Y, Cen YL, Tang LY, Yu DD, et al. Joint effects of Epstein-Barr

virus and polymorphisms in interleukin-10 and interferon-gamma on breast cancer risk. J

Infect Dis. 2011 Jan 1;205(1):64-71.

139. Guzman MG, Kouri G. Dengue haemorrhagic fever integral hypothesis: confirming

observations, 1987-2007. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008 Jun;102(6):522-3.

140. Hss AS, Koh MT, Tan KK, Chan LG, Zhou L, Bouckenooghe A, et al. Safety and

immunogenicity of a tetravalent dengue vaccine in healthy children aged 2-11 years in

Malaysia: a randomized, placebo-controlled, Phase III study. Vaccine. 2013 Dec

2;31(49):5814-21.

141. Mathew A, Rothman AL. Understanding the contribution of cellular immunity to

dengue disease pathogenesis. Immunol Rev. 2008 Oct;225:300-13.

142. Garcia G, Sierra B, Perez AB, Aguirre E, Rosado I, Gonzalez N, et al. Asymptomatic

dengue infection in a Cuban population confirms the protective role of the RR variant of the

FcgammaRIIa polymorphism. Am J Trop Med Hyg. 2010 Jun;82(6):1153-6.

143. Shekhar KC, Huat OL. Epidemiology of dengue/dengue hemorrhagic fever in

Malaysia--a retrospective epidemiological study. 1973-1987. Part II: Dengue fever (DF).

Asia Pac J Public Health. 1992;6(3):126-33.

144. Shekhar KC, Huat OL. Epidemiology of dengue/dengue hemorrhagic fever in

Malaysia--a retrospective epidemiological study 1973-1987. Part I: Dengue hemorrhagic

fever (DHF). Asia Pac J Public Health. 1992;6(2):15-25.

145. Coffey LL, Mertens E, Brehin AC, Fernandez-Garcia MD, Amara A, Despres P, et

al. Human genetic determinants of dengue virus susceptibility. Microbes Infect. 2009

Feb;11(2):143-56.

146. Moi ML, Lim CK, Takasaki T, Kurane I. Involvement of the Fc gamma receptor IIA

cytoplasmic domain in antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Gen

Virol. 2010 Jan;91(Pt 1):103-11.

147. Loke H, Bethell D, Phuong CX, Day N, White N, Farrar J, et al. Susceptibility to

dengue hemorrhagic fever in vietnam: evidence of an association with variation in the

vitamin d receptor and Fc gamma receptor IIa genes. Am J Trop Med Hyg. 2002

Jul;67(1):102-6.

159

148. Silva LK, Blanton RE, Parrado AR, Melo PS, Morato VG, Reis EA, et al. Dengue

hemorrhagic fever is associated with polymorphisms in JAK1. Eur J Hum Genet. 2010

Nov;18(11):1221-7.

149. Gravel S, Zakharia F, Moreno-Estrada A, Byrnes JK, Muzzio M, Rodriguez-Flores

JL, et al. Reconstructing Native American migrations from whole-genome and whole-exome

data. PLoS Genet. 2013 Dec;9(12):e1004023.

150. Abecasis GR, Auton A, Brooks LD, DePristo MA, Durbin RM, Handsaker RE, et al.

An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature. 2012 Nov

1;491(7422):56-65.

151. Bedoya G, Montoya P, Garcia J, Soto I, Bourgeois S, Carvajal L, et al. Admixture

dynamics in Hispanics: a shift in the nuclear genetic ancestry of a South American

population isolate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 9;103(19):7234-9.

152. Bryc K, Velez C, Karafet T, Moreno-Estrada A, Reynolds A, Auton A, et al.

Colloquium paper: genome-wide patterns of population structure and admixture among

Hispanic/Latino populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 11;107 Suppl 2:8954-61.

153. Wang S, Ray N, Rojas W, Parra MV, Bedoya G, Gallo C, et al. Geographic patterns

of genome admixture in Latin American Mestizos. PLoS Genet. 2008 Mar;4(3):e1000037.

154. Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV. Rapid detection and

typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase

chain reaction. J Clin Microbiol. 1992 Mar;30(3):545-51.

