EVOLUCIÓN DE RESISTENCIA A HERBICIDAS, DIAGNÓSTICO Y MANEJO EN MALEZAS DEL ARROZ

Albert Fischer1 y Bernal E. Valverde2

Resumen

El monocultivo de arroz, la elevada dependencia en el control químico de malezas, y el uso repetido de un mismo tipo de herbicidas han conducido a la evolución de resistencia en las poblaciones de malezas causando pérdidas de rendimiento e incrementando los costos y el riesgo ambiental. Los herbicidas son herramientas esenciales cuyo empleo debe racionalizarse. Su uso repetido selecciona genotipos capaces de sobrevivir y reproducirse luego de un tratamiento herbicida que normalmente controla a esa maleza. Existe resistencia cruzada cuando un biotipo de una maleza es resistente a más de un herbicida, debido a la presencia de un único mecanismo individual de resistencia. Por su parte, la resistencia múltiple describe aquellas situaciones en que los biotipos resistentes tienen dos o más mecanismos distintos de resistencia. Los factores que determinan la tasa de evolución de resistencia son: la proporción original de individuos (mutantes) resistentes, su fecundidad y persistencia en el banco de semillas del suelo, su adaptabilidad ecológica, el sistema de reproducción, la base genética de la resistencia y su modo de herencia, la toxicidad y residualidad del herbicida, así como la dosis empleada y su frecuencia de uso. La presión de selección a favor de biotipos resistentes se reduce incorporando otras medidas de control y usando secuencias o mezclas de herbicidas con diferente modo de acción y mecanismo de degradación. El uso de herbicidas debe combinarse con técnicas agronómicas. El empleo de semilla certificada libre de malezas, las inspecciones de campo y las pruebas de detección ayudan a limitar la dispersión de resistencia. El control de producción de semilla debe ser un objetivo fundamental en el manejo de la resistencia. Es necesario evitar por todos los medios la producción de semilla de las plantas que escapan al herbicida. La resistencia de tipo metabólico y la evolución de resistencia múltiple son ciertamente un desafío que requerirán estrategias creativas y enfatizan la necesidad de practicar un control integrado de malezas. Los modelos de predicción son un apoyo para la investigación y permiten el diseño y selección de programas de manejo integrado rentables. El manejo de la resistencia implica mantener un registro de las técnicas de control que se han empleado como base para el plan de acción futura; es pues una tarea de planificación a largo plazo y requiere el apoyo de programas educativos. Abstract

Rice monoculture, the high reliance on chemicals for weed control, and the repeated use of the same kind of herbicides has led to the evolution of herbicide resistance in weed populations. This has caused yield losses, increased costs, and has raised environmental concerns. Herbicide use must be rationalized in order to keep safe and essential tools for weed control. Repeated herbicide use can select genotypes able to survive and reproduce after treatment with an herbicide normally lethal to that weed. Cross-resistance exists when a biotype is resistant to more than one herbicide via a common resistance mechanism. Multiple resistance occurs when a biotype exhibits more than one mechanism of resistance towards different herbicides. Factors affecting the rate of resistance evolution are: the initial frequency of resistant (mutant) individuals, their fecundity and longevity in the soil reservoir, their ecological fitness, the reproduction mode, the genetic base and mode of inheritance of the resistant trait, the toxicity and residuality of the herbicide, and the herbicide dosage and frequency of use. This selection pressure in favor of herbicide-resistant weed biotypes can be reduced by using other means of weed control and by combining herbicides with different modes of action and plant detoxification pathways. A priority in resistance management is to avoid seed production and dispersal by resistant biotypes. Seed production by plants escaping herbicide treatment must be avoided by all possible means. The use of weed-free certified crop seed, field monitoring and detection tests help reduce the dispersal of herbicide-resistant biotypes. The evolution of metabolic and multiple resistance represents a challenge that will require creative management strategies and underscores the need for an integrated weed management approach. Models to predict the evolution of resistance are useful research tools

1 Plant Sciences Department, University of California, Davis, CA 95616, Estados Unidos de América; ajfischer@ucdavis.edu 2 The Royal Veterinary & Agricultural University, Weed Science, Agrovej 10, DK-2630 Taastrup, Dinamarca. bev@kvl.dk

and allow for the design and selection of profitable integrated weed management programs. The management of resistance requires keeping records of weed control techniques previously used as a basis for formulating future action plans, long-term planning and the support of educational programs are required. 1. Introducción

El control químico como única herramienta y el uso repetido de ciertos grupos de herbicidas ha

llevado inevitablemente a la aparición de malezas resistentes a herbicidas en muchos cultivos, así como en pasturas, sistemas perennes y en áreas no cultivadas. La resistencia complica el manejo de malezas e incrementa los costos de producción. También puede aumentar la carga ambiental de plaguicidas cuando las fallas de control incentivan el incremento de las dosis y del número de aplicaciones. Los herbicidas seguirán siendo componentes esenciales en el control de malezas, pero deberemos racionalizar su empleo para que la evolución de resistencia no nos prive de estas herramientas útiles. La evolución de resistencia es un proceso complejo cuyo manejo no puede conceptualizarse sin el análisis científico de los factores que la determinan. El cultivo del arroz presenta, en sus diversos ecosistemas, una gama tal de problemas que hacen de él un modelo apropiado para este capítulo que pretende analizar los factores determinantes de la evolución de resistencia, los criterios para detectarla, los mecanismos de resistencia, y aportar conceptos para su prevención y manejo. 2. Definiciones

Es importante tener clara la nomenclatura para designar a un grupo de plantas como resistente a herbicidas. En la literatura científica y en la comunicación oral es frecuente que los términos resistencia y tolerancia se usen indistintamente. En este capítulo hemos adoptado las definiciones presentadas por Valverde et al. (2000). La resistencia se define como la capacidad hereditaria natural de algunos biotipos dentro de una población para sobrevivir y reproducirse después del tratamiento con un herbicida que, bajo condiciones normales de empleo, controla efectivamente esa población de maleza. Es importante resaltar que la resistencia a uno o varios herbicidas es una característica hereditaria cuya transmisión a generaciones sucesivas de plantas depende de la naturaleza del gene o genes involucrados (dominancia, dominancia incompleta, recesividad) y que su aparición está relacionada con la presión de selección impuesta por el uso de los mismos herbicidas. La especie como tal es afectada por el herbicida aplicado a las dosis recomendadas; pero gracias a un proceso evolutivo (selección de individuos resistentes) grupos de plantas o biotipos sobreviven y completan su ciclo reproductivo a pesar de la aplicación del herbicida. La tolerancia es la capacidad hereditaria natural que tienen todas las poblaciones de una maleza para sobrevivir y reproducirse después del tratamiento con un herbicida. En este caso, la norma es que la especie como tal no es afectada por el herbicida de interés. La tolerancia no resulta de un proceso de selección por uso de herbicidas. En relación con los cultivos convencionales, la selectividad fisiológica (propiedad de un herbicida de afectar a las malezas sin producir daño al cultivo) está justamente asociada a la tolerancia del cultivo a tal producto. Un buen ejemplo de tolerancia es la que ofrece el cultivo del arroz al herbicida propanil. Cuando una población de plantas evoluciona resistencia a un herbicida es común encontrar que también lo hace a otros herbicidas. Existe resistencia cruzada cuando un biotipo de una maleza es resistente a más de un herbicida, debido a la presencia de un único mecanismo individual de resistencia. Existen biotipos de Echinochloa colona que evolucionaron resistencia a herbicidas ariloxi-fenoxi propanoicos como el fenoxaprop que exhiben resistencia cruzada a ciclohexanodionas como setoxidim. Frecuentemente la resistencia cruzada involucra a herbicidas que tienen el mismo modo de acción. En California existen biotipos de Cyperus difformis que son resistentes a la vez a bensulfurón-metilo, penoxsulam, e imazetapir; todos estos herbicidas son inhibidores de la enzima acetolactato sintetasa (ALS). El mecanismo de resistencia es el mismo en todos los casos y tiene que ver con el modo de acción de estos herbicidas conforme se discutirá más adelante. Por su parte, la resistencia múltiple describe aquellas situaciones en que los biotipos resistentes tienen dos o más mecanismos distintos de resistencia. En Centroamérica se han documentado biotipos de E. colona resistentes a fenoxaprop-etilo y propanil que, además, son resistentes a azimsulfurón. En algunos casos se ha confirmado que un biotipo resistente a un herbicida exhibe un aumento en la susceptibilidad a otros herbicidas con distinto modo de acción o de degradación, condición que se denomina resistencia cruzada negativa. No conocemos de ningún caso documentado de resistencia cruzada negativa en malezas asociadas al arroz.

