Excrección urinaria de tromboxano B2 (TxB2) como marcador de … · 2019-03-12 · mos de oxigeno...
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Joaquín González Revaldería
Madrid, 2015
© Joaquín González Revaldería, 1988
Excrección urinaria de tromboxano B2 (TxB2) como
marcador de rechazo en transplante renal humano
Departamento de Bioquímica
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Ciencias Qufmicas
Departamento de Bioquimica
1111111111111 * 5309873002*
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
-·-
EXCRECCION URINARIA DE TROMBOXANO 8 2
(TxB2) COMO MARCADOR DE RECHAZO EN TRANSPLANTE RENAL HUMANO
Colecci6n Tesis Doctorales. N.R 37/88
© Joaquin Gonzalez Revalderia
Edita e imprime Ia Editorial de Ia Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprografia Noviciado, 3 - 28015 Madrid Madrid, 1988 Ricoh 3700 Deposito Legal: M-2155-1988
A QUIENES TANTO DEBO
II
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. D. Joaquin Ortuiio Mirete por su supervisi6n y jui
cios cr1ticos, sin cuya ayuda hubiese sido imposible la consecu
ci6n de ~ste trabajo.
A ca. Carmen Revalder1a por su inquebrantable apoyo dura~
te la realizaci6n del trabajo y por su labor mecanogr!fica en la
preparaci6n del original.
Al Dr. D. Jos~ Luis Teruel Briones por s·u amabilidad y
paciencia.
A los· facul tativos del Servicio de Nefrolog!a y, en gene
ra~, a todo el personal del Hospital Ram6n y Cajal per su compafi!
rismo y porque cualquiera puede enseiiar algo a quien est~ dispue!
to a aprender.
A todo~ aqu~llos que con sus· consejos y opiniones han co
laborado en la forma final del presente trabajo.
III
INDICE
1.- INTRODUCCION 1
1.1.- BIOOUIMICA DE LAS PROSTAGLANDINAS Y TROMBOXANOS 1
1.2.- TRANSPLANTE RENAL Y RECHAZO 11
1.3.- INDICADORES DE RECHAZO EN TRANSPLANTE RENAL 15
2.- OBJETIVOS 19
3.- DETERMINACION DE LOS NIVELES URINARIOS DE TxB2 20
3.1.- ELECCION DEL M£TODO. ANTECEDENTES 20
3.2.- MATERIAL Y M£Tooos 21
3.2.1.- RECOLECCION DE LAS MUESTRAS URINARIAS 21
3.2.2.- OIALISIS 22
3.2.3.- EXTRACCION 22
3.2.4.- CROMATOGRAFIA LIOUIDA DE ALTA EFICACIA 23
3.2.5.- RADIOINMUNOENSAYO 24
3.2.6.~ PROCEDIMIENTOS ESTADISTICOS 30
3 .• 3.- RESULTADOS 31
3.3.1.- PURIFICACION DE LAS MUESTRAS 31
3.3.1.1.- DIALISIS 31
3.3.1.2.- EXTRACCION ORGANICA 33
3.3.1.3.- CROMATOGRAFIA L!QUIDA DE ALTA
EFICACIA EN FASE REVERSA. 33
3.3.2.- INFLUENCIA DEL pK URINARIO 37
3.3.3.- PRECAUCIONES EN LA MANIPULACION Y ALMA-
CENAMIENTO DE LAS MUESTRAS 37
IV
3.3.4.- TRATAMIENTO DE LOS BLANCOS
3.3.5.- CALCULO DE RESULTADOS
3.3.6.- FIABILIDAD DE LA T£CNICA
3.3.6.1.- PARALELISMO
3.3.6.2.- PRECISION
3.3.6.3.- EXACTITUD
3.3.6.4.- ESPECIFICIDAD E INTERFERENCIAS
MEDICAMENTOSAS.
3.3.6.5.- SENSIBILIDAD
3.3.7.- INFLUENCIA DE LOS TIEMPOS DE INCUBACION
3.3.8.- PRESENCIA URINARIA DE CSLULAS SANGUINEAS
3.3.9.- VALORES NORMALES
3.3.10.- INFLUENCIA DE LA CIRUGtA
3.4.- DISCUSION
~.- TxB2·EN TRANSPLANT£ RENAL HUMANO 4.1.- PACIENTES Y M£TODOS
4.1.1.- ENFERMOS
4.1.2.- INMUNOSUPRESION
4.1.3.- DIAGNOSTICO DE NECROSIS TUBULAR AGUDA
4.1.4.- DIAGNOSTICO DE RECHAZO
4.1.5.~ RECOLECCION DE MUESTRAS
4 .1. 6 • - Ml::TODOS ANAL!TICOS
4.1.6.1.- DETERMINACION DE TxB 2
4.1.6.2.- DETERMINACION DE NIVELES DE
40
42
44
46
46
49
51
51
53
53
56
sa
60
67
67
67
67
68
69
72
73
73
CREATININA 73
4.1.6.3.- DETERMINACION DE SODIO Y POTASIO 73
v
4.1.7.- PROCEDIMIENTOS ESTAD!STICOS
4 • 2 • - RESULTADOS
4.2.1.- GRUPO A: TRANSPLANTE NO COMPLICADO
4 • 2. 2.- GRUPO B: RECHAZO SOBRE INJERTO PREVIAMENTE
74
74
75
FUNCIONANTE 77
4.2.3.- GRUPO C: NECROSIS TUBULAR AGUDA SIN RECHAZO 83
4.2.4.- GRUP9 0: RECHAZO SOBRE NECROSIS TUBULAR
AGUDA PREVIA
4.2.5.- SIGNIFICACION DE LAS DETERMINACIONES DE
TxB.2 Y TxB2/Cr
4.3.- DISCUSION
5.- CONCLUSIONES
6.- BIBLIOGRAFIA
7.- APENDICES
7 .1.- C.!U.CULO DE LAS CONCENTRACIONES DE TxB2 MEDIANTE UN
CALCULAOOR PROGRAMABLE HP-9 7
7.1.1.- MANEJO
7.1.2.- LI'STADO
7.2.- ANALISIS DE LA VARIANZA Y DE REGRESION
7.2.1.- MANEJO
7.2.2.- LISTADO
83
87
91
96
98
117
117
117
118
119
119
121
VI
ABREVIATURAS
PG Prostaglandina (PGA2, PGB2 , PGE2 , PGI 2)
Tx Tromboxano (~xA2 , TxB2 >
PLA Fosfolipasa (PLAf, PLA2 )
EDTA
CLAE-FR
Ag
* Ag
Ac
%B/B0
X
OS
cv
EfNa
cr5,cr
0
NTA
ECO
6-MP
HD
Acido etilendiamintetrac~tico.
Cromatograf!a l!quida de alta eficacia en fase reversa.
Ant1geno
Ant!geno marcado radiactivamente.
Anticuerpo
~laxima cantidad de ant1:geno que puede unirse a una canti
dad determinada de anticuerpo en las condiciones de analisis.
Fracci6n de ant1qeno marcado unido respecto del m~imo de
uni6n.
Media.
Desviaci6n t1:pica
Coeficiente de variabilidad
Excrecci6n fraccional de sodio.
Concentraci6n plasmaticajurinaria de creatinina.
Necros·is tubular aguda.
Ecograf!a
6-metil prednisolona
Hemodialis·is-.
-1-
1.- INTRODUCCION
1.1.- B!OQU!MICA DE LAS. PROS'l'AGLANDINAS Y TROMBOXANOS
Las prostaglandina~, tromboxanos y leucotrienos constitu
yen una familia de compuestos conocida generalmente como eicos.!
noides o productos ~e la "cascada del 4cido araquid6nico". Su
importancia fisiol6gica se ha puesto de relieve durante la tilt!_
ma d~cada y son considerados hoy dta como un grupo de mol~culas
mediadoras cuy~s dianas se encuentran muy cerca del sitio de
s1ntesis.
Las pros·taqlandi:nas muestran una gran variedad de efectos
fisiol6gicos, algunos· de los cuales son completamente opuestos.
As1, la prostaglandina E2 (PGE2l, que quiz! haya sido lamas am
pliamente estud:tada, es capaz de inducir fiebre, vasodilataci6n,
aumento de la permeabiltdad vascular (lo que oriqina la formaci6n
de edemas), contracci6n del m~sculo liso del titero, etc ..•• El
tromboxano A2 (TxA2 l produce agregaci6n plaquetaria y broncocon~
tricci6n, mientras· que la prostaciclina (PGI2) es el mas eficaz
agente antiagregante plaquetario de origen natural conocido (2) •
Se ha comprobado, adem4s·, que en la diabetes el TxA2 est4 aume_!!
tado y la PGI 2 disminufda (3, 4}. Tambi6n est4 aumentado el TxA2
en el shock endot6x±co (5}, hidronefrosis {6, 7}, nefropat1as.
obstructivas (8}, enfermedades coronarias isqubicas (9, 10),
lupus eritematoso Clll, s1ndrome hepatorrenal (12, 13) e isque
mia cerebral (141, entre otros muchos.
-2-
Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos derivan
enzimaticamente de los 4cidos grasos insaturados de 20 4tomos
de carbona, siendo su principal precursor el 4cido araquid6n!
co (4cido cis-5, 8, 11, 14-eicosatetraenoico), el cual provi~
ne del ~cido graso esencial linoleico (15) • Este da lugar a
las prostaglandinas de la serie "2", mientras que las formadas
a partir del 4cido dihomo-Y- linoleico y del eicosapentanoico
o .timn6dico orig:i.:nan, respect:i.:vamente, las prostaglandinas de
las series "1" y· "3". Estes indices hacen referencia al nGmero
de instauraciones que conservan las prostaglandinas en su mole
cula y que son dos menos que las que posee el 4cido graso pre
cursor. Es·te nt:irnero es el que se escribe como sub1ndice cuando
se las nombra.
Una vez inger~do en la d:i.:eta, el ~cido linoleico sufre
primero una deshidrogenac:i.:6n catali:zada por la ~ 6-desaturasa
la cual forma un doble enlace c:i.:s dando lugar al 4cido Y-lino
leico. Posteriormente la mol~cula aumenta su longitud en dos
~tomes de carbona dando lugar al 4cido dihomo- r-linoleico y,
por fin, actua una ~2desaturasa r±ndiendo 4cido araquid6nico
ll&l, lFigura,ll.
El 4cido araquid6nico esterifica la posici6n fC6 2) de
los fosfol!pidos (.en especial del fosfatidilinositol y de la
fosfatidilcolinal, como es norma general en los 4cidos grasos
poliinsaturados· (Fig. 2). Sin embargo, para la formaci6n de los
eicosanoides ha de estar libre. La enzima que hidroliza la
uni6n del araquid6nico al esqueleto carbonado del glicerol es
-3-
0
~5-CoA llnoloii-CoA
1 ~S-CoA
0
1 S-CoA
0
1 0
S-CoA
aracauldonll -CoA
FIGURA 1.- Etapas de formaci6n del araquidonil-CoA a partir del acido
llnoleico.
(ex)
PLC PLO
(oc) H2c-o\® \ •
FIGURA 2.- Representacion esquematica de una molecula de fosfol!pido
y de los puntos de ataque en.zilllatico de 1& fosfolipasa.
R' , R: residues de acidos grasos; P: fosfato1 B: colina, etanolamina, inositol o serina.
-4-
la fosfolipasa A2 tPLA2l y~en menor porporci6n,las fosfolipasas
c y o. El paso hidrolttico es el limitante en la velocidad de
producci6n de los eieosanoides. Esta enzima se activa por una
qran cantidad de estfmulos tanto mec!nicos como f1sicos, hormo
nales, inmunol6qicos, etc ••• (17). La fosfolipasa A2 est! fo~
da por un qrupo heter6loqo de enzimas ampliamente distribu1das
en las· c'lulas- eucariotas-. Este tipo de enz:Lmas se suele divi
dir en dos qrupos:
- Formas unidas a la membrana, las cuales requieren calcio
y pH neutro para una activ~dad catal1tica 6ptfma, siendo accesi
bles desde el exterior celular, y
- Formas- solubles, las cuales no requieren calcio y su pH
6pt~o es 4cido.
Tanto la PLA1 como la PLA2 se inhiben por un cierto nt'lme
ro de compues-tos, s-iendo los mis conoc.tdos los- qlucocorticoides.
Estos actflan sobre el n11cleo eelular induciendo la s-tntesis de
la prote!na maeroeortina (181 y/o de lipomodulina (19) que son
los verdaderos fnhibi:dores de la fosfolipasa. Otros compuestos
inhiben las fosfolipasas por interacci6n con los fosfol1pidos,
impidiendo el ataque enzim4tico a estes. Entre ellos se encuen
tran los compuestos- cati6nicos- del tipo de la mepacrina y la
clorpromacina y los poliam1nicos como la putrescina y la esper
midina. Otro tipo de inhibidores, como el 4cido etilendiaminte
trac,tico (EDTAl, aetGan interfiriendo la uni6n del ca2+, que
es necesaria para mantener la conformaci6n estructural de la en
zima Cl7l.
Una vez liberado, el 4cido araquid6nico es- atacado, bien
-s-
por la ciclooxigenasa para dar lugar a las prostaglandinas y
tromboxanos, bien por la lipooxigenasa para originar los leuco
trienos (Figuras 3 y 4) •
La ciclooxigenasa o prostaglandina endoper6xido sintetasa
(EC 1.14.99.1) presenta dos tipos de actividad enzim&tica. En
primer lugar actQa la actividad oxigenasa introduciendo dos at~
mos de oxigeno en las posiciones 9 y 11 de la mol~cula de !cido
araquid6nico, dando lugar a un producto intermedio, el hidrope
roxiendoper6xido PGG2 , que posee una vida media de 5 minutes en
medio acuoso y a pH fisiol6gico. Inmediatamente actQa sobre PGG2
la actividad peroxid!sica liberando el hidroxiendoper6xido PGH2 junto con especies oxtdadas de estructura no conocida (20). Esta
enzima es una glicoprotetna que contiene 12 moles de manosa y 5
de N-acetilglucosamina por mol de enztma. Su peso molecular es
de 126.000 siendo el de la cadena polipept!dica de 69.000 (21).
Para la primera actividad la enzima prectsa del grupo hemo, el
cual esta muy debilmente unido y de tript6fano u otro agente re
ductor para proteger a la enzima de la acci6n peroxid!sica. Este
agente se consume estequiometrtcamente al reducir el qrupo hidro
perOxide intermediario (22) •
La ciclooxigenasa es una enzima muy ampliamente distribu1-
da de la que se ha secuenciado su extremo amino terminal (23) •
Es inhibida irreversiblemente por la aspirina mediante la aceti
laci6n de una serina del centro activo, que se encuentra en el
extremo amino terminal y, reversiblemente, por los antiinflamato
rios no estero!dicos del tipo de la indometacina (24), que actuan
sobre dos sitios: el centro activo, lo que determina la potencia de
~ .. ~
PtoStaddina
l
L Hfi. I
OH
6-om-PGF\oe.
110.
~M HO' . :
OH
-6-
.................
l ~COOH ·~
p~
FIGURA 3.- Formacion de prostaglandinas y tromboxanos a partir del acido
araquid6nico {via de la ciclooxigenasa).
~ 1 ~ Acldo o•lflttld6AICO
~ 1 Achlo 1!41droporoal• '_
-1- eiCQI&enaonolco ·
~· l .f, Leucaulano A4
HO
I I I I J,
E•p••••• oci4Uias (I. T a4• ,,,,..,.~
-7-
rrou ••••"'""••
HO
+----------
FIGURA 4.- Formaci6n de leucotrienos a partir del &cido araquid6nico (vta de la lipoaxi9enaaa>.
1: 5-llpoax19•n&N 2 a Leucotrieno A.t epSxido hidrolasa 3: Glutation tranaferaaa 4' Y'- Glutaail•transpeptidasa 5: Ciateini1-91icina dipept.tdasa 6: Cicloaxi9enaaa 7: Glutatioa pezooxidasa
-8-
la acci6n de es·tos· compuestos, y el sitio suplementario, con el
cual debe existir tambi~n una interacci6n para una adecuada efi
cacia inhibidora(25} •
A partir de los endoper6xidos c1clicos se forman las dis
tintas prostaglandinas y· tromboxanos. Para el TxA2 y la PGI 2 se
han identificado s·intetasas· pero para las restantes prostaglan
dinas no se sabe con seguridad si su formaci6n est~ catalizada
enzimaticamente (20), aunque se ha llegado a aislar una enzima
con actividad s·intetasa de PGE2 (26} •
Existen distintos tipos de prostaglandinas·; asl, las de
la serie E son f-hidroxiacetonas; las de la F, dioles 1,3; las
de la A, cetonas ~ ,p-insaturadas, el TxA2 , un hemiacetal 1!
bil, etc ••• En cada c~lula, al activarse la cascada del acido ara
quid6nico se forma una mezcla de prostaglandinas predominando
unas· sobre otras· dependiendo de la c~lula, tej ido o especie de
que se trate.
La tromboxano srntetasa es una enzima que ha sido solubili
zada y separada de la ciclooxigenasa (27, 28), la cual actfia iso
merizando la PGH2 a TxA2 y, en las plaquetas.,. que es· d6nde princ!_
palmente se s·intetiza el TxA2 ,. se localiza en el sistema tubular
denso. Esta enzfma es inhibida especrficamente por el imidazol
(291.
El TxA2 (Figura 31 posee en su mol!cula un anillo oxano y
un grupo hidroxilo hemiacetalico. Fue identificado por vez prime
ra por Samuelsson .(30} al estudiar el metabolismo de los 4cidos
grasos· en las plaquetas. Este COlllpuesto result6 ser el responsa-
-9-
ble de la constricci6n de la aorta de conejo que se habia detec-
tado anteriormente por bioensayo (31). Recientemente se ha sinte
tizado quimicamente, a partir de TxB 2 , un compuesto con la ex
tructura asignada por Samuelsson al TxA2, comprob!ndose que po
see las mismas propiedades fisiol6gicas que 6ste, por lo que se
considera correcta la pr~era estructura propuesta para el com-
puesto fisiologicamente activo (32) •
El TxA2 en med~o acuoso y a pH fisiol6gico es inestable,
teniendo una vida media de 32 s. Este compuesto se transforma en
TxB 2, que es el !cido 8 - (l-hidroxi-3-oxopropil)- 9,12 L-dihi
droxi- 5,10 - heptadecadienoico, por medic de un ataque nucleofi
lico del aqua. El TxB 2 es estable perc posee poca actividad bio
l6gica.
Las prostaglandinas, en general, se degradan por medic de
oxidaciones que conducen a una marcada p6rdida de actividad bio-
16gica. En la Figura 5 se muestra la ruta de degradaci6n m!s ha-
bitual de las prostaglandinas, existiendo tambi6n, procesos de
)3Y UJ-oxidaci6n (20). El paso limitante es la conversi6n catali
zada por la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa. Esta enzima
y la A13-prostaglandina reductasa utilizan NAD+ como cofactor
(33), aunque la segunda puede utilizar tambi6n NADP+, dependie~
do del tipo de c6lula en que se encuentre (34).
El TxB 2, producto de degradaci6n del TxA2, puede sufrir
posteriores modificaciones en su mol6cula, habiendose identifica
do hasta 20 metabolites urinarios ·{35-38), siendo los principa
les el 2,3-dinor-TxB2 y el 2, 3, 4, S-tetranor-TxB2 (Figura 6),
-10-
~COOH H~
PGEz
1 ,S-hidfOJ<IPrG&I&91&ndl ....
d•staldtov•nasa
0
~COOH ~~
HO 8 \5-0Xo-PGE 2
1 A 'I:!. prouaolandlou
reduct at.•
~H HO 0
13,14-dihidro- \5-oxo-PGE2
1 15-o•oprosug;latodl~
reduccua
0
~H HO H "oH
\3, t4-dihidro-PGE2
FIGURA 5.- Catabolismo de los productos formados en la via de la ciclooxiqenasa.