155. Harris E, Roberts TG, Smith L, Selle J, Kramer LD, Valle S, et al. Typing of dengue

viruses in clinical specimens and mosquitoes by single-tube multiplex reverse transcriptase

PCR. J Clin Microbiol. 1998 Sep;36(9):2634-9.

156. Shriver MD, Parra EJ, Dios S, Bonilla C, Norton H, Jovel C, et al. Skin

pigmentation, biogeographical ancestry and admixture mapping. Hum Genet. 2003

Apr;112(4):387-99.

157. Molokhia M, Hoggart C, Patrick AL, Shriver M, Parra E, Ye J, et al. Relation of risk

of systemic lupus erythematosus to west African admixture in a Caribbean population. Hum

Genet. 2003 Mar;112(3):310-8.

158. Bandelt HJ, Forster P, Rohl A. Median-joining networks for inferring intraspecific

phylogenies. Mol Biol Evol. 1999 Jan;16(1):37-48.

159. Perkins JR, Lees J, Antunes-Martins A, Diboun I, McMahon SB, Bennett DL, et al.

PainNetworks: A web-based resource for the visualisation of pain-related genes in the

context of their network associations. Pain. 2013 Sep 11.

160. Xavier-Carvalho C, Gibson G, Brasil P, Ferreira RX, de Souza Santos R, Goncalves

Cruz O, et al. Single nucleotide polymorphisms in candidate genes and dengue severity in

children: A case-control, functional and meta-analysis study. Infect Genet Evol. 2013

Dec;20:197-205.

161. Ueta M, Tokunaga K, Sotozono C, Sawai H, Tamiya G, Inatomi T, et al. HLA-

A*0206 with TLR3 polymorphisms exerts more than additive effects in Stevens-Johnson

syndrome with severe ocular surface complications. PLoS One. 2012;7(8):e43650.

162. Garred P, Larsen F, Madsen HO, Koch C. Mannose-binding lectin deficiency--

revisited. Mol Immunol. 2003 Sep;40(2-4):73-84.

163. Brown KS, Ryder SD, Irving WL, Sim RB, Hickling TP. Mannan binding lectin and

viral hepatitis. Immunol Lett. 2007 Jan 15;108(1):34-44.

160

164. Acioli-Santos B, Segat L, Dhalia R, Brito CA, Braga-Neto UM, Marques ET, et al.

MBL2 gene polymorphisms protect against development of thrombocytopenia associated

with severe dengue phenotype. Hum Immunol. 2008 Feb;69(2):122-8.

165. Rabellino EM, Nachman RL, Williams N, Winchester RJ, Ross GD. Human

megakaryocytes. I. Characterization of the membrane and cytoplasmic components of

isolated marrow megakaryocytes. J Exp Med. 1979 Jun 1;149(6):1273-87.

166. La Russa VF, Innis BL. Mechanisms of dengue virus-induced bone marrow

suppression. Baillieres Clin Haematol. 1995 Mar;8(1):249-70.

167. Huang KJ, Li SY, Chen SC, Liu HS, Lin YS, Yeh TM, et al. Manifestation of

thrombocytopenia in dengue-2-virus-infected mice. J Gen Virol. 2000 Sep;81(Pt 9):2177-82.

168. Moreira LO, Zamboni DS. NOD1 and NOD2 Signaling in Infection and

Inflammation. Front Immunol. 2012;3:328.

169. Kupcinskas J, Wex T, Bornschein J, Selgrad M, Leja M, Juozaityte E, et al. Lack of

association between gene polymorphisms of Angiotensin converting enzyme, Nod-like

receptor 1, Toll-like receptor 4, FAS/FASL and the presence of Helicobacter pylori-induced

premalignant gastric lesions and gastric cancer in Caucasians. BMC Med Genet.

2011;12:112.

170. Hofner P, Gyulai Z, Kiss ZF, Tiszai A, Tiszlavicz L, Toth G, et al. Genetic

polymorphisms of NOD1 and IL-8, but not polymorphisms of TLR4 genes, are associated

with Helicobacter pylori-induced duodenal ulcer and gastritis. Helicobacter. 2007

Apr;12(2):124-31.

171. Zhang FR, Huang W, Chen SM, Sun LD, Liu H, Li Y, et al. Genomewide

association study of leprosy. N Engl J Med. 2009 Dec 31;361(27):2609-18.