Existen también cultivos resistentes a herbicidas y el arroz no es una excepción. Los cultivos resistentes pueden ser transgénicos, es decir, desarrollados mediante la transformación genética. En el caso del arroz, se han desarrollado variedades resistentes a los herbicidas glufosinato de amonio y glifosato. También se han desarrollado variedades resistentes a herbicidas mediante métodos convencionales (no transgénicos) como lo es el arroz resistente a herbicidas imidazolinonas que se comercializa con el nombre de Clearfield®. Con la siembra de cultivos resistentes a herbicidas también se abre la posibilidad de que malezas sexualmente compatibles con el cultivo adquieran resistencia a través del flujo de (trans)genes provenientes del cultivo. Tal sería el caso del arroz maleza (Oryza spp.) que por ser congénere o conespecífico con el arroz cultivado puede cruzarse con el cultivo y producir híbridos resistentes a herbicidas. 3. Historia de la incidencia de resistencia

El primer caso de resistencia a herbicidas (a la auxina sintética, 2,4-D) se informó en 1957 pero no fue sino hasta 1970, cuando se documentó la resistencia a triazinas en Senecio vulgaris, que la resistencia comenzó a ser reconocida como un problema de importancia agronómica y económica (Ryan (1970). A la fecha 65 especies de malezas han evolucionado resistencia a las triazinas y otros inhibidores de la fotosíntesis que actúan en el fotosistema II (Heap 2005). En el mundo hay confirmados 296 biotipos resistentes a herbicidas pertenecientes a 178 especies (107 dicotiledóneas y 71 monocotiledóneas). Dos grupos de herbicidas cuyos modos de acción son relativamente nuevos, es decir, aquellos que inhiben la enzima ALS y los inhibidores de la acetil coenzima-A carboxilasa (ACCasa) han contribuido a agravar el problema (Fig. 1). Existen 90 especies resistentes a herbicidas inhibidores de ALS y 34 especies resistentes a herbicidas inhibidores ACCasa (Heap 2005). Ambos grupos de herbicidas se emplean en arroz. Uno de los casos más controversiales en la actualidad es el de la resistencia al glifosato, la cual se ha documentado en 7 especies (Ambrosia artemisiifolia, Conyza bonariensis, C. canadensis, Eleusine indica, Lolium multiflorum, L. rigidum y Plantago lanceolata) en ningún caso en asocio con el cultivo del arroz. En el cultivo del arroz, la resistencia a herbicidas se ha presentado en prácticamente todos los agroecosistemas de importancia económica (Valverde & Itoh 2001). Los casos de resistencia a herbicidas en malezas asociadas al arroz comenzaron a documentarse en la literatura a principios de la década de los 90 y en la actualidad incluyen 31 especies. La resistencia a inhibidores de ALS, provocada principalmente por el uso generalizado de sulfonilureas, es la más frecuente en malezas del arroz, especialmente en Asia. Se conocen 20 especies de malezas resistentes a inhibidores de ALS; muchas de ellas son especies acuáticas cuyo control se basó fundamentalmente en el uso de bensulfurón. Varias especies de Echinochloa, principalmente E. colona y E. crus-galli engrosan la lista de casos de resistencia y modos de acción involucrados. Ambas especies luego de ser expuestas por muchos años al propanil dejaron de ser controladas eficazmente por dicho herbicida en varias regiones del mundo. Valverde et al. (2000) describen en detalle aspectos relacionados con la evolución y manejo de E. colona resistente a propanil en América Central. Especies de Echinochloa también evolucionaron resistencia a los herbicidas tiocarbamatos (tiobencarbo y molinato) y al butaclor (una cloroacetamida) empleados en su control. También se ha documentado resistencia a inhibidores de la ACCasa, principalmente fenoxaprop-etilo y cyhalofop. Ischaemum rugosum también exhibe resistencia a dichos herbicidas Colombia. Casi todas las especies de Echinochloa de importancia económica en el arroz también han evolucionado biotipos resistentes al herbicida auxínico quinclorac. Finalmente, algunos biotipos de malezas del arroz exhiben resistencia múltiple. Uno de los casos más importantes es el de E. phyllopogon resistente a fenoxaprop, cyhalofop, tiobencarbo, molinato, bispiribac, clomazone, y penoxsulam en California, el cual se discute más adelante.

4. Factores que determinan el riesgo de evolución de resistencia

Es difícil anticipar el nivel de resistencia que existirá en un predio, pero si comprendemos cuáles son los factores involucrados en la evolución de resistencia en una maleza, tendremos elementos para diseñar estrategias de manejo que nos permitan mitigar este proceso. 4.1. Factores relativos a la biología de la especie 4.1.1 Frecuencia original de resistencia. La resistencia resulta de un proceso evolutivo, dónde la selección impuesta por el uso repetido de un mismo tipo de herbicida incrementa las frecuencias de los alelos de resistencia y por lo tanto de los individuos resistentes en una población. Los alelos de resistencia resultan de mutaciones al azar y pueden estar presentes en una población incluso antes de que ésta haya sido expuesta a la acción de herbicidas. Las mutaciones ocurren continuamente en poblaciones naturales, pero su frecuencia es baja, y por eso la proporción original de individuos resistentes se estima que es de sólo uno en 104 a 106 individuos (Jasieniuk et al. 1996; Jander et al. 2003). Estas frecuencias reflejan el equilibrio entre la continua generación de alelos resistentes por mutación recurrente y la sobrevivencia de los individuos que los portan y, por lo tanto, son superiores a las tasas absolutas de mutación (Jasieniuk et al. 1996). No existen pruebas claras de que tales mutaciones sean inducidas por la acción tóxica de algún herbicida. La frecuencia inicial de resistencia es uno de los factores que determinan el número de generaciones de selección necesarias para que una población alcance un nivel de resistencia problemático. La resistencia comienza a advertirse en el campo cuando hay más de un 30% de individuos resistentes en la población de cierta maleza. 4.1.2. Fecundidad. Estas frecuencias originales de resistencia son suficientes como para asegurar que encontraremos individuos resistentes en un predio cuando las densidades de infestación son altas y, especialmente, si se trata de especies que producen mucha semilla y logran más de una generación reproductiva por año. 4.1.3. Persistencia del banco de semillas. Si un herbicida elimina todos los individuos susceptibles dejando unos pocos sobrevivientes resistentes capaces de producir semilla, la frecuencia de individuos resistentes presentes al ciclo siguiente dependerá de cuánta semilla resistente se produjo y de la cantidad de semillas susceptibles que existan en el reservorio de semillas del suelo. Los individuos susceptibles que emerjan a partir del banco de semillas del suelo “diluirán” la frecuencia de individuos resistentes que provienen de la semilla producida por los sobrevivientes del ciclo anterior. Este efecto

de dilución será más prolongado y relevante en especies cuyas semillas tengan latencia y considerable longevidad en el suelo (como es el caso de muchas especies con semillas de tegumentos gruesos). Por el contrario, serán las especies que produzcan semilla de corta latencia, o sin ella, y con poca longevidad en el suelo las que más rápido incrementen su frecuencia de individuos resistentes con el uso repetido del herbicida. Tal característica es frecuente en las especies de Echinochloa que han evolucionado resistencia a diversos herbicidas en muchos ecosistemas de arroz. 4.1.4. Adaptabilidad ecológica. Las frecuencias iniciales de individuos resistentes tenderán a ser más bajas si la mutación que confiere resistencia tiene un efecto pleiotrópico sobre el éxito ecológico de esos individuos (medido como el tamaño final de su descendencia establecida). Esta merma de adaptabilidad ecológica o fitness se ha detectado claramente en varios biotipos resistentes a triazinas (herbicidas que inhiben el fotosistema II) (Gressel & Segel 1990) debido a que la mutación que confiere resistencia reduce la eficiencia de transferencia de electrones hacia la plastoquinona en la fase lumínica de la fotosíntesis y por lo tanto afecta el rendimiento cuántico en la fijación fotosintética del CO2. Así, las plantas resistentes son más débiles, con menores tasas de crecimiento y niveles de fecundidad que las normales (susceptibles). Sin embargo, esta reducción de fitness, casi no se ha detectado de forma consistente para otros herbicidas. Es posible que las diferencias entre biotipos susceptibles y resistentes a otros herbicidas sean más sutiles y requieran métodos más precisos para su detección. La evolución de resistencia a herbicidas inhibidores de la enzima ALS suele ser rápida y se ha notado que la frecuencia original de individuos resistentes en poblaciones no tratadas es comparativamente alta. Es posible que a esto contribuya el hecho de que la resistencia a inhibidores de la ALS no suele acarrear mayores desventajas en sobrevivencia y reproducción. 4.1.5. La base genética de la resistencia, su modo de herencia, y la forma de reproducción de las especies son aspectos relevantes en la evolución y dispersión de la resistencia. Su análisis es requisito para la conceptualización racional de pautas de mitigación. La resistencia de sitio activo (ver sección 5.) suele estar gobernada por el par de alelos de un gene mayor de origen nuclear. El alelo resistente puede ser dominante, semidominante, o recesivo. Ejemplo de gene dominante es la resistencia a paraquat en Erigeron canadensis (Moss 2002). La resistencia a inhibidores de la ALS y ACCasa suele involucrar genes nucleares dominantes o con dominancia incompleta. Los casos de resistencia bajo control de genes recesivos son muy raros; un ejemplo es la resistencia a trifluralina en Setaria viridis que está controlada por un par de alelos recesivos. La resistencia conferida por un gene dominante de origen nuclear se propagará rápidamente en las especies alógamas (de fecundación cruzada); la dispersión del polen contribuirá considerablemente al flujo genético de la resistencia en la población y a la dispersión de la resistencia hacia otras poblaciones. La fecundación cruzada no favorecerá la expresión y propagación de resistencia conferida por genes recesivos, cuya expresión estará oculta por las mayores frecuencias de heterocigotos. La resistencia gobernada por genes recesivos se propaga mejor en las especies autógamas tal como lo es Setaria viridis (Jasieniuk et al. 1996). En especies altamente autopolinizadas los alelos mutantes recesivos se propagan casi tan rápido como los dominantes (Jasieniuk et al. 1996). La resistencia a triazinas es un ejemplo de herencia materna (o citoplásmica) conferida por ADN del cloroplasto. Los cloroplastos se heredan en el óvulo materno, y por lo tanto este tipo de resistencia no se transfiere por polen, salvo en casos muy raros. El flujo genético que propague la resistencia ocurrirá por dispersión de semillas. La inmigración de genes de susceptibilidad provenientes de poblaciones vecinas o del banco de semillas no reducirá la tasa evolución de resistencia dado que no existe recombinación genética en este tipo de herencia. De forma similar, esto sirve para evaluar el riesgo de transferencia de genes de resistencia a partir de cultivos con resistencia genética a herbicidas. Si nuestro vecino tuviera un cultivo de maíz con resistencia genética de sitio activo a la atrazina, no correremos mayor riesgo de que este gen pueda transferirse a plantas de maíces silvestres. Sin embargo, si se tratara de resistencia de sitio activo a inhibidores de la ALS, este gene nuclear dominante o semidominante se propagaría rápidamente a poblaciones vecinas de maíces silvestres. Por esta misma razón, cuando se trata de malezas de polinización cruzada, la inmigración de polen resistente desde fincas vecinas es ciertamente un problema si la resistencia está controlada por genes nucleares dominantes. Con excepción de las triazinas, la resistencia a herbicidas está determinada por genes nucleares. La resistencia también puede ser poligénica, donde cada gen contribuye con un efecto menor. Varias mutaciones menores o amplificaciones pueden acumularse dando lugar a un incremento gradual en el nivel de resistencia de los individuos. Este tipo de control genético puede