QH
. ~/~COOH
HO~ OH
2,3-dinor~TxB2
OH OH ~ ..... ......._....,cooH
HO~ OH
o~" OH
2,3.4.5 -tetranor-Tx 82 11 -dehidro-TxB2
FIGURA 6.- Princtpales productos de degradacion del. TxB2
-11-
los cuales son productos de ~- oxidaci6n ( 39) • El siquiente ca
tabolite en importancia resulta de la deshidroqenaci6n del al-
cohol hemicet~lico lo que da luqar al ll-dehidro-TxB2 • Este com
puesto puede sufrir posteriormente una deshidroqenaci6n de alco
hol del carbono 15 y reducci6n de los dobles enlaces AS y ~ 13
Un qrupo minoritario de metabolites excretados son compuestos
no c!clicos con qrupos hidroxilo en C-11 y c-12.
1.2.-TRANSPLANTE RENAL Y' RECHAZO.
El transplante renal es· un tratamiento habitual, casi ru-
tinario, de la insufic:tencia renal cr6nica. Sin embargo, aunque
cada d!a se obtienen mejores· res-ultados, el rechazo del injerto
constituye el principal problema del transplante, ocasionando
del75% al 80% de las· causas de p~rdida del riii6n {40).
En la actual:tdad el diaqn6s·tico de rechazo se realiza ba
s4ndose en el siquiente conjunto de par!metros.
* Siqnos y s1ntomas cl.tn:tcos:
- P:tebre
.... Aparic~:6n de edemas
-. Hipertensi6n arterial
- Dolor sobre el injerto
-. Malestar. qeneral, as·tenta,
- Dism:i:nuc:t6n de la diurests·
-12-
* Par~etros anal.tticos·:
- Aumento de urea y creatinina plasm4tica
o disminuci6n acusada de su ritmo de
descenso.
Disminuci6n de la excrecci6n urinaria de
Na+
Proteinuria
* Ecoqraf!a:
- Aumento del tamafio de la silueta renal
- Hipertrofia de las pir~ides renales
Disminuci6n de los ecos del seno renal
Este procedimiento detecta la presencia
de masas en la pelvis: linfocele, hematoma
o urinoma. As1mismo, la ecoqraf!a se utili
za para detectar procesos obstructivos.
* Histoloq!a:
Presencia de infiltrados intersticiales
y perivasculares de cEHulas mononucleadas.
- Edema intersticial
-· Extravasaci6n eri:trocitaria
* Procedi~iento~ isot6picos:
Los e~tudfos· con 99Tc y plaquetas marcadas
con Indio suministran informaci6n sobre la
vas~ularizaci6n del 6rqano transplantado.
Una pobre vascularizaci6n del injerto pue-
de estar presente en procesos de rechazo.
-13-
* Arteriograf!a:
- Oetecci6n de lesiones· en las principales
arterias·.
Ninguno de es·tos datos es espec!fico de rechazo, lo que
implica serias dificultades diaqn6s·ticas y decisiones terapet1t!
cas err6neas. Por otro lado, muchos de ellos -y en concreto los
m~s fiables- son datos o par&metros funcionales, cuya siqnifi
caciOn y utilidad disminuye o se anula completamente si el ri•
fi6n, antes del rechazo, no funcionaba por otro motivo (necrosis
tubular isqu'mica} • Por ~ltimo, las alteraciones sugestivas de
rechazo son tard!as·: se manif:i:estan cuando la lesi6n histol6gi
ca de rechazo est~ ya evolucionada.
Por tanto la bt1squeda de un marcador de rechazo precoz,
espec1fico, fiable, de senc:i:lla determinac:i:6n y econ6mico es de
fundamental importanc:i:a para el mejor manejo del enfermo trans
plantado ya que permittr1a ins·taurar precozmente la terapia ade
cuada.
Aunque el mecani$mo de rechazo no se comprende totalmente,
cada vez es mayor el conoci~iento que se va loqrando de este fe
n6meno {41-531. En la Pigura 7 se muestra un esquema de lares
puesta inmune no •od~ftcada que t±ene lugar ante la presencia
de anttgenos· extraiios·.
Mediante procedim±entos h.tstol6g:i:cos· se ha demostrado que
las· prilneras c~lulas· que invaden los· injertos renales· son linfo
c~tos y monoc:ttos- (541 extst.tendo un nt:lmero relativamente pequ~
no de c~lulas·B pero con una respuesta proliferativa muy acusa
da.
-14-
8 • • • • Antrno l
(;'\ - - +-:-\ V, -- --,. ~ \;-! ---. ... _· .... ~/] \ 8 '>< \ ~ Anticuerpos
!:\ Q r::::\ 8. Comp~emento v ~ v ADCC
FIGURA 7.- Esquema de !a requ1aci6n de la respuesta i~une en el rechazo.
CPA: TH: Ts: 8:
Tc= M ~: NK: ADCC: ---il' : __ ...,.:
Celula presentadora de antiqeno (dendritica, macrofaqo) Linfocito T colaborador Linfocito T. supresor Linfocito B Linfocito T citotoxico Macrofaqo Celulas asesinas Citotoxicidad celular mediada por anticuerpos Estimulacion Inhibicion
-15-
Las plaquetas tambi~n es·t~n intimamente ligadas al recha
zo. En los injertos rechazado& existe una r~pida agreqaci6n pl~
quetaria (55) que casi coincide temporalmente con el aumento de
la inflamaci6n. Tanto en la activaci6n plaquetaria l30# 56) co
mo en la de los otros· tipos celulares que intervienen en los pr~
cesos de rechazo se sintetizan y secretan metabolitos del ~cido
araquid6nico. As!, los macr6fagos· esti1nulados· sintetizan y seer~
tan tromboxano s 2 dufante la fagocitosis (.571 y en respuesta a
los 11ltimos componentes del complemento (.58}. De igual manera
los linfocitos hwnanos en s·uspens·iones libres de plaquetas son
capaces de sintetizar TxB 2 (591 al igual que los leucocitos pol!
morfonucleares· (601. Por su parte, el TxA2 es· capaz de estimular
tanto la prol:i:£eraci6n como la toxic:i:dad de los· linfocitos l61-
631 •
1.3.- INDICADORES DE RECHAZO EN TRANSPLANT£ RENAL
En la b'llsqueda de un diagn6st.i:co precoz y fiable del recha
zo se han propuesto distintos marcadores. Entre ellos se encuen
tra la determinac.t6n de diversas enzi111as s~ricas y urinarias·.
As 1, la N-acetil- (l -D-qlucosam.i:nidasa urinari:a (.69) presenta una
elevaci6n aproxiuadamente 1~5 dtas antes del diagn6stico cl!nico
de rechazo en el 70% de los casos. Sin eJQbarqo no parece ser es
pec!fica de este proceso ya que la oliqoanuria, hipotensi6n, es
tenosis de la arteria renal y la adminis·traci6n de qentamicina
tambiefi la elevan, tardando en normalizarse de S a 6 d!as tras
-16-
la desaparici6n de las causas. As!mismo se ha estudiado la de
terminaci6n de la lisozima s~rica y urinaria (65). Esta ha re
sultado ser un eficaz marcador de dafio tubular pero no es esp~
c1fica del rechazo. La adenilato quinasa urinaria (66) ha mos
trado su utilidad en el diagn6s·tico del rechazo, al menos en
los 6 primeros d1as postransplante, pero no se eleva precozme~
te y se propone mas bien para el seguimiento de la eficacia
del tratamiento anti-rechazo.
Otras enzimas estudi:adas· han sido las qlicos·idasas liso
somales, la adenosin desaminasa, la muramidasa, 14ctico deshi
drogenasa, fosfatasas· !cida y alcalina, f1 -glucuronidasa, r -gl~ tamil transpeptidasa, leucina aminopeptidasa y m4lico deshidr£
(67-70) • Ninguno de ellos posee gran utilidad en el diaqn6stico
de rechazo.
Se han investigado otras· proteinas como posibles marcado
res (71) prestando especial atenci6n a la proteina C reactiva
(72-74) la cual presenta un bajo namero de falsos positivos y
neqativos. Su mayor inconveni:ente es· que no posee valor predic
tivo alquno. Mucha inter~s se ha puesto en la determinaci6n de
~2-microglobulina (75, 76} pero este par&metro resulta tambi~n
alterado por la necrosis tubular aguda y sus niveles no se modi
fican precozmente respecto del dtagn6s·tico cU:nico.
El es·tudio de par4metros- :tlllllunol6gi·cos corqo la formaci6n
de rosetas E (.77}, la no respuesta a ntit6genos· {.781, los ensa
yos· de c6lulas- T funci:onales [791, anticuerpos-monoclonales
(.801 o el an4lisi:s· de inmunoqlobulinas y fraccione& del comple..-
-17-
mento (81) no han sido eficaces, principalmente debido a su
falta de valor predictivo, no siendo tampoco concluyentes los
ensayos realizados con pro&taciclina, plaquetas marcadas radiac
tivamente y estudios con coloi.des de 99nl.rc Sn (82-84) •
Debido a los cambios· his-tol6qicos que tienen lugar duran
te los procesos de rechazo, ultimamente se ha propuesto la rea
lizaci6n de biopsias rutinar:tas· con aquja fina (85, 86) para
controlar la evoluci6n del injerto. Tambi~n.se ha propuesto que
el an!lis·is de la activaci6n celular que tiene lugar durante e~
tos procesos· (87, 88) puede-resultar efectivo en el diagn6stico
de rechazo. Sin embargo, las prillleras suponen un procedimiento
agresivo para el paciente, aunctue este hecho s-e vea reducido
por el empleo de la t~cnica con aguja fina, y los segundos pre
cisan de una tecnologta muy softs·ttcada.
La determinaci6n de los productos formados durante los
procesos de activaci6n celular no es, en general, tan agresiva
como las anteriores y pueden ser tanto 0 mas espec!ficas que
aqu~llas. Como el TxA2 se sintetiza en maltiples tipos celula
res que son activados durante el proceso del rechazo y, a su
vez, es capaz de estimular distintos aspectos de la respuesta
inmune, su evaluaci6n a trav~s de su metabolito estable, el
TxB2, puede constituir un marcador atil del rechazo frente a la
creatinina s~rica y los par&metros cl1nicos habitualmente utili
zados. La determinac16n de los niveles urinarios de Txs2 repre
senta, por otra parte, un procedtmiento no invasive, lo cual es
un requisite esencial para un indicador adecuado de diagn6stico.
-18-
Apoyando esta hip6tes·is s-e encuentra el hecho de que durante el
proceso de rechazo se ha encontrado un aumento en la s!ntesis
de TxB 2 en perros (891 y en ratas· (90). Foeqh y cols. han reali
zado un estudio en 12 enfermos transplantados (.91, 92) mostran
do resultados prometedores- en es·te sentido. As!mismo, se ha ev!_
denciado en un modelo experimental en ratas (93) que el trata
miento de estas con inhibidores de la s!ntesis de TxB 2 prolonga
significativamente l_a s·upervivencia del injerto antes de la ap~
rici6n de rechazo.
-19-
2.- OBJETIVOS
El presente trabajo pretende:
1.- Desarrollar una t~cn~ca dt11 para la deter.minac16n de TxB 2 en orina.
2.- Estud1ar su ~ en el diaqn6sttco de rechazo y compa
rarla con la de los indtcadores habituales.
3.- Aclarar la influencia del acto quirdrgico,de la necrosis
tubular aquda post-transplante y de otros factores en los
niveles de TxB2 urinarto.
-20-
3.- DETERMINACION ··DE LOS NIVELES · URINARIOS DE TxB2
3 .1.- ELECCION DEL. MtfODO. ANTECEDENTES •
Historicamente, y dejando aparte los bioensayos (94-96),
los pr~eros m4todos utilizados en el an,lisis de los derivados
del !cido araquid6nico fueron la espectrofotometr!a y la croma
tograf!a gas-l.f.quido (97}. Estos ensayos se caracterizan por ~
seer una especificidad relativamente elevada pero son poco sen
sibles ya que requieren de a•2 a 20 JUg, de muestra como m!nimo.
En la d~cada de los setenta se utilizaron t~cnicas de ere
matograf!a de gases acoplada a espectrometr!a de masas (98, 99)
que son muy espec1.ficas pero requieren un equipo care y comple
jo, consumen bastante tiempo y necesitan cantidades de muestra
elevadas, lo que conlleva largos procesos de purificaci6n.
Posteriormente se introdujeron las t~cnicas de radioirunu
noensayo (100}. Estos m~todos poseen una gran sensibilidad, no
necesitan de un equipamiento caro y/o complejo y poseen una al
ta especificidad, ya que, debido a su estructura, las prostagla~
dinas y tromboxanos son ant.f.genos a partir de los cuales pueden
obtenerse anticuerpos de elevada especificidad. Estes metodos
peoniten, adem!s, la realizaci6n si~ult!nea de un elevado n~e
ro de determdnaciones (101] •
-21-
Estes hechos hacen que pueda considerarse el radioinmuno
ensayo como la t~cnica de elecci6n para la determinaci6n de los
niveles urinarios de TxB2 • No obstante, hay que observar que
ciertos productos de deqradaci6n de este metabolite, al poseer
estructw:::as anulares id€mticas a la suya, pueden reacciol•ar en
mayor o menor extensi6n con el anticuerpo. As!, en el caso del
TxB2, el 2,3-dinor-T~2 (Fiqura 6) es capaz de reaccionar bas
ta en un 40% con el anticuerpo anti TxB 2• Este hecho hace que
cuando se hable de niveles de TxB2 determinados por radioinmu
noensayo haya que pensar en un conjunto.de entidades con estru~
turas qutmicas muy semejantes y con un mismo oriqen (la trans
formaci6n catab61ica del TxB2) (38). A este conjunto se le sue
le denominar "TxB2 inmunorreactivo• o •sustancias del tipo del
Txa2•.
3. 2.- MATERIAL Y ~DOS.
3 • 2 .1.- RECOLECCrON DE LAS MUESTRAS URINARIAS
Se recoqieron orinas de 24 horas de los sujetos es
tudiados, en recipientes de poliprolipropileno sobre 40 mg de i~
dometacina a una concentraci6n final de 5.10-5 M, suficiente pa
ra inhibir la posible qeneraci6n de TXB2 por parte de las c61u
las que pueden aparecer ocasionalmente en la orina de 6stos pa
cientes (60). Una vez terminada la recolecci6n, se centrifuq6
una alicuota de 10 ~ de cada orina a 4°C y 1000 q durante 10
-22-
minutos, conserv,ndose alicuotas de la misma de 3 ml en tubos
de prolipropileno a·-80°C hasta su· procesamiento.
3. 2.2 • .- DD\LUIS
Se inve~tiq6 la posible presencia de sustancias in
terfirientes mediante un expertmento de di4lisis. Estos interfi
rientes podr!an ser capaces de alterar el ~librio ant!qeno
anticuerpo y/o de adsorberse sobre las part1culas de carb6n re
vestidas de dextrano con mayor afinidad que los ant!qenos libres
~pidiendo, de ~ste modo, su separaci6n del medio de reacci6n.
Se dializaron 5 orinas (al!cuotas de 2 ml ) con una membra
na de 4'8 nm. de tamafio medio de poro Cltmite de exclusiOn mole
cular de 12.0001 durante 15 h. frente a 1.000 voldmenes de aqua
a 4°C con un intercambio en la octava bora. Al finalizar el pro
ceso, se anadi6 TxB2 a las distintas muestras para obtener dis
tintas concentraciones del metabolito.
3.2.3.- EXTRACCION
Las mueetras urinari:as (1 ml 1 fueron acidificadas
a pH 3'5 con 4cido fOrmico 2M (Merckl, midiendo el pH con un po
tenci6metro {~RrSoN, pH/mVmeter diqit 5011 y con tiras reactivas
de alta sensibilidad {Spezialindikator-papier y Urines indikator-
-23-
papier, Merckl. Posteriormente fueron extratdas, una vez, con un
voldmen doole de cloroformo o acetado de etilo (Merkl, los cua
les se muestran apropiados para la extracciOn de prostaglandi
nas y tromboxanos (102).
Tras agitar cada tubo durante 30 s. y centrifugarlos duran
te 5 minutes a 1.000 g y temperatura ambiente, se tomaron 1,8 ml
de la fase org4nica (superior en las extracciones con acetato de
etilo e inferior en las· extracciones con cloroformo), evapor~nd~
se estas a sequedad en atmOsfera de nitrOgeno a temperatura am
biente. Despu~s se resuspendi6 el extracto en el mismo volGmen
de~n fosfato {muestras para radioinmunoensayo) o fase m6vil
inicial (muestras para cromatograf.ta liquida de alta eficacia en
fase reversa;CLAE-FR) •
Para determinar la efectividad de la extracciOn se adicio
nO 3H-TxB2 a 10 muestras de orina, cont4ndose su radiactividad
tras la extracci6n. As!mismo se extrajeron por duplicado con ca
da extractante distintas soluciones acuosas de TxB2 de concentr~
ciOn conocida estudi4ndose la linearidad de ambas curvas.
3.2.4.- CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA
Las muestras urinarias fueron extra!das previamen
te a ser sometidas al proceso cromatogr!fico, el cual se llev6 a
cabo con un equipo Waters compuesto por dos bombas de doble cabe
za con pist6n alternante M-510, un inyector de voldmen variable
-24-
de hasta 2 m1 de capacidad U6K, un detector u1travioleta Lambda
Max M-841, un proqramador de qradientes M-680 y un reqistrador
inteqrador M-730. La columna uti1izada fue una ;u-Bondapak c18
de compresi6n radial (8 x 100 mm) de 10 )UM de tamano de partt
cula. En todos los cases se utiliz6 una lonqitud de onda de 210
~y un flujo de 2 ml/min.
Los disolventes orqAnicos utilizados fueron de pureza cro
matoqrAfica (Merck, Scharlau} prefiltrados a trav~s de un fi1tro
de 0,45 ..,...um y desqasificados con ultrasonidos (Brandsonic-12) d~
rante 15 minutes previamente a su utilizaci6n. El aqua utilizada
fue bidesti1ada, prefi1trada a trav~s de un filtro de 0,2 )Um y
desgasificada a vacto con agitaci6n continua durante 20 minutos.
Se ensayaron e1uciones tanto isocr4ticas como con qradien
tes (lineales, c6ncavos y convexos), para consequir el pico mAs
extrecho y sim~trico en las muestras cromatoqrafladas.
Las fracciones elutdas se recoqieron en un colector LKB-2112
REDIRAC a distintos tiempos, para ser sometidas posteriormente a
radioinmunoensayo o contaje de radiactividad.
3.2.5.- RAOIOINMUNOENSAYO
Para la determinaci6n de los niveles de TxB2 en
orina por radioinmunoensayo se han utilizado los componentes de
un equipo comercial fabricado por la firma New Enqland Nuclear
(Drieich, RFA) para determinaciones plasm4ticas.
-25-
El ~rincipio del ensayo es la inhibiciOn competitiva de la
uniOn del ant1geno marcado radiactivamente <.3H-TxB 2 en ~ste ca
so) a un anticuerpo espectfico (Ac) par parte del ant1geno sin
marcar (.TxB2). Este equilibria se rige por la ley de acciOn de
masas {10 3} •
El ant1geno marcado utilizado posee una actividad de 50~i/
nmol (1.860 kBq/nmol) y se obtiene enzimaticamente a partir del
&cido (.5, 6, a, 9, 1,1, 12, 14, 15-3H8
) -araquidOnico. El anticuer
po se obtiene por inmunizaciOn de conejos con un conjugado de
TxB2 y albdmina bovina. El ensayo se realiza en un media tamp6n
fosfato SO mM (pH=7 1 3l con 0'1% de gelatina (utilizada para re
vestir las paredes de los tubas de grupos polares y evitar ast
la adsorci6n sabre ellos de las inmunoglobulinas) y 0'01% de ti
merosal como conservante.
