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EXPRESION DEL GEN melA DE Rhizobium etli EN E coli
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EXPRESION DEL GEN melA DE Rhizobium etli
EN E coli
•HURTADO SÁENZ ANDRÉS.
compuestos aromáticos y combustibles: Aplicaciones en los sectores farmacéutico.
Se obtienen mediante procesos basados en refinación química a partir del petróleo y derivados.
Procesos generan subproductos que contaminanel medio ambiente.
Seres vivos realizan transformaciones químicas por medio de proteínas especializadas llamadas enzimas.
La biotecnología • Aprovecha capacidad catalítica• Generar procesos biológicos de producción de
moléculas útiles.• Conocida: ingeniería de vías metabólicas (IVM).
Melaninas polímeros papel protector en varios organismos.
Caracteristicas fisico-químicas, diversas aplicaciones:• Resinas de intercambio iónico o catiónico.• Semiconductor amorfo.• Fotoprotector.• Antioxidante• Agente antiviral
Cepas mantenidas en medio líquido o solidificado.
La cepa CFN42 de R. etli (medio PY)
La cepa E. coli XL 1 Blue fue usada en experimentos de clonación.
cepa W3110 para la expresión del gen melA.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Cepa R etli CFN42 medio: 5g de extracto de levadura, 10g de caseina y 10 ml de CaCl2 a 0.7 M. por cada litro.
El medio de crecimiento clonación de melA Luria-Bertani (LB) líquido y sólido: 5g extracto de levadura y 10 g NaCl. por cada litro.
Fase exponencial, se inoculó en medio M9 suplementado con 0.1 mM de IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido), 40 μg/mL de CuSO2, 2 g/L de glucosa y 0.4 g/L de L-tirosina en polvo, para iniciar a una densidad óptica a 600 nm (DO 600) de aproximadamente 0.1.
BACTERIAL STRAINS AND GROWTH CONDITIONS
BACTERIAL STRAINS AND GROWTH CONDITIONS
El antibiótico concentración 200 μg/ml de Ampicilina cuando las cepas de E. coli que contenían el plásmido.
Caseína sólida medio producción de melanina contenida: 1 g de glucosa, 5 g NaCl, 0.1 g CaCl2, 10 g bactotryptone, 15 g agar caseína, 0.4 mg CuSO4 y 2 g I-tirosina. por litro
Matraces bafleados de 250 mL a 30°C y 300 rpm en una incubadora de agitación marca New Brunswick Scientific, modelo C24KC.
PLASMID CONSTRUCTION
5melA 5' CCG AAC GTC CAT GGC GTG GCT GGT CGG C33melA 5' CCG GAG CCC GGG TGT TAG GCG GAC AC3
El cambio secuencial del nucleotido en el codón inicial no causa ningún cambio en la secuencia de la proteína.
Prolina se cambió por una Alanina ocurrida en la segunda posición.
Protocolo de desnaturalización 95 ◦C/3 min
Se clonó y expresó el gen melA de R. etli en E.coli.
La cepa W3110 de E. coli transformada por el plásmido pTRCmelA produjo eumelanina a partir de tirosina.
En cultivos líquidos se determinó que se obtienen rendimientos de conversión de tirosina en eumelanina cercanos al 100% del teórico.
CONCLUSIONES
Natividad Cabrera-Valladares.Alfredo Martínez.Silvia Piñero.Víctor H. Lagunas-Munoz.Raunel Tinoco.Ramón de Anda.Rafael Vázquez-Duhalt.Francisco Bolívar.Guillermo Gosset.Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Mor. 62250, México
AUTORESExpression of the melA gene from Rhizobium etli CFN42 in
Escherichia coli and characterization of the encoded tyrosinase
GRACIAS