aparecer cuando la resistencia es debida a una elevada capacidad metabólica para desintoxicar herbicidas (ver sección 5.). Según se indicó, la resistencia evolucionará rápidamente si resulta de una alteración del sitio activo que usualmente es controlada por herencia monogénica. Esta evolución se acelera cuando el herbicida es altamente fitotóxico (como es el caso de los inhibidores de la ALS) o se usa a una dosis elevada, dado que prácticamente todos los individuos sobrevivientes que pasen su descendencia a la próxima generación serán portadores del gene de resistencia (la presión de selección a favor de la resistencia será máxima). Por el contrario, dosis bajas o herbicidas poco letales permitirán que un mayor número de individuos susceptibles sobrevivan y produzcan semilla, lo que diluirá el avance de la selección por resistencia (baja presión de selección). Por lo tanto, una forma efectiva de retrasar la evolución de resistencia de sitio activo es emplear dosis bajas de herbicida que reducen la presión de selección. Pero la situación puede ser muy diferente si la resistencia está controlada por varios genes. En este caso, dosis bajas de herbicida capaces de matar al biotipo susceptible podrían permitir la supervivencia de individuos poseedores de algunos genes de resistencia parcial. Esos sobrevivientes podrían intercambiar y acumular genes de resistencia, o tendrían tiempo como para que algunos de esos genes con efectos menores se duplicaran o amplificasen. El resultado sería un aumento con el tiempo del nivel de resistencia individual de ciertos genotipos, cuya frecuencia se incrementará bajo selección del herbicida. La evolución de resistencia es considerablemente más lenta cuando está gobernada por varios genes, y su evolución podría prevenirse con dosis elevadas o herbicidas muy fitotóxicos empleados antes de que la mayoría de individuos haya tenido oportunidad de acumular suficientes alelos de resistencia como para sobrevivir al tratamiento herbicida. El empleo de herbicidas en sus dosis recomendadas no debería favorecer la resistencia poligénica. Pero la realidad es otra y los casos de resistencia metabólica (que probablemente estén bajo control de poligenes) abundan cada vez más. Entre otras cosas, es necesario tener en cuenta que las malezas no emergen todas al mismo tiempo y siempre hay plantas más grandes que otras al momento de la aplicación. Para estas plantas más grandes la dosis será subóptima y las que porten genes de resistencia marginal sobrevivirán. Algo similar ocurre con plantas que emergen de forma tardía a medida que la residualidad de herbicidas aplicados al suelo disminuye. La resistencia que se observa en Echinochloa phyllopogon y E. oryzoides en los arrozales de California es de tipo metabólico (ver sección 5.), probablemente involucrando diversas isoenzimas de detoxificación que pueden estar controladas por varios genes individuales y/o haber resultado de duplicaciones génicas sobre un mismo cromosoma. Esta resistencia evolucionó luego de décadas de uso de herbicidas tiocarbamatos cuya “ventana de aplicación” es estrecha, lo que lleva a que frecuentemente se usen de forma tardía. Estos herbicidas pueden absorberse desde el suelo, por lo que plantas de emergencia tardía estarán expuestas a niveles comparables a dosis bajas; la emergencia escalonada de estas especies es un hecho comprobado en los arrozales, sobretodo cuando los niveles de inundación no son constantes. Puede especularse que estos factores podrían haber contribuido a la evolución gradual de resistencia poligénica en las poblaciones de estas malezas según lo discutido anteriormente.

4.2.Factores relativos al herbicida y su uso

La presión de selección es el factor más importante que determina las tasas de evolución de

resistencia y se refiere a la proporción relativa de individuos resistentes y susceptibles que quedan luego de un tratamiento herbicida. La presión de selección impuesta resulta de:

a) Fuerte toxicidad del herbicida (la especie es muy susceptible) que determina una elevada capacidad de matar a todas las plantas susceptibles, dejando sólo individuos resistentes como sobrevivientes

b) Dosis elevada (por la misma razón anterior) c) Herbicidas con un único sitio de acción, dado que una única mutación en un gene mayor es

suficiente para conferir resistencia. Esta es una de las razones por las que los inhibidores de la ALS y los de la ACCasa son considerados herbicidas de riesgo elevado. La probabilidad de que ocurran al mismo tiempo varias mutaciones en diferentes sitios para conferir resistencia es mucho menor; tal es el caso de herbicidas con modos de acción complejo, los llamados herbicidas de “bajo riesgo”.

d) Prolongado efecto residual, puesto que la selección ejercida por más tiempo actúa sobre un mayor número de individuos lo que aumenta la probabilidad de seleccionar mutantes resistentes

e) Uso frecuente del herbicida que incrementa la probabilidad de seleccionar mutantes resistentes.

Por lo tanto, el empleo frecuente durante el ciclo del cultivo y en ciclos consecutivos (incluso con

otros cultivos) de herbicidas altamente eficaces con el mismo modo de acción (o que se detoxifiquen en la planta a través del mismo mecanismo bioquímico) favorece la proliferación de individuos genéticamente dotados para sobrevivir a su acción. Es por lo tanto muy importante conocer el modo de acción de los herbicidas para evitar su uso continuado Esto es válido incluso para los llamados herbicidas considerados de bajo riesgo como los tiocarbamatos, cuyo uso prolongado en California ha seleccionado biotipos resistentes a molinato y tiobencarbo en todas las especies de Echinochloa (E. phyllopogon, E. oryzoides y E. crus-galli) de importancia en arroz. Esto resalta la relevancia que tiene la presión de selección por uso repetido de un mismo tipo de herbicidas.

Las especies que tienen una germinación escalonada expondrán un mayor número de plantas a la acción de un herbicida si éste es persistente y la presión de selección será elevada. En cambio, si las plantas emergen de forma simultánea y el herbicida se aplica después de que éstas hayan emergido, el efecto residual no incrementará la presión de selección, dado que todas las plantas ya han sido expuestas; este sería el caso de herbicidas con acción foliar que además tengan efecto residual. En cuanto a la discusión sobre herencia monogénica y poligénica vs. dosis altas o bajas presentada anteriormente en la sección 4.1.5, lo cierto es que en general no se conocen a priori los tipos de control genético de resistencia existentes en una población. Por lo tanto, en términos prácticos lo más recomendable es emplear los herbicidas en las dosis que permitan obtener un control eficaz de las malezas para no favorecer la evolución de resistencia poligénica. Luego asegurarse de eliminar con otro herbicida para el cual no existe resistencia en ese lugar, o mediante una técnica cultural, a todas aquellas plantas que pudieran haber sobrevivido al tratamiento inicial. Por último, cabe mencionar que para muchos el uso de umbrales de infestación como estrategia de control con herbicidas no es aconsejable en lugares donde se ha diagnosticado resistencia. Esta técnica no sólo permite que individuos resistentes presentes entre aquellos cuyo nivel de infestación esté por debajo del umbral produzcan semilla, sino que además da lugar a que aquellos con resistencia marginal puedan acumular genes menores de resistencia poligénica por entrecruzamiento. 5. Mecanismos de resistencia

Las malezas se tornan resistentes a los herbicidas principalmente a causa de cambios moleculares en el sitio de acción del herbicida o debido al metabolismo acelerado o rápida degradación del herbicida en la planta. En unos pocos casos, en la resistencia interviene el transporte limitado o el “secuestro” del herbicida. Este mecanismo se ha propuesto para el paraquat. Cuando las malezas poseen resistencia múltiple, opera más de un mecanismo (por ejemplo, dos mutaciones independientes que afectan sitios de acción distintos). No elaboraremos más sobre mecanismos de resistencia aquí, pues esto ya ha sido ampliamente discutido por el Dr. De Prado en otra parte de esta publicación. 6. Detección y confirmación de la resistencia

El diagnóstico de la resistencia a herbicidas en el campo normalmente no se realiza sino después de que el agricultor presenta un reclamo ante la falta de eficacia del herbicida que aplicó. El agricultor a través de su conocimiento y experiencia anticipa el grado de control que obtendrá con el herbicida pero difícilmente se percata de la presencia de individuos resistentes hasta que justamente la pérdida de eficacia del herbicida es notoria. Al presentar su reclamo ante un agente de extensión o representante de ventas de la compañía proveedora de agroquímicos se inicia un debate del por qué el herbicida no cumplió con su cometido. El vendedor rara vez considerará como primera opción el hecho de que la población de la maleza sea resistente y más bien buscará razones de técnica de aplicación, estado de los equipos, condiciones del tiempo, oportunidad de la aplicación, calidad del agua y otras para justificar el pobre desempeño del herbicida. Tanto el técnico agrónomo como el productor deben valorar una serie de aspectos y contestar las preguntas pertinentes para sospechar de la resistencia, la cual deberá ser corroborada experimentalmente. 6.1. Preguntas claves en el diagnóstico de la resistencia

El diagnóstico apropiado no se puede realizar sin la debida visita al campo. El agricultor y la persona que aplicó debe estar presente para recabar la mayor cantidad de información posible. Para descartar que la ineficacia del herbicida se deba al producto propiamente se deben considerar las siguientes preguntas:

• ¿Se utilizó el herbicida recomendado para el control de la maleza de interés? • ¿Se encontraba el herbicida en su envase original y debidamente etiquetado? • ¿Estaba el herbicida almacenado en condiciones apropiadas y dentro de su vida útil? • ¿Presentaba el herbicida un aspecto normal en cuanto a su densidad y color?