En cada an!lisis se determin6 la uniOn inespec1fica (tubas
en los que s6lo hay tamp6n y 3H-TxB2) y el m&ximo de uni6n (tu
bas en los que hay 3H-TxB 2 y Ac, pero no TxB2), el cual es nece
sario para calcular el porcentaje de uniOn de los ant1genos de
patrones y problemas. Tambi~n se incluyeron tubos para la medida
de la actividad del 3H-TxB 2 que se adiciona a todos los tubas
("totales"), los cuales s6lo !levan ant!geno marcado dilutdo con
tamp6n al vol~en final de todas las muestras; su radiactividad
se mide directamente, sin someterlos al proceso de separaciOn.
A partir del contaje de estos tubas y del mAximo de uni6n, se
puede calcular el porcentaje de uni6n del ant1geno al anticuerpo
mediante la expresi6n:
-26-
M-B X 100
T B
M Media de las cuentas del rn!ximo de uni6n.
B Media de las cuentas del blanco.
T Media de las cuentas del total.
Las soluciones patr6n de trabajo se obtuvieron mediante
diluciones seriadas,, realizadas en cada ensayo, a partir de una
soluci6n de 100 ng/ml {227' 2 nmol/ll de TxB 2 (_soluci6n P) seg6n
el siguiente esquema:
a) 200 .,..ul soluci6n p + 1'8 ml tarnp6n
bl 2'0 ml soluci6n a + 2'0 ml " 5'0 ng/ml
c) 2'0 ml soluci6n b + 2'0 ml 2 1 5 ng/ml
d) 2'0 ml soluci6n c + 3'0 ml •• 1'0 ng/ml
e) 2 1 0 ml soluci6n d + 2'0 ml o•s ng/ml
f) 2'0 ml soluci6n e + 2'0 ml 0 1 25 ng/rnl
g) 2'0 ml soluci6n f + J'O ml 0 1 10 ng/ml
h} 2'0 ml soluci6n 9' + 2'0 ml " 0'05 ng/rnl
Cuanto mayor es la concentraci6n de TxB2 {de patrones o
problemas}, me nos mol~culas de 3H-TxB 2 estar4n unidas al Ac con
lo cual la radiactividad de esta fr.acci6n ser4 menor, aumentan-
do la que contenga a los ant!genos libres (1041.
Las muestras urinarias y los patrones tras la extracci.6n
y/o cromatografta se sometieron al esquema de trabajo mostrado
en la Tabla I.
TABLA I.- VARIABILIDAD DE LA TSCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACION DE LOS
NIVELES URINARIOS DE TxB 2 •
VOLOMEN/TUBO (u1)*
ACTIVIDAD "CERO" DE UNION •PATRONES 0 INESPECIFICA TOTAL muON INESPEC!FICA PROBLEMAS DE PROBLEMAS
----I
IV TAMPON FOSFATO 900 300 400 200 300 o,J
I
PATRON 0 PROBLEMA - - - 100 100 3H-TxB 2 100 100 100 100 100
ANTICUERPO - 100 - 100
* Todos los ensayos se realizaron por dup1icado
-28-
Despu~s de agitar los tubos tras la adici6n de cada react!
vo, se incubaron estos 20 horas a 4°C. Posterior.mente, se mant~
vieron durante 10 minutos a 0°C en bano de hielo y se anadieron
500 pl de una suspensi6n al 0 • 5% de carb6n neutro Norit A y <>'5%
de Dextran T-70 en ~ fosfato 10 mM, agitando inmediatamente
los tubos. Al cabo de 15 minutos de incubaci6n en el bano de
hielo, se centrifugaron estos en una centr1fuga refrigerada
IEC PR-6.000 durante 10 minutos a 1.000 g y 4°C con lo que en
el sobrenadante quedaron los complejos TxB2-Ac y 3H-TxB2-Ac y
en el precipitado, los ant1genos libres (T.xB2 y 3a-TxB2) (Fig~
ra 8). Se tomaron 0 1 7 ml de sobrenadante y se transfirieron a
viales de vidrio de 20 ml de capacidad, anadiente 10 ml de 11-
quido de centelleo ATOMLIGHT {New England Nuclear}, cont4ndose
su radiactividad en un contador de centelleo para emisores beta,
(Mark II Nuclear Chicago, Searle), a 4°C, con una eficiencia de
contaje para tritio del 60%.
Una vez conocida la actividad de cada muestra, se constru-
y6 una curva de calibrado representando enabscisas la concentra
ci6n de ant!geno {o una funci6n de la misma} y en ordenadas una
funci6n del porcentaje de uni6n de la fracci6n libre o de la uni
da, respecto del m!xtmo de uni6n. Por interpolaci6n en estas cur
vas se obtiene la concentraci6n de ant!geno de los problemas.
El material empleado en todo momenta en la manipulaci6n de
las muestras (contenedores, tubos, puntas de pipetas, etc ••• )
fue de pol1propileno.
Se estud16 la fiabilidad general de la t~cnica en los aspe£
tos de:
• • Ag ~ Ag-Ac Ag-Ac .~ Ag-Ac + Ac + Ag + Ag ~ · • Contajo radiactividad
~ Ag-Ac I Ag• N Ag+AQ \0 I
lncubac:lon Sepa rac:ton
FIGURA 8.- Esquema de un proceso de radiOinmunoensayo.
paralelismo
precisiOn
- exactitud
-30-
- especificidad e interferencias medicamentosas
- sensibilidad
as1 como las condiciones mas adecuadas para su desarrollo:
- pH 6ptimo de la extracci6n org4nica
material de m.anipulaci6n de las mues-tras y reactivos
- condiciones de almacenamiento de las muestras
- tratamiento de los blancos
- influencia de los tiempos de incubaci6n.
Tambi~n se determin6 el range de normalidad de los niveles
de TxB 2 en orina y la influencia que sabre estes ejercen la pr~
sencia de c~lulas sanguineas y la cirugia (.laparotomia explor~
toria) •
3.2.6.- PROCEDIMIENTOS ESTAD!STICOS
Los resultados del proceso de radioinmunoensayo se
analtzaron utilizando la curva de dosis~respuesta que mejor se
ajust6 matematicamente a la distribuci6n experimental de los p~
trones. El estudio de las curvas de calibrado en coordenadas lo
git-log (105) y de los coeficientes de variabilidad se llev6 a
cabo mediante un programa escrito para una calculadora progr~
ble HP-97, el cual, adem4s de proporcionar las concentraciones
interpoladas de los problemas, suministra la ecuaci6n de la rec
-31-
ta de calibrado y su coeficiente de correlaci6n. Todos los re
sultados se expresan como media±. desviaci6n tipica (.x .±.OS),
excepto los valores normales de TxB2 urinario que se expresan
como x + 2DS.
3.3.- RESULTADOS
3.3.1.- PURIFICACION DE LAS MUESTRAS
3.3.1.1.- orJU.·rsrs
La realizaci6n directa del radioinmunoensayo sa
bre las muestras urinarias centrifugadas, tanto en orinas de s~
jetos sanos como de transplantados, adic~onando o no TxB 2 ex6g~
no, conduce a contajes de radiactividad superiores a los del m4
ximo de uni6n (o sea, valores de la fracci6n de ant!geno marca
do ligado superiores al 100%). En todos los casas el pH de las
disoluciones de cada tuba en d6nde se 1levaron a cabo los ensa
yos fue el mismo del tatllp6n fosfato utilizado (7'3).
El an41is·is por radioinmunoensayo de las muestras dializa
das aparece en la Figura 9 en d6nde se puede observar que el pr£
ceso de di~lisis elimina en gran medida las interferencias, pas!
bi1itando el an41isis de las mismas. Sin embargo, este proceso
es lento y no plenamente eficaz por lo que se impone la utiliza
ci6n de un m6todo alternative de purificaci6n (102, 106 .... 113) •
95
90
80
so
20
to
5
.os .1
-32-
.25 .5 1.0 25
Tx82 (ng/ml)
5.0
FIGURA 9.- Representacion de una curva de calibrado (e) y de las mismas
concentraciones de TxB2
analizadas en orinas dializadas (•).
-33-
3.3.1.2.- EXTRACCION ORG.l\NrCA
Se extrajeron 10 muestras de orina a las que se ad!
cionaron 1.400 cprn de 3a-TxB2 segan el esquema expuesto en el
apartado 3.2.3., tanto con cloroformo como con acetato de etilo.
La extracci6n con cloroformo resulta ser ligerarnente mas efect!
va {90%.!. 2'9%) que la realizada con acetato de etilo (83.!. 3'1%),
presentando el prirne~o la ventaja de una mas f~cil evaporaci6n.
As!mismo, se extrajeron soluciones de TxB 2 de concentraci6n co
nocida con ambos disolventes, obteniendo una rnejor correlaci6n
con cloroforrno (r = 0'9963) que con acetato de etilo (r=0'9817).
3.3.1.3.- CROMATOGRAF!A LlQUIDA DE ALTA EFICACIA EN
FASE REVERSA (CLAE-F·R).
Las condiciones mas adecuadas de eluci6n del TxB 2
se determinaron inyectando en el cromat6grafo muestras acuosas
de concentraci6n conocida una vez extra!das y reconstitu!das en
la fase m6vil. En la Figura 10 se muestra el cromatograma obte
nido al eluir 5 }19 de TxB 2 en condiciones isocr4ticas de aceto
nitrilo-agua-4cido trifluoroac~tico (26: 74: 0'02, vol/vol/vol,
pH = 3) que son simi1ares a las que se han utilizado en el an4-
lisis general de prostaglandinas (111, 114-117). E1 pico apare
ce a un tiempo de retenci6n de 32 minutos, siendo ancho y lige
ramente asim~trico. Para disminuir e1 tiernpo durante el cual
e1uye el TxB2
, se ensayaron gradientes tanto lineales como c6n
-34-
..::.:. b s.
0 5 25 30 35
tiempo (min.)
~GURA 10.- Cromatoqrama obtenido a1 ana1izar una muestra acuosa de TxB2
•
Condiciones: e1uci6n isocratica con ca3
-CN: a2o (23: 76) a pH=3
F1ujo: 2 m1/min.
VolGmen de inyeccion: 25 1
u1.
Lonqitud de onda: 210 nrn.
-35-
cavos y convexos. En la Figura 11 se muestra con 11nea continua
el pico obtenido tras eluir una muestra isocr4ticamente durante
30 minutos con acetonitrilo-aqua-4. trifluoroac~tico (20: 80:
0'02) sequido de un qradiente liqeramente c6ncavo {linea 8 del
proqramador) durante 10 minutos hasta unas condiciones finales
de acetonitriloaqua-4. trifluoroac~tico (40: 60: 0'02). Tras c~
da an4lisis se l~pi6 la columna durante 15 minutos con acetoni
trilo al 100%. De es~a manera, se consique un pico de absorci6n
sim~trico y estrecho cuyo tiempo de retenci6n es de 39'1 + 0'04
min. (n=lO) y que eluye en, aproximadamente, 1 minuto. En la Fi
gura 11 se representa en l!nea de puntos el radiocromatoqrama
obtenido tras inyectar 5.300 cpm de 3H-TxB 2 y recoqer fraccio
nes cada minuto. La recuperaci6n de la radiactividad resulta
ser del 79~ ± 3% (n=9), siendo el coeficiente de variabilidad
intram~todo del 9% (n=lO} y d1a a d1a, del 13% (n=lO). En la Fi
gura 12 se muestra el cromatoqrama que se obtiene tras extraer
una muestra urinaria a la que se hab!an afiadido 10 }lq/ml de
TxB2• El pico del metabolito muestra un coeficiente de resolu
ci6n, Rs, de 0'9, siendo la eficacia de la columna, N, de 11.000
platos te6ricos. La mtn~a cantidad de TxB2 detectable es de 25
nq/ml.
El an4lisis por radioinmunoensayo de las fracciones eluidas
tras afiadir 10, 20, 50, 100 y 200 nq de TxB 2 por mililitro de
orina, muestran una recuperaci6n media del 76% ± 7% (n=5), exis
tiendo una relaci6n lineal entre los valores de TxB2 determina
dos tras extracci6n y cromatoqraf!a y los obtenidos tras extrac
ci6n unicamente (f-0'51 + 1'19 x; r = 0'8993, n=20).
. .. c .
A . A
<
-36-
30
3
35 40 45
tiempo (min,)
FIGURA 11.- Cromatograma de una diso1uci6n acuosa de TXB2 y radiocromatograma
de 3H-TxB 2. E1uci6n isocratica con CH3-CN: H2o (20: 80) durante
30 min. Posterior gradiente concavo durante 10 min. hasta CH3..CN:
... u c .. .0
0 .. A
<
H2o (40: 60). Demas condiciones igua1 que en FIGURA 10 •
tlempo (min.)
FIGURA 12.- Cromatograma de una muestra urinaria a'1a que se afiadio TxB2
~ogenamante tras eKtracci6n con cloroformo, evaporaci6n y resus-_...., __ .: :::: ......... - ..~: ___ -~~-.:'.. ~ -:-! ...
-37-
3 • 3. 2 • • INFLUENCI'A DEL ·pH URINARIO
Se estud16 la variac16n de los niveles urinarios
medidos, para tres concentraciones distintas de TxB2 (n=lO en
cada nivel) al extraer las muestras a 5 pHs distintos. En la
Tabla II se muestran los resultados encontrados. En ella se
puede apreciar que no existe una variaci6n significativa en la
cantidad de TxB 2 detectada en el rango de pH comprendido en
tre 3 y 4. Este hecho hace que el pH pueda ser ajustado tan
to con potenci6metro como con tiras reactivas de suficiente
precisi6n.
3 • 3. 3.- PRECAUCIONES EN LA MANIPULACION Y ALMACENAMIENTO
DE LAS MUESTRAS.
Tanto el TxA2 como el TxB2 poseen la propiedad de
adherirse inespec!ficamente a las superficies de los recipien
tes que contienen sus disoluciones (118). Para tratar de mini
mizar este efecto se estudiaron 10 muestras de orina recogidas
en probetas de polipropileno de las cuales se almacenaron al!
cuotas a -80°C durante 24 h en tubos de vidrio, polietileno y
polipropileno, que son los m~s empleados habitualmente en los
la.boratorios. Posteriormente, se analizaron las muestras por
radioinmunoensayo tras extracci6n, utilizando en todo momento
material de polipropileno para manejar (puntas de pipetas) y
contener (tubos de ensayo) las muestras. En la Figura 13 se
TABLA II.- INFLUENCIA DE LAS VARIACIONES DEL pH
NIVEL pH .[T_x. ~2J.(_ng/rnl)
3'00 0'43
} 3 1 25 0 1 44
BAJO 3'50 0 1 42 c.v. a:: 7%
I I
3 1 75 0'36 w C)
I 4 1.00 . ...... 0. 1.41.
3'00 1 1 00
J 3'25 0 1 97
3'50 1'06 c.v. := 4% ~ ( VARIABILIDAD MEDIO INTRAENSAYO 3'75 1 1 00
4 1 00 0'96
3'00 3'20
} c.v. = 5%
3.'25 3'10
ALTO 3'50 3 1 30
3'75 3'30
4'00 2'90
-39-
PERDIDAS POR EL MATERIAL
• OJ0 perdida
100
% 50
"OLII'RO,.ILENO VIOIIIO ,.OLIETIUNO
0
FIGURA 13.- Porcentaje de disminucion en los niveles de TxB2 medidos
tras a~cenar 10 muestras urinarias en contenedores de
vidrio y polietileno durante 24 horas a -aooc respecto de
los encontrados tras almacenar las muestras en polipropi
leno.
-40-
puede observar el porcentaje de p~rdidas encontradas al almace
nar las muestras con los distintos materiales.
Asimismo se ha investigado la influencia del tiempo de al
macenamiento, tanto de las muestras como de los extractos recons
tituidos en tamp6n fosfato, sobre los niveles de TxB 2 que se mi
den. Para ella se han analizado 10 muestras de orina y sus ex
tractos, tanto en el dia de su recogida como a los 3, 15, 30,
90 y 120 dtas de a~acenamiento a -80°C en tubas de polipropil~
no. La Figura 14 muestra que en los extractos existen p~rdidas
significativas ya a los 15 dias de almacenamiento, llegando a
ser del 40% a los 4 meses. Sin embargo, en las muestras urina
rias sin extraer no se detectan p~rdidas hasta despu~s de seis
meses de almacenamiento.
3.3.4.- TRATAMIENTO DE LOS BLANCOS
Debido a que la introducci6n de un proceso previa
de purificaci6n podr1a originar algun tipo de interferencias,
se sometieron al proceso extractive a 10 alicuotas de 1 ml de
tamp6n fosfato con concentraciones conocidas de TxB2, las cua
les se ensayaron par radioinmunoensayo al igual que las mismas
muestras sin extraer y que los blancos correspondientes a cada
punta de la curva de calibrado. Todas ellas mostraron contajes
de radiactividad similares· que nunca representaron mas de un 5%
del valor del m~~o de uni6n. Las muestras urinarias estudia
das se ensayaron as1mismo con su blanco correspondiente, no en
-41-
PEROIDAS POR ALMACENAMIENTO DEL EXTRACTO ( - 80 ·c )
10
%
50 3 15 2 3 4
Basal dias diu mes meses meses meses
~ •f. PERDIDA ( x de 10 determin.tc1ones)
FIGURA 14.- Porcentaje de disminucion en los niveles de TxB2
medidos tras
almacenar el extracto reconstitu!do en tamp6n fosfato SO mM,
pH 7'3, en contenedores de polipropileno durante distintos pe
r!odos de tiempo.
-42-
~ontrando en estos, contajes de blanco superiores al 6% del m~
.::imo de uni6n.
3 • 3. 5.- CALCULO DR RESULTADOS
En la Figura 15 se muestra la curva de calibrado
~ue se obtiene al representar la fracci6n de ant!geno marcado
~igado respecto de la actividad total {%(B/BT)), o bien respec
~o del m~ximo de uni6n {% (B/B0)l, frente ala concentraci6n de
·.!:xB2 en papel milimetrico. El valor de % (B/B0) se calculo me-
-~iante la expresi6n:
p - B. ----------X 100, d6nde
M- B
Media de las cuentas del problema o patr6n.
Media de las cuentas del blanco
!1 Media de las cuentas del m!ximo de uni6n.
~a curva que resulta es de dif!cil trazado, mostrando una pen
~iente muy elevada en la zona de concentraciones. bajas que difi
~ulta la interpolaci6n en esa zona.
En la Figura 16 se representa la misma curva pero tomando
en abscisas una escala logar1tmica. Resulta as! una curva sigma!
de que es ampliamente utilizada pero cuyo trazado puede ser bas
~ante azaroso, no permitiendo, adem4s, una sencilla comparaci6n
entre distintas curvas de calibrado. Sin embargo, los puntos de
la curva de calibrado se ajustan bien· .. a una recta en el rango de
-43-
9 /e., Bf9a •100 •\00
60 Mlt.IMETRICO
100
80 40
60
20 40
-5 2
FIGURA 15.- Radioinmunoensayo de TxB2 . eurva de calibracion representada. en escala mil~etrica.
lOO SEMI· LOG
60
60
.os ·1 -25 -5 1 2-5 5
[TxB~(ng /ml)
FIGURA 16.- Radioinmunoensayo de TxB2 . Curva de calibracion representada en la escala semiloqar!tmica.
-44-
o•s a 5 ng/ml (0'14- 11'36 nmol/1} si se utiliza una represen
t:.aci6n logit-log (Figura 17}. En ella, en ordenadas se represe.!!_
t:.a el logit de B/80 , que se calcula mediante la siguiente ecua
ci6n:
Logit (B/B0) Ln (% B/B
0)
100 - (%B/B0}
y en abscisas el logaritmo de la concentraci6n de ant!geno. En
la misma Figura se muestran los l!mites de confianza del 95% in
-:.raensayo.
El trazado de esta curva puede realizarse de manera sencilla
~ediante ajuste por m!nimos cuadrados. Para ello se escribi6 un
~rograma adaptado a una calculadora programable Hewlett-Packard,
;aP-97, q~e tambi~n puede desarrollarse en los modelos HP-67 y
3P-41. Este programa, a partir de los valores del % B/B0 de los
~atrones, suministra la ecuaci6n de la recta en escala logit-log
:· su coeficiente de correlaci6n, permitiendo realizar en ella,
~e manera autom~tica, interpolaciones de los valores de la frac
=i6n de ant!geno marcado ligado para obtener directamente sus
~oncentraciones; o bien, calcular el valor del % B/B0
correspon
~iente a una determinada concentraci6n de ant!geno. En la Sec
=i6n 7 se muestra el listado del programa y la manera de utili
..zarlo.