172. Leven RM, Clark B, Tablin F. Effect of recombinant interleukin-6 and

thrombopoietin on isolated guinea pig bone marrow megakaryocyte protein phosphorylation

and proplatelet formation. Blood Cells Mol Dis. 1997 Aug;23(2):252-68.

173. Chen K, Min H, Wu X, Zhu X, Li Z, Li H, et al. JAK1 gene polymorphisms are

associated with the outcomes of hepatitis B virus infection, but not with alpha interferon

therapy response in a Han Chinese population. Genet Test Mol Biomarkers. 2012

Oct;16(10):1206-10.

174. Gadina M, Hilton D, Johnston JA, Morinobu A, Lighvani A, Zhou YJ, et al.

Signaling by type I and II cytokine receptors: ten years after. Curr Opin Immunol. 2001

Jun;13(3):363-73.

175. Kurylowicz A, Miskiewicz P, Bar-Andziak E, Nauman J, Bednarczuk T. Association

of polymorphism in genes encoding kappaB inhibitors (IkappaB) with susceptibility to and

phenotype of Graves' disease: a case-control study. Thyroid Res. 2009;2(1):10.

176. Wurfel MM, Gordon AC, Holden TD, Radella F, Strout J, Kajikawa O, et al. Toll-

like receptor 1 polymorphisms affect innate immune responses and outcomes in sepsis. Am

J Respir Crit Care Med. 2008 Oct 1;178(7):710-20.

177. Chaturvedi UC, Agarwal R, Elbishbishi EA, Mustafa AS. Cytokine cascade in

dengue hemorrhagic fever: implications for pathogenesis. FEMS Immunol Med Microbiol.

2000 Jul;28(3):183-8.

178. Barcellini W, Rizzardi GP, Poli G, Tambussi G, Velati C, Meroni PL, et al.

Cytokines and soluble receptor changes in the transition from primary to early chronic HIV

type 1 infection. AIDS Res Hum Retroviruses. 1996 Mar 1;12(4):325-31.

161

179. De Benedetti F, Massa M, Pignatti P, Albani S, Novick D, Martini A. Serum soluble

interleukin 6 (IL-6) receptor and IL-6/soluble IL-6 receptor complex in systemic juvenile

rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 1994 May;93(5):2114-9.

180. Van Zaanen HC, Lokhorst HM, Aarden LA, Rensink HJ, Warnaar SO, Van Oers

MH. Blocking interleukin-6 activity with chimeric anti-IL6 monoclonal antibodies in

multiple myeloma: effects on soluble IL6 receptor and soluble gp130. Leuk Lymphoma.

1998 Nov;31(5-6):551-8.

181. Rodriguez-Ramos C, Galan F, Diaz F, Elvira J, Martin-Herrera L, Giron-Gonzalez

JA. Expression of proinflammatory cytokines and their inhibitors during the course of

spontaneous bacterial peritonitis. Dig Dis Sci. 2001 Aug;46(8):1668-76.

182. Stone K, Woods E, Szmania SM, Stephens OW, Garg TK, Barlogie B, et al.

Interleukin-6 receptor polymorphism is prevalent in HIV-negative Castleman Disease and is

associated with increased soluble interleukin-6 receptor levels. PLoS One.

2013;8(1):e54610.

183. Fernandez-Real JM, Broch M, Vendrell J, Richart C, Ricart W. Interleukin-6 gene

polymorphism and lipid abnormalities in healthy subjects. J Clin Endocrinol Metab. 2000

Mar;85(3):1334-9.

184. Pinto LM, Oliveira SA, Braga EL, Nogueira RM, Kubelka CF. Increased pro-

inflammatory cytokines (TNF-alpha and IL-6) and anti-inflammatory compounds

(sTNFRp55 and sTNFRp75) in Brazilian patients during exanthematic dengue fever. Mem

Inst Oswaldo Cruz. 1999 May-Jun;94(3):387-94.

185. Rausch SM, Clark MM, Patten C, Liu H, Felten S, Li Y, et al. Relationship between

cytokine gene single nucleotide polymorphisms and symptom burden and quality of life in

lung cancer survivors. Cancer. 2010 Sep 1;116(17):4103-13.