La ineficacia del producto también puede deberse a que se aplicó una dosis incorrecta o con

equipo en mal estado o sin la debida calibración. La calidad de la aplicación se puede valorar contestando las siguientes preguntas:

• ¿El equipo empleado en la aplicación del herbicida estaba debidamente lavado y en buenas condiciones? El aplicador o el agricultor difícilmente le dará una respuesta negativa a esta interrogante, así que es importante verificar las condiciones en que se encuentra el equipo para inferir el tipo de cuidado y mantenimiento que se le brinda.

• ¿Se procedió a calibrar el equipo antes de realizar la aplicación? Si así fuere, es necesario verificar

las hojas de campo para constatar que se realizaron los cálculos apropiados de manera que la dosis asperjada fuera la correcta.

• ¿Se utilizó agua limpia para hacer la aplicación? En caso de no ser así, podría ser recomendable

tomar una muestra del agua empleada y verificar su contenido de sedimentos y el pH.

• ¿Se adicionaron los herbicidas o componentes de la mezcla en el orden apropiado? ¿Se agregó aceite agrícola o algún coadyuvante recomendado o requerido según la etiqueta?

• ¿Permitían las condiciones del terreno la aplicación homogénea del herbicida? En los terrenos

muy húmedos se dificulta el paso de los implementos agrícolas y el caminar, si se trata de una aplicación con bomba de mochila.

• ¿Se mantuvo la velocidad y presión durante toda la aplicación?

Las condiciones ambientales afectan la eficacia de los herbicidas. Es importante verificar bajo qué condiciones se realizó la aplicación.

• ¿Llovió durante la aplicación del herbicida o poco después?

• ¿Tenía el suelo las condiciones apropiadas de textura y humedad? La aplicación de herbicidas sobre suelo muy seco puede provocar una adsorción excesiva del producto. Por el contrario, en suelos saturados, el herbicida puede no adsorberse y perderse una gran cantidad por medio de la escorrentía o evaporación. Los suelos mal preparados, con terrones grandes no permiten la acción eficaz de herbicidas preemergentes como la pendimetalina.

• ¿Se realizó la aplicación con viento calmo o fuerte? Las pérdidas por deriva cuando la velocidad

del viento es elevada, especialmente si la aplicación es aérea, pueden ser cuantiosas. Dependiendo del herbicida y su formulación también podría ser importante considerar la temperatura a la cual se realizó la aspersión.

Las condiciones en que se encontraba el cultivo y la maleza también deben valorarse.

• ¿En qué estado de crecimiento se encontraba la maleza? Los herbicidas, en general, son más

eficaces cuando se aplican sobre plántulas. Algunos productos preemergentes tienen una actividad postemergente limitada. Por ejemplo, la eficacia de la pendimetalina se reduce severamente si el herbicida se aplica sobre plántulas de gramíneas que tienen tres o más hojas. Si el herbicida es estrictamente preemergente, la aplicación sobre plantas establecidas será ineficaz. También es importante considerar el estado de crecimiento de la maleza en relación con el cultivo. Si el cultivo ya ha empezado a cubrir el suelo con su follaje y la maleza se encuentra en estados iniciales de crecimiento, es posible que el cultivo retenga la mayor parte del herbicida postemergente. También puede darse el caso de que malezas que rebrotaron de

tejidos remanentes de la cosecha anterior y que se encuentran en un estado más avanzado de crecimiento que aquellas que provienen de semillas recién germinas, escapen al efecto del herbicida.

• ¿Qué densidad de maleza existía al momento de la aplicación y cómo era su distribución? Si las

densidades de la maleza son muy altas, podría ser necesario un ajuste (incremento) en la dosificación.

• ¿Se aplicaron otros agroquímicos poco tiempo antes o después de la aspersión del herbicida? Es

posible que ocurran incompatibilidades entre un agroquímico y el herbicida de interés si se aplican conjuntamente o inmediatamente antes o después del herbicida. El manejo de la fertilización también modifica la respuesta a los herbicidas.

El conocimiento del historial de empleo de herbicidas en el lote es de vital importancia para

valorar la posibilidad de que las poblaciones de malezas sean resistentes a los herbicidas.

• ¿Ha utilizado el mismo herbicida (ingrediente activo) o productos de la misma familia o familias fisiológicamente afines (que comparten el mismo modo de acción y/o detoxificación) para controlar la maleza? Como ya se discutió, el uso persistente de un mismo herbicida o de productos afines acrecienta la presión de selección.

• ¿Ha notado una merma paulatina en el grado de control obtenido con el mismo herbicida?

• ¿Ha tenido problemas de resistencia en otras malezas o en otras áreas de su finca? ¿Existen

malezas resistentes en áreas vecinas? Dependiendo de las respuestas obtenidas es importante complementar la información con preguntas acerca del alquiler de equipos de preparación de suelo y de cosecha así como de la fuente de semilla utilizada.

6.2. Inspección de campo

La verificación del grado de control en el campo es indispensable para dilucidar si estamos ante la posible presencia de una maleza resistente. Se debe llegar al campo con una mentalidad abierta y con ojo crítico. Debe ponerse atención a si las fallas de control siguen patrones definidos. Si hay escapes en un patrón riguroso puede sospecharse de la calidad de la aplicación. Por ejemplo, podría tratarse de la ausencia de traslape adecuado, el atascamiento de una boquilla, o la aplicación con la barra de aspersión a una distancia muy corta del suelo que propiciara dejar franjas sin tratar. Debe conocerse el espectro de acción del herbicida. La proliferación de una maleza puede deberse a que ella no es controlada por el herbicida (la especie es tolerante). Este ser el caso de un reclamo que se presenta a menudo después de la aplicación del bispiribac-sodio en virtud de la proliferación de Leptochloa spp. y Digitaria spp., especies que no son controladas por el producto. La ineficacia de algunos herbicidas, por ejemplo de los tiocarbamatos, puede deberse al “enriquecimiento” del suelo, es decir, a la degradación acelerada del herbicida por parte de las poblaciones de microorganismos del suelo. Si hay escapes, es importante mirar las malezas alrededor y determinar si están afectadas por el herbicida. Cuando el problema comienza es común encontrar plantas de la misma especie severamente afectadas por el herbicida al lado de otras de la misma edad y tamaño que no han sufrido daño en absoluto. La resistencia también puede manifestarse como la capacidad de rebrote de las plantas moderadamente afectadas. Por lo tanto, es importante que la visita al campo se haga en el momento oportuno. En condiciones más severas de presión de selección continua, es posible encontrarse un “monocultivo” de la maleza. Esto es indicación de que el problema es crítico. 6.3. Confirmación experimental de la resistencia

Valverde et al. (2000) presentan un capítulo detallado sobre cómo proceder para la detección de malezas resistentes. Las pruebas experimentales tienen diversos grados de complejidad y refinamiento dependiendo de la pregunta que se desea contestar. Si únicamente se desea verificar que la población es resistente, puede realizarse una aplicación en un área limitada del campo utilizando la dosis comercial y una o dos dosis superiores (por ejemplo, el doble y cuádruplo) más un testigo sin tratar. Una vez que los síntomas de toxicidad se desarrollan, se realiza una evaluación visual del daño. Si la

experiencia dicta que el herbicida controla bien la maleza a la dosis comercial y en esta prueba no se observan daños severos con las dosis altas, puede tenerse una sospecha fundada de que la población evolucionó resistencia. Una prueba de este tipo tiene la ventaja práctica de que podría permitir la aplicación oportuna de un herbicida alternativo, así como la suspensión de la aplicación del producto en otros predios donde se sospeche que las malezas puedan ser resistentes. Los análisis más elaborados requieren de la recolección de semilla de las plantas sospechosas de ser resistentes así como de otras que se sabe son susceptibles y que servirán de comparador de referencia. Con la semilla recolectada se procede a realizar bioanálisis en el invernadero (con plantas enteras) o en el laboratorio (con plántulas, tejidos, orgánulos o sistemas enzimáticos). El diagnóstico agronómico estándar se basa en bioanálisis con plantas enteras tratadas con dosis crecientes del herbicida, siguiendo un diseño experimental apropiado con un número razonable de dosis (preferiblemente cinco o más incluyendo el testigo sin herbicida) y repeticiones. Las comparaciones se hacen entre poblaciones susceptibles de referencia y aquellas de las que sospechamos resistencia. Una vez aplicado el herbicida bajo condiciones controladas y que los síntomas de fitotoxicidad se desarrollan, se procede a valorar la respuesta a dosis crecientes del producto (las dosis deben incrementarse según un multiplicador común). La medición que se emplea con más frecuencia es la del peso fresco o peso seco. Utilizando un modelo de regresión apropiado (Streibig et al. 1993) se procede a calcular la dosis del herbicida que causa una reducción del crecimiento equivalente a un 50%. A este valor se le denomina dosis de reducción media del crecimiento (RC50). Para verificar si la población en duda es resistente, se calcula la razón entre la RC50 de la población sospechosa y la de referencia. Al valor obtenido se le denomina índice de resistencia (IR). Si el IR es mayor de 2,0 se confirma que la población en estudio es resistente (Fig. 2).