3.3.6.- FIABILIDAD DE LA T£CNICA
olOO
50
40
30
20
10
x':Lnx
y'= log it y = Ln y
100-Y
-45-
LOG IT· LOG
Y•-1.061 -2.214 x
r• -.9998
Log it
3
2
0
·1
·2
3~--------~-----------------------~----------------~-----------~----------------~ .14 .27 .68 1.36 2.72 6.81 11.36
(rxa2] (n mol/1>
.OS .1 .25 .5 1.0 2.5 5.0
[TxB2] (ng jml)
FIGURA 17.- Radioinmunoensayo de TxB2• Curva de calibracion representada en escala
logit-log, mostrando los niveles de confianza del 95\ intraensayo.
-46-
3 • 3 • 6 .1.- ?1\RALELl:SMO
La realizaci6n de una prueba de paralelis
mo es un procedtmiento dtil en el estudio de la presencia de efe~
~os inespec1f1cos en un radioinmunoensayo y m's si las muestras
nan sido sometidas a un proceso previo de purificaci6n, concentra
=i6n, etc ••• (98). Se sometieron tres muestras de orina con vale
res altos de TxB 2 a d~luciones seriadas al 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16.
Eri la Fiqura 18 se muestra una t1p1ca curva de diluci6n (b) y
una de calibrado la), siendo sus ecuaciones:
Curva de calibrado: y
Curva de diluci6n: y
-1'82 -2'07x; r
-1 1 22 -2'14x; r
-0'9984_
-0'9965
La realizaci6n de una prueba de comparaci6n entre pendien
t:es muestra que no existe diferencia siqnificativa (p > 0 '95} en
tre ellas.
3.3.6.2.- PRECISION
Se estudi6 1a precisiOn del m~todo a tres
niveles distintos de concentraci6n urinaria de TxB2, tanto intr~
ensayo como d!a a d!a. En ambos casos los resultados se expresan
en forma de coeficiente de variabilidad (CV) (Tabla III}, seqdn
~a expresi6n:
DS 'cv = X 100, d6nde
-47-
90
B I 8 0
.100
70
50
30
10
.1 .25
1/16 118
.s
DILUCIONES
1/4 112
1.0 2.5 [r x s2] ( ng 1 ml )
111
SD
FIGURA 18.- Paralelismo entre los valores de TxB2 inmunorreactivo contenido
en sucesivas diluciones urinarias (b) y una curva de calibrado (a).
TABLA III.- VARIABILIDAD DE LA TgCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACION
DE LOS NlVELES URINARIOS DE TXB 2 •
n i (ng/m1) DS {ng/m1) c.v. (%) --- ----.
20 0'20 0'014 7'0
INTRAME:TODO 20 0'70 0'032 4'6 I
i ~
20 2'15 0'118 5'5 CD I
15 0'30 0'038 12'7
D!A A D!A 16 0'85 0'087 10'2
14 2'04 0'230 11'3
-49-
como antes x representa la media de los valores obtenidos a ca
da nivel y DS su desviaci6n t!pica.
Todas las muestras se ensayaron por duplicado. La realiz~
ci6n del ensayo por triplicado no mejora la reproductibilidad
en mas del 0'5% a cualquier nivel.
3.3.6.3.'C"' EXACTITUD
Se estudi6 la exactitud adicionando a una muestra
de orina cantidades conocidas y crecientes de TxB 2 tanto en el
rango fisio16gico como a niveles superiores e inferiores. En
la Figura 19 se representan los valores medidos frente a los
calculados teoricamente. El valor de la ordenada en el or!gen
de la recta obtenida coincide con el valor end6geno de TxB2 de
la muestra urinaria.
As1mismo, debido a que en ocasiones pueden encontrarse va
lores muy elevados de TxB 2 en las muestras a ensayar, y sea ne
cesario realizar diluciones de ~stas, se estudi6 el efecto de
las diluciones sobre el extracto reconstitu!do, encontrando que
para tres niveles distintos de concentraci6n de TxB 2, los resu!
tados obtenidos son proporcionales a las diluciones realizadas
(Figura 20) •
-so-
i .... 5.0 .. ~
0 ~
:; • E C'f
CD ac 2.5 1-
t.O
1.0 25 5.0
TxB2 te6rlco (ng/ml)
-=~ 19.- Exactitud del analisis de Tx82 realizado mediante el ensayo de muestras urinarias a las cuales se adicionaron cantidades conocidas y crecientes de TxB2 •
e -Cit c
OILUCION&S
-=GURA 20.- Proporcionalidad entre concentraciones de TxB medidas en sucesivas diluciones de los extractoa reconstitu!dos a ~ niveles distintos de concentraci6n del metahollto.
-51-
3. 3. 6. 4.- ESPECIFICIDAD' E INTERFERENCIAS MEDICAMEN-
·~.
La especificidad del anticuerpo utilizado, calcula
da a partir de la cantidad de compuesto necesaria para provocar
un 50% de desplazamiento del ant1geno marcado, aparece en la Ta
bla IV. Para los compuestos de PGA2, PGB2 y !cidos linoleico,
oleico, palm!tico y a~aquid6nico, el porcentaje de reacci6n cru
zada es inferior a 0 1 001 (=50 pg de compuesto) •
Se estudi6 la posible interferencia de diversos farmacos ad
ministrados habitualmente a sujetos transplantados. El ensayo de
disoluciones acuosas de furosemida, 6-metil-prednisolona, predn!
sana, azatioprina y tobramicina a las concentraciones urinarias
teoricamente mas elevadas posibles, no muestran interferencias
con el ensayo. Del mismo modo sucede con la indometacina a las
concentraciones utilizadas en la recogida de las orinas.
3.3.6.5.- SENSrB~.
Generalmente se suelen utilizar dos definiciones di~
tintas para la sensibilidad: una la describe en t~r.minos de la
pendiente de la curva de dosis-respuesta; esto es, el cambia en
la respuesta para un cambia dado en la dosis; la otra, se refiere
a la menor cantidad de sustancia (ant!geno sin marcar) que puede
distinguirse de la ausencia de ant!geno con precisi6n aceptable
{m!n~o detectable). En el analisis de prostaglandinas, ~sta dlti
-52-
TABLA IV.- ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO UTILIZADO EN LA
DETERMINACION DE NIVELES URINARIOS DE TxB2 •
COMPUES'l'O
TxB2
PGD2
PGE2
PGF2
6-ceto-PGFl
PGA2
%. DE REACTIVIDAD CRUZADA
100
2'0
0'1
O'l
0'08
0'005
-53-
ma es la acepci6n mas empleada (100, 119). En la practic~ se con
sidera que esta cantidad de ant1geno es la que provoca un 10\ de
desplazamiento del m!xtmo de uni6n; la cual, en el radioinmunoen
sayo utilizado, ha resultado ser de SO pg/ml (0'14 nmol/1) de
La avidez del anticuerpo es de 3.109 M-l y la capacidad me
dia de uniOn del ant1geno al anticuerpo del 45% ~ 2\ (n=20),
siendo la cantidad de·TxB 2 capaz de provocar un 50\ de desplaza
miento del ant1geno marcado, de 0'52 ng/ml (1'41 nmol/1).
3.3.7.- INFLUENCIA DE LOS TIEMPOS DE INCUBACION.
El per1odo de incubaci6n con el anticuerpo no resul
t6 ser determinante de los resultados obtenidos entre 18 y 24 ho
ras (Figura 21).
En la Tabla V se muestra la influencia del tiempo de incuba
ci6n de los tubos con la suspensiOn de carbOn y dextrano. Este
tiempo influye mucho mas sobre los resultados finales obtenidos
que el de la incubaci6n de la mezcla de reacci6n.
3 • 3 • 8 • - PRESENCIA URINA:RIA DE Cl:LULAS SANGUINEAS.
Debido a que la hematuria es relativamente frecuente
en el postransplante inmediato, se investig6 la influencia de c6-
90
70
50
30
tO
-54-
INFLUENCIA DEL TIEMPO DE INCUBAC ION
• i
•: 16 horas
4! 18 .. a: 22 .. •: 24 ..
.os .1
• I
.25
• D •
.s
• I
• I •
2l
1.0 2.5 5.0
[rxe2J (ng/ml)
~IGURA 21.- Puntas de las curvas de calihrado obtenidas a distintos tieapos de
incubacion de la mezcla de reaccion.
-ss-
TABLA V.- INFLUENCIA DEL TIEMPO DE INCUBACION DE LA MEZCLA DE - --REACCION CON LA SUSPENSION DE CARBON Y DEXTRANO SO-
BRE LOS NIVELES DE·. TxBr
TIEMPO DE INCUBACION (.mi.nutos)
5
10
15
20
25
DISMINUCION DE LA RAOIOACTIVIDAD DE LA FRACCION UN IDA . ( \)
35
8
10
28
-56-
_ulas sanguineas bien conservadas (hematies, leucocitos y plaque-
~as) y de estas mismas pero lisadas (hemolizado) sobre la determi
~ac16n en orina de los niveles de TxB2 • Para ello se adicionaron
~istintas cantidades de c~lulas y de hemolizado a muestras urina
=ias que conten1an 0'23 nq/ml (0'62 nmol/1) de TxB2 end6geno. Una
~l!cuota de cada qrupo se extrajo tras incubarla 24 horas con las
~~lulas en presencia de indometacina 5.10-S M y otra en ausencia
~e esta, a 22°C. El porcentaje de incremento en los niveles de
'!'xB2 respecto de los basales se determin6 mediante la expresi6n:
x-c % de incremento ~ ------ X 100, d6nde
c
x es la concentrac16n final de TxB 2 encontrada en las orinas y
_ la concentraci6n end6qena inicial de las mismas.
La extracc16n y ensayo de las orinas tras 24 horas de incub~
~i6n con las c~lulas o hemolizado sin indometacina conduce a una
elevac16n en las concentraciones de TxB 2 que es mucho mas importa~
teen el caso de las c6lulas no lisadas (Tabla VI}. Sin embarqo,
la 1ncubac16n en presencia de indometacina reduce dr!sticamente
la qenerac16n ex6qena de TxB2 (Tabla VII) •
J. 3. 9 • - VALORES NORMALES
Con el .fin de establecer un intervale de referencia de los
valores urinarios de TxB2, se estudiaron sus niveles en la orina
de 24 horas de 12 sujetos (9 varones y 3 mujeres) de edades com
prendidas entre 16 y 40 anos, recogidas segdn el m~todo expuesto
-57-
TABLA VI.- EFECTO DE LA PRESENCIA DE C£LULAS LISADAS Y NO
LISADAS TRAS 24 HORAS DE INCUBACION CON LAS ORINAS
SIN INDOMETACINA.
C£LULAS LISADAS
% EN ORINA
0'8
1'0 1'7 8'3
12'5
0'8
1'0
C£LULAS NO LISADAS 1'7 8'3
12'5
% ELEVACION
39
78
378
156
572
2.488
TABLA VII.- EFECTOS DE LAS C£LULAS LISADAS Y NO LISADAS TRAS 24
HORAS DE INCUBACION CON LAS ORINAS EN PRESENCIA DE
INDOMETACINA 5.10-5 M.
' EN ORINA ' ELEVACION
2'5 21 CELULAS LISADAS 12'5 21
25 21
2'5 29 CELULAS NO LISADAS 12'5 31
25 43
-sa-
en 3.2.1. Ninquno de estos sujetos tom6 inhibidores de la cic1o
oxiqenasa durante, al menos, una semana antes de 1a recolecci6n
de las orinas. Los valores encontrados fueron:
X
DS
0'47
0'120
ng/ml (1'27 nmo1/1)
" x + 2DS 0'23-0'71 ng/m1 (0'62-1'92 nmol/1)
Ranqo: 0'32-0'74 (0'87-2'01 nmol/1)
Tambi!n se estudiaron los valores normales del cociente
TxB2/Cr urinarios encontrando en 1a misma muestra de indiv!duos
los siguientes resultados:
0'35 nq/mg
DS 0'130
X + 2DS 0'19 - 0 1 71 " Rango: 0'21 - 0'64
3.3.10.- ~NFLUENCIA DE LA CIRUG!A
Todos los sujetos transplantados son sometidos a un
proceso quirdrgico que conlleva una activaci6n de la coagulaci6n
sangu!nea y un aumento en la s!ntesis de TxA2• Por ello se estu
diaron los niveles urinarios de TxB2 durante los tres primeros
d!as de evoluci6n postquirdrgica en 5 sujetos sometidos a cirug!a
(laparotom!a exploratoria) no complicada, encontrando una eleva
ci6n significativa en el d!a 2 desde valores de 0'61 ± 0'50 ng/ml
~59-
a 1'05 + 0'44 ng/ml (p<O'OS, prueba de Wilcoxon de la escalade
clasificaci6n con signo), retornando posteriormente los niveles
de TxB2 a valores basales (0'41 + 0'21 ng/ml).
-60-
3.4.- OISCUSION
El radioinmunoensayo es un m6todo adecuado para la deter
minaci6n seriada de los niveles urinarios de TxB 2 cuando es neces~
rio realizar un elevado ndmero de determinaciones en un per1odo r~
lativamente corto de tiempo y con fiabilidad. El radioinmunoensayo
proporciona un m6todo r!pido, de costo no excesivo (ya que no nee~
sita un equipamiento caro o complejo) y que al mdsmo tiempo es sen
sible y espectfico. Por otra parte, la utilizaci6n de muestras uri
narias hace que el m~todo no sea en absoluto agresivo.
En nues·tra experiencia, no es posible realizar el an~li
sis directamente sobre las muestras de orina debido a la presencia
de interferencias inespec!ficas de bajo peso molecular, las cuales
afectan a la adsorc16n del exceso de anttgeno marcado sobre el ca!
b6n reves·tido de dextrano. Este hecho puede estar acompaiiado, en
menor proporci6n, de la uni6n de las substancias interferientes a
los sitios espec!ficos para el ant1geno que posee el anticuerpo,
con lo que quedar1a adn m4s ant!geno libre marcado en la mezcla de
reacci6n sin poderse unir al carb6n. Por ello se hace necesario un
proceso previo de purificaci6n, que ha de ser eficaz, sencillo, de
r&pida realizaci6n para disminuir los tiempos de an!lisis y que
afecte lo menos posible a la fiabilidad global del proceso. De es
ta manera se estudiaron la extraccr6n con disolventes org&nicos y
la extracci6n sequida de cromatograf!a l!quida de alta eficacia en
fas-e reversa.
En la extracci6n org4nica, el cloroformo resulta m!s efe£
tivo que el acetato de etilo, proporcionando una mayor reproducib!
-61-
lidad en el proceso. Debido a que las muestras utilizadas son
de orina, no se hace necesario realizar una extracci6n previa
con hexano a pH=7 para eliminar los l!pidos neutros, lo que es
necesario llevar a cabo con la mayor!a de las muestras. plasma
ticas (102) • As!, se evita la manipulaci6n excesiva de las
muestras con la consiquiente posibilidad de introducir facto
res que afecten a la deter.minaci6n anal!tica de TxB 2• Se han
utilizado al!cuotas.de l ml. de orina ya que de esta manera se
ha podido realizar la extracci6n en tubos de polipropileno de
10 ml. voldmenes menores que hubieran dificultado el manejo de
las muestras y habr!an podido ser causa de errores. Por el co~
trario, el empleo de vol11menes mayores.no hubiese permitido
utilizar este manterial ni el aparato de evaporaci6n simult~nea
de extractos- con capacidad para 12 muestras. De esta manera el
an41isis s-er!a considerablemente m!s lento y tedioso.
El proceso de extracci6n no alarqa siqnificativamente el
tiempo de an4lisis, ya que cada orina se agita durante 30 s. con
el cloroformo y la evaporaci6n no consume mas de 15-20 minutos a
temperatura ambiene. Esta velocidad puede incrementarse introdu
ciendo los tubos en un bafio de agua a 35-37°C en caso de ser ne
cesario. Tanto las mues·tras· como los patrones fueron sometidos
al proceso extractivo en medio ~cido y todos ellos mostraron po
seer el mismo pH (7'3) al ser reconstitu!das con el tamp6n fosf~
to, por lo que no fu~ neces·ario lavar los extractos para neutra
lizar el pH.
La extracci6n de las orinas con cloroformo no ha presen
tado problemas de formaci6n de emulsiones salvo en alqunos casos
de orinas muy hemat(iricas. En es·tas, la emulsi6n se ha eliminado
-62-
removi~ndola lentamente con una punta de pipeta de polipropileno
y centrifugando posteriormente.
Para asequrar la mtxima recuperaci6n en la extracci6n
es necesario acidificar las muestras de manera que no existan
carqas sobre la mol4cula de TxB2 .. Esta acidificaci6n puede con
trolarse con una simple tira de papel reactivo de suficiente
precisi6n, situando e~ pH entre 3 y 4. Por encima de pH=4, ~a
recuperaci~n t~ende'a disminuir por la no completa extracci6n
del metabolite, mientras que por debajo de pH=3 empiezan a te
ner luqar fen6menos de hidr6liais ..
La uti1izaci6n de un qradiente 1iqeramente c6ncavo en
1a cromatoqraffa 1fquida de alta eficacia en fase reversa permi
te realizar la eluci6n del Txa2 de manera r4pida y completa, 02
teni~ndose un pico s~trico. Habitualmente, e1 TxB2 es el pro
ducto derivado de ~a ciclooxtqenasa que peor e1uye, presentando
unos picos anchos y no siempre sim6tricos (109, 111-115). Con
el qradiente uti1izado, la eluci6n se rea1iza en un pico estre
cho y s~trico con lo que es m!s sencillo aislar la fracci6n
en que se encuentra y se cometen menos errores en su evaluaci6n
directa por medio de un inteqrador. Sin embargo, esto no es su
ficiente para poder detectar los niveles urinarios habituales
que presenta el metabolito. El proceso de concentraci6n que es
necesario realizar (aprox:tmadamente x 100 6 1000) hace que au
mente excesivamente e1 tiempo de an4lisis por muestra. Como t~£
nica purificativa, 1a CLAE-FR no incide de manera determinante
sobre la fiabilidad del an411s·is y bace la t~cnica m4s· lenta.
-63-
Un aspecto que habitualmente no es considerado es el ma
terial que se utiliza en la manipulaci6n de muestras y reactivos.
El TxB 2 tiende a adherirse inespec!ficamente a las superficies
de los recipientes que contienen sus disoluciones. Esta tenden
cia es mayor en el vidrio, y, sobre todo, en el polietileno res
pecto del polipropileno. Por ello, tanto los recipientes de re
cogida de muestras como las puntas de pipetas y tubos de almace
namiento, extracci6n y radioinmunoensayo fueron de polipropile
no. Los fen6menos de adsorci6n, degradaci6n, o ambo~ que tienen
lugar en los extractos almacenados, hicieron que estos se ensa
yasen siempre dentro de las 24 horas siguientes a su extracci6n.
Durante ese per!odo no se observaron disminuciones significati
vas de los niveles de TxB2 medidos. Este hecho no se observ6,
sin embargo, durante el almacenamiento de las muestras urina
rias centrifugadas-, qui.z4 por un efecto de "revestimiento~ de.
las paredes de los tubos- por parte de otros metabolites presen
tes en la orina.
Tanto las- muestras como las disoluciones empleadas en
la construcci6n de la curva de calibrado mostraron valores de
los blancos bajos, constantes y reproducibles, siendo siempre
menores que el l!mtte pr4ct:tco de utilizaci6n del m~todo (nin
gdn blanco represent6 m4s del 10% del m4ximo de uni6n). Durante
la extracci6n, la eliminaci6n de interferencias es eficaz como
lo muestran los ensayos de paralelismo y exactitud. La reprodu-.
cibilidad del m~todo, tanto intraensayo como d!a a d!a se en
cuentra en el rango habitual de las t~cnicas de radioi:nmunoen
sayo. El anticuerpo utilizado es espec!fico y los f4rmacos en-
-64-
sayados no interfieren con el proceso anal!tico. Estos son los
que se administran tanto durante la terapia inmunosupresora b~
sal como en las crisis de rechazo o en presencia de infecci6n.