186. Woodson SE, Freiberg AN, Holbrook MR. Coagulation factors, fibrinogen and

plasminogen activator inhibitor-1, are differentially regulated by yellow fever virus infection

of hepatocytes. Virus Res. 2013 Apr 29.

187. Longo CL, Brasil P, Espindola OD, Leite AC, Nogueira RM, Lupi O, et al. Dengue

fever and human T-cell lymphotropic virus type 1 infection. Int J Infect Dis. 2013 Mar 16.

188. Alagarasu K, Mulay AP, Singh R, Gavade VB, Shah PS, Cecilia D. Association of

HLA-DRB1 and TNF genotypes with dengue hemorrhagic fever. Hum Immunol. 2013

May;74(5):610-7.

189. Morales-Garcia G, Falfan-Valencia R, Garcia-Ramirez RA, Camarena A, Ramirez-

Venegas A, Castillejos-Lopez M, et al. Pandemic influenza A/H1N1 virus infection and

TNF, LTA, IL1B, IL6, IL8, and CCL polymorphisms in Mexican population: a case-control

study. BMC Infect Dis. 2012;12:299.

190. da Silva Santos S, Clark TG, Campino S, Suarez-Mutis MC, Rockett KA,

Kwiatkowski DP, et al. Investigation of host candidate malaria-associated risk/protective

SNPs in a Brazilian Amazonian population. PLoS One. 2012;7(5):e36692.

191. Mestan J, Digel W, Mittnacht S, Hillen H, Blohm D, Moller A, et al. Antiviral

effects of recombinant tumour necrosis factor in vitro. Nature. 1986 Oct 30-Nov

5;323(6091):816-9.

192. Chen HC, Hofman FM, Kung JT, Lin YD, Wu-Hsieh BA. Both virus and tumor

necrosis factor alpha are critical for endothelium damage in a mouse model of dengue virus-

induced hemorrhage. J Virol. 2007 Jun;81(11):5518-26.

162

193. Tsai TT, Chuang YJ, Lin YS, Wan SW, Chen CL, Lin CF. An emerging role for the

anti-inflammatory cytokine interleukin-10 in dengue virus infection. J Biomed Sci.

2013;20:40.

194. Puthothu B, Krueger M, Forster J, Heinze J, Weckmann M, Heinzmann A.

Interleukin (IL)-18 polymorphism 133C/G is associated with severe respiratory syncytial

virus infection. Pediatr Infect Dis J. 2007 Dec;26(12):1094-8.

195. Li Y, Shi Y, Chen J, Cai B, Ying B, Wang L. Association of polymorphisms in

interleukin-18 and interleukin-28B with hepatitis B recurrence after liver transplantation in

Chinese Han population. Int J Immunogenet. 2012 Aug;39(4):346-52.

196. Han M, Yue J, Lian YY, Zhao YL, Wang HX, Liu LR. Relationship between single

nucleotide polymorphism of interleukin-18 and susceptibility to pulmonary tuberculosis in

the Chinese Han population. Microbiol Immunol. 2011 Jun;55(6):388-93.

197. Song W, Wilson CM, Allen S, Wang C, Li Y, Kaslow RA, et al. Interleukin 18 and

human immunodeficiency virus type I infection in adolescents and adults. Clin Exp

Immunol. 2006 Apr;144(1):117-24.

198. Choi HJ, Dinarello CA, Shapiro L. Interleukin-18 inhibits human immunodeficiency

virus type 1 production in peripheral blood mononuclear cells. J Infect Dis. 2001 Sep

1;184(5):560-8.

199. Dinarello CA. Targeting interleukin 18 with interleukin 18 binding protein. Ann

Rheum Dis. 2000 Nov;59 Suppl 1:i17-20.

200. Truelove AL, Oleksyk TK, Shrestha S, Thio CL, Goedert JJ, Donfield SM, et al.

Evaluation of IL10, IL19 and IL20 gene polymorphisms and chronic hepatitis B infection

outcome. Int J Immunogenet. 2008 Jun;35(3):255-64.

201. Abhimanyu, Mangangcha IR, Jha P, Arora K, Mukerji M, Banavaliker JN, et al.

Differential serum cytokine levels are associated with cytokine gene polymorphisms in north

Indians with active pulmonary tuberculosis. Infect Genet Evol. 2011 Jul;11(5):1015-22.