El procedimiento de regresión puede realizarse con distintos paquetes estadísticos. Ritz &

Streibig (2005) han desarrollado un protocolo para este tipo de análisis, denominado DRC (dose response curve) utilizando un programa de cómputo de libre acceso; ambos pueden obtenerse de Internet1. Con base en los mismo principios se pueden realizar pruebas en cajas de petri poniendo semillas a germinar sobre agar en el que se ha incorporado el herbicida a varias dosis, usando tejidos vivos como trozos de hojas, hijos (macollas) de gramíneas recolectadas en el campo. Cuando se desea comparar los efectos fisiológicos del herbicida sobre plantas resistentes y susceptibles se pueden

realizar pruebas con extractos crudos, enzimas purificadas y hasta pruebas específicas de ADN si ya se conoce la mutación causante de la resistencia. Cualquiera sea el método que se utilice para diagnosticar la resistencia es importante tener un buen testigo o biotipo de referencia que sirva de comparador. Ante una falla en el campo y en ausencia de una prueba confirmatoria rápida, lo mejor es suponer que la población es resistente, evitar repetir la aplicación del herbicida y establecer prácticas de manejo apropiadas. 7. Prevención y manejo de la resistencia

La variabilidad genética inherente en las especies de malezas determina que cuando se emplea

repetidamente una misma técnica de control, aparezcan con el tiempo genotipos dotados de la capacidad adaptativa necesaria para sobrevivir y escapar al control. Esta es la base de la evolución de resistencia a herbicidas. Por lo tanto, a fin de prevenir o de retrasar la evolución de resistencia debemos reducir la presión de selección ejercida por el uso repetido de ciertos herbicidas, dado que este uso repetido es el factor más importante que determina la evolución de resistencia. El concepto básico es que si las plantas que sobreviven a un tratamiento herbicida pueden ser portadoras de genes de resistencia, éstas deben eliminarse mediante otra técnica de control diferente para evitar la proliferación de tales genotipos. Es necesario combinar técnicas para controlar esos escapes y proteger así la vida útil del herbicida. Por lo tanto, que la prevención y el manejo de la resistencia se basan en la implementación de un programa de manejo integrado de malezas donde se combine la prevención, el manejo agronómico y el control químico. Es importante inspeccionar periódicamente los predios para detectar la presencia de escapes y evaluar si existe una merma en la eficacia del control con respecto a años anteriores. En este sentido es importante establecer métodos eficaces de detección de resistencia. La inspección debe detectar manchones incipientes de malezas resistentes que pudieran ser eliminados manualmente en forma localizada o por métodos físicos o químicos. El manejo debe buscar todas las formas posibles para controlar plantas que escapen a un herbicida a fin de evitar la incorporación al suelo de semilla resistente. 1 http://www.bioassay.dk . 7.1. Prevención.

La principal tarea de prevención es el uso de semilla certificada libre de malezas. Lamentablemente, en muchos casos existen niveles de tolerancia en la semilla certificada que permiten una presencia mínima de semillas de ciertas malezas. Si la semilla certificada puede ser portadora de algunas semillas de una maleza resistente es necesario implementar medidas que permitan eliminar por completo tales tolerancias. En California, estudios genéticos demuestran que la distribución geográfica de E. phyllopogon se debe a la dispersión de semillas. Si bien se considera factible imponer la cero tolerancia a esta contaminación, aún persiste una tolerancia mínima a semillas de esta maleza en la semilla certificada de arroz. Tal como en el caso del arroz maleza (como el arroz rojo), es necesario evitar que el agricultor plante semilla del año anterior. Es importante también evitar la contaminación de los equipos agrícolas con semilla de malezas resistentes. La limpieza del equipo es esencial al pasar de un predio al otro. Esto suele ser crítico con el uso de cosechadoras contratadas. Se debe cosechar por último aquellos sectores de la finca en donde se haya detectado resistencia. 7.2. Manejo agronómico

El riesgo de resistencia es particularmente elevado en situaciones de monocultivo donde el uso de herbicidas no se complementa con técnicas alternativas de control. Buscaremos pues reducir la presión de selección por uso del herbicida utilizando además diferentes opciones no químicas de control. Estas técnicas individuales podrán proporcionar un control parcial, pero deberán ser capaces de complementar la acción de los herbicidas y suprimir aquellos genotipos que escapen a su aplicación. 7.2.1. Rotaciones. El monocultivo perpetúa un ecosistema favorable a determinadas malezas que se vuelven un problema crítico. El arroz, en sus diversas modalidades de cultivo, es frecuentemente sembrado en forma continua por lo que a él se han asociado malezas cuyos géneros se repiten en los ecosistemas de arroz en todo el mundo. El desarrollo de fuertes y pertinaces infestaciones obligan al uso repetido de herbicidas, lo que favorece la evolución de resistencia e incrementa la carga ambiental de plaguicidas. Además, el monocultivo determina que un cierto grupo de herbicidas se esté usando de

forma reiterada. La rotación del cultivo permitiría interrumpir el ciclo de muchas malezas problema, emplear otras técnicas de control y usar diferentes herbicidas. La rotación es frecuente en áreas de secano en Asia y en el arroz irrigado del sureste de EE.UU., pero no en América Latina o en California. La rotación de arroz con soya u otros cultivos ha sido útil en el manejo de E. crus-galli y E. colona resistente a propanil en Arkansas y en América Central. En Uruguay, el arroz es rotado con pasturas perennes y la incidencia de resistencia es extremadamente baja, dado que en las pasturas no se emplean herbicidas y éstas reducen la incorporación al suelo de semillas de malezas del arroz. 7.2.2. Siembra retrasada y labranza reducida. Esta es una técnica muy eficaz que se utiliza con frecuencia en el manejo del arroz maleza, y que puede adaptarse a las diversas modalidades de cultivo. Una vez preparado el suelo para la siembra se espera que una lluvia o riego auxiliar promueva la emergencia de las malezas. Las malezas se eliminan mediante labranza muy superficial o con un herbicida no selectivo como el glifosato, glufosinato, o paraquat previo a la siembra del arroz. Esa labor no selectiva eliminará malezas resistentes y gran parte de aquellas que de lo contrario hubieran emergido luego con el cultivo. Ciertas malezas suelen emerger en tandas sucesivas por lo que puede ser necesario repetir la operación. El caso ideal es cuando la siembra se hace sin remover el suelo, o con una remoción mínima como en el caso del cero laboreo o la labranza mínima, a fin de no promover la emergencia de nuevas malezas. Esta técnica implica un retraso en la siembra, lo que en climas templados puede requerir el empleo de variedades de arroz de ciclo corto y en áreas tropicales puede limitar la siembra oportuna debido a la humedad excesiva en el campo que no permite el ingreso de implementos agrícolas. 7.2.3. Sistemas de establecimiento. En California, donde el arroz prácticamente no se rota y el control de Echinochloa spp. resistente se ha vuelto extremadamente problemático, se están probando sistemas alternativos de instalación del cultivo. Fundamentalmente se busca combinar varios conceptos: a) la alternancia de establecimiento del cultivo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, b) el empleo de la técnica de siembra retardada, c) la no remoción del suelo para evitar traer a la superficie nueva semilla resistente desde el banco de semillas del suelo, y d) la introducción de herbicidas para los cuales no existe resistencia y que no pueden usarse bajo la práctica corriente de siembra en agua. Se ha visto que la siembra en agua tradicional (siembra de semilla pregerminada en terrenos inundados) se asocia con un espectro bien definido de malezas, el cual cambia drásticamente cuando se siembra sobre suelo seco (Fig. 3). De modo que si una especie problemática adquiere resistencia en un sistema de siembra anaeróbica, su incidencia puede disminuirse cambiando a un sistema de siembra en seco y viceversa. El empleo de la siembra retrasada usando glifosato fue exitosa tanto en sistemas convencionales de siembra en agua como en sistemas de siembra en seco y permitió reducir la incidencia de malezas en un 75 %. La siembra retardada en combinación con la labranza cero, redujo las malezas en un 90%. La siembra retardada, en la medida que reduce la infestación posterior de malezas, puede permitir una reducción en el empleo de herbicidas. Cuando el tratamiento de presiembra con glifosato se combinó con una siembra en agua sin laboreo y con el mantenimiento posterior de una lámina de agua permanente de 10 a 15 cm, se pudo llevar el cultivo a cosecha sin aplicación adicional de herbicida. Alternar la siembra anaérobica con una siembra en suelo seco permitió además usar pendimetalina que no está registrado en California para uso en arroz sembrado bajo agua pero que controla Echinochloa spp. resistente a otros herbicidas. La siembra retardada permite el uso de glifosato para el control de todas las especies resistentes. De modo que aunque la rotación del arroz con otros cultivos presentaba inconvenientes, se demostró que es posible obtener muchos de los beneficios de la rotación del cultivo cuando se rotan diferentes técnicas de establecimiento del cultivo que combinan los cuatro conceptos antes mencionados. Este se un ejemplo de integración de tácticas de manejo aplicado a las malezas resistentes en arroz. 7.2.4. Control de producción de semilla. Este debe ser un objetivo fundamental en el manejo de la resistencia. Es necesario evitar por todos los medios la producción de semilla de las plantas que escapan al herbicida. La detección de escapes es una tarea en la que no debe escatimarse esfuerzos. Las prácticas agronómicas deben complementar la acción de los herbicidas para minimizar las oportunidades de que plantas sobrevivientes se reproduzcan. La imposición de una lámina de inundación permanente en arroz irrigado es un elemento primordial, así como lo es el establecimiento de un cultivo denso y competitivo y el uso de variedades competitivas (ver más adelante). Al momento de la cosecha es frecuente encontrar malezas aun en estado vegetativo que pueden producir semilla si las condiciones de humedad y temperatura lo permiten. El enterrado o quema de rastrojos previa maduración de la semilla (en la medida en que sea posible o permitido) puede ser útil para retardar la