El procedimiento anal!tico presenta una elevada sensibilidad,
tanto en el sentido de poseer un bajo de m!nimo detectable
(0'05 ng/mll como en el de pendiente de la curva de dosis-res-
puesta que es tal, que en el intervalo de concentraciones de
0,25 a 1 ng/ml es capaz de detectar diferencias de 0.02 ng/ml
estando en esta zona el rango de los valores encontrados· en
las orinas de 24 horas de los sujetos sanos. As!mismo, los ex
tractos pueden diluirse, encontrando resultados· proporcionales
a la diluci6n realizada en un amplio ranqo de concentraciones.
Para realizar el c4lculo de resultados se eligi6 la re
presentaci6n loqit-log no ponderada (120) la cual, evita los
inconvenientes de ·la utilizaci6n de las· representaciones en p~
pel milim~trico (dificultad de interpolaci6n a valores altos
de% B/B0) o semilogaritmico (trazado arbitrario}. Con el m~to
do utilizado, cuando un punto se desvi6 muy significativamente
de los dem&s, no fu~ introducido en el c&lculo de regresi6n.
Sin embargo, pequefias o moderadas desviaciones· de algW\ punto
no condujeron a la obtenci6n de resultados sustancialmente di!_
tintos de concentraci6n de TxB2 o del valor de la pendiente de
la recta. El empleo de un calculador progrcunable hace que se
evite la introducc16n de juicios subjetivos, tanto en el traza
do de la curva patr6n, como en el de las interpolaciones reali
zadas sobre ella. El m~todo utilizado ha sido comparado con
otros m4s complejos que neces·itan un soporte material mucho
-65-
m4s sofisticado para su realizaci6n, no encontrado diferencias
Dnportantes respecto de ellos (121).
El tiempo de incubaci6n de los ant!qenos con el anti
cuerpo no es determdnante de los resultados obtenidos en un maE
gen de ~ 2 horas alrededor de las 20 de incubaci6n. Sin embargo,
tiempos menores conllevan un alejamiento de las condiciones de
equilibrio del sistema con la consiguiente disminuci6n en la
reproductibilidad de los resultados. Esta incubaci6n se realiz6
a 4°C con el f!n de aumentar la enerq!a de la reacci6n ant!ge
no-anticuerpo, disminuir la actividad de posibles enzimas degr~
dantes y aumentar la sens·ib:i:lidad del ensayo.
MAs determinante es el tiempo de incubaci6n con la sus
pensi6n de carb6n y dextrano. Pequenas variaciones por debajo
de los 15 minutos implican una no completa adsorci6n de los an
t.!genos libres sobre el carb6n, mientras que, a tiempos superi~
res, empieza a absorberse el ant!geno de los complejos, lo cual
origina una alteraci6n del equilibrio ant!geno-anticuerpo y, por
tanto, un falseamiento de los resultados·. Por ello, es importan
te que el tiempo que permanece la s·uspensi6n en todos los tubos
sea esencialmente el mismo y de 15 minutos. En la pr4ctica esto
se consique facilmente no ens~ m4s de 100 tubos simultanea
mente.
La presenc:ta de c~lulas· sanquineas en la orina, durante
el tiempo de recoqida de las muestras hace que se encuentren V!
lores de TxB2 muy elevados· en las· mismas, que aumentan con la
cantidad de aqu,llas· o, en menor proporci6n,. de hemolizad_o. Por
el1o, es impreseindtble realizar la recoqida de las orinas sobre
-66-
indometacina a la concentraci6n de 5.10-S M mostr!ndose ~sta
atil para prevenir la generaci6n ex6gena de TxB2• De esta mane
ra, disminuye la influencia de la hematuria, en el postoperato
rio inmediato, sobre los niveles medidos del metabolite.
Un factor que es necesario tambi~n tener en cuenta en
las primeras horas del postransplante es la elevaci6n de los n!
veles de TxB2 como consecuencia del proceso quirarqico. En nue!
tra experiencia, existe un aumento significativo de ~stos el
d!a 2 de evoluci6n tras ciruq!a exploratoria. Este aumento se
debe presumiblemente a TxB2 de oriqen extrarrenal que se ha foE
mado durante la activaci6n plaquetaria y de otras c'lulas en
los procesos de coagulaci6n post-quir6rqicos.
En res6men, la t~cnica estudiada para la determinaci6n
de los niveles urinarios del TxB2 es de sencilla ejecuci6n, con
un proceso previo de purificaci6n mediante extracc16n orq!nica
que no alarqa considerablemente el tiempo de an~isis, fiable y
suficientemente sensible para permitir el seguimiento d!a a d!a
de 4ste metabolite en sujetos transplantados, teniendo en cuen
ta la necesidad de una correcta recolecci6n de las muestras y
la influencia del propio proceso quir6rqico.
4.- TxB2 EN TRANSPLANTE RENAL HUMANO
4.1.- PACIENTES Y MiTODOS
4 .1.1.- ENFERHJS
Se es·tudiaron 45 enfermos transplantados, 43 de
cad~ver y 2 de donante vivo, 35 varones y 10 mujeres, con e~a
des comprendidas entre 14 y 56 aiios (35,8 :t 9,9). El per!odo
evolutivo estudiado comprende desde el d!a del transp1ante
hasta el alta del Hos·pita1, nefrectom!a o exitus, con un pro
medio de 21,7! 10,9 d!as y un rango de 3-G5 d!as.
4 .1 • 2 • - INMUNOSUPRESI'ON
En todos los casos se realiz6 inmunosupresi6n
convencional con esteroides (prednisona y 6-metil prednisolona)
y a%atioprina.
Durante las primeras 48-72 horas se administr6
6-metil prednisolona intravenos·a (40 mg/12 horas). Una vez lo
grada la tolerancia digest:t.va, se comenz6 con prednisona oral
a l~ dosis de 80 mg/d!a en 2 tomas. En los enfermos sin episo
dios cl!nicos de rechazo agudo, la prednisona oral se redujo has
-68-
ta alcanzar los 20 mg/d!a al finalizar el tercer m~s y la dos~
de manten~iento de 10 mg/d!a al comienzo del segundo ano.
La dosis de azatioprina oscil6 entre 100 y 150 mg/d!a
seqdn peso y tolerancia hematol6gica. Esta dosis se mantuvo de
manera continua excepto en.los casos de aparici6n de efectos
secundarios (principalmente leucopenia).
Los episodios de rechazo aqudo fueron tratados con 6-
metil prednisolona intravenosa (250 mg diaries hasta alcanzar
una dosis de 2-4 g. por episodic de rechazo agudo), manteni6n
dose la dosis previa de prednisona oral hasta que la funci6n ~
nal se estabiliz6. Ninguno de los sujetos recibi6 irradiaci6n
local del injerto.
4 .1. 3.- DIAGNOSTrCO DE NECROSIS "TUBUlAR AGUDA (NTA)
Esta situaci6n es definida como funci6n renal in-
mediata insuficiente, con ascenso postoperatorio de los produc-
tos nitrogenados· en sangre y necesidad de di4lisis, exclusi6n de
otras causas, patr6n bioqu1mico urinaria sugestivo (principalme~
te concentraci6n urinaria de Na+ superior a 20-25 mEq/1 (20-25
mmol/l))y cociente de osmolalidades entre orina y plasma de 1,2
6 menor y evoluci6n espontanea hacia la recuperaci6n funcional.
-69-
4 .1. 4. DrAGNOST:tCO DE RECHAZO
Se han estudiado 34 episodios de rechazo agudo
con determinaciones seriadas de TxB2 en orina, habi~ndose con
firmado el diagn6stico de rechazo en el an§lisis retrospectivo
realizado. Todos los casos disponen de registro adecuado de
s!ntomas, peso, temperatura y tensi6n arterial. El estudio ana
l!tico incluy6, entre otras, las determinaciones diarias de
creatinina, urea, sodio en orina, excrecci6n fraccional de so
dio, proteinuria y hematuria. Todos los casos excepto uno di!
ponen de estudio ecosonogr4fico seriado; 15 casos de renogra
ma con 99 Tc-DTPA y s6lo en uno se hizo arteriografta. (Figuras
22 y 23). En el an4lisis retrospectivo se ha valorado la evo
luci6n cl!nica y, especialmente, la respuesta al tratamiento
anti-rechazo. As!, 28 de 34 crisis de rechazo respondieron al
intensificar la inmunosupresi6n y en los 6 restantes se dispo
ne de confirmaci6n histol6gica.
Para analizar los res-ultados se han distinguido cuatro
situaciones cl!nicas diferentes:
GRUPO A.- Transplante no complicado, sin NTA ni rechazo.
Est4 constitu!do por 10 sujetos con buena funci6n re
nal inmediata y persistente que no recibieron trata
miento anti-rechazo. La creatinina s~rica en el momen
to del alta era de 1,5 + 0,36 mg/dl (132'6 + 31'82
1umol/l).
-70-
OIAGNOSTICO DE RECHAZO SOBRE RINON FUNCIONANTE
100
N• 25
.. , .. D EXPLORAOO
50 ~ POSITI\Q
0
FIGURA 22.- Porcentaje de parametres explorados y de enfermos en que se alteran estos en el diaqn6stico de rechazo sobre injerto funcionante. EfNa: Excreccion fraccional de sodio. ECO: Ecoqrafia.
DIAGNOSTICO DE RECHAZO SOBRE NTA
100
N•9
% 0 EXPLORADO
50 ~ POSITIVO
0
FIGURA 23.- Porcentaje de parametres explorados y de enferMos en que se alteran estos en el diagnostioo de rechazo sobre NTA.
-71-
GRUPO B.- Rechazo sobre injeL·to funcionante.
Este grupo estS. constitu!do por 25 observaciones. Co
mo promedio el rechazo apareci6 el d!a 9,4 ~ 8,7 de
evoluci6n pos·transplante. S6lo 4 casos· no respondie
ron al tratamdento anti-rechazo y en todos ellos el
diagn6stico se confirm6 histol6gicamente. La creati
nina al alta de los casos con buena evoluci6n fu~ de
1,6 ~ 0,46 mq/dl {141'4 ~ 40,66 1umol 1}.
GRUPO c.- NTA postoperatoria s·in rechazo.
Se ha observado en 5 ocasiones. Cuatro casos cursa
ron con oliguria. La creatinina s~rica alcanzada al
superar la NTA fue de 1,73 ~ 0,33 mq/dl (152'9 ~
29 I 17 /U1J.Dl/ 1) •
GRUPO o.- Rechazo sobre NTA.
El diaqn6s·tico de rechazo se estableci6 el d!a 5 ~ 2
de postoperatorio con un ranqo de 2-8 dtas. Respon
dieron al tratamiento anti-rechazo 7 de los 9 casos~
en los otros do~ el diaqn6stico se confirm6 histol6-
gicamente. La creatinina al alta de los que respon
dieron fu~ de 1,6! 0,60 mg/dl (141'4! 53'04 1umo1/1).
Un enfermo sufri6 2 eptsodios de rechazo aqudo sobre ri
n6n funcionante. Otros 3 enfermos, que cursaron con NTA inicial,
padecieron rechazo una vez recuperada la funci6n. Por ello, se
analizaron un total de 49 situaciones o circuns·tancias cU.nicas
en 45 enfermos.
En resOmen, un 31\ de los enfermos padecieron NTA, la
-72-
incidencia de rechazo durante el per!odo estudiado fu~ de 0,75
crisis/enf~rmo (80% de los enfermos con riii6n funcionante y
64\ de los que tuvieron NTA) y el 82\ de las· crisis de rechazo
respondieron al intens·ificar la inmunosupresi6n.
4.1.5.~ RECOLECCrON DE MUESTRAS
Las muestras sanguineas se recoqieron en tubos
heparinizados, centrifugados posteriormente a 1000 g. durante
10 minutos a temperatura ambiente, utiliz~dose el plasma as1
obtenido para determinar las concentraciones de sodio, potasio,
urea, creatinina y otros par!metros complementarios (calcio,
f6sforo, ~cido Grice, glucosa, osmolalidad} •
Las muestras urinarias se recoqieron durante per!odos
de 24 horas sobre indometacina (5.10-S M) a temperatura ambien
te. Tras medir su volGmen se centrifugaron al!cuotas de 10 ml
a 1000 g. durante 10 minutes y temperatura ambiente. Con el s~
brenadante se realizaron determinaciones de tromboxano s 2 , so
die, potasio, urea, creatinina, f6sforo, calcic y glucosa. Se
comprob6 la ausencia de interferencias de la indometacina a
concentraciones de hasta 25 mM con los m~todos ana11ticos uti-
lizados en el an~lisis de los dem~s par&metros bioqu1micos. Pa
ra analizar el sedimento urinario se utilizaron muestras de
orina pertenecientes a una micci6n reciente. Diez mili1itros
de esta mues·tra se centrifuqaron a 400 q. durante 10 minutes· a
temperatura ambiente. Tras dt:!sech.ar el sobrenadante, se some
ti6 al precipitado a an~1isis microsc6pico sin utilizar ninq1in
m6todo de tinci6n.
-73-
4.1.6.~ MSTODOS ANAL!TICOS
4.1.6.1.• DETERMINACION DE TxB 2
La concentraci6n urinaria de TxB 2 se determin6 por rad.ioinmunoensayo tras extracci6n de las ori
nas con disolventes orq!nicos seqG.n se expuso en la Secci6n 3.
4.1.6.2.~ DETERMINACION DE NIVELES DE CREATININA
Los niveles de este uetabolito se de
terminaron espectrofotom6tricamente seqG.n el m6todo de Jaf£6
modificado (122), en un Autoanalizador ASTRA 8 (Beckman}, mi
diendo con 4cido p1cr.tco en medio b!s·ico. Esta reacci6n tiene
una constante de velocidad de primer orden que es funci6n de
la concentraci6n de NaOH presente en el medio.
El ranqo normal de los valores de 6ste par&metro es de
l'O + 0'10 mg/dl (85'7 ± 8'84 1umol/l) para hombres y de 0'7 !
·0'10 mq/dl {61'9 ~ 8'84 ;umol/1) para mujeres.
4.1.6.3.~ DETERMINACION DE SODIO Y POTASIO
Los niveles de Na+ y K+ en plasma y
orina se midieron potenciometricamente en un Autoanalizador
ASTRA 8 por medio de electrodes selectivos para estos iones. El
ranqo·de normalidad para·Na+ es de 141 ~ 3'0 mEq/1 (141! 3'0
mmol/1) y de 4 + 0 '3 mEq/1 (4 ~ 0' 3 mmol/1) para K+ (123).
-74-
4.1.7.- PROCEDIMIENTOS ESTADISTICOS
El estudio de los valores de los par~metros ut!
lizados y la comparaci6n entre los distintos grupos se realiz6
mediante an4lisis de la varianza, y pruebas de Wilcoxon en el
caso de muestras de pequeno tamano m~lS). El an~lisis de la v~
rianza y de regresi6n se llev6 a cabo con un calculador progra
mable HP-97 (124) y ?n programa escrito en Pascal para un mini
ordenador Digital (125).
El an4lisis de la utilidad diagn6stica de los valores
de TxB2 y de TxB2/Cr, cuando se utilizan junto con los par~e
tros diagn6sticos habituales de rechazo y necrosis tubular agu
da, se realiz6 mediante la aplicaci6n iterativa del teorema de
Bayes (126).
4 • 2.- RESULTADOS
Se estud16 la evcluci6n post~-trans·plante de los valores
de la concentraci6n de TxB 2 y del cociente de TxB2/cr urinarios
junto con los dem4s parbletros· utilizados en el seguimiento del
enfermo transplantado, entre los cuales, adem.1s de los utiliza
dos en el diagn6stico de rechazo, se encuentran hematocrito,
concentraci6n de hemoglobina, recuento de leucocitos y plaquetas,
pruebas de funci6n hep4tica, estudios virol6gicos y anticuerpos
citot6xicos.
Lo~ valorea de la excrecci6n urinaria de TxB2 (cantidad
de TxB2 excretada en orina par unidad de tiempo-24 horas-) mos-
-75-
traron poseer una elevada correlaci6n con los de la correspon
diente concentraci6n de TxB2 (r=O q606, p .(. 0 • 001; n=60ll • Sin
embargo, en diures·is· inferiores a 500 ml/24 horas desaparece
esta correlaci6n (r=0~0325; n=l04).
No se encontr6 correlaci6n entre los valores de pH y
concentraci6n de TxB2 (z=0'2104) o entre pH y excrecci6n de
TxB 2 (r=0'2108). As!mismo nos-e encontr6 correlaci6n entre vo
ldmen y concentraci6n de TxB2 urinarios (r=0'2368).
4.2.1.- GR.UPO A: TRANSPLANTE NO COMPLICADO
Los· sujetos de ~ste grupo evolucionaron hacia
una r!pida normalizaci6n de la funci6n renal reflejada por la
disminuci6n de los niveles de creatinina plasm!tica seqdn se
muestra en la Fiqura 24 en la cual s-e representa el comporta
miento global de la diuresis y de los niveles de creatinina,
TxB2 y TxB2/Cr. Estos· dos altimos s-e mantienen uniformemente
bajos y estables durante la evoluci:6n postransplante, al tiem
po que se mantienen elevadas diuresis.
En los dos primeros d!as de evoluci6n se observa una
ligera elevaci6ri de TxB2 y TxB2/cr, la cual se asocia a la in
fluencia de la cirugia y revierte rapidamente normaliz4ndose
ambos parAmetros a partir del tercer d!a de postoperatorio
(p <O 'OS).
En dos enfermo~ se aprecia una elevaci6n del TxB2 no
atribu!ble a rechazo. El primero de ellos present6 una eleva
ci6n leve, unieamente del cociente, los d!as 9 y 10 de post-
(Tx Bz]o x 100 (Cr)o
{ng/mg)
(TxBzJo
(ng/ml),
{mg/df)
12.0
100
80
60
40
20
0
o•a 0'6
0'4
0'2.
0
"10
a
.f3 4
2
-76-
Tx 82 EN TR NO COMPLICADO
., .. ,
N • 10
......... . ·-·..._. __ --·-·---·.--•-·.-·-·
Q;-~-----------------------------------6
0 5 I
1J 4 R E :3 s I 2 s
f/2.4horas
0~~~--------~------------~-------------5 10 15
DIAS
TIGURA 24.- Evoluci6n media de TxB2/Cr y TxB2 urinarios, creatinina serica y
. vo:J,.\imen de diuresis en transplante renal no cauplicad.o.
-77-
operatorio sin otro dato cl!nico que febricula; la evoluci6n
fu~ excelente sin tratamiento antirrechazo ni empleo de anti
bi6ticos •.
El otro enfermo present6 un cuadro agudo en el inme
diato postoperatorio, de hipotensi6n y· anemia intensa: median
te ecosonograf1a se detect6 un gran hematoma perirrenal. La
reintervenci6n demostr6 un escape a nivel de la sutura arte
rial. Durante una s·emana se obtuvo drenaje ham4tico de la cel
da y present6 hematuria con coagulos. El cociente TxB2/cr se
mantuvo elevado durante las 2 primeras semanas de evoluci6n;
la concentraci6n de TxB 2 solo se elev6 los dtas 12 y 13. Par
tanto, se trata de un falso positive par hematoma perirrenal
y hematuria macrosc6pica.
4. 2. 2.- GRUPO B: RECHAZO SOBRE INJERTO PREVIAMENTE
FUNCIONANTE.