202. Figueiredo CA, Barreto ML, Alcantara-Neves NM, Rodrigues LC, Cooper PJ, Cruz

AA, et al. Coassociations between IL10 polymorphisms, IL-10 production, helminth

infection, and asthma/wheeze in an urban tropical population in Brazil. J Allergy Clin

Immunol. 2012 Jun;131(6):1683-90.

203. Malavige GN, Ogg GS. T cell responses in dengue viral infections. J Clin Virol.

2013 Dec;58(4):605-11.

204. Van Dyke AL, Cote ML, Wenzlaff AS, Land S, Schwartz AG. Cytokine SNPs:

Comparison of allele frequencies by race and implications for future studies. Cytokine. 2009

May;46(2):236-44.

205. Pullat J, Fleischer R, Becker N, Beier M, Metspalu A, Hoheisel JD. Optimization of

candidate-gene SNP-genotyping by flexible oligonucleotide microarrays; analyzing

variations in immune regulator genes of hay-fever samples. BMC Genomics. 2007;8:282.

206. Wang L, Chen RF, Liu JW, Lee IK, Lee CP, Kuo HC, et al. DC-SIGN (CD209)

Promoter -336 A/G polymorphism is associated with dengue hemorrhagic fever and

correlated to DC-SIGN expression and immune augmentation. PLoS Negl Trop Dis.

2011;5(1):e934.

207. Steinman L. Mixed results with modulation of TH-17 cells in human autoimmune

diseases. Nat Immunol. 2009 Jan;11(1):41-4.

208. Liu L, Xu Y, Liu Z, Chen J, Zhang Y, Zhu J, et al. IL12 polymorphisms, HBV

infection and risk of hepatocellular carcinoma in a high-risk Chinese population. Int J

Cancer. 2011 Apr 1;128(7):1692-6.

163

209. Poland GA, Ovsyannikova IG, Jacobson RM. Immunogenetics of seasonal influenza

vaccine response. Vaccine. 2008 Sep 12;26 Suppl 4:D35-40.

210. Morris GA, Edwards DR, Hill PC, Wejse C, Bisseye C, Olesen R, et al. Interleukin

12B (IL12B) genetic variation and pulmonary tuberculosis: a study of cohorts from The

Gambia, Guinea-Bissau, United States and Argentina. PLoS One. 2011;6(2):e16656.

211. Amaya MP, Criado L, Blanco B, Gomez M, Torres O, Florez L, et al.

Polymorphisms of pro-inflammatory cytokine genes and the risk for acute suppurative or

chronic nonsuppurative apical periodontitis in a Colombian population. Int Endod J. 2013

Jan;46(1):71-8.

212. Zhang L, Prather D, Vanden Eng J, Crawford S, Kariuki S, ter Kuile F, et al.

Polymorphisms in genes of interleukin 12 and its receptors and their association with

protection against severe malarial anaemia in children in western Kenya. Malar J. 2010;9:87.

213. Dhiman N, Haralambieva IH, Kennedy RB, Vierkant RA, O'Byrne MM,

Ovsyannikova IG, et al. SNP/haplotype associations in cytokine and cytokine receptor genes

and immunity to rubella vaccine. Immunogenetics. 2010 Apr;62(4):197-210.

214. Li N, Zhu Q, Li Z, Han Q, Zhang G, Chen J, et al. IL17A gene polymorphisms,

serum IL-17A and IgE levels, and hepatocellular carcinoma risk in patients with chronic

hepatitis B virus infection. Mol Carcinog. 2012 Dec 31.

215. Peng R, Yue J, Han M, Zhao Y, Liu L, Liang L. The IL-17F sequence variant is

associated with susceptibility to tuberculosis. Gene. 2013 Feb 15;515(1):229-32.

216. Ocejo-Vinyals JG, de Mateo EP, Hoz MA, Arroyo JL, Aguero R, Ausin F, et al. The

IL-17 G-152A single nucleotide polymorphism is associated with pulmonary tuberculosis in

northern Spain. Cytokine. 2013 Oct;64(1):58-61.

217. Natividad A, Hull J, Luoni G, Holland M, Rockett K, Joof H, et al. Innate immunity

in ocular Chlamydia trachomatis infection: contribution of IL8 and CSF2 gene variants to

risk of trachomatous scarring in Gambians. BMC Med Genet. 2009;10:138.