evolución de resistencia. Sin embargo, muchas especies de maleza ya han desgranado al tiempo de la cosecha. La quema del rastrojo puede reducir la viabilidad de semillas que yacen sobre la superficie del suelo, o incluso romper su latencia y permitir la eliminación posterior de plántulas.

En la práctica los resultados no siempre han sido demasiado exitosos y en muchas partes existen restricciones a la quema de rastrojos por razones ambientales. En California se ha visto que el enterrado del rastrojo posterior a la cosecha incorpora al suelo semillas de malezas. Esto hace que las infestaciones de Echinochloa spp. en la primavera siguiente sean muy elevadas. Cuando los rastrojos no se entierran y los campos permanecen con agua durante el invierno hay una merma significativa de semillas de Echinochloa por depredación que reduce mucho los niveles de infestación al año siguiente. La semilla es un propágulo que puede diseminar la resistencia sobre grandes áreas. Este es el caso de Echinochloa phyllopogon resistente en California, donde los biotipos ampliamente dispersos por los arrozales de ese estado están fuertemente emparentados genéticamente y son probablemente descendientes de un mismo genotipo que se ha dispersado a partir de una fuente original (Tsuji et al. 2003). Esto ha determinado que el control de la dispersión de semilla resistente sea un objetivo prioritario en el manejo de la resistencia en esta especie. 7.2.5. Competencia del cultivo. Estudios conducidos en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) con cultivares de riego y de secano, así como trabajos realizados en California (Fischer et al. 1997, Fischer et al. 2001, Gibson & Fischer 2004) demostraron que es posible obtener cultivares altamente productivos y con elevada capacidad de suprimir el crecimiento y la fecundidad de Echinochloa spp. y otras malezas; esto permite reducir la necesidad de aplicaciones reiteradas de herbicida . La capacidad competitiva del arroz está ligada a características de la planta relacionadas con la captura de luz, duración de ciclo y habilidad para aprovechar nutrimentos. Esta técnica se adecua a las prácticas normales del productor y no le representan un costo adicional. En muchos casos, particularmente en arroz irrigado, existe un período crítico durante el cual el arroz debe estar libre de malezas para no sufrir pérdida de rendimiento. A partir de la finalización de ese período crítico el arroz es capaz de suprimir el establecimiento de nuevas cohortes de malezas (Gibson et al. 2002, Fischer et al. 1993). Esto es fundamental para evitar la producción tardía de semillas de malezas y para reducir el número de aplicaciones de herbicidas. Es importante conocer este período crítico y proporcionar las condiciones de crecimiento que lo acorten. Una buena nivelación

del terreno que permita el establecimiento de una lámina de inundación permanente favorece la capacidad del arroz para suprimir el establecimiento de malezas. 7.2.6. Otras opciones. Condiciones de clima templado determinan bajas temperaturas del agua lo que permite mantener niveles significativos de oxígeno disuelto. Esto hace posible la siembra de arroz con semilla pregerminada sobre terrenos inundados. Una lámina de 10 a 15 cm de profundidad impide la emergencia de malezas importantes como Leptochloa spp y E. crus-galli; ésta última ha evolucionado resistencia a diversos herbicidas en muchos sistemas de arroz. Este tipo de siembra se practica en Australia, Chile, California y en zonas arroceras del Mediterráneo. En el trópico, la temperatura del agua es más elevada y el crecimiento microbiano agota considerablemente el oxígeno; no obstante estudios conducidos en el CIAT permitieron identificar genotipos con considerable tolerancia a la sumersión bajo condiciones tropicales. Investigaciones llevadas a cabo en el Instituto Internacional de Investigación sobre el Arroz (IRRI) en colaboración con investigadores del Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA) en Arkansas permitieron identificar cultivares alelopáticos de arroz con una elevada capacidad de suprimir el crecimiento de Echinochloa crus-galli y otras especies, ampliando así las oportunidades para un enfoque a nivel de germoplasma en el manejo integrado de malezas resistentes (Olofsdotter et al. 2002). 7.3. Uso de herbicidas

Lo más importante es evitar el uso repetido del herbicida a fin de reducir la presión de selección. Se busca combinar productos a fin de eliminar con un herbicida las plantas que escapen al otro y así retrasar la evolución de resistencia a ambos. El empleo de herbicidas alternativos será una forma de controlar la producción de semilla de las plantas que escapan al herbicida o que emergen tardíamente. Los herbicidas no selectivos pueden emplearse cuando las malezas sobrevivientes aparezcan en manchones más o menos discretos. 7.3.1. Tiene validez la alternancia y mezcla de herbicidas con diferente modo de acción? La recomendación de rigor es rotar o utilizar mezclas de herbicidas con diferentes modos de acción, tanto en las aplicaciones sucesivas dentro de un mismo ciclo, así como en los cultivos subsiguientes. Pero con la aparición de biotipos cuya elevada capacidad metabólica de desintoxicación les permite degradar diversos herbicidas con modos de acción diferentes, resulta claro que alternar únicamente modos de acción no es una medida suficiente para manejar resistencia. Se debería también alternar herbicidas que tengan rutas bioquímicas de degradación diferente. Esto es complicado, no sólo porque esta información no es de fácil acceso o es incompleta, sino porque además son muchos los herbicidas que se desintoxican a través de mecanismos metabólicos similares. Recordemos el caso mencionado anteriormente de las especies de Echinochloa de California capaces de oxidar una plétora de herbicidas a través de monoxidasas P450. Incluso herbicidas con estructuras químicas que aparentan ser muy diferentes en el papel son desintoxicados mediante reacciones bioquímicas similares. De todas formas rotar herbicidas sigue siendo un componente válido cómo parte del manejo integrado de resistencia. En primer lugar, porque es una forma efectiva de retrasar la evolución de resistencia de sitio activo. En segundo lugar, porque si bien las rutas de desintoxicación pueden implicar mecanismos metabólicos similares, como es el caso de monoxidación por enzimas P450 o la conjugación con glutatión mediada por glutatión-S-transferasas (GST), cada uno de estos mecanismos puede involucrar muchísimas isoenzimas con diversos grados de especificidad por los sustratos y de control genético diferente. Es decir, dos herbicidas pueden degradarse por monoxidación pero las isoenzimas P450 involucradas pueden ser diferentes y específicas para cada herbicida. Los herbicidas pueden alternarse o emplearse como mezclas de aplicación simultánea. La aplicación en secuencia es interesante pues además de controlar escapes también se controlan malezas de emergencia tardía y se previene la incorporación de sus semillas al reservorio del suelo previo a la cosecha. Sin embargo hay que tener en cuenta que el segundo herbicida ejercerá presión de selección por resistencia sobre estas últimas. Esto no ocurre con el empleo de mezclas cuando la acción de ambos herbicidas es simultánea. Ahora bien, si una población ya es resistente a un componente, la mezcla no protegerá de resistencia al segundo componente. Es importante que ambos herbicidas en la mezcla sean efectivos sobre la misma especie y que su persistencia o efecto residual sea similar. De este modo se cumple bien aquello de que “uno protege al otro”. Las diferencias en persistencia no son mayormente problemáticas si la mezcla se aplica una vez que todas las malezas han emergido. Lo ideal es comenzar aplicando una mezcla y luego, si es necesario controlar escapes o