Diecinueve de los 25 episodios (76%) cursa
ron con elevaci6n del TxB2 , que fu~ previa al diagn6stico cl£
nico del rechazo y al incremento de la creatinina, con una
antelaci6n promedio de 48 horas (p < 0' 01, Figura 25) . El co
ciente TxB2/Cr se afect6 m~s precozmente que la concentraci6n
de TxB 2 , elevAndose significativamente (p < 0'021 cuatro dias
antes del diagn6stico. El tratamiento del rechazo con 6-metil
prednisolona intravenosa normaliz6 inmediatamente la concentra
ci6n de TxB2 pero se apreciaron ligeras elevaciones del cocie~
te TxB2/Cr algunos d!as· durante los 10 primeros de evoluci6n
100
80
60
40
20
-78-
Tx 82 EN RECHAZO SOBRE INJERTO FUNCIONANTE
N • 25
0~--------------~------------------------------------1'0
0'8
0 16
0'4
0'2
o;----------------+--------------------------------------6·
5
4•
3·
2·
.\ ·-'· ·-·-· ............. -·-·- .......... .......... __ _ '·---·---........ _ ...... ,
o~--~,r-----------4------------~,----------~------------~~~
6
4
A er,
eng/ell
0
....
-5 0 5 10 15
OtAS
N •25
•\. RECHAZO SOBRE INJEitTO FUNCIONANTE VARJACIOM Cr5
\ \ -·-·-·--•" .............. ·-· "'·----T -5 -:s -1 0 I 3 5
OIAS 7 9 II · 13
-:...:m.A 25.- Evolucion media de TxB2/Cr y TxB2 urinarios, creatinina seri.ca e increm~
to de creatinina en rechazo sobre transplante funcionante. El dia 0 re
presenta el d!a del diaqn6stico cl!nico del rechazo; la barra horizontal,
el tratamiento iJDunosupresor.
-79-
del rechazo. Con el control de la crisis ambos par!metros se
normalizan de manera persistente. La suspensi6n de las dosis
de los valores de 6-metilprednisolona ocasiona en 5 casas
una elevaci6n de los valores de TxB2 y TxB 2/Cr (fen6meno de
rebate} s·in paralelismo en los niveles sericos de creatinina.
La Figura 26 muestra la evoluci6n t!pica de un sujeto
de este grupo. En este caso, los niveles de TxB 2 se elevan 72
y 24 horas antes del diagn6stico clinico del rechazo, mientras
que los· valores de TxB2/Cr siguen una evoluci6n similar aun
que continuamente elevados. En este momenta evolutivo, la
creatinina estaba disminuyendo y la diuresis se normalizaba
tras la fase poliGrica inicial. La resoluci6n del proceso de
rechazo exigi6 la administraci6n de 8 dosis intravenosas de
6-metilprednisolona. Al comenzar este tratamiento los valores
de TxB2 y TxB2/cr se normalizaron rapidamente, mejorando paul~
tinamente la funci6n renal. La suspensi6n de la terapia aste
roidea ocasiona un ligero efecto rebate que no tuvo repercusi6n
cl!nica.
En 6 crisis de rechazo (24%) el TxB2 urinario no se ele
v6 (falsos negatives}. En 5 ocasiones se trat6 de rechazos le-
ves que en ningun momenta supusieron elevaciones de los valores
de creatinina plasm4tica de m&s de 1 mg/dl (88,4;umol/l}; en el
otro case, la elevaci6n de este par4metro fue de 3,7 mg/dl
(327 1umol/l} • Todos fueron tratados· y respondieron con facili
dad y rapidez (m4xima dosis· de 6~metilprednisolona empleada:
4.250 mg)..
-so-
6-MP
[TX62). 8
[er]. 6
(ng/mg) ., __ / : .... , ...... ,
(Tx82]. 5
4 (ng/ml)
3'
2 •
(cr ls 10
(mg/dl"} 8
6
2 \ ·-· . / '· ' /. ...... ·--·-· '•'--·-----·--
0 I 4 u R E 5 I 5
( l!dia) .1 5 10 15
dias post -transplante
FIGURA 26.- Evoluci6n t!pica de un sujeto con rechazo sobre transplante funcionante. Se observa la elevacion de TXB2 y TxB2/Cr previa al diagn6stico clinioo de rechazo,marcada por el inicio del tratamiento con terapia inmunosupresora de choque, y un ligero efecto de rebote en ambos parmaetros al cesar esta. 6-HP: 6-meti]pl::~solona.
-81-
En 4 ocas·i:ones· la evoluci6n fu~ mala, abocando a la ne
frectom!a (2 cases} o al exitus ( 2 casos). En el primer caso,
el paciente falleci6 por candidiasis sist~rnica, sin coloniza
ci6n del injerto, el d!a 20 de evoluci6n. Hab!a presentado cr!
sis de rechazo, confirmado por biopsia, con mejor!a funcional
transitoria bajo tratamiento y con empeoramiento preterminal.
La necropsia demostr6 la persistencia de signos histol6gicos
de rechazo. Los valores de TxB 2 permanecieron elevados, aunque
de manera inconstante durante los 20 d!as de evoluci6n.
En el segundo caso se trat6 de una crisis rnuy severa
de rechazo, instaurado el d!a 8 de evoluci6n, con rotura del
injerto y nefrectom!a el d!a 9. El TxB 2, previamente normal, se
elev6 coincidiendo con el diagn6stico de rechazo.
El tercer caso falleci6 por encefalitis herp~tica ful
rninante el d!a 18. El enfermo hab!a recibido tratamiento anti
rechazo los d!a 6 al 9 de postoperatorio, con respuesta funcio
nal y norrnalizaci6n del TxB2 urinario (Figura 27) • En las 48
horas previas al exitus se detect6 elevaci6n de la creatinina
y del TxB2 • La necropsia evidenci6 la persistencia de rechazo.
El cuarto case termin6 en nefrectom!a el d!a 47 de evo
luci6n tras dernostrar la biops-ia un severo rechazo vascular.
Durante el tratamiento del rechazo, la concentraci6n de TxB 2 fu~ normal pero el cociente TxB2/cr se elev6 algunos d!as de
rnanera irregular. Simultaneamente, la enferma present6 una in
fecci6n por ci tomegalovirus·.
HO
6-MP
(Tx82].
[er]. (ngJmg)
18·~,. 4
6
4·
2
. 5· (Tx~].
4 (ng/ml)
3
[cr ], (mg/dl)
D I u R E s I s
( lldia)
2· 1-
10-
8-
6·
4-
2-
4-
3·
2
1-
-82-
vv v
~
1
\ \A-
5
~ i I ............
I .. ......
10 15 dias post -transplante
YIGURA 27.- Transplante renal con rechazo refractario. TxB2 y TxB2/Cr se normalizan por el tratamiento inmunosupresor pero se elevan al suspenderse este. HD:. flemodiil.isia. '
-83-
4.2.3.- GRUPO C: NECROSIS TUBULAR AGUDA SIN RECHAZO.
El comportamiento global de este qrupo es an~
logo al del transplante no complicado: normalizaci6n de ambos
par.:t.metros a partir del tercer d.! a (p < 0 • 05 para TxB 2 y p < 0 • 01
para TxB2/Cr; Figura 28) •
4.2.4.- GRUPO D: RECHAZO SOBRE NECROSIS TUBULAR AGUDA
PREVIA.
En ~sta situaci6n se observan las elevaciones
m!s intensas y sostenidas, tanto de la concentraci6n de TxB 2
(Figura 29 como del cociente TxB 2/Cr (Figura 30), con un pa
tr6n claramente diferenciado de la necrosis tubular sin recha
zo. As!,se observan diferencias s·ignificativas en los valores
de TxB2 en los d!as 2 a 5 post..,.transplante entre estos grupos
(p<O'OS) y entre los d!as 3 (p<O'Ol), 4 y 5 (p<.0'05) para
el cociente TxB2/Cr.
Estos enfermos evolucionaron qeneralizadamente con oli
guria y valores muy elevados de creatinina plasm~tica que hi
cieron que necesitasen tratamiento s·ustitutivo con di4lisis.
As!, en el caso mostrado en la Figura 31 fueron necesarias 6
sesiones de hemodi4lisis entre las cuales la creatinina plasm~
tica lleg6 a niveles de 12'1 mg/dl (1.070 1umol/l).
10
4
e ....... Cl 3 c ,_.o
"' m f5.
L..J
2
I 5 DIAS
-84-
Tx 82 EN NTA N•5
0 80 E
....... tJ' c -Q
60 )(
0 r-1 0 t\11"1
Q] '-
~ (.)
L.J L.J
40
10 5 DIAS
10
FIGURA 28.- Evolucion ind!vidualizada de los valores de TxB2 y TxB2/cr en pacientes con necrosis tubular aguda.
e :~ 1%
r! CD 10 ~ '-'
8
G
4
z
0
Tx Ba EN NTA + RECHAZO N•t
0
5 10
DIAS
-85-
15
1 ~ ~
g .. .I no .. ,..., m .. e8
"300
220
110
140
100
10
20
Tx Bt /Cr EN NTA + RECHAZO
N•t
10
DIAS 15
FIGURAS 29 y 30.- Evolucion individualizada de los valores de TxB2 y TxB2/Cr urina
rios en necrosis tubular aguda con rechazo asociado.
HD
6-MP
[TxB2J. 8·
[cr]. 6
(ng/mg) 4
2·
5 [rx~].
4 (ng/mt)
J•
2·
1·
[cr ls 10~
(mg/dl) 8-
6-
4-
2-
0 l 4-u R J· E s 2-I s 1 ~
( l/dia)
-86-
v vv v v v
/ ,l.t \ • 66
• . ~_./\ ._,....
., t
I 1~ 18
I ....... '......_,.....-
• ~-*...;~ .. -·;;: i ............... _..,..\ J Vv\ .
'· \ ·-·,·-·-·
!L--r-1 5 10 15 20
dias post -transplante
FIGURA 31.- EvoluciOn t!pica de un paciente con rechazo sobre necrosis tubular
ayud&.
-87-
4.2.5.-: SIGNIFICAC!ON DE LAS DETERMINACIONES DE
TxB2~2/Cr.
Para conocer la significaci6n diagn6stica de
una determinaci6n ais·lada de TxB 2 , se ha calculado el porcen
taje de resultados anormalmente elevados en las diferentes
circunstancias cl!nicas.
En ausencia de necrosis tubular aguda y de rechazo
{Figura 32) s6lo hay un 4% de falsos positives. En los-3 d!as
previos al diagn6s·tico cl!nico de rechazo {prerrechazo), un
36% de las determinaciones son altas·, porcentaje que disminu-.
ye al ll% durante el tratamiento antirrechazo: despu~s de su~
pender el tratamiento {rechazo clinicamente controlado) un 8%
de las determinaciones· son falsos posi tivos.
Cuando el rechazo incide sabre necrosis tubular, el
100% de las determinaciones realizadas durante los 3 d!as pre
vias al diagn6s·tico de rechazo son al tas. Considerando globa!_
mente todas las crisis de rechazo (tanto si la situaci6n pre
via es normal como si incide sobre necrosis tubular) se apre
cian un 7% de falsos positives y un 38% de falsos negatives.
El cociente TxB2/cr (Figura 33) presenta una elevaci6n
previa al diagn6stico cl!nico de rechazo en el 70% de los ca
ses en el grupo de evoluci6n inicial satisfactoria y en un 91%
de los caso& que cursan con necrosis tubular aguda. La sensib!
lidad global de ~ste par&metro es mayor (77%) que la del TxB2
pero a expensas de un mayor n6mero de falsos positives (18%).
100 (I) <(
~ <(
(I) 11.1 z 0
!l 50 z :E a: 11.1 1-11.1 a .,.
n
N
10 25 25 2Z
107 36.213 120
-88-
( Tx 82. J o EN RECHAZO
5 9 9 7
88 25 46 59
100
15 34 34 29
195 61 259 179
7IGURA 32.- Utilidad de las deteDninaciones de TxB2 urinario en el diagnostico de rechazo y rechazo sobre necrosis tubular aguda. El termino "pre-rechazo" se refiere a los 3 d!as previos al diagnostico cl!nico. T 0
: tratamiento-rechazo. n: niimero de casos; N: nGmero de determinaciones analiticas.
(Tx 82. Jo EN RECHAZO [Cr]o
n 10 25 25 22 5 9 9 7 15 34 34 29 N 88 40 194 105 67 22 44 51 155 62 238156
100 II
0 <(
n 70
!:i "' r3 z 0 u c:c z :i a: 11.1
t.i a .,.
0
-89-
La aplicaci6n del teorema de Bayes sobre el conjunto
de signos· y s·!ntomas habitualmente utilizados en el diagn6stico
de rechazo (Tabla VI"II") , proporciona las probabilidades diagn6~
ticas que se muestran en la Tabla IX, columna ~· en el diagn6s
tico diferenc.ial de necros-is tubular y rechazo (asociado o no a
necrosis tubular}.
Los valores de la probabilidad "a priori" de encontrar
el proceso considerado, se basan en los datos de frecuencia de
esos diagn6sticos· en la poblaci6n estudiada. Se observa, que no
se puede distinguir entre procesos de rechazo o de necrosis tu
bular ya que ambos muestran un conjunto de signos y s!ntomas
muy similar. As!, los par!metros cl!nicos y bioqu!micos habi
tualmente considerados como sugestivos de rechazo se observan
en ausencia de ~1. De cada 100 casos· sugestivos, 44 se deber.Sn
a rechazo sobre injerto funcionante, 42 a necrosis tubular y
14 a rechazo moSs necrosis tubular.
Sin embargo, la adici6n de TxB2 (Tabla IX, £ ) o del
TxB2/cr (Tabla rx,· ~) hace que se obtenga una mayor especific!
dad para el diagn6stico de rechazo. Si se utilizan simultanea
mente TxB2 y TxB2/Cr, se obtiene un conjunto de par!metros que
distingue de una manera practicamente absoluta los procesos de
rechazo frente a los de necrosis tubular sin rechazo (Tabla IX,
TABLA VIII.- UTILIOAD DE ~S PARAHEfROS CL!NICOS MAS HABITuALMENTE EMPLEADOS EN EL DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE RECHAZO
Y NU:ROSIS TUBULAR AGUDA.
PARAHETROS DIAGNOSTICOS CL,SICOS 0 HABlTUALES
PROBABILIDAD FIEBRE t TENSION SIGNOS PROTEI- HEMATU- ECO-DIAGt()STIOO A PRIORI '>' J8•c t PESO 4- DIURESIS ARTERIAL LOCALES +EfNa NURIA RIA + cr GRAFU TxB2 TxB/Cr
RECHAZO (R) 0'51 0'82 0'91 0'81 0'32 . 0'18 0'70 0'50 • 0'10 1'00 0'62 o• s2 0'80
lfl'A 0'10 0'60 0'80 1'00 0'20 0 1 20 0'60 1'00 0'80 1'00 0'40 O'lOj R + lfl'A 0'18 0'89 1'00 1'00 O'll 0'56 0'56 0'25 0'11 1'00 0'78 1'00 1'00
BUENA 0'21 0'10 0'10 0'10 0'10 0'10 0'20 0'10 0'10 0'10 0'10 0'20 0'40 EVOLUCION
---·-·-··------- --------------~-
TABLA IX.- DISTRIBUCION PORCENTUAL DE PAMMETROS ALTERAOOS EN DIVERSAS SITUACIONES CL!NICAS
_!_ ~ ...£.._ d
DIAGOOSTICO SIGNOS CLASICOS a + TxB2
a + TXB/Cr a + Txa2
+Txa2;cr
RECHAZO 44 57 62 56
NTA 42 10 14
RECHAZO + tll'A 14 33 24 41
BUENA EVOLUCION 1'11'0 NO ,VO N 0
i
I \0 0 I
-91-
4.3 ..... DI:SCUS:tON
Los resultados' encontrados confirman que las crisis
de rechazo agudo se acompanan de elevaci6n del TxB2 urinario
(82% de los· cases) y que la ausencia de elevaci6n (falsos ne
gatives) se aprecia fundamentalmente en cases de rechazo leve
con escaso deterioro funcional y facil control al intensifi
car la inmunosupresi6n (5 de 6 cases).
El aumento del TxB 2 urinario no se debe a la agre
si6n quirtirgica, cuyo efecto queda limitado a las primeras 48
horas, co~o se hab!a observado en cirug!a experimental (93) •
Por otra parte, se produce. pese a los efectos potenciales de
la prednisona-inhibidor de la fosfolipasa A2 (17)- y de la
azatioprina -inhibidor de la tromboxano sintetasa, al poseer
un grupo imidazol (127)-.
En la utilidad del TxB 2 como marcador precoz y fiable
del rechazo en transplante renal cabe diferenciar entre dos
circunstancias cl!nicas en funci6n de la diferente dificultad
diagn6stica que conllevan: rechazo sobre el rin6n previamente
funcionante y rechazo sabre necrosis tubular aguda. En el case
de buena funci6n previa del injerto, la determinaci6n del TxB 2 urinario permite confirmar el 76% de las crisis. S6lo se han
observado 2 elevaciones del TxB 2 no atribu!bles a rechazo: en
una ocas·i6n se asoci6 a febr!cula y no puede descartarse un r~
chazo subcl!nico de evoluci6n favorable con la inmunosupresi6n
basal; la otra observaci6n corres·ponde a un gran hematoma per!_
-92-
renal en el inmediato postoperatorio; dada la facilidad con que
la ecosonograf!a permite en la actualidad detectar las coleccio
nes l!quidcsperirrenales, esta situaci6n no plantea especiales
dificultades diagn6sticas. No se ha observado ningdn caso de
trombos·is venos-a profunda, circuns·tancia en la que tambien se
aprecia un marcado aumento del TxB2 urinario (91). Este aumento
no se produce por infecci6n urinaria ni por infecci6n sistemica
sin rechazo, lo que pace del TxB2 urinario un par~etro m4s es
pec!fico que la beta-2-microglobulina (66).
Aparte de su contribuci6n en la confirmaci6n no invasi
va del rechazo, con un nftmero aceptable de falsos positivos y
negativos, el TxB2 urinario aumenta unas 48 horas de promedio
antes de que el diagn6stico cl!nico de rechazo sea posible. Sin
negar que esta precocidad permite una sospecha de rechazo inmi
nente, podr!a ser aventurado iniciar el tratamiento antirrecha
zo bas ado exclus·ivamente en el aumento aislado del TxB2, en au
senyia de deterioro funcional y de otros datos cl!nicos, por
lo ~e la aportaci6n adicional del TxB 2 no parece de importan
cia relevante para el diagn6stico de rechazo sobre rifi6n funcio
nan\e.
La administraci6n intravenosa de 6-metil-prednisolona
co~ tratamiento del rechazo disminuye inmediatamente el TxB2 urinario, independientemente de que el rechazo sea corticosen
sible o corticorre~istente. En general, llega a normalizarse
en los caso~ con buena evoluci6n, aunque una cuarta parte de
ellos· experimenta un fen6meno de rebote pasajero al suspender
-93-
el tratamiento. Por el contrario, cuando el rechazo es refract!
rio, el descenso del TxB2 no es completo y constituye un par4m~
tro de cierto valor p~on6stico.
cuando el rechazo incide sobre necrosis tubular aquda
previa, el hallazgo fundamental es que no hay falsos negatives:
todos los casos cursaron con elevaci6n del TxB2 urinario. La d!
ficultad del diaqn6stico en ~sta situaci6n resalta la importan
cia de ~ste hecho, &unque, al mismo tiempo, obliqa a extremar
la cautela. En nuestro caso, consideramos que los diagn6sticos
de rechazo sobreaiiadidos a necrosis· tubular aquda son fiables
dada la conjunci6n de datos cl!nicos y exploraciones en que se
bas6 y al meticuloso an4lis·is retrospective realizado; en ~ste
sentido, es significative que se diaqnosticaran 0'64 crisis/e~
fermo con necros-is tubular y 0 '75 crisis/enfermo con riii6n fun
cionante1 que 7 de 9 casos evolucionaron favorablemente con tra
tamiento antirrechazo; y que los 2 casos corticorresistentes es
t!n confirmados histol6gicamente.