218. Abu-Maziad A, Schaa K, Bell EF, Dagle JM, Cooper M, Marazita ML, et al. Role of

polymorphic variants as genetic modulators of infection in neonatal sepsis. Pediatr Res.

2010 Oct;68(4):323-9.

219. Loeffler J, Steffens M, Arlt EM, Toliat MR, Mezger M, Suk A, et al. Polymorphisms

in the genes encoding chemokine receptor 5, interleukin-10, and monocyte chemoattractant

protein 1 contribute to cytomegalovirus reactivation and disease after allogeneic stem cell

transplantation. J Clin Microbiol. 2006 May;44(5):1847-50.

220. Levine AJ, Singer EJ, Sinsheimer JS, Hinkin CH, Papp J, Dandekar S, et al. CCL3

genotype and current depression increase risk of HIV-associated dementia. Neurobehav HIV

Med. 2009 Nov;1:1-7.

221. Moutaftsi M, Brennan P, Spector SA, Tabi Z. Impaired lymphoid chemokine-

mediated migration due to a block on the chemokine receptor switch in human

cytomegalovirus-infected dendritic cells. J Virol. 2004 Mar;78(6):3046-54.

222. Kidd LR, Jones DZ, Rogers EN, Kidd NC, Beache S, Rudd JE, et al. Chemokine

Ligand 5 (CCL5) and chemokine receptor (CCR5) genetic variants and prostate cancer risk

among men of African Descent: a case-control study. Hered Cancer Clin Pract.

2012;10(1):16.

223. Lin GT, Tseng HF, Yang CH, Hou MF, Chuang LY, Tai HT, et al. Combinational

polymorphisms of seven CXCL12-related genes are protective against breast cancer in

Taiwan. OMICS. 2009 Apr;13(2):165-72.

164

224. Schoormans D, Radonic T, de Witte P, Groenink M, Azim D, Lutter R, et al. Mental

quality of life is related to a cytokine genetic pathway. PLoS One. 2012;7(9):e45126.

225. Schouten M, Wiersinga WJ, Levi M, van der Poll T. Inflammation, endothelium, and

coagulation in sepsis. J Leukoc Biol. 2008 Mar;83(3):536-45.

226. Green S, Rothman A. Immunopathological mechanisms in dengue and dengue

hemorrhagic fever. Curr Opin Infect Dis. 2006 Oct;19(5):429-36.

227. Kliks SC, Nimmanitya S, Nisalak A, Burke DS. Evidence that maternal dengue

antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am J

Trop Med Hyg. 1988 Mar;38(2):411-9.

228. Coornaert B, Carpentier I, Beyaert R. A20: central gatekeeper in inflammation and

immunity. J Biol Chem. 2009 Mar 27;284(13):8217-21.

229. Avirutnan P, Punyadee N, Noisakran S, Komoltri C, Thiemmeca S, Auethavornanan

K, et al. Vascular leakage in severe dengue virus infections: a potential role for the

nonstructural viral protein NS1 and complement. J Infect Dis. 2006 Apr 15;193(8):1078-88.

230. Maly MA, Tomasov P, Hajek P, Blasko P, Hrachovinova I, Salaj P, et al. The role of

tissue factor in thrombosis and hemostasis. Physiol Res. 2007;56(6):685-95.

231. Suharti C, van Gorp EC, Setiati TE, Dolmans WM, Djokomoeljanto RJ, Hack CE, et

al. The role of cytokines in activation of coagulation and fibrinolysis in dengue shock

syndrome. Thromb Haemost. 2002 Jan;87(1):42-6.

232. Kurane I. Dengue hemorrhagic fever with special emphasis on immunopathogenesis.

Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2007 Sep;30(5-6):329-40.

233. Long HT, Hibberd ML, Hien TT, Dung NM, Van Ngoc T, Farrar J, et al. Patterns of

gene transcript abundance in the blood of children with severe or uncomplicated dengue

highlight differences in disease evolution and host response to dengue virus infection. J

Infect Dis. 2009 Feb 15;199(4):537-46.

Evaluación del efecto de variantes en genes candidatos ... · candidatos sobre la enfermedad del...

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