nuevas malezas, hacerlo con otra mezcla diferente. ¿Es posible que la aplicación de tantos herbicidas pueda conducir a la acumulación de varios mecanismos de resistencia en un mismo individuo (resistencia múltiple)? Sí lo es. Pero si cada mecanismo involucra una mutación diferente, la coincidencia de todas las mutaciones tiene una probabilidad de ocurrencia muy baja. La utilización de varios herbicidas puede también acelerar la selección por resistencia metabólica si los mecanismos de degradación e isoenzimas responsables son comunes para los herbicidas involucrados. Esto es una posibilidad muy real si se tiene en cuenta que un único inhibidor de P450 (malatión) es capaz de bloquear la resistencia metabólica a herbicidas tan diferentes como penoxsulam, bispiribac-sódico, tiobencarbo y cihalofop-butilo en biotipos resistentes de E. phyllopogon en California, sugiriendo la existencia de mecanismos comunes. Estos son elementos suficientes para darnos cuenta de que el manejo de la resistencia no se logrará únicamente con base en el uso exclusivo de control químico, sino que se requiere un programa de manejo integrado que incorpore métodos de control opcionales. 7.3.2. Uso de agentes sinérgicos. Una estrategia muy útil en el manejo de resistencia con herbicidas es el uso de mezclas sinérgicas Un agente sinérgico puede no tener ningún efecto sobre la maleza, pero sí ser capaz de acrecentar o restablecer la acción del herbicida de modo que éste pueda controlar los biotipos resistentes, incluso a dosis menores que la recomendada. Además de lograrse el control de la maleza resistente, la reducción de la dosis del herbicida limita la presión de selección sobre la población. Los agentes sinérgicos a menudo inhiben selectivamente el mecanismo que utiliza la maleza para desintoxicar al herbicida (resistencia metabólica). A menudo el mecanismo selectividad en el arroz y el de resistencia en la maleza coinciden. De modo que el agente sinérgico debe inhibir la isoenzima responsable por la desintoxicación en la maleza pero no tener afinidad por la isoenzima que opera el mismo mecanismo en el arroz. Esto puede parecer un hecho fortuito y en buena medida lo es, pero afortunadamente en arroz tenemos dos exitosos ejemplos. Valverde et al. (2000) desarrollaron el empleo de piperofós y luego anilofós, ambos herbicidas organofosforados, en mezcla con propanil para quebrar la resistencia en E. colona. Como se explicó previamente, la resistencia a propanil es de origen metabólico debida a una elevada actividad de AAAsa en la maleza. Esta es la misma enzima que desintoxica al propanil en el arroz permitiendo su uso selectivo. Existen algunas diferencias entre la AAAsa del arroz y la de E. colona. La AAAsa del arroz tiene una mayor afinidad por el propanil que la de los biotipos resistentes y susceptibles de E. colona. Por esta razón, los agentes sinérgicos que actúan como inhibidores competitivos de la enzima podrían ser más eficaces en Echinochloa que en el arroz. Además, en el caso de los herbicidas piperofós y anilofós, el arroz posee la capacidad de metabolizarlos por lo cual son selectivos al cultivo. Las mismas mezclas funciona con E crus-galli resistente a propanil, pero los resultados son algo más erráticos, quizás debido a diferencias en las isoenzimas de ambas especies. De forma similar, en California, Fischer et al. (2004) desarrolló la mezcla de tiobencarbo con bispiribac-sódico para quebrar la resistencia a bispiribac en E. phyllopogon. A la dosis y época de aplicación empleada el tiobencarbo no tiene efecto ninguno sobre el crecimiento de la maleza, pero elimina la resistencia de ésta al bispiribac. La resistencia a bispiribac es también de tipo metabólico mediante actividad P450. El tiobencarbo puede ser un inhibidor de P450, pero lo interesante es que E. phyllopogon también es resistente a tiobencarbo debido a P450. El tiobencarbo pudiera estar actuando como sustrato trampa para la enzima evitando su acción sobre bispiribac. De todas formas tiene mayor especificidad por las isoenzimas presentes en la maleza que por las del arroz, pues el control se sinergiza sólo sobre E. phyllopogon sin incremento alguno en la fitotoxicidad al arroz. El tiobencarbo es metabolizado por el arroz. En ambos casos de sinergismo, tanto el propanil como el bispiribac-sódico se emplean en la mezcla con el agente sinérgico a dosis mucho menores que las dosis de campo recomendadas. El uso de herbicidas en el manejo de la resistencia requiere planificación. Es importante llevar registro de los herbicidas que se utilizaron en cada predio de la finca. Se deberá planear cuidadosamente el programa de uso de herbicidas para los años futuros en función de lo que se hizo en el pasado y de los resultados de las inspecciones y pruebas de detección. 7.3.3. Variedades de arroz resistentes a herbicidas no selectivos. Se ha desarrollado arroz transgénico con resistencia a glufosinato y a glifosato. Ambos son herbicidas no residuales y con bajo riesgo de evolución de resistencia que han dado excelentes resultados en el control de todas las malezas resistentes del arroz en California y en pruebas experimentales en otras localidades. Ambos herbicidas casi no son degradados por las plantas, por lo que las posibilidades de estar sujetos a la resistencia metabólica que se ha observado en las malezas del arroz es también remota. El arroz resistente a glufosinato tiene aprobación de uso en los EE.UU. y se espera se libere comercialmente en los próximos dos años; su siembra en otros países seguirá poco después, fundamentalmente para el

control de arroz maleza. El carácter no selectivo simplificará las operaciones del agricultor, y como son herbicidas de acción foliar se adaptan para el uso en siembra retardada y labranza cero. Sin embargo, algunos problemas pueden surgir con esta estrategia. En primer lugar se trata de una técnica que puede volverse muy atractiva y conducir a un uso repetido del mismo herbicida. Esto conlleva siempre el riesgo de evolución de resistencia o de cambios drásticos en las poblaciones de malezas resultado en la sustitución de especies por de otras naturalmente tolerantes a esos herbicidas. Existe siempre el riesgo de flujo de genes desde los materiales transgénicos hacia el arroz maleza que escapen al herbicida. Plantas de arroz voluntario en un cultivo subsiguiente también pueden hibridar con el arroz maleza o con el arroz comercial. El flujo de genes hacia el arroz comercial es un problema en California donde la ley de preservación de germoplasma impuesta en ese estado prohíbe la contaminación con arroz transgénico para evitar problemas de comercialización en el mercado extranjero. Estudios en California con arroces transgénicos resistentes a ambos herbicidas demuestran que su polen no es capaz de fecundar al arroz comercial a una distancia mayor a los 1.8 m de la fuente de polen (Fischer et al. 2004b), lo cual permitiría el empleo de distancias de aislamiento para evitar la contaminación entre cultivos vecinos. Pero en otras regiones, donde condiciones mas húmedas permiten una viabilidad más prolongada del polen, éste ha sido transferido al arroz maleza a través de distancias mayores (Gealy et al. 2003). Es posible diseñar estrategias que mitiguen el flujo de genes, tales como distancias de aislamiento, restricciones a replantar sobre la misma área, y proscripción del uso repetido de esta tecnología en un mismo lugar. Pero en áreas con infestación de arroz maleza será difícil evitar por completo el flujo de genes de resistencia hacia esa maleza. En cuanto al manejo de resistencia, la integración de esta tecnología con otras técnicas y otros herbicidas resultará sin duda una herramienta de enorme valor. Otro tipo de arroz resistente a herbicidas son los cultivares de arroz IMI o Clearfield® con resistencia a herbicidas del grupo de las imidazolinonas. Estas variedades han sido obtenidas mediante mutación inducida y luego el gene de resistencia ha sido transferido al arroz comercial mediante cruzamiento convencional. Por no ser un arroz transgénico, el arroz IMI en muchos países no está sujeto a rigurosos análisis de riesgo para su aprobación de uso ni a las restricciones comerciales internacionales que afectan a los cultivos transgénicos. El arroz IMI ha sido desarrollado para el control de arroz maleza y se siembra comercialmente en el sureste de USA así como en varios países latinoamericanos. Los mismo problemas mencionados antes se aplican para este tipo de arroz por lo que es importante imponer medidas para mitigación del flujo de genes hacia el arroz maleza. (Olofsdotter et al. 2000). Un problema adicional con el arroz IMI es que se trata de resistencia a inhibidores de la ALS que son los herbicidas con mayor riesgo de evolución de resistencia en malezas. Además, con el fin de controlar eficazmente al arroz maleza se recomiendan dos aplicaciones de estos herbicidas en cada ciclo del cultivo lo que resulta en fuerte presión de selección. Ocasionalmente, se aprueba hasta una tercera aplicación (llamada de rescate) cuando la densidad de las plantas que escapan al herbicida es alta. En Costa Rica, ya se han identificado híbridos putativos entre arroz maleza y arroz IMI en campos comerciales con tan solo dos siembras subsecuentes del arroz cultivado resistente, los cuales son resistentes al imazapir, que junto con el imazapic constituyen la mezcla formulada de imidazolinonas empleada en el cultivo (Valverde datos no publicados).El riesgo de evolución de resistencia a inhibidores de la ALS en las malezas del arroz y en el arroz maleza por la presión de selección adicional impuesta con las imidazolinonas (independiente del flujo genético) es indudablemente muy grande. En el sureste de EE.UU. el arroz se rota con soya, cultivo en el cual también se emplean herbicidas inhibidores de la ALS. En California las especies de Echinochloa resistentes a herbicidas ya son también resistentes al imazetapir y a otros herbicidas inhibidores de la ALS que podrían usarse con el arroz IMI. El mecanismo es resistencia metabólica por P450. La utilidad del arroz IMI en el manejo de la resistencia en malezas del arroz es ciertamente dudosa. 8. Predicción de la evolución de resistencia

El uso de modelos para predecir la evolución de resistencia ha avanzado considerablemente desde los primeros modelos propuestos por Gressel & Segel (1990). El uso de modelos de predicción permite establecer la importancia relativa de los diversos factores que determinan la evolución de resistencia. Los modelos son también una herramienta útil para orientar la investigación y permiten explorar opciones de manejo para prevenir y/o retrasar la evolución de resistencia. El modelo inicial de Gressel & Segel puede resumirse en la siguiente expresión simplificada:

Nn = N0 [1+ fα/ñ]n [1]