Las diferencias obs-ervadas en el TxB2 cuando el rechazo
incidi6 sobre necrosis tubular en comparaci6n al rechazo sobre
riii6n funcionante, no son imputables a modificaciones de la in
munosupresi6n, ya que no ex.tsti6. El an~li,sis de los· casos
con necrosis tubular sin rechazo permite tambi~n excluir que el
proceso necrosis-regeneraci6n tubular modifique la excrecci6n
urinaria de TxB2• Es· posible atribuir aqu~llas diferencias a la
mayor seriedad del rechazo en los casos de necrosis tubular. En
~s-te sentido parecen apuntar tanto la pricoz instauraci6n del
/
/
-94-
rechazo (d!a 5 frente a d!a 9 de evoluci6n como promedio), co
mo el hecho de que 2 de los 9 casos tuvieran que ser nefrecto
mizados con s·ignos intensos· de rechazo vascular y rotura renal.
Por consiguiente, la determinaci6n de TxB 2 urinario
es de gran utilidad en el diagn6stico de rechazo sobre necrosis
tubular aguda, por cuanto es· un procedimiento no invasivo, con~
tantemente alterado y utilizable en una situaciOn con especia
les dificultades· diagn6sticas· al no poder disponer de par4me
tros funcionales.
Para perfilar aun m~s la utilidad de ~ste par~etro se
ha intentado delirnitar el valor diagn6stico de una determina
ci6n aislada, cuantificando los fasos· positivos y los fasos n~
gativos en las· diferentes si tuaci:ones cl!nicas. Los resultados
corroboran las conclusiones anteriores: en cuanto a la concen
traci6n urinaria de TxB2, un 11% ~e las dete~naciones en si
tuaci6n de necrosis tubular aguda son falsos positivos, pero
no hay falsos negativos: es decir, una determinaci6n normal
permitir!a excluir la existencia de rechazo. En cuanto al co
ciente TxB 2/Cr, parece menos especifico (24% de falsos positi
vos) y menos sensible (91% de los casos) •
El origen del TxB2 urinario que se mide, no se conoce
de manera precisa. En ausencia de trombosis venosa profunda y
de hematoma perirrenal, parece clara su procedencia intrarre
nal (91), veros·111lilmente en relaci6n con la parti:cipaci6n de
plaquetas (128}, las cuales son la principal fuente end6gena
de tromboxano conocida. Estas plaquetas son acumuladas con rna-
-95-
yor intenstdad en los procesos de rechazo {83) •
Adem4s de las· plaquetas, existe tambi~n una acumulaci6n
y activaci6n de macr6fagos (129), los· cuales son capaces de si~
tetizar tromboxanos (130); y los linfocitos, adem4s de poder
sintetizar ellos mismos tromboxano (59), son capaces de estim~
lar la producci6n de este por parte de los macr6fagos (131) •
Pero su papel en el fen6meno de rechazo continua siendo una in
c6gnita.
En res·1lmen, los· hallazgos· realizados apoyan algunos
preliminares (91, 92) y permiten cuantificar la utilidad de la
determinaci6n de TxB2 urinarto en el diagn6stico precoz del re
chazo en transplante renal. Hasta ahora no se hab!a diferencia
do entre rifi6n funcionante y necrosis tubular aguda, siendo es
ta nuestra principal aportaci6n por lo necesario que es dife
renciar entre ambos estados para un mejor tratamiento de cada
uno y un menor riesgo para el enfermo.
-96-
- CONCLUSIONES
1.- La determinaci6n de TxB 2 urinario mediante radioinmunoen
sayo, con las innovaciones introducidas por nosotros, es
una t~cnica precisa, exacta y sensible. As!mismo, se han
estudiado y controlado la influencia de las condiciones
de recoqida y almacenamiento de las muestras y la interf~
rencia de la ciruq!a, c~lulas sanquineas y fSrmacos emple~
dos en el tratamiento de ~stos enfermos.
2.- Los enfermos transplantados de rin6n con buena evoluci6n
postoperatoria o con necrosis tubular aquda, muestran va
lores normales de TxB2 y del cociente TxB2/Cr en orina.
3.- El rechazo aqudo provoca una elevaci6n de TxB2 y TxB2/cr
48 horas antes, como promedio~ del diaqn6stico cl!nico.
El TxB2 muestra una especificidad global del 93% y una
sensibilidad del 62%. El TxB2/Cr es ~s sensible (77%)
pero menos espec!fico (82%).
4.- Los valores m4s elevados de TxB 2 y TxB2/cr se observan
cuando el rechazo incide sabre necrosis tubular aquda
previa.
5.- Por eonsiquiente, la determinaci6n de TxB2 urinario
-97-
constituye una aportaci6n sustancial en el manejo correcto del
enfermo transplantado, especialmente para el diagn6stico precoz
de rechazo en presencia de necrosis tubular.
-98-
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7.- APENDICES
7.1.- CALCULO DE CONCENTRACIONES DE TxB 2 MEDIANTE UNA CALCU
LADORA PROGRAMABLE HP-97.
7.1.1.- MANEJO
Una vez le!da la tarjeta por ambas caras, se
introducen en parejas los valores de la concentraci6n de los pa
trones por la tecla A y el valor de % B/B0
por la B. Tras ello
se presiona la tecla C obteni~ndose, por ~ste orden:
- Coeficiente de correlaci6n
- Ordenada
- Pendiente
A partir de aqu! se pueden interpolar los valores de
% B/B0
de los problemas introduciendo su valor por la tecla D.
El valor correspondiente de concentraci6n aparece en la impreso
ra de la m~quina. As!mismo, puede realizarse la interpolaci6n i~
versa: dada la concentraci6n, obtener el valor de% B/Bdmedian
te la tecla E.
-118-
7.1.2.- LISTADO DEL PROG~.MA
aJJ •i.BLA e-~ )r. SS! $L8LE •Jo RCL6 !Sl 'rO
l/l\ 61); I.M 847 p .. c 692 LN 137 X 18:2 RCU 8€1~ ~l!i4 845 ST04 tlo- SiD£ 138 RCL9 183
_,, X
9{14 P.Tk t4S P:.s 8j4 RCLo 139 !84 (X ors ft. FLo 858 1\CL.; !1.95 RC..L4 143 Ck~ 185 l·'X ~86 $TO~ 651 RCL3 OS6 RCL£ !.fl RCLS 1~6 p~c
087 652 297 l42 .,. 187 RCL.; a as t1 ec:~ P:.s 896 143 x~ JS8
~~ X
il8j ~ i354 RCL4 ~99 e·' 144 sro; 189 SPC tHO iCLE 855 ;; 1t111 fiiuZ 145 RCL4 1.98 PRT>: (!11 esc CHS l8! R,:u 146 .'i'Z 19! SPC 8;2 l/~ t157 sro::; 102 !47 .KCLS 15Z P:S eu RCL2 ass f':S 18~ + 148 JS<J .KCL4 8l4 X 85.51 RCL6 !84 u;.; 149 CHS 194 x~ 015 Lll 868 RCLS 185 RCL2 158 RCL5 195 RCL9 816 STOS 8<)1 106 151 + 196 Bl7 RCi..5 B6Z ;:s HJr 1 1:~ !/X lSi ~tiS "'L 81$ EHTt 863 RCL5 1es a :s;; RCLl 198 RCL5 CH RCLl 61)4 + 165< {) !54 X 19~ + 829 I+ 1365 ST06 llt! X 155 Cfi5 288 1/Y.
RTH 866 ? .. , !U Riii 156 STCJ 621 .... 281 ST02
82~ fLBLC 86i RCLi:i 112 •LBLD 157 RCLo 282 RCL4 82.3 DSP4 ~oa h~ 113 STli£ lSS "-'""="
283 RC'-9 n~
824 SPC eo9 ~~L9 il4 l 15S RCL9 2134 82S p;s 878 115 6 168 2135 X2
RCL.; 871 CkS 4f·- t1 lel CHS ezo J•Ci 286 RCL.2 8.27 RCL5 Bi2 F:CL:' !17 RCL£ 162 P.CL7 2Bi ~
928 X iJ?3 1.i~ !G~ 26i STG2 azs RCLS Bi4 RC!.J 119 lo. Jt=.; P.CL1 ZBE- RCL3 63ti ... 875 1.213 ~CLE io5 216 v·x ~31 CHS 376 l/."i 1Zi , .. 1t)o SiOJ 21! RCLZ U2 RCLB IJT? SiG.Z 1~.2 Lk . -~ RCd Z1Z •Co• 8JJ + e?s p.;u 123 STu£ ;58 .; .213 P.Cl.l fJ?S •.•.-:: l ~.· RCL.; j6: 83 .. STC~ .. ~ L'f
214 X 035 RCL4 es.; RCLZ 125 l/X 1<a ~ ... -;.; .215 [i\ 936 xz 881 P' RCL6 i ~l RC:..i Zlci u:< .. o 837 f.Ci.3 &52 FF:r;: 127 RCLE 1 ~.2 ~ Zl7 F:s f!3S ~8J iii !2$ x:r liJ H!Jl Z18 RC:..6 ~!9 ~HS 684 PRiX l.ZS :?4 RCL4 2.!3 X d4ti RCL5 . ~55 r:s lJ~ 1!5 .'1~ E.£0 PRif; £141 086 RCL6 J3i e' "'~ RCL9 Z21 RTH 042 STii~ 88;' FRTX 132 ~TI, li'i ZZ2 K/S tl43 P.CL3 888 RCL4 133 ti5Lo& ;7S CHS
889 PiiTX !J.: - .. c li'9 RCL5 e44 l/X r .. ..,
845 RCLl 899 ~;;, Jj5 RCL4 136
-119-
7.2.- ANALISIS DE LA VARIANZA Y DE REGRESION
Para analizar 1a series de datos se rea1iz6 un programa
en Pascal para un microcomputador Digital Rainbow 100 plus· con un
sistema operative CP/M 86/80 y un compilador de Pascal COMPAS de
Digital Research. As!mismo, se rea1iz6 una versi6n en Basic de es
te mismo programa.
7.2.1.- MANEJO
Tras la introducci6n de los datos solicitados,
el programa exhibe el siguiente MENU:
D Correcci6n de datos
K Prueba de Kolrnogorov-Srnirnov
C ANOVA y prueba de comparaci6n de medias (Scheff~)
L Listar datos
B Prueba de Barlett
M Prueba de medias con heteroscedasticidad
R Nuevo an!lisis
G Transforrnaci6n Loge x
F Transformaci6n ex
U Transformaci6n x112
X Transformaci6n x 2
W Prueba no param~trica de Welch
T An!lisis de regresi6n
E Fin (en la versi6n Pascal)
-120-
El proqrama per.mite comprobar las hip6tesis del an~lisis
de la varianza y realizar transformaciones de los datos en caso
de que no se cumpla alquna de ellas. S6lo se requiere que el
muestreo sea aleatorio. As!mismo, permite realizar el an~lisis
de reqresi6n de dos series con el mismo nGmero de datos y prue
bas no param6tricas.
Cada opci6n puede ejecutarse independientemente de las
de~s.
-121-
1.2.2.- LISTADO DEL PROGRAMA
PROGRAM ONE_WAY_ANOVA; <* 28 JULY 198G *> CONS!
BELL • e?; !YPE
VAR
B_ARRAY= ARRAY Cl •• lOJ OF INTEGER: V_ARRAY~ ARRAY Cl •• lOJ OF REAL;
N: ARRAY Cl •• lO,l •• 4BJ OF REAL; Q,H,F,S,K,D,W: V_ARRAY; B: B._ARRAY; A,V: INTEGER;
PROCEDURE WAIT; CONST
ENTER = 913; VAR
CHARAC:CHAR; BEGIN
READCKBD,CHARAC>; WHILE CHARAC <> ENTER DO
BEGIN
-~ END;
WRITE<BELL) ;·· READCKBD,CHA,RAC>
END
. PROCEDURE CLEAR_HOHE; CONS!
CLSH•@27'CO;OH'@27'C2J'; BEGIN
WR I'IE < CLSH > END;
PROCEDURE HEADl; BEGIN
CLEAR_HOHE; GOTOXYC0,5>; WRITELN<'************~******************~*' WRITELN<'* •· WRI!ELNC'* ONE-WAY ANOVA ~'
WRI!ELN<'* ~'
WRITELNC'****~*******************A******~*' GOTOXY< 7, 20 > i WRITEC'PRESS ''ENTER'''>;
. WAIT END;
!UNCTION UPPERCCHARAC:CHAR>:CHAR; BEGIN
IF CHARAC IN C 'a 1 ...
1 z' T !HEN UPPER: =CHIU OP.D < C~ARAC > -3'2 > ELSE UPPER:=CHARAC
. END;
FUNCTION CORRECT ANSWER:BOOLEAN; VAR -
CHARAC:CHAR; BEGIN
READ<KBD,CHARAC>; CHARAC:=UP~ERCCHARAC>;
-122-
WHILE NO! <CHARAC IN C'Y','N'J) DO BEGIN
---· ---~RliE<B£1..1..); ··-READ<KBD,CHARAC>; CHARAC:=UPPER~CHARAC>
END;· WRIIE<CHARAC>; CORRECI_ANSWER:= <CHARAC 'Y' >
END;
PROCEDURE ZEROS; VAR
!:INtEGER; BEGIN
FOR I:• 1 IO ~ DO BEGIN
END;
SCIJ:= 0; KCIJ:= o;
·wen:= o; DCIJ:= 0
END
PROCEDURE CALCl; VAR .
I,J:IN'IEGER; BEGIN
v:=o; FOR I:=l tO A DO
BEGIN
END;
FOR Ji=l tO BCIJ DO BEGIN
SCIJ:= SCIJ + NCI,JJ; KC!J:= KCIJ + < NCI,JJ. Nt!,JJ >: DCIJ:= SQRt (( Kt!J - ( SCIJ * S[!J > I BCIJ >
I C BC IJ - 1 » ; W t I l : = W.t I J + 1 ; V:• V + 1
·END; HtiJ:= SCIJ I WCIJ; FCIJ:= < SCIJ * SC!J > I WCIJ
END
<*SI GE'tDAIA.PAS*> <*SI OPIIOND.PAS*> <*SI OPIIONK.PAS*> <*SI OPIIONC.PAS*> <*SI OPIIONL.PAS*> C*SI OPIIONB.PAS*> <*SI OPtiONH.PAS*> <*SI OPIIONSS.PAS*> <*SI OPIIONI.PAS*>
PROCEDURE RESTARt; BEGIN
ZEROS; GEtDAtA; CALCl
'END:
PROCEDURE OPI!ONS; VAR .
OPTION:CHAR;
-123-
PROCEDURE CALL OPTION<OPTION:CHAR): EiEG-IN ___ -·--· ~. -------··· --·--·----CASE OPTION Of
1 D1 !CORRECTION:
END
I K I : .{OUIOGOROV; 1 C':ANOVA_COMP; I L': LISt.; .' B' :BARLETT; 'M':MEAH; 'R':RESTART; I G I: LOG; ' 'F': INV_LOG;· 'U':ROOt'; 'X':INV_ROOT; 'W' :WELCH; '!':REGRESSION; 'E':
END; <* CALL_OPTION *> .. BEGIN
REPEAT' CLEAR_HOME; GOtOXY< 33,2 > ; WRITE< 'HENU' >; GOTOXY<32,3>; WRITE<'======'); GOTOXY<0,5>; WRIIELN<I ':l9,'D WR ITELN ( I , : 19' I K WRITELN<' ': 19, 'C WRITELN( I , :19, 'L WRITELN<' ':19,'B WR ITELN ( , I : 1 CJ t I M WRITELN<' ': 19, 'R WRITELN<' ':19, 1 8 WRITELN< I I: 19, 1 F WRITELN<' 1 !l9,'U WRITELN(' 1 !19,'X WRITELN<' ':19,'W '.JRITELN<' ':19,'! WRITELN<' ':19.''£ WR!IELN; i..Jf<ITE<' ':19,'SELECT BY READ<KBD,OPTIQN); OPTION:=UPPER<OPT!ON>; WHILE NOT
DATA CORREC!ION ') KOLMOGOROV-SM''S TEST '' ANOVA AND MEAN CQMP. !EST'> LIST D~TA ') BARLE!T''S TES! ') MEANS TEST W!:H H£TEROS. '' NEW TEST ' ) LOG. TRANSF. '\ !NV. LOG. TRANSF. I)
ROOT TRANSF. ') !NV. ROOT ') WELCH''S NON ?ARAM. !ES! ') REGRESSION 'l END ')
( 0 pI ION IN ( , D , • I ~( , • ' I c I , I L , • I B I , I !11 • I 1?. ' • I '3 I • I '.J I • , '!: I • I X I ' • w I , • ! ' , BEGIN ' I '£ 1 ))DO
WR IIE (BELL> ; : . READ<KBD,~PT!DN>; OPTION:=UPPER<OPTION>
END; WRIIE<OPTION>; CALt OPTION<OPTION>;
UNtiL OPTION='£'; CLEAR_HOHE
-l2i4-
BEGIN HEADl; GEIDAIA; CALCl;. OPTIONS
END.
PROCEDURE GEIDATA; (* 30 JULY 86 ~~ VAR
I,J,L,H:INTEGER; BEGIN
A: =0.; CLEAR_HOttE; GOTOXY<0,2>; WRITE('INTRODUCE THE NUMBER ~F SERIES !0 AMALIZE '>; READ<A>; rOR I:•l TO A DO
BEGIN H:•O; L:•O; REPEAT CLEAR_HOHE; BCil:=O; GOIOXY<0,2>; WRIIEC'INTRODUCE THE NUMBER OF DAtA OF SERlE ',I,' ·~: READCBtiJ>; . GOIOXY<0,7>; WRITEC'IS THE NUHBER OF DA!A CORREC:?<YIN>: '>; UNTIL CORRECT_ANSWER; SCll:=o; KC Il :=0; WC I.l: aO; Dttl:=o; CLEAR_HOHE; GOtOXY<0,2); WRIIELN<'INTRODUCE THE DAIA OF !HE ~Ei!E '.I.' :''; FOR J:=l TO Btil DO
.BEGIN . H: =H+l: GO!OXYC14*M,L+4>: WRITECJ:3,' ':3>; READ<Nti,Jl>; IF H a 3·THEN
END;
BEGIN H:ao; L:=L+1
END
GOIOXYC7,20>; WRltE<'PRESS ''EN~ER'''>; WAI'E
END END; <* GEtDAtA"*>
-125-
PROCEDURE CORRECTION; <A 30 JULY 1986 *' VAR
R9 E,I:INTEGER; BEGIN
CLEAR_HOHE; GOTOXY<0,2>;
<A OPTIOND ~>
WRITE<'INTRODUCE THE INDEX OF THE SERlE WITH !H£ VALUE TO BE CHANGED REPEAT
READ(R); IF <R<l> OR <R>A) THEN
BEGIN
END
WRITE-< BELL); GOTDXY<G~,2>; WRitE<' ':16>; GOTOXY<63 9 2)
UNTIL <R>=l> AND <R<=A>; GOTOXYC0,4>; WRITELNC'!NTRODUCE THE INDEX OF !HE PLACE OCCU~l!D IN !HE SER!E '.R);. WRITE<'BY THE VALU~·TO BE CHANGED : 'J; READ<E·>; GOtOXY<O,B>; WRlTE<'PRESENt VALUE ',NCR,EJ:8:2>: GOTOXY<O,lO>; WRITEC'INTRODUCE THE NEW VALUE '>; READCNCR,EJ>; ZEROS; GOTOXY(7,20>; WRITE<'WAIT A HOHENT'>; CALCl
END; <A OPTIOND ==> CORRECTION A>
-126-
PROCEDURE KOLHOGOROV; <* 25 JULY 1986 ~~
VAR <* OPTIONK *>
Z,Y,AK,L: ARRAY [1 •• 10,1 .. 48] OF REAL; X: ARRAY [1 •• 2,1 •• 10] OF REAL; U,V~;: V_ARRAY; H,I,J,PI,REH:INTEGER; !Et1P:REAL;
PROCEDURE CORREC!_BH<BH:IN!EGER;VAR VH:REAL): BEGIN .