Donde Nn es la proporción de individuos resistentes en una población al cabo de n años de uso continuo del herbicida, N0 es la proporción inicial de individuos resistentes preexistentes al uso del herbicida, y el exponente n es el número de años de tratamiento. La expresión entre corchetes incluye al factor de adaptabilidad ecológica o fitness (f) del biotipo resistente relativa a la del susceptible (alrededor de 0.5 en el caso de muchos biotipos con resistencia de sitio activo a triazinas; no se ha demostrado que sea mucho menor que 1 para otros herbicidas); ñ es la vida promedio del banco de semillas del suelo para esa maleza (estimada en 2 a 5 años para la mayoría de las malezas anuales); α es la presión (o coeficiente) de selección del herbicida expresada como el cociente entre la proporción de individuos resistentes y la de individuos susceptibles al final del ciclo del cultivo luego de que el herbicida ha hecho su efecto. Si un herbicida elimina el 99% de los individuos susceptibles y no afecta a ninguno de los resistentes, el valor de α será 1/0.01 = 100 (una medida más realista de la presión de selección sería expresarla en función de la diferencia de producción de semilla resistente y susceptible). Esta expresión muestra cómo la proporción de individuos resistentes se incrementa exponencialmente con el uso repetido del herbicida. Variando los parámetros de la ecuación dentro de magnitudes realistas se ve cómo la tasa de evolución de resistencia es particularmente sensible a cambios en la presión de selección y en segundo lugar a la longevidad del banco de semillas del suelo (Fig. 4c y 4d). Gressel & Segel (1990) introdujeron más tarde un modelo que permite hacer inferencias sobre las rotaciones y mezclas de herbicidas. Ese modelo demuestra cómo las diferencias de fitness a favor del biotipo susceptible causan una reducción en la proporción de individuos resistentes mientras no se usa el herbicida; la evolución de resistencia se retrasa en función de la duración y la frecuencia de los períodos en que el herbicida no se usa. Maxwell et al (1990) introdujeron un enfoque mucho más completo basado en un criterio demográfico para modelar la dinámica poblacional de una especie anual. A esto se agrega un submodelo que describe la herencia de resistencia según la ley de Hardy-Weinberg para un par de alelos mayores y fecundación cruzada al azar (esto podría modificarse para considerar casos de autofecundación). Finalmente, otro aporte de este modelo es incluir procesos de inmigración de polen y semilla (flujo de genes) y el efecto de la competencia entre biotipos reflejando las diferencias de fitness entre biotipos. Esos modelos sugieren que la evolución de resistencia se retrasa reduciendo la presión de selección, lo cual está indudablemente comprobado. El uso de dosis bajas de herbicida, suficientes como para controlar malezas por encima del umbral económico, tendría ese efecto y además la competencia entre sobrevivientes disminuiría la proporción de individuos resistentes con menor fitness. El modelo de Maxwell et al. además demostraba que si se permitía la inmigración de semilla de individuos susceptibles, o se dejaban franjas sin tratar, la semilla producida por las plantas susceptibles diluiría la contribución de las resistentes y retrasaría el avance de la resistencia, especialmente en etapas tempranas de su evolución. También la inmigración de polen susceptible serviría para retrasar la evolución de resistencia.

Pronto se comprendió que si bien el razonamiento era verosímil, existían problemas graves de índole práctico, pues al permitir la supervivencia de algunas plantas mediante un control limitado, se disparan los niveles de infestación y la solución resulta claramente antieconómica. Esto fue elocuentemente demostrado por Morrison & Friesen (1996) utilizando un modelo para Avena fatua con resistencia de sitio activo a inhibidores de la ACCasa. Además, un mayor número de individuos incrementa las posibilidades de hallar a los raros mutantes resistentes. Finalmente, se sabe que los alelos resistentes son dominantes o semidominantes, por lo que la inmigración de polen portador de alelos susceptibles recesivos no tendrá ningún efecto en menguar la evolución de resistencia en poblaciones de fecundación cruzada (Jasieniuk et al. 1996, Diggle & Neve 2001).

Nuevos refinamientos han sido incorporados a los modelos. Gardner et al. (1998) introdujeron un modelo que permite simular la evolución de resistencia controlada tanto por genes mayores como por herencia cuantitativa. Este modelo presenta una solución al dilema de ciclo vicioso donde dosis altas favorecen resistencia monogénica pero dosis bajas favorecen la resistencia poligénica (ver discusión en sección 4.1.5). Este nuevo modelo propone ciclos con secuencias de algunas dosis bajas seguidas por dosis moderadas; las dosis moderadas se escogerían de un nivel suficiente como para eliminar individuos que ya hubieran acumulado algunos genes menores de resistencia. Por último, otra nueva contribución es la introducción de la dinámica espacial de plantas en los modelos de resistencia. Esto surge de reconocer que las malezas no se distribuyen uniformemente en el campo, sino que aparecen en parches. El tamaño de estos parches regula la proximidad entre plantas y con ello se afecta la dinámica poblacional, el flujo de genes entre ellas, y la dispersión de la resistencia.

Según Diggle & Neve (2001) el modelado de la resistencia se basa en dos componentes fundamentales. En primer lugar, un modelo de dinámica poblacional que describe las transiciones dentro del ciclo de vida de una especie integrando los factores que determinan supervivencia y fecundidad. En cada etapa del ciclo de vida la fracción de la población que pasa de un estadio al otro está regulada por factores dependientes de la densidad de plantas y de factores externos (lo que permite simular tácticas de manejo). El otro componente importante es el que se refiere a la genética de poblaciones y describe las frecuencias génicas. Este componente incorpora algoritmos para

describir los efectos de las diversas situaciones que discutimos en la sección 4.1.5. Este refinamiento en la incorporación de aspectos genéticos es lo que ha dado versatilidad a los modelos para intentar la simulación de la evolución de resistencia múltiple como ocurre en Lolium rigidum en Australia. Finalmente, los modelos pueden incluir efectos resultantes de la distribución espacial de plantas. Con estos enfoques se puede predecir no sólo la evolución de resistencia en términos de la frecuencia de individuos resistentes sino que también los cambios concomitantes en los niveles de infestación.

El problema con los modelos es que se basan en parámetros para los cuales la información aún es escasa. Por ejemplo, los intentos por determinar con exactitud las frecuencias de mutación o las frecuencias iniciales de individuos resistentes en una población son muy escasos. Por otra parte, las predicciones de los modelos rara vez han sido validadas en el terreno. Independientemente del nivel de complejidad de los modelos, todos concluyen que el manejo de la resistencia pasa por la reducción de la presión de selección, la rotación o mezcla de herbicidas y la integración de técnicas no químicas de control, manteniendo niveles bajos de infestación.

Los modelos permiten integrar una gran complejidad de factores para evaluar el éxito relativo de diferentes técnicas manejo y efectuar un análisis de sus ventajas económicas. Son además una excelente herramienta para detectar áreas que deben ser investigadas a fin de conocer mejor los factores involucrados en la evolución de resistencia a herbicidas. 9. Conclusiones

El monocultivo de arroz, la elevada dependencia en el control químico de malezas, y el uso repetido de herbicidas con igual modo de acción o ruta metabólica de desintoxicación en la planta han conducido a la evolución de resistencia en las poblaciones de malezas del arroz. Este uso repetido selecciona biotipos dotados de la capacidad genética para resistir aplicaciones de herbicidas que normalmente controlan a las plantas de esa especie. La presión de selección a favor de biotipos resistentes se reduce a través de una acción integrada incorporando otras medidas de control que reduzcan los niveles de infestación. El empleo de semilla certificada libre de malezas, las inspecciones de campo y las pruebas de detección son fundamentales para la prevención y manejo temprano de la resistencia. Las secuencias o mezclas de tanque combinando herbicidas con diferente modo de acción y mecanismo de degradación son útiles para retrasar la evolución de resistencia. El uso de herbicidas debe combinarse con técnicas agronómicas. La resistencia de tipo metabólico y la evolución de resistencia múltiple son ciertamente un desafío que requerirán estrategias creativas y enfatizan la necesidad de practicar un control integrado de malezas. El manejo de la resistencia implica mantener un registro de las técnicas de control que se han empleado como base para el plan de acción futura; es pues una tarea de planificación a largo plazo. Los modelos de predicción son un apoyo para la investigación y permiten el diseño y selección de programas de manejo integrado rentables que permitan conservar a los herbicidas como herramientas esenciales en el manejo de malezas. La experiencia demuestra que la adopción de medidas de prevención y manejo de resistencia por parte del productor es un proceso difícil. Mucho esfuerzo debe volcarse en la implementación de programas educativos. 10. Bibliografía Diggle, A.J. & Neve, P. 2001. The population dynamics and genetics of herbicide resistance-a modeling approach. In Powles, S.B.; Shaner. D.L. eds. Herbicide resistance and world grains. Boca Raton, CRC Press. p. 61-99. Fischer, A.J.; Cheetham, D.P. & De Prado, R. 2004. Enhanced effect of thiobencarb on bispyribac-sodium control of E. phyllopogon (Stapf) Koss in California rice (Oryza sativa L.). Weed Biology and Management 4:206-212. Fischer, A.J.; Cheetham, D.P.; Laca, E.A.; Mckenzie, K.S. & Gealy, D.R. 2004b. Outcrossing study between transgenic herbicide-resistant rice and non-transgenic rice in California. In Conference Challenges and Opportunities for Sustainable Rice-Based Production Systems (2004, Torino, IT). Proceedings. Eds. A. Ferrero; F. Vidotto. Vercelli, Mercurio. p. 407-408. Fischer, A.J.; Lozano, J.; Ramirez, A. & Sanint, L.R. 1993. Yield loss prediction for integrated weed management in direct-seeded rice. International Journal of Pest Management 39:175-180.

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