CASE 8H OP 4: VH:= 0.417; 5: VH:= 0.405; G: VH!= 0.3G4; 7: VH:= 0.349; B: VH:= 0.3<31; 9: VH:= 0.311;
10: VH:= 0.294; 11: VH: = 0. 284; 12: VH:= 0.2?5; 13: VH:= 0.2GB; 14: VH:= 0.261; 15: VH:= 0.25'7.";· 1G :· VH := O. 250; 17: VH:= 0.245; 18: VH:= 0.239; 19: VH:= 0.235; 20,21,22,23,24: VH 0.231; 25,26,27,28,29: VH 0.203; 30,31,32,33,34: VH 0.167
END END;
BEGIN <* KOLHOGOROV *> CLEAR_HOHE; GO!OXY<7,20>; WRI!EC'WAIT A HOHENI'>; FOR H:= 1 TO A DO
FOR I:= 1 tO BCHJ DO ZCH,IJ:= C NCH,IJ- MCHJ> I DCHJ:
FOR H:= 1 tO A DO fOR I:= l TO BCHJ - 1 DO
BEGIN PI:= I+l: FOR J:= PI IO BCHJ DO
END;
IF ZCH,IJ > ZCH,JJ THEN BEGIN
!EHP:.= ZCH, IJ; ZCH,IJ:= ZCH,JJ; ZCH,Ji:= TEHP
END r·
~OR H:= 1 tO A DO FOR 1:• 1 !0 BCHl DO
YCH,lJ:= < EXP.< 1.6GS7 * ZCK,lJ >> ! ( 1 + EXP < 1.6657 * ZCH,IJ >>;
FOR H:• l tO A DO FOR t:a ~ tO BCHl DO
-127-
BEGIN REH:= SCHJ; AKCH,Il:= ( ~ I REH ) - YCH,Il: T(H~"lT::.-·yc:A-;-fl- ~-c-·c·r:i -r -,- :ctHj ··;-
END; FOR H:= 1 tO A DO
IF AKCH,lJ > AKCH,2J tHEN XCl,HJ:= AKCH~lJ ELSE
IF AKCH,2l > AKt:H,ll tHEN Xi:l,H1:= •';L:!:H,?"~; FOR H:• 1 TO A DO
FOR I:= 3 TO BCHJ DO IF AKCH,IJ > XCl,HJ tHEN XCl,HJ:= AK[H.!J:
FOR H:= 1 tO A DO IF LCH,ll > LCH,2l tHEN XC2,HJ:= LCH,!J
ELSE . · IF LCH,2l > LCH,lJ tHEN XC2,Hl:= ltH,2l;
FOR H:= 1 TO A DO FOR I:= 3 TO BCHl DO
IF LCH,IJ > Xt2,HJ tHf.N XC2,Hl:= LCH,!l: FOR H:= 1 tO A DO
IF XC1,Hl >= XC2,HJ tHEN UCHJ:= XCl,Hl ELSE IF Xtl,H~ < Xt2,Hl THEN UtHJ:• XC2,Hl;
CLEAR_HOHE; GOIOXY"< 3, 5 > ; WRITE<'HlGHESt D'>; FOR H:= l TO A-oo·
&EGIN . GOTOXY<l4,4+H); WRitELN<UCHJ:7:2>
END; GOTOXY< 7, 20 >; WRITE('PRESS ''ENtER''')• WAit; - , CLEAR_HOHE; FOR H:= l tO A DO
BEGIN IF BCHJ > 34 tHEN
VKCHJ:a 1.031 I BtHJ ELSE CORRECt_BH<&CHl,VKCHJ>; GOTOXYC0,4+H>; IF- UCHJ >= VKCHJ tHEN
END;
WRI!EC'tHE DISTRIBUtiON ',H,' IS HO! GAUSSIAN: P < 0.01', ELSE WRITE< 'THE DIS!RIBU'!ION I~"'' !S GriiJSSIAN')
GOTOXY<7,20>; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; WA !!' .
END; <A OPTIONK ==> KOLHOGOROV A>
-128-·
?ROCEDURE ANOVA_COHP; <* 22 JULY 1~86 *>
VAR <* OPTIONC *>
I,J:INTEGER; FA,Gt,N2,SC,T,T3,TODO:REAL; CT,SST,SSG,SSD,HSE,HSD,ES,TS,NO:~EAL; SA2,VEG,VIG,JO,INA,DX,SAUX:REAL;
BEGIN N2:= o; . GT:= 0; sc:= o; t3:• o; r:= o; TODD:• 0; CLEAR_HOME; FOR I:=l %0 A DO
BEGIN GT:• at + scu·; sc:= sc + KttJ; t3:• !3 + Ftl~; r:• T + we IJ
END; Ct!= GI * GI / T; ss.r:• sc - cr; SSG:= I3 - CI ; . ' SSD:= SST - SSG; HSE:• SSG I < A- 1 >; HSD:= SSD / < I - A >; FS:= HSE I HSD;
· TS:=·saar < :s >; FOR I:= 1 TO A DO
T·ODO:.• TODO + BCIJ; · IODO:• TODD - A;
GOTOXY<0,3>; WRIIELN<'IHE VALUE OF CALCULATED FS IS : ',FS:7:2>; GOtOX'H0,7>; WRITELN<'IF Ecalc. > F table5 2~R ',A-l,' A~r
!000:5:2,' D.f. THAT THERE'>; WRITELN<'IS AN ADDED COMPONENT OF VARIANCE'>: IF A•2 THEN
BEGIN GOtOXY<O, 13>; WRITE<'STUDENT t TEST VALUE ',TS:7:3>
END; GOTOXY<7,20>; WRitE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT; FOR I:• 1 TO A DO
N2:• N2 + < Wtll A Wtll >; NO:= ( 1 I < ~- 1 >> ~ t I-< N2 IT >>; CLEAR_HOHE; GOTOXY<0,3>; WRITE<'AVERAGE SIZE OF tHE SAHPLE: ',N0:7:3>: SA2:• ( KSE - HSD ) I NO; U SA2 < 0 THEN
BEGIN GOTOXY<O,l'5>; WRITE('THERE IS NOT AN ADDED COH~ONENT OF VARIANCE'>•
END; GOTOX'l'< 0, 1 > ;
-129.--
WRI!EC'APPROX. VALUE OF THE ADDED COHPONEN! ',SA2:7:3>: VEG:= SA2 I ( HSD + SA2 >; --vro: • I - -"QEG;------- -··-· -- ...... - .. . GOTOXY (13, 9 >; WRITEC'CORR. COEF. PETWEEN GROUPS ',VEG:?:3~;
GOTOXYC 13,11 >; WRITE<'CORR. COEF. INTRA GROUPS '~V!G:7:3,; GOTOXYC7,20>; WRITEC'PRESS ''ENTER'''>; WAIT; CLEAR_HOHE; GOTOXYC25,3>; WRitEC'ttEAN COMPARISON TEST'>; GOTOXYCO,S>; FOR I:• 1 tO A DO
WRITELN<'HBAN.SERIES ':22,I,' ';MCIJ:?:2.'SD ':24,0Cil:7:2>: GOTOXY<7,20>; . WRltE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT; CLEAR_HOHE; GOTOXY<O,O>; WRITELN<'INTRODUCE tHE ''F'' VALUE ~OR ',A-1.' AND '
t0DO:S:2,' !.d. AND THE'>; WRITEC'LEVEL OF SIGNIFICANCE SELECTED : '>: READ< F-A>; · GOTOXY<0,4>; WRitELN('tHE DIFFERENCE OF MEANS BETWEEN SERIES :'>: FOR I:• 1 TO A DO
FOR J:• ( I + 1 ) TO A DO BEGIN
SAUX:• SORT << A- l > *FA >: JO:• 1 I WCil + 1 I WCJJ~
INA:• SAUX ·*SORt C HSD * JO >: DX:• ABS < HCil - HCJl >; WRITECI:lO,' AND ',J>; IF INA <• DX THEN
Wf( IrELN ( I IS sIGN IF !CAN!, ) ELSE
END; WRITELN;
WRITELN<' IS NOT SIGNIFICANT')!
WRITEC'F~R THE SELECTEO ''P'''>; GOTOXY<7,20>; . WR!tE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT
END; <* OPTIONC ••> ANOVA *>
-130":"'
PROCEDURE LISt; (A 22 JULY 1986 A) (A OPTIONL A>
VAR I,J,K,L:INTEGER;
BEGIN POR I:= 1 ID A DO
BEGIN K:=O; L:=o; CLEAR __ HOME; GOtOXY<0,2>; WRITELN<'DATA 0£ SERlE ',I,' ~·>;
·PDR J:= 1 tO BCIJ DO
END
BEGIN . K:=K+l; GOtOXY<lGAK,4+L>; WRITE<J:3,' ':3,NCI,JJ:7:2); IP K = 3 THEN
END;
BEGlN K:=O; L:=L+l
END
GOTOXYC7,20>; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; WA.I'l .
END; <* OPTIONL ••> LIST A>
,...131-
PROCEDURE BARLETT; C* 24 JULY 1986 *> <* OPTIONB *>
VAR I: INTEGER; S2PP,FU,LS2,INVl,INV2,SPPL,CHI2,CHIA,BUF,COR:REAL;
BEGIN CLEAR_HOHE; GOTQXY<30,3>; WRitE<'BARLET!''S TEST'>; S2PP:=O; LS2:=0; INVl :=o·; INV2:=0; rOR I:= l TO A DO
BEGIN QCIJ:= DCIJ A DCIJ~ 52PP:= S2PP + <C QCIJ * < BCIJ - )) I C V -A >>
END; SPPL:= LN ( S2PP > I LN < ~0 >; FOR I:= 1 TO A DO
BEGIN FU:= LN < QCIJ > I LN < 10 >; LS2:= LS2 + << BC!l - l ) * FU
END; CHI2:= ((( V-A > * SPPL - LS2 > * 2.3026; FOR I:= 1 TO A DO
BEGIN INVl:= INVl + < 1 I < BCil- 1 >>: INV2:= INV2 + < BCIJ ;_ 1 >
END; BUF := INVl - ( 1 I INV2 >·; COR:= 1 + < 1 I ( 3 * < A- 1 ))) * BUf; CHIA:= £HI2 I COR; GO!OXY<O,G>; WRITE<'SQUARED CHI ADJUSTED : ',CHIA:5:2i; GOTOXY<O,S>; WRITEC'FOR ',A-1,' DEGREES OF FREEDOH'>: GOTOXY<O,lO>; WRITELN<'COHPARE WITH SQUARED CHI IN !ALES FOR 0.01;'': WRITELNC'!F CHI2 calc. > CHI2 tab •. !HE !HS~E ! E!ERQCEDAS!!C!!~. A~~· WRITELN<'YQU MUST PERFORM AN APPRO~. !E: ~? ;:~ L RI!Y B£!WEEN ~E~~~ ·~~ GOTOXY <7, 20 > ; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT
END; <* OPTIONB •=> BARLETT *>
-132-
-:.ROCEDURE MEAN; <* 22 JULY 1996 *> C A ·oPT IONK It>
AR I,NUl: INtEGER; GHE,OH,tCW,SSGP,JE,JOPE,FPR,NU2,WI,WY: REAL; G,E,C: IJ_ARRAY;
·EGIN .·.· wi:• o; WY:•·O; OH:• 0; JE:• o; . CLEAR_KOME; GO'tOXY <18, 2 > ; WRI'IE( 'APPROX.; 'tESt OF SIMILARitY BETWEEN MEANS'>: GOTOX't(l8,4>; WRilE('(for samples ~ith hetero~eneous variances>'>: FOR I:• 1 tO A DO
BEGIN QCIJ:• DtlJ It DCIJ; CtlJ:• BtiJ I QCIJ; ECIJ:• CtiJ It HtiJ
END; POi I:• 1 ~0 A DO
WI:.; WI + CCIJ; FOR I:• 1 tO A DO·
BEGIN GCIJ:a 1 - < CCIJ I WI >; WY:• WY + Etil
END; GME:• W't I WI; FOR I:• 1 tO A DO
OH:• OH + < HtiJ It ECIJ >; tCW:• ( WY * WY > I WI; SSGP:• OK - TCW; POR.I :• 1 tO A DO
JE:• JE + << GCil It GCIJ > I < ~CIJ -1 ~): JOPE:• 1 + (( 2 k C A- 2 ) I ( A It A - l )) * JE >: FPR:• C SSGP I < A~ l )) I JOPE; NUl:• A - 1; NU2:• (A* A- 1 > I < 3 * JE >; GOTOXYC0,'1>; WRITE< 'THE CALCULATED Fs VALUE FOR '.NUl.' ~N[I '.
NU2:6:2,' t1EGREES OF FREEDOM',' IS: ',E'PR:7:2>; GOTOXYCO,lO>; WRI'tELNC'IF F calc.> F tab. FOR 'tHIS d.f. AND !H£ SELECTED ''P''. !H£N WRitEC'SAHPLES &ELONG 'tO DIFFERENT POPULATIONS'); GOIOXYC1,20>; WRitEC'PRESS ''ENTER'''>; WAIT;
-~D; <*·OPtlONK ••> KEAN 6> .
-133-
<* OPTIONS G, F, U, X, W; SUBROUTINE ZEROS! A)
PROCEDURE ZEROSl; VAR
I:INIEGER; BEGIN
ZEROS;
<* 22-JULY 1986 *>
CLEAR_HOHE; GOTOXY<?,?>; WRIIE<'WAIT A HOHEN'I')
END;
PROCEDURE LOG; <* OPT~ONG l> VAR
I,J:INIEGER; BEGIN
ZEROS!; FOR I:= 1 IO A DO
FOR. J:= 1 IO BCIJ DO NCI,JJ:=· LN C NCI,Jl >;
CALCl END; <l OPIIONG ==> LOG *> PROCEDURE INV_LOG; <* OPTIONF *> VAR
I,J:INIEGER; BEGIN .
ZEROSl; FOR I:= 1 TO A DO
FOR J:= 1 IO BCIJ DO NCI,JJ:= EXP (.NCI,JJ >;
CALCl END; <A OPIIONF ==> INV_LOG *> PROCEDURE ROOI; <* OPIIONU l> VAR
I,J:INTEGER; BEGIN
ZEROS!; FOR I:= 1 TO A DO
FOR J:= 1 TO BCIJ DO NCI,JJ:= SORT ( NCI,JJ >:
CALCl SND; <* OPTIONU ==> ROOI *> PROCEDURE INV_ROOT; (l bPTIONX A> VAR
I,J:I!'liEGER; BEGIN
ZEROS!; FOR I:= 1 IO A DO
FOR J:= 1 TO BCIJ DOf NCI,JJ:= Nti,JJ w Ntt,JJ;
CALCl END; <w OPIIONX ==> INV~ROOI w>
PROCEDURE WELCH; <~ OPTIONW ~> VAR
1: IN'IEGER;
-134-
WIW,WIX,XIW,NU11,NU22: REAL; HlXl,HlX2,HIX3,MIX3l,HIX32,HIX33,HIX333,M!X34,MlX5: REAL:
B l!G IN . . . . . . . .. . - . -· . . . . . . . HIX333:• o; HIX3l.:• .. O; HIX32:•'.0; HIX33:•··0; MIX34 :• ·o;. WIW:• o; lUX:• 0; ttiXl:• o.; MIX3:• o; CLEAR_HOME; GOTOXY<22,5>; WRIIE<'WELCH''S NON PAR~MEIRIC !ESI'>; FOR I:• 1 TO A DO
BEGIN WIW:= WIW + BtiJ I DtiJ ~ DtiJ >>; WIX:= lUX+ tl[IJ ~ BtlJ /. < DtiJ *. I•t!J »>
END; XIW:• WIX I WIW; FOR I:= 1 ~0 A DO
HIX.l := HIX1 + << BtiJ I C DtiJ ~ DtiJ >> ~ t M[!J - XIW > 1r. < MtiJ - X!W>>;
MIX2:• HIXl I < A- 1 >; FOR 1:= 1 TO A DO
BEGIN MlX3l:= l- (( BtiJ / < DCIJ 1r. I•CIJ » I WIW >; HIX32:= HIX3l h HIX31; HIX33:= HIX32 1r. < l I ( Btll- 1 >>; HIX333:• MlX333 + HIX33
END; HIX34:• HIX333 * 2 1r. < A- 2 ) I < A* A - l >; HIX3:• H1X3• + l; HIXS:• HIX2 I HlX3; NUll:• A - l; NU22:• HIX333 ~ 3 I ( A~ A- l >; NU22:• l I NU22; GOTOXY<0,9>; WRI!EC'V2 VALUE: ',MIX3:?:2>; GO!OX"H 0, 12 > ; WRITELN<'Comp•~e the F value tor '.NUll:5:2
,' and ',NU22:5:2,' de9rees of fre&~oru • 'and desired ''P''.'>;
WRITE('!! V2 > F, then there is ~difference between the groyps'>: GOTOXYC7',20>; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; \.!Ali
~ND; <* OPTIONW ••> WELCH~*>
-135-
PROCEDURE REGRESSION; <*- 22 JULY 1986 *->
VAR <*- OPTION! k>
J,O:INIEGER; IX,IY,SXY,BUNO,BDOS,SCR,SCA,SCB,SCE,FRl,fR2.FR3,RDOS,P:REAL;
BEG·IN ·, i ...
SXY~•-· Q;. o :·-~o; P:• -~o; ·:-.:: CLEAR_HOME; GOTOXY<29,2>; WRITE( 1 REGRESSIOH ANALYSIS'>; IF C A <> 2 > OR ( BCll <> BC2J > THEN
BEGIN GO!OXY<O,S>; WRITELN('THIS ANALYSIS CAN ONLY BE PERfORMED WITH TWO DATA GROUPS'>: WRITE<'AND THE SA~E NUMBER OF DATA IN EACH ONE'>; GOTOXY<7,20>; • WRItE (,PRESS I I ENtER '!1 , ) ;
-~··WAIT
BND"' ELSE -
BEGIN , ·E'OR ·J:= 1 ·ro Bell DO
SXY!= SXY + < Ntl,JJ k Nt2,JJ >; BDOS:= < SXY- < StlJ k SC2J I BtlJ >l I
< KClJ- < SCll k SClJ I BClJ >>; BUNO:= MC2J - < BOOS k MtlJ >; SCR:= < BUNO A SC2J >: + < BDOS k SXY ) : SCA:= SCR- < SC2J *- SC2J > I SClJ; SCB:= SCR - ( SC2l k SC2J ) I Btl~: SCE:= Kt2J - SCR; FRl:= < BCll - 2 ) I 2 k SCR I SCE; FR2~= < BtlJ - 2 > k SCA I SCE; FR3!= ( Btll - 2 ) k SCB I SCE; RDOS:= SCB I < KC2l - < SC2l I BClJ >); GO!OXY(0y5>; WRITE ( I y = ' 'BUNO: 7:3' , + (I , 81)05: 7: 3, ' ) :-:' ) ; GOIOXY<0,7>; WRITE<'r =',SORT< RDOS >:7:3>: GOIOXY< 0, 10 >; · WRIIELN<'Fl = ',FR1:9:3>; IIIRITELN<'F2 = ',FR2:9:3>; WRITE<'F3 = ',FR3:9:3>; GOTOXY<O,l4>; WRITELN<'IF Fl > F tab. FOR 2, AND '.BtlJ - 2,
'd.!. AND THE DESIRED '>: WRI!ELNC'LEVEL OF SIGNIFICANCE, !HEN A AND B ARE SIMULTANEQU~~y '
'DIFFERENT FROM 0.'>; WRITELN('IF F2 OR F3 > F tab. FOP l AND '.B[lJ - 1,
I d.t. AND THE SELECTED LEVEL'); WRIIELNC'OF SIGN~FICANCE, THEN THE ORD!NA!E OR THE SLOPE ARE '
'DIFFERENT FROM 0'>; GOTOXY<7,20>; WRI!E('PRESS ''ENTER'''>; WAit; CLEAR,.;.HOME; GO'tO~'( < 7, 7);
·-136-
WRitE c ~ oo -rou .wANt ro INtERPOLATE '=' < '! tN > '>; If CORRECT ANSWER THEN .. BEGIN -
REPEAT . ~-Cl..!"Al()ttltiE ~· ..